一种利用EM菌发酵食用菌菌包废料制备肥料的方法及应用

技术领域

本申请涉及生物发酵技术领域，更具体地说，它涉及一种利用EM菌发酵食用菌菌包废料制备肥料的方法及应用。

背景技术

EM是英文(Effective Microorganisms)的缩写语，中文译为“有效微生物群”。它是由光合菌群、乳酸菌群、酵母菌群、放线菌群、丝状菌群等5科10属80余种微生物组成的。各类微生物利用其他微生物产生的物质，形成一种共生共荣体系，从而保证EM益生菌多效活性液状态稳定、功能齐全。所以这种复合微生物菌剂在种植、养殖、环境保护等方面能发挥多种功能，促进动植物生长发育，抑制病害发生。

食用菌菌包废料是指食用菌出菇结束以后剩下的菌包废料。目前，我国已成为世界上食用菌生产第一大国。食用菌栽培已发展成与种植业、养殖业并重的农村三大产业，成为我国农村经济中最具活力的新兴的朝阳产业。随着我国食用菌生产规模的逐年扩大，产生的废弃物也越来越多。据不完全统计，全国每年菌包废料达到400万t以上。由于没有有效的回收利用方法，目前食用菌菌包废料变成了固体垃圾，常常被倾倒在河沟、路边，污染水和土地，影响环境，如此处理菌包废料不仅导致资源的浪费，还导致霉菌有害孢子和害虫的滋生，对环境造成极大污染。因此要发展食用菌生产，特别是规模化生产，就必须研发食用菌菌渣的综合利用技术。

发明内容

为了合理利用食用菌菌包废料，减少资源的浪费和对环境的污染，本申请提供一种利用EM菌发酵食用菌菌包废料制备肥料的方法及应用。

第一方面，本申请提供的一种利用EM菌发酵食用菌菌包废料制备肥料的方法采用如下的技术方案：

一种利用EM菌发酵食用菌菌包废料制备肥料的方法，包括EM菌液体菌种制备工艺和EM菌菌肥的制备工艺；

所述EM菌液体菌种制备工艺包括以下步骤：

S101、从EM菌液中分离得到光合菌群、乳酸菌群、酵母菌群、放线菌群和丝状菌群；

S102、斜面培养：将S101分离得到的光合菌群、乳酸菌群、酵母菌群、放线菌群和丝状菌群在35℃条件下分别接种于PDA固体培养基，培养14天，活化菌种；

S103、一级种子培养：将步骤S102活化的菌种在35℃条件下分别接种于液体培养基，120rpm摇床培养14天，用血球计数板计数，每种菌株浓度达到1.0×108cfu/ml以上；

S104、混合发酵培养：将步骤S103一级种子混合接种于液体培养基中，接种量为液体培养基的体积的1％，进行复合菌剂摇床培养，混合搅拌培养条件：温度35℃，120rpm，培养14天得到复合微生物EM菌剂；

S105、EM菌群筛选：按照步骤S104进行发酵培养，其他条件不变，仅调节液体培养基pH，按照不同的pH值梯度进行发酵培养，筛选偏酸性条件下稳定繁育的组成，用血球计数板计数，测算光合菌群、乳酸菌群、酵母菌群、放线菌群和丝状菌群的菌株浓度；

S106、EM菌群液体菌种的制备：按照步骤S104进行摇床发酵培养，发酵液pH调整为5.5，培养14天，即得到复合微生物EM菌液体菌种。

所述EM菌菌肥的制备工艺包括：

S201、食用菌菌包废料脱毒处理

收集食用菌菌包废料，粉碎至8目以下颗粒性物料，按照1：10的料水比加入水混合，用碱液调节pH值为13左右，浸泡15～30h，调节pH值至中性，即得到食用菌菌包废料脱毒液；

S202、制备中国被毛孢菌发酵营养物

将采集的野生冬虫夏草经过分离、纯化、传代培养获得冬虫夏草唯一无性型菌种中国被毛孢作为菌种，将菌种依次进行斜面培养、摇瓶培养、种子扩大培养和深层发酵培养，收集发酵终点的发酵液固液分离，收集固液分离滤液，浓缩至浓缩液浓度12～20％，调节pH值至4.5，反应温度55℃，加入纤维素酶450ml/吨发酵液，同时加入葡萄糖转苷酶12IU，反应时间24h，灭酶，浓缩至浓度35％以上，喷雾干燥获得粉末状物料，即为中国被毛孢菌发酵营养物；

S203、EM菌培养液制备

以步骤S201制备的食用菌菌包废料脱毒液为主要营养液，添加步骤S202制备的中国被毛孢菌发酵营养物，补充少量玉米粉，白砂糖，硫酸镁0.02％，磷酸氢二钾0.02％，调节pH为5.5，121℃灭菌30min，得到EM菌培养液；

S204、EM菌肥料制备

将步骤S106制备的EM菌液体菌种接种于上述步骤S203中的EM菌培养液中，进行发酵培养，温度35℃，通气量1:0.5～1:2V/V，培养时间5～15天；

收集发酵终点的发酵液，固液分离，分别收集滤液和固体残渣，滤液浓缩至固形物含量15％以上后灌装获得EM菌培养液体肥料A；固体残渣经过干燥、粉碎后获得EM菌培养固体肥料B。

优选的，步骤S103和步骤S104中液体培养基(重量组分计算)组成：牛肉膏1.2％，蛋白胨2.5％，白砂糖3.0％，玉米粉2.0％，琼脂1.5％，硫酸镁0.06％，磷酸氢二钾0.06％，pH5.5～6.5，121℃灭菌30min。

优选的，步骤S102EM菌种中光合菌群、乳酸菌群、酵母菌群、放线菌群和丝状菌群混合接种的比例按照2：3.5：2.5：3：5菌株浓度配比混合。

优选的，步骤S201中所述食用菌菌包废料的主要成分是秸秆、杂木屑和棉籽壳。

优选的，步骤S201所述碱液中的碱有氢氧化钠、碳酸钠、石灰水和氢氧化钙。

优选的，步骤S203中EM菌培养液的成分判断方法为：还原糖含量≥15g/L，氨氮含量≥0.5g/L。

优选的，步骤S202和步骤S204所述发酵终点的判断方法均为：检测发酵液还原糖含量≤100mg/L，氨氮含量≤200mg/L。

第二方面，本申请提供一种利用EM菌发酵食用菌菌包废料制备肥料的应用，采用如下的技术方案：

一种利用EM菌发酵食用菌菌包废料制备肥料的应用，权利要求1所制得的EM菌培养液体肥料A和EM菌培养固体肥料B用于马铃薯、菊芋和小麦等农作物。

综上所述，本申请具有以下有益效果：

1、由于本申请采用上述技术方案，通常食用菌菌包废料直接固态堆肥，施用效果差，本发明经过处理后，食用菌菌包废料可以再次作为EM菌发酵的原料，提升了食用菌包废料的利用率和价值；冬虫夏草菌发酵滤液中富含氨基酸、虫草多糖、甘露醇、腺苷等很多有效成分以及大量微量元素，通过本方法可以全部回收冬虫夏草菌发酵滤液中的有效成分，作为EM菌发酵的营养，也可以利用其含有的纤维素酶诱导物诱导EM菌产生纤维素酶，提高食用菌包废料的利用率，同时做到了冬虫夏草菌发酵滤液废水的“零”排放，杜绝了环境污染的可能性，节约了环保成本。

2、本申请中食用菌菌包废料优选采用秸秆、杂木屑和棉籽壳作为主要成分，不仅有效借助发酵原理，增加肥料的天然营养成分，还做到了废物利用，降低了生产成本。

3、本申请制备的肥料应用于马铃薯、菊芋和小麦等农作物，大大增加了这些农作物的产量，增强了肥料回收利用的幅度，也减少了对环境的污染。

具体实施方式

以下结合实施例和对比例对本申请作进一步详细说明。

实施例

实施例1

一种利用EM菌发酵食用菌菌包废料制备肥料的方法，包括EM菌液体菌种制备工艺和EM菌菌肥的制备工艺；

所述EM菌液体菌种制备工艺包括以下步骤：

S101、从EM菌液中分离得到光合菌群、乳酸菌群、酵母菌群、放线菌群和丝状菌群。

S102、斜面培养：将S101分离得到的光合菌群、乳酸菌群、酵母菌群、放线菌群和丝状菌群在35℃条件下分别接种于PDA固体培养基，培养14天，活化菌种；步骤S102EM菌种中光合菌群、乳酸菌群、酵母菌群、放线菌群和丝状菌群混合接种的比例按照2：3.5：2.5：3：5菌株浓度配比混合。

S103、一级种子培养：将步骤S102活化的菌种在35℃条件下分别接种于液体培养基，120rpm摇床培养14天，用血球计数板计数，每种菌株浓度达到1.0×108cfu/ml以上。

S104、混合发酵培养：将步骤S103一级种子混合接种于液体培养基中，接种量为液体培养基的体积的1％，进行复合菌剂摇床培养，混合搅拌培养条件：温度35℃，120rpm，培养14天得到复合微生物EM菌剂。

步骤S103和步骤S104中液体培养基(重量组分计算)组成：牛肉膏1.2％，蛋白胨2.5％，白砂糖3.0％，玉米粉2.0％，琼脂1.5％，硫酸镁0.06％，磷酸氢二钾0.06％，pH5.5，121℃灭菌30min。

S105、EM菌群筛选：按照步骤S104进行发酵培养，其他条件不变，仅调节液体培养基pH，按照不同的pH值梯度进行发酵培养，筛选偏酸性条件下稳定繁育的组成，用血球计数板计数，测算光合菌群、乳酸菌群、酵母菌群、放线菌群和丝状菌群的菌株浓度。

表1菌株浓度计量表

备注：菌株浓度单位cfu/ml

根据pH值单因素试验，以各菌群浓度为标准，可以明显的看到，在偏酸性条件下乳酸菌群、酵母菌群、丝状菌群生长良好，光合菌群合放线菌群生长不太好，综合各种菌群生长情况，用血球计数板计数，每种菌株浓度都达到1.0×10

此处要说明一下，因为本发明是利用EM菌群发酵食用菌菌包废料制备肥料，所以针对EM菌活性最强时的pH值确定是有必要的，而针对培养基和培养条件的筛选则意义不大。

S106、EM菌群液体菌种的制备：按照步骤S104进行摇床发酵培养，发酵液pH调整为5.5，培养14天，即得到复合微生物EM菌液体菌种。

所述EM菌菌肥的制备工艺包括：

S201、食用菌菌包废料脱毒处理

收集食用菌菌包废料，粉碎至8目以下颗粒性物料，按照1：10的料水比加入水混合，用碱液调节pH值为13左右，浸泡15h，调节pH值至中性，即得到食用菌菌包废料脱毒液。

本申请中，所述食用菌菌包废料的主要成分是秸秆、杂木屑和棉籽壳等，因为有木质素的存在，其营养成分很难直接被微生物菌种直接利用，经过碱液脱毒处理，脱除了木质素、棉酚等有害成分，破坏了秸秆、杂木屑、棉籽壳的结构。

所述碱液中的碱有氢氧化钠、碳酸钠、石灰水和氢氧化钙。

S202、制备中国被毛孢菌发酵营养物

采集青藏高原青海玉树野生冬虫夏草，经过分离、纯化、传代培养获得冬虫夏草唯一无性型菌种中国被毛孢(蝙蝠蛾被毛孢)作为菌种，将菌种依次进行斜面培养、摇瓶培养、种子扩大培养和深层发酵培养，收集发酵终点的发酵液固液分离，收集固液分离滤液，浓缩至浓缩液浓度12％，调节pH值至4.5，反应温度55℃，加入纤维素酶450ml/吨发酵液，同时加入葡萄糖转苷酶12IU，反应时间24h，灭酶，浓缩至浓度35％以上，喷雾干燥获得粉末状物料，即为中国被毛孢菌发酵营养物。

发酵终点的判断方法均为：检测发酵液还原糖含量≤100mg/L，氨氮含量≤200mg/L。

各培养基的成分和组成如下：

斜面培养：将菌种接种于斜面培养基，在18℃培养7天，获得斜面菌体；斜面培养基质量组成为：葡萄糖2.5％、土豆汁0.6％、酵母粉0.8％、蛋白胨1.5％、硫酸镁0.02％、磷酸二氢钾0.02％、溶剂为纯化水，pH值6.0。

摇瓶培养：菌种在pH值6.0、温度18℃，摇床转速120r/min，培养6天获得种子液；种子培养基含重量百分比的以下组分：葡萄糖1.2％、玉米粉0.6％、土豆汁1.2％、酵母膏1.2％、蛋白胨0.8％、硫酸镁0.02％、磷酸二氢钾0.02％和余量的水。

种子扩大培养：将种子液接种到种子罐进行三级种子扩大培养，每级种子液接种量为10％，种子罐通气量为1.1vvm，培养温度18℃，种子罐培养基配制为：葡萄糖2.4％、玉米粉1.2％、土豆汁0.6％、酵母膏0.8％、酵母粉0.3％、酵母抽提物0.15％、蚕蛹粉0.2％、蛋白胨1.2％、硫酸镁0.02％、磷酸二氢钾0.02％、溶剂为纯化水，pH值5.5。

深层发酵培养：取三级种子培养罐种子液接种到发酵罐中进行发酵培养，发酵培养条件：种量为12％，pH值6.0，温度18℃，通气量1.1V/V，培养时间8天；发酵培养基含重量百分比的以下组分：葡萄糖1.5％、玉米粉1.0％、土豆汁2.5％、尿素0.1％、蚕蛹粉1.2％、酵母浸粉1.5％、菊芋2.5％、酵母膏0.8％、组氨酸0.03％、半胱氨酸0.03％、组氨酸三甲基内盐0.01％、硫酸镁0.02％、磷酸二氢钾0.02％。

S203、EM菌培养液制备

以步骤S201制备的食用菌菌包废料脱毒液为主要营养液，添加步骤S202制备的中国被毛孢菌发酵营养物，补充少量玉米粉，白砂糖，硫酸镁0.02％，磷酸氢二钾0.02％，调节pH为5.5，121℃灭菌30min，得到EM菌培养液。

培养液的成分判断方法为：还原糖含量≥15g/L，氨氮含量≥0.5g/L。

S204、EM菌肥料制备

将步骤S106制备的EM菌液体菌种接种于上述步骤S203中的EM菌培养液中，进行发酵培养，温度35℃，通气量1:0.5V/V，培养时间5天。

发酵终点的判断方法均为：检测发酵液还原糖含量≤100mg/L，氨氮含量≤200mg/L。

收集发酵终点的发酵液，固液分离，分别收集滤液和固体残渣，滤液浓缩至固形物含量15％以上后灌装获得EM菌培养液体肥料A；固体残渣经过干燥、粉碎后获得EM菌培养固体肥料B。

上述所制得的EM菌培养液体肥料A和EM菌培养固体肥料B用于马铃薯、菊芋和小麦等农作物。

按照上述方法连续制备三批样品，送青海珠峰冬虫夏草原料有限公司检测，检测结果如下表2所示。

表2中国被毛孢菌发酵营养物成分

备注：样品1、样品2、样品3分别为连续制备3批所收集的三个批次的中国被毛孢菌发酵营养物样品。

经检测，中国被毛孢菌发酵营养物样品中富含总糖、多糖、粗蛋白、氨基酸等发酵必需营养物质，还含有D-甘露醇、槐塘、D-半乳糖等纤维素酶可溶性诱导物，尤其槐糖在极低浓度(0.34ppm)下就有诱导微生物产生纤维素酶的作用，可以促进EM菌产生纤维素酶提高食用菌菌包废料中营养成分的利用率。

实施例2

一种利用EM菌发酵食用菌菌包废料制备肥料的方法，包括EM菌液体菌种制备工艺和EM菌菌肥的制备工艺。

所述EM菌液体菌种制备工艺包括以下步骤：

S101、从EM菌液中分离得到光合菌群、乳酸菌群、酵母菌群、放线菌群和丝状菌群。

S102、斜面培养：将S101分离得到的光合菌群、乳酸菌群、酵母菌群、放线菌群和丝状菌群在35℃条件下分别接种于PDA固体培养基，培养14天，活化菌种；步骤S102EM菌种中光合菌群、乳酸菌群、酵母菌群、放线菌群和丝状菌群混合接种的比例按照2：3.5：2.5：3：5菌株浓度配比混合。

S103、一级种子培养：将步骤S102活化的菌种在35℃条件下分别接种于液体培养基，120rpm摇床培养14天，用血球计数板计数，每种菌株浓度达到1.0×108cfu/ml以上。

S104、混合发酵培养：将步骤S103一级种子混合接种于液体培养基中，接种量为液体培养基的体积的1％，进行复合菌剂摇床培养，混合搅拌培养条件：温度35℃，120rpm，培养14天得到复合微生物EM菌剂；

步骤S103和步骤S104中液体培养基(重量组分计算)组成：牛肉膏1.2％，蛋白胨2.5％，白砂糖3.0％，玉米粉2.0％，琼脂1.5％，硫酸镁0.06％，磷酸氢二钾0.06％，pH6.0，121℃灭菌30min。

S105、EM菌群筛选

按照步骤S104进行发酵培养，其他条件不变，仅调节液体培养基pH，按照不同的pH值梯度进行发酵培养，筛选偏酸性条件下稳定繁育的组成，用血球计数板计数，测算光合菌群、乳酸菌群、酵母菌群、放线菌群和丝状菌群的菌株浓度。

S106、EM菌群液体菌种的制备

按照步骤S104进行摇床发酵培养，发酵液pH调整为5.5，培养14天，即得到复合微生物EM菌液体菌种。

所述EM菌菌肥的制备工艺包括：

S201、食用菌菌包废料脱毒处理

收集食用菌菌包废料，粉碎至8目以下颗粒性物料，按照1：10的料水比加入水混合，用碱液调节pH值为13左右，浸泡20h，调节pH值至中性，即得到食用菌菌包废料脱毒液。

本申请中，所述食用菌菌包废料的主要成分是秸秆、杂木屑和棉籽壳等，因为有木质素的存在，其营养成分很难直接被微生物菌种直接利用，经过碱液脱毒处理，脱除了木质素、棉酚等有害成分，破坏了秸秆、杂木屑、棉籽壳的结构。

所述碱液中的碱有氢氧化钠、碳酸钠、石灰水和氢氧化钙。

S202、制备中国被毛孢菌发酵营养物

采集青藏高原青海玉树野生冬虫夏草，经过分离、纯化、传代培养获得冬虫夏草唯一无性型菌种中国被毛孢(蝙蝠蛾被毛孢)作为菌种，将菌种依次进行斜面培养、摇瓶培养、种子扩大培养和深层发酵培养，收集发酵终点的发酵液固液分离，收集固液分离滤液，浓缩至浓缩液浓度16％，调节pH值至4.5，反应温度55℃，加入纤维素酶450ml/吨发酵液，同时加入葡萄糖转苷酶12IU，反应时间24h，灭酶，浓缩至浓度35％以上，喷雾干燥获得粉末状物料，即为中国被毛孢菌发酵营养物。

发酵终点的判断方法均为：检测发酵液还原糖含量≤100mg/L，氨氮含量≤200mg/L。

各培养基的成分和组成如下：

斜面培养：将菌种接种于斜面培养基，在18℃培养7天，获得斜面菌体；斜面培养基质量组成为：葡萄糖2.5％、土豆汁0.6％、酵母粉0.8％、蛋白胨1.5％、硫酸镁0.02％、磷酸二氢钾0.02％、溶剂为纯化水，pH值6.0。

摇瓶培养：菌种在pH值6.0、温度18℃，摇床转速120r/min，培养6天获得种子液；种子培养基含重量百分比的以下组分：葡萄糖1.2％、玉米粉0.6％、土豆汁1.2％、酵母膏1.2％、蛋白胨0.8％、硫酸镁0.02％、磷酸二氢钾0.02％和余量的水。

种子扩大培养：将种子液接种到种子罐进行三级种子扩大培养，每级种子液接种量为10％，种子罐通气量为1.1vvm，培养温度18℃，种子罐培养基配制为：葡萄糖2.4％、玉米粉1.2％、土豆汁0.6％、酵母膏0.8％、酵母粉0.3％、酵母抽提物0.15％、蚕蛹粉0.2％、蛋白胨1.2％、硫酸镁0.02％、磷酸二氢钾0.02％、溶剂为纯化水，pH值6.0。

深层发酵培养：取三级种子培养罐种子液接种到发酵罐中进行发酵培养，发酵培养条件：种量为12％，pH值6.0，温度18℃，通气量1.1V/V，培养时间8天；发酵培养基含重量百分比的以下组分：葡萄糖1.5％、玉米粉1.0％、土豆汁2.5％、尿素0.1％、蚕蛹粉1.2％、酵母浸粉1.5％、菊芋2.5％、酵母膏0.8％、组氨酸0.03％、半胱氨酸0.03％、组氨酸三甲基内盐0.01％、硫酸镁0.02％、磷酸二氢钾0.02％。

S203、EM菌培养液制备

以步骤S201制备的食用菌菌包废料脱毒液为主要营养液，添加步骤S202制备的中国被毛孢菌发酵营养物，补充少量玉米粉，白砂糖，硫酸镁0.02％，磷酸氢二钾0.02％，调节pH为5.5，121℃灭菌30min，得到EM菌培养液。

培养液的成分判断方法为：还原糖含量≥15g/L，氨氮含量≥0.5g/L。

S204、EM菌肥料制备

将步骤S106制备的EM菌液体菌种接种于上述步骤S203中的EM菌培养液中，进行发酵培养，温度35℃，通气量1:1.5V/V，培养时间10天。

发酵终点的判断方法均为：检测发酵液还原糖含量≤100mg/L，氨氮含量≤200mg/L。

收集发酵终点的发酵液，固液分离，分别收集滤液和固体残渣，滤液浓缩至固形物含量15％以上后灌装获得EM菌培养液体肥料A；固体残渣经过干燥、粉碎后获得EM菌培养固体肥料B。

上述所制得的EM菌培养液体肥料A和EM菌培养固体肥料B用于马铃薯、菊芋和小麦等农作物。

实施例3

一种利用EM菌发酵食用菌菌包废料制备肥料的方法，其特征在于，包括EM菌液体菌种制备工艺和EM菌菌肥的制备工艺。

所述EM菌液体菌种制备工艺包括以下步骤：

S101、从EM菌液中分离得到光合菌群、乳酸菌群、酵母菌群、放线菌群和丝状菌群。

S102、斜面培养：将S101分离得到的光合菌群、乳酸菌群、酵母菌群、放线菌群和丝状菌群在35℃条件下分别接种于PDA固体培养基，培养14天，活化菌种；步骤S102EM菌种中光合菌群、乳酸菌群、酵母菌群、放线菌群和丝状菌群混合接种的比例按照2：3.5：2.5：3：5菌株浓度配比混合。

S103、一级种子培养：将步骤S102活化的菌种在35℃条件下分别接种于液体培养基，120rpm摇床培养14天，用血球计数板计数，每种菌株浓度达到1.0×108cfu/ml以上。

S104、混合发酵培养：将步骤S103一级种子混合接种于液体培养基中，接种量为液体培养基的体积的1％，进行复合菌剂摇床培养，混合搅拌培养条件：温度35℃，120rpm，培养14天得到复合微生物EM菌剂；

步骤S103和步骤S104中液体培养基(重量组分计算)组成：牛肉膏1.2％，蛋白胨2.5％，白砂糖3.0％，玉米粉2.0％，琼脂1.5％，硫酸镁0.06％，磷酸氢二钾0.06％，pH6.5，121℃灭菌30min。

S105、EM菌群筛选：按照步骤S104进行发酵培养，其他条件不变，仅调节液体培养基pH，按照不同的pH值梯度进行发酵培养，筛选偏酸性条件下稳定繁育的组成，用血球计数板计数，测算光合菌群、乳酸菌群、酵母菌群、放线菌群和丝状菌群的菌株浓度。

S106、EM菌群液体菌种的制备：按照步骤S104进行摇床发酵培养，发酵液pH调整为5.5，培养14天，即得到复合微生物EM菌液体菌种。

所述EM菌菌肥的制备工艺包括：

S201、食用菌菌包废料脱毒处理

收集食用菌菌包废料，粉碎至8目以下颗粒性物料，按照1：10的料水比加入水混合，用碱液调节pH值为13左右，浸泡30h，调节pH值至中性，即得到食用菌菌包废料脱毒液。

本申请中，所述食用菌菌包废料的主要成分是秸秆、杂木屑和棉籽壳等，因为有木质素的存在，其营养成分很难直接被微生物菌种直接利用，经过碱液脱毒处理，脱除了木质素、棉酚等有害成分，破坏了秸秆、杂木屑、棉籽壳的结构。

所述碱液中的碱有氢氧化钠、碳酸钠、石灰水和氢氧化钙。

S202、制备中国被毛孢菌发酵营养物

采集青藏高原青海玉树野生冬虫夏草，经过分离、纯化、传代培养获得冬虫夏草唯一无性型菌种中国被毛孢(蝙蝠蛾被毛孢)作为菌种，将菌种依次进行斜面培养、摇瓶培养、种子扩大培养和深层发酵培养，收集发酵终点的发酵液固液分离，收集固液分离滤液，浓缩至浓缩液浓度20％，调节pH值至4.5，反应温度55℃，加入纤维素酶450ml/吨发酵液，同时加入葡萄糖转苷酶12IU，反应时间24h，灭酶，浓缩至浓度35％以上，喷雾干燥获得粉末状物料，即为中国被毛孢菌发酵营养物。

发酵终点的判断方法均为：检测发酵液还原糖含量≤100mg/L，氨氮含量≤200mg/L。

各培养基的成分和组成如下：

斜面培养：将菌种接种于斜面培养基，在18℃培养7天，获得斜面菌体；斜面培养基质量组成为：葡萄糖2.5％、土豆汁0.6％、酵母粉0.8％、蛋白胨1.5％、硫酸镁0.02％、磷酸二氢钾0.02％、溶剂为纯化水，pH值6.0。

摇瓶培养：菌种在pH值6.0、温度18℃，摇床转速120r/min，培养7天获得种子液；种子培养基含重量百分比的以下组分：葡萄糖1.2％、玉米粉0.6％、土豆汁1.2％、酵母膏1.2％、蛋白胨0.8％、硫酸镁0.02％、磷酸二氢钾0.02％和余量的水；

种子扩大培养：将种子液接种到种子罐进行三级种子扩大培养，每级种子液接种量为10％，种子罐通气量为1.1vvm，培养温度18℃，种子罐培养基配制为：葡萄糖2.4％、玉米粉1.2％、土豆汁0.6％、酵母膏0.8％、酵母粉0.3％、酵母抽提物0.15％、蚕蛹粉0.2％、蛋白胨1.2％、硫酸镁0.02％、磷酸二氢钾0.02％、溶剂为纯化水，pH值6.5。

深层发酵培养：取三级种子培养罐种子液接种到发酵罐中进行发酵培养，发酵培养条件：种量为12％，pH值6.0，温度18℃，通气量1.1V/V，培养时间8天；发酵培养基含重量百分比的以下组分：葡萄糖1.5％、玉米粉1.0％、土豆汁2.5％、尿素0.1％、蚕蛹粉1.2％、酵母浸粉1.5％、菊芋2.5％、酵母膏0.8％、组氨酸0.03％、半胱氨酸0.03％、组氨酸三甲基内盐0.01％、硫酸镁0.02％、磷酸二氢钾0.02％。

S203、EM菌培养液制备

以步骤S201制备的食用菌菌包废料脱毒液为主要营养液，添加步骤S202制备的中国被毛孢菌发酵营养物，补充少量玉米粉，白砂糖，硫酸镁0.02％，磷酸氢二钾0.02％，调节pH为5.5，121℃灭菌30min，得到EM菌培养液。

培养液的成分判断方法为：还原糖含量≥15g/L，氨氮含量≥0.5g/L。

S204、EM菌肥料制备

将步骤S106制备的EM菌液体菌种接种于上述步骤S203中的EM菌培养液中，进行发酵培养，温度35℃，通气量1:2V/V，培养时间15天。

发酵终点的判断方法均为：检测发酵液还原糖含量≤100mg/L，氨氮含量≤200mg/L。

收集发酵终点的发酵液，固液分离，分别收集滤液和固体残渣，滤液浓缩至固形物含量15％以上后灌装获得EM菌培养液体肥料A；固体残渣经过干燥、粉碎后获得EM菌培养固体肥料B。

上述所制得的EM菌培养液体肥料A和EM菌培养固体肥料B用于马铃薯、菊芋和小麦等农作物。

性能检测试验

1.试验方法

1.1试验地概况

试验于2021年4-10月在青海省互助县威远镇卓扎滩村基地(102.01E，36.86N)进行。该基地属大陆性高原气候，海拔2650m，年均温3℃左右，生长季≥0℃积温2100℃左右，无霜期112d左右，年降水量480mm左右，年蒸发量1200mm左右。土壤为栗钙土，基础地力为：全N1.92g/kg、全P2O51.85g/kg、全K2O23.47g/kg、碱解N124.00mg/kg、速效P16.40mg/kg、速效K213.00mg/kg、有机质28.58g/kg、pH8.33。

1.2试验设计

以“青薯9号”、“青芋3号”、“互麦14号”为种植对象，分别设置6个EM菌肥处理，以不施用EM菌肥为对照(CK)，EM菌肥(A+B等重量组分)处理分别为施用60、120、180、240、300、360L/ha。EM菌肥A和EM菌肥B由青海珠峰冬虫夏草原料有限公司生产提供。

供试马铃薯品种为“青薯9号”，单因素随机区组排列。小区面积4m×6m＝24m2，5行区，3次重复。密度均为4.18×104株/ha。EM菌肥B为播前一次性基施；EM菌肥A为同浓度灌根1次，其中，苗期(6月22日)灌根1次。播种前，施入专用肥(硫酸钾型，N-P2O5-K2O为16-14-10％)750kg/ha(青海省专用肥料厂生产)、二铵(N-P2O5为18-46％)214.3kg/ha(云南云天化股份有限公司生产)、有机肥(含有机质45％)1500kg/ha(青海环友农业科技有限公司生产)。机械化起垄覆膜，人工点播。田间管理按照国家马铃薯品种区域试验进行。4月29日播种，9月30日成熟、收获。

供试菊芋品种为“青芋3号”，单因素随机区组排列。小区面积4m×6m＝24m2，5行区，3次重复。密度均为4.18×104株/ha。EM菌肥B为播前一次性基施；EM菌肥A为同浓度灌根1次，其中，苗期(6月22日)灌根1次。播种前，施入专用肥(硫酸钾型，N-P2O5-K2O为16-14-10％)450kg/ha(青海省专用肥料厂生产)、二铵(N-P2O5为18-46％)112.5kg/ha(云南云天化股份有限公司生产)、有机肥(含有机质45％)1200kg/ha(青海环友农业科技有限公司生产)。机械化起垄覆膜，人工点播。田间管理按照国家马铃薯品种区域试验进行。4月29日播种，9月30日成熟、收获。

供试小麦品种为“互麦14号”，单因素随机区组排列。小区面积4m×6m＝24m2，5行区，3次重复。密度均为4.18×104株/ha。EM菌肥B为播前一次性基施；EM菌肥A为同浓度灌根1次，其中，苗期(4月25日)灌根1次。播种前，施入专用肥(硫酸钾型，N-P2O5-K2O为16-14-10％)650kg/ha(青海省专用肥料厂生产)、二铵(N-P2O5为18-46％)212.5kg/ha(云南云天化股份有限公司生产)、有机肥(含有机质45％)1500kg/ha(青海环友农业科技有限公司生产)。机械化起垄覆膜，人工点播。田间管理按照国家马铃薯品种区域试验进行。3月21日播种，7月30日成熟、收获。

1.3测定内容与方法

收获时，马铃薯、菊芋、小麦试验区各重复小区实收测产，分别记录，并核算亩产。

1.4数据处理

使用Excel2007和DPS9.50进行数据处理和分析，采用Duncan法进行多重比较。

2.结果分析

分别统计马铃薯、菊芋、小麦这三种作物的产量，进行对比分析，详细数据见表3。

表3不同EM菌肥施用量下马铃薯、菊芋、小麦产量

3.结论

本研究表明，施用EM菌肥均对马铃薯、菊芋、小麦的增产有效果，产量随着EM菌肥施加量增加而增加，效果显著。

本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。