一种能提高农作物盐胁迫抗性的复合微藻肥料

技术领域

本发明属于农作物微生物肥技术领域，具体涉及一种能提高农作物盐胁迫抗性的活性复合微藻生物肥料。

背景技术

在农业生产，尤其是蔬菜棚室设施栽培过程中，为追求更高的经济效益，农户往往会在同一地点连续多年栽培。而同一地块施肥种类单一会引发土地盐渍化和pH升高等问题。而连作地和养殖过程中的盐胁迫会造成作物种子萌发率降低、种子活力下降、出芽后的幼胚侧根发育不全，壮苗率下降、幼苗整体失水萎缩，地上部干鲜质量下降，叶片黄化枯萎，抗逆性变弱等问题，从而影响成苗质量，进一步会影响农产品产量和质量。究其原因，大多蔬菜作物是甜土植物，对盐度敏感，其生长容易受到栽培环境中盐离子浓度的影响。特别是蔬菜等作物因其具有较高的经济价值生产中提高种子发芽率和种苗成活率及壮苗率对提高作物产量、品质和降低生产成本具有重要作用。

微藻是指仅在显微镜下才能观察到的微小藻类，是一种结构简单的低等光合自养植物，其既可以单独生长，也可以与其他生物共生。大量的微藻参与碳循环和能量转化，具有良好的固碳、固氮特性；而且大多数微藻会产生大量的生物活性化合物，在动物饲料、人类食品、制药、水产养殖和作物生产等多个方面具有广泛的应用前景。在进行光合作用过程中，微藻植物体积累了大量的光合产物、生物量及营养成分。根据微藻种类的不同，其植物体中含有成分迥异而复杂的多糖、脂肪酸等物质，这些物质具有作为农作物生长调节剂来使用的前景。而淡水微藻肥研究多集中在小球藻、栅藻和蓝藻等蓝绿藻种。已有的研究发现微藻肥料对包括玉米、菠菜、韭菜、洋葱、生菜和西红柿在内的一系列植物具有潜在的生物刺激作用。

但现有的微生物有机肥料存在如下的缺点：

1)现有微藻生物肥料多为微藻细胞破碎物制成，其藻株多为海水藻种，细胞内含有大量盐分，未经去除直接使用于农业环境中会造成土壤盐渍化加剧；

2)细胞破碎后的微藻生物肥料的成分为微藻细胞内含物及微藻培养基成分，这些物质具有不可增殖的特点，施用后释放营养物质随着时间推移营养物质逐渐降低；

3)目前的具有活性微藻的有机肥料多为蓝藻产品，该类型微藻有机肥利用蓝藻异形胞具有的固氮能力来增加土壤环境中的氮含量，达到肥力效果。但大量的蓝藻菌株随微藻生物肥料的施用而引入农业环境，会影响使用地的生物多样性及水体安全。蓝藻虽能固氮，但蓝藻细胞在死亡后会释放海藻毒素及蓝藻毒素，藻毒素往往对人和牲畜具有内毒作用，在进入生物体后对其他生物造成严重的健康伤害。

在黄瓜种植中，盐渍化土壤会对黄瓜产生不良影响，因此，如何解决盐渍化土壤条件下黄瓜种子的萌发率和黄瓜幼苗质量，是黄瓜种植领域亟待解决的技术问题。

发明内容

本发明提供一种能提高农作物盐胁迫抗性的活性复合微藻生物肥料，所提供的微藻生物肥料中的微藻细胞均为淡水来源的活体微藻细胞；所选用藻株不会释放微藻毒素，对环境安全；在施用到农业环境中后可以进行细胞增殖而延长肥力效果作用时间；且有助于提高作物抗性。

本发明首先提供一种活性微藻生物肥料，所述的活性微藻生物肥料包含有斜生栅藻(Scendesmus obliquus)和簇生舟形藻(Navicula gregaria Donkin)；

更进一步，所述的活性微藻生物肥料中斜生栅藻和簇生舟形藻的菌量比为1：0.05-1；更优选的比例为1：0.1-0.5，进一步的为1：0.3-0.4，最佳比为1：0.35。

本发明还提供所述的活性微藻生物肥料的一种用途，是在提高农作物盐胁迫抗性中的应用；

所述的农作物，作为实施例的具体记载为黄瓜。

本发明还提供活性微藻生物肥料的另一种用途，是在促进黄瓜种子发芽中的应用。

本发明另一个方面还提供一种盐渍化土壤的生物肥料，所述的生物肥料中包含有上述的活性微藻生物肥料。

本发明所提供的微藻复配肥料对黄瓜在盐胁迫下种子萌发和幼苗生长具有显著的缓解作用和促进生长作用。通过实验发现，外源施加复合微藻肥料通过调节黄瓜种子萌发到幼苗这一关键阶段的细胞内抗氧化酶含量和内源激素水平，缓解了盐胁迫带来的氧化损伤和生长抑制，提高了种子萌发指数和种子萌发活力。采用复配的微藻肥料消除盐渍环境对黄瓜的胁迫损伤为提高黄瓜的种苗成活率、提高黄瓜果实质量和产量提供了新的解决方案。

附图说明

图1：黄瓜种子在不同NaCl浓度胁迫下的发芽率统计图；

图2：黄瓜种子萌发7d后的萌发指数(Gi)图，其中CK：清水对照，YJ：200mM NaCl处理，YJ+Z：200mM NaCl处理并添加0.1g·L

图3：黄瓜种子萌发7d后的活力指数(Vi)图，其中CK：清水对照，YJ：200mM NaCl处理，YJ+Z：200mM NaCl处理并添加0.1g·L

图4：黄瓜种子萌发7d后各处理组的幼苗内脱落酸(ABA)含量图；

图5：黄瓜种子萌发7d后各处理组幼苗内生长素(IAA)含量图；

图6：黄瓜种子萌发7d后各处理组幼苗内的玉米素(ZA)含量图，其中图4到图6中*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。CK：对照处理，YJ：200mM NaCl处理，YJ+Z：200mM NaCl和斜生栅藻簇生舟形藻藻液混合处理。

图7-图10：黄瓜种子萌发7d后各处理组幼苗抗氧化酶含量图，其中图7为黄瓜幼苗超氧化物歧化酶(SOD)含量；图8为黄瓜幼苗过氧化物(POD)含量；图9为黄瓜幼苗丙二醛(MDA)含量；图10为黄瓜幼苗过氧化氢酶(CAT)含量；其中NS代表无显著性差异；*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。CK：对照处理，YJ：200mM NaCl处理，YJ+Z：200mM NaCl和斜生栅藻簇生舟形藻藻液混合处理。

图11：不同微藻生物肥浓度对黄瓜种子萌发5d后生物量影响图，其中CK：对照处理，YJ：200mM NaCl处理；a、b、c、d为各个不同处理浓度。

具体实施方式

本发明通过对不同盐浓度胁迫下黄瓜种子的萌发率做统计研究，确定黄瓜种子萌发半致死效应发生时的盐浓度。在此基础上，进一步将黄瓜种子及幼苗在该半致死盐浓度下培养，筛选活性微藻生物肥料。确定本发明的活性微藻生物肥料包含两种活体微藻细胞，为斜生栅藻(Scendesmus obliquus)和簇生舟形藻(Navicula gregaria Donkin)。

斜生栅藻属于绿藻门，栅藻科，栅藻属，通常由4～8个细胞组成定形群体。簇生舟形藻属于与硅藻门，羽纹纲，舟形藻目，舟形藻科，细胞可单独生活。

本发明的优选后的活性微藻生物肥料中斜生栅藻和簇生舟形藻的数量比为1：(0.05-1)，更优选的比例为1：(0.1-0.5)，进一步的为1：(0.3-0.4)。本发明将两种不同的淡水微藻进行比例复配混合，通过合理配比使得活细胞微藻生物肥料活性高、效果好、增殖能力强，作用持久。

本发明的活细胞微藻生物肥料中的微藻为活体状态，作用持久，配比合理，通过复配后的两种微藻在BG11培养基中培养，具有良好的共生增殖特性，通过细胞计数板观察可见微藻活细胞数量超过1.0×10

分析微藻对盐胁迫下黄瓜种子萌发和幼苗生长指标和抗氧化酶系统的影响。以期利用微藻肥料消除盐渍化土壤对黄瓜种植的影响，进而可以提高土地利用率；同时，通过探讨藻类肥料对黄瓜种子和幼苗盐胁迫的缓解效果，为藻类肥料在盐渍化土壤和农业种植的应用中提供基础数据。

本发明实施例中使用的黄瓜品种为“绿剑”，种子来源为黑龙江省农业科学院园艺分院旱黄瓜研究室。

下面结合实施例和附图对本发明进行详细的描述。

实施例1：NaCl胁迫对种子发芽指标的影响

采用NaCl(分析纯)模拟盐胁迫，共设置100、120、140、160、180，200和220mmol·L

数据统计和整理使用Microsoft Office Excel 2021，使用RStudio进行数据处理、差异分析及绘图。

结果表明，随着NaCl浓度的增加，黄瓜的首日发芽率及最终发芽率均逐渐降低，最终发芽率与种子萌发环境盐胁迫浓度呈负相关。

220mmol·L

实施例2：复合配比的微藻生物肥料提高黄瓜盐胁迫抗性

在2022年7月到12月，在哈尔滨师范大学生命科学与技术学院水生生物学重点实验室进行。

斜生栅藻保种及扩培采用灭菌后的BG11液体培养基，簇生舟形藻采用WC培养基，两种微藻培养环境如下：

温度25-30℃，光照强度3000-4000lux，光照：黑暗＝14h:10h，每天手动摇动培养锥形瓶3次。

采用超纯水清洗的方法以去除藻类培养基对后续实验的影响，离心法进行微藻植物体富集。吸取60mL藻液置于100mL离心管中，转速8000g，离心20min，弃去上清液、保留沉淀，并用超纯水将沉淀充分悬浮后重复上述操作。重复3次，得到去除藻类原有培养基的新鲜藻液沉淀。

将新鲜藻液用超纯水重新悬浮后，用烘干至恒重并提前称好质量的0.45μm滤膜(质量记为m

调整藻液生物量密度至ρ

为研究微藻复配的微藻肥料对盐胁迫下黄瓜种子萌发作用效果，对黄瓜种子进行200mmol·L

采用土培方式进行幼苗栽培试验。栽培容器选用内径9cm的营养钵,培养基质采用草炭土：园土：蛭石＝3：1：1，均质化处理后使用。黄瓜种子催芽后播种到营养钵中，种子萌发后转移至光照周期为14h/10h，光照强度3000-4000lux的植物培养架上进行培养，待黄瓜幼苗长到3叶1心，保持土壤水分并用200mmol·L

在施加了200mM NaCl胁迫后，黄瓜种子的萌发指数(Gi)极显著(p<0.01)降低；通过复合微藻肥料的添加，可以极显著的提高盐处理下黄瓜种子萌发指数，而与对照组相比，在施加盐胁迫的同时对黄瓜种子施用复合微藻肥，种子萌发指数无显著性变化，复合微藻肥料可以缓解盐胁迫对于黄瓜种子萌发指数的影响；而在没有盐胁迫的条件下，复合微藻肥同样也能够极显著提高黄瓜种子萌发指数，该结果表明，在盐胁迫及非胁迫条件下，施用复合微藻肥均可以提高黄瓜种子萌发指数，有助于黄瓜幼苗的生长(图2)。

同样，在盐胁迫下黄瓜种子的活力指数(Vi)极显著降低，在施加了复合微藻肥料后，能够提高盐胁迫下黄瓜种子的活力指数，但是与对照相比仍有极显著差异；而在没有胁迫的情况下施用复合微藻肥对黄瓜种子活力指数没有显著的提高(图3)。在对各处理组黄瓜种子萌发7d后的幼苗进行了内源激素测定后发现，NaCl胁迫下的黄瓜幼苗脱落酸(ABA)的含量极显著高于对照组，提高了57.42％；同时施加了复合微藻肥后，能显著提高盐胁迫下黄瓜幼苗ABA含量，相较盐处理组提高了33.76％，是对照组的2.10倍(图4)。通过分析黄瓜幼苗赤霉素(GA

结果表明，盐胁迫下黄瓜幼苗中生长素(IAA)含下降45.15％，达到极显著水平；施加了复合微藻肥之后的盐处理组IAA含量相较盐处理组提高了20.06％，既微藻肥料显著提高盐胁迫下黄瓜幼苗的IAA含量，但与未施加胁迫的对照组相比，仍降低了35.36％(图5)。在进行NaCl胁迫后黄瓜幼苗的玉米素(ZA)含量极显著增加，是对照组的2.82倍，而在添加了复合微藻肥之后的黄瓜幼苗ZA含量是对照组的2.90倍，但与盐胁迫组相比没有显著变化(图6)。

黄瓜幼苗的超氧化物歧化酶(SOD)活性在受到盐胁迫后表现为极显著的增加，而在藻肥处理组与对照组相比SOD含量表现为显著降低，与盐胁迫组相比较可以发现，施加了复合藻肥之后对降低黄瓜幼苗的SOD含量具有极显著的作用，如图7所示。黄瓜萌发后7d幼苗的过氧化物酶(POD)含量在盐处理组中显著高于其他各处理组，但盐胁迫下施加复合微藻肥料之后的处理组与对照组相比没有显著变化(图8)。这表明黄瓜幼苗在盐胁迫下其SOD和POD的含量都显著提高。NaCl处理下黄瓜幼苗植物体内积累了大量的SOD和POD，但盐胁迫下施加了复合微藻肥的处理组YJ+Z却表现出SOD和POD显著下降的趋势，结果显示出复合微藻肥料对于降低盐胁迫下的黄瓜幼苗SOD和POD含量具有显著效果。

在丙二醛(MDA)含量的测定中，盐胁迫下黄瓜幼苗MDA的水平急剧上升，盐胁迫组MDA含量极显著高于其它处理组，为对照组的1.80倍，盐胁迫使黄瓜幼苗积累了大量的MDA；在盐胁迫的同时施用复合微藻肥料后，MDA含量降低了21.13％，但仍显著高于对照组，说明使用复合微藻肥聊之后能够显著缓解黄瓜幼苗的MDA积累，但不能够完全消除盐胁迫带来的细胞渗透损伤(图9)。

黄瓜幼苗在受到盐处理(200mM NaCl)后过氧化氢酶(CAT)含量下降了34.6％，与对照组相比达到极显著水平。施加了复合微藻肥料后黄瓜幼苗显著提高了CAT含量，分别是对照组和盐处理组的1.2和1.8倍。(图10)

上述结果表明在黄瓜种子萌发过程中施加复合微藻肥料可以提高盐胁迫下的黄瓜种子的萌发指数和种子活力指数，促进黄瓜种子的萌发后期生长速度与生物量积累。

施加盐胁迫后的黄瓜种子萌发过程中，复合微藻肥会显著增加幼苗细胞内ABA和IAA的含量，对ZA和GA

通过施加复合微藻肥料可以显著的降低因盐胁迫带来的SOD、POD和MDA含量升高，提高了细胞内CAT活性，这对于缓解黄瓜幼苗盐胁迫损伤具有积极作用。

实施例3：不同生物量浓度的复配微藻生物肥料对黄瓜种子萌发及幼苗生长的影响

斜生栅藻保种及扩培采用灭菌后的BG11液体培养基，簇生舟形藻采用WC培养基，两种微藻培养环境如下：

培养温度25-30℃，光照强度3000-4000lux，光周期为光照：黑暗＝14h:10h，每天手动摇动培养锥形瓶3次。

采用超纯水清洗的方法去除藻类培养基对后续实验的影响，离心法进行微藻植物体富集。吸取60mL藻液置于100mL离心管中，转速8000g，离心20min，弃去上清液、保留沉淀，并用超纯水将沉淀充分悬浮后重复上述操作。重复3次，得到去除培养基的新鲜藻细胞。

将新鲜藻液用超纯水重新悬浮后，用烘干至恒重并提前称好质量的0.45μm滤膜(质量记为m

通过添加液体水的方法来调整微藻生物量密度，分别调整至处理a：ρ

将上述浓度的微藻生物肥料分别添加到正常条件下及盐胁迫处理下黄瓜种子萌发过程中，进行萌发实验，种子萌发5d后分别测量上胚轴及下胚轴干重，得到数据进行统计后发现，微藻生物肥浓度b在黄瓜种子萌发过程中，具有显著增加黄瓜植物体生物量的作用。这种促进的作用在黄瓜种子正常生长和受到盐胁迫后均显著的高于其他浓度微藻生物肥料的作用。结果表明微藻生物肥配比浓度b为各个处理组的优选浓度(图11)。

综上，本发明所提供的微藻复配肥料对黄瓜在盐胁迫下种子萌发和幼苗生长具有显著的缓解作用和促进生长作用。