酰胺的制备方法

技术领域

本发明涉及酰胺的制备方法。

本申请要求基于2018年6月15日在日本申请的特愿2018-114782的优先权，以引用的方式将其全部内容并入本文。

背景技术

在肽合成中，将氨基酸的羧基活化，使其与氨基酸的氨基发生偶联反应而形成酰胺键，通过重复该反应来使氨基酸依次延伸。作为使羧基活化的方法，已知有几种方法。存在使用活化度弱的缩合剂对异构化及副产物的生成进行抑制的同时合成肽的方法；也存在使用活化剂在短时间内合成肽的方法。

作为使用高活性的活化剂使所述羧基活化的方法，有酰氯法、酸酐法。这些酰氯法、酸酐法与对活化度弱的缩合剂加以使用的活化法相比，由于活化剂的结构简单，因此具有单价便宜并且来自活化剂的副产物的生成少等优点。

酸酐法分为对称酸酐法和混合酸酐法。

例如，在非专利文献1～非专利文献2中，公开了使用对称酸酐作为羧酸活性物质的酰胺合成法。

非专利文献1～非专利文献2中公开的对称酸酐法可称为具备以下步骤的方法：第1步骤，通过羧酸之间的缩合反应生成对称酸酐；第2步骤，进行上述对称酸酐与胺的偶联反应。

此外，例如在非专利文献3中，公开了使用混合酸酐作为羧酸活性物质的酰胺合成法。

在非专利文献3中，记载了将羧酸和氯甲酸异丙酯在第1微型混合器中混合，在短时间内合成混合酸酐，接着，为了不使合成的混合酸酐外消旋化，立即将含有混合酸酐的溶液同胺以及催化剂(碱)在第2微型混合器中混合，进行酰胺化。

非专利文献3中公开的混合酸酐法可称为具备以下步骤的方法：第1步骤，使羧酸与氯甲酸酯反应得到混合酸酐；第2步骤，向上述混合酸酐中添加碱得到酰基吡啶鎓物质；第3步骤，将所述酰基吡啶鎓物质与胺进行偶联反应得到酰胺。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：“Efficient Amide Bond Formation through a Rapid andStrongActivation of Carboxylic Acids in a Microflow Reactor”，Fuse，S.Mifune，Y.Takahashi，T.，Angew Chem.Int.Ed.53，851-855(2014)。

非专利文献2：“Total synthesis of feglymycin based on a linear/convergent hybrid approach using micro-flow amide bond formation”，Fuse，S.Mifune，Y.Nakamura，H.Tanaka，H.Nat.Commun.7，13491(2016)。

非专利文献3：小竹佑磨、中村浩之、布施新一郎，“マイクロフロー法を駆使するN－メチル化ペプチドの効率的合成”，2017年3月16日，日本化学会第97春季年会、3F4-14。

发明内容

发明所解决的技术问题

在对称酸酐法中，使用精氨酸或精氨酸衍生物作为胺时，存在反应几乎不进行的问题。进而，即使在反应进行的情况下，也存在大概率发生所述氨基酸的异构化和δ-内酰胺的生成等副反应这样的问题。

在混合酸酐法中，即使在使用精氨酸或精氨酸衍生物作为胺时，也可以进行反应。然而，大概率发生所述氨基酸的异构化和δ-内酰胺的生成等副反应这样的问题依然没有消除。

本发明是为了解决上述问题而完成的，其目的在于提供下述的酰胺制备方法：在将羧基活化使其与氨基发生偶联反应而形成酰胺键的反应中，反应效率良好且难以发生副反应。

解决技术问题的技术手段

也就是说，本发明具有以下方式。

(1)一种酰胺的制备方法，所述方法包括使侧链的两处氨基或亚氨基被保护基保护的精氨酸、精氨酸衍生物或精氨酸类似物同卤化甲酸酯反应后，再与胺进行反应。

(2)如上述(1)所述的酰胺的制备方法，所述方法包括使侧链的两处氨基或亚氨基被保护基保护的精氨酸、精氨酸衍生物或精氨酸类似物同卤化甲酸酯反应后，再与碱进行反应，然后与胺进行反应。

(3)一种酰胺的制备方法，所述方法包括使将侧链的两处氨基或亚氨基被保护基保护的精氨酸、精氨酸衍生物或精氨酸类似物同卤化甲酸酯混合而得到的混合物进行反应，再将该反应的产物与胺混合。

(4)如上述(3)所述的酰胺的制备方法，所述方法包括使将侧链的两处氨基或亚氨基被保护基保护的精氨酸、精氨酸衍生物或精氨酸类似物同卤化甲酸酯混合而得到的混合物进行反应，再将该反应的产物同碱和胺混合。

(5)如上述(2)或(4)所述的酰胺的制备方法，所述碱为选自于由吡啶、吡啶衍生物、咪唑、咪唑衍生物和1,4-二氮杂双环[2,2,2]辛烷组成的组中的任意一种以上。

(6)如上述(2)或(4)所述的酰胺的制备方法，所述碱为选自于由4-吗啉基吡啶、N,N-二甲基-4-氨基吡啶、4-吡咯烷基吡啶、吡啶、4-甲氧基吡啶、咪唑、N-甲基咪唑和1,4-二氮杂双环[2,2,2]辛烷组成的组中的任意一种以上。

(7)如上述(1)～(6)中任一项所述的酰胺的制备方法，两处的所述保护基为氨基甲酸酯系保护基或磺酰胺系保护基。

(8)如上述(1)～(7)中任一项所述的酰胺的制备方法，所述卤化甲酸酯为选自于由氯甲酸异丙酯、氯甲酸异丁酯、溴甲酸异丙酯和溴甲酸异丁酯组成的组中的任意一种以上。

(9)如上述(1)～(8)中任一项所述的酰胺的制备方法，所述胺是氨基酸或氨基酸衍生物。

(10)如上述(1)～(9)中任一项所述的酰胺的制备方法，所述胺的亲核性低于从构成蛋白质且作为遗传信息编码的20种氨基酸中除去缬氨酸和异亮氨酸后的18种氨基酸的亲核性。

(11)如上述(9)或(10)所述的酰胺的制备方法，所述胺是缬氨酸、异亮氨酸或N-烷基化的氨基酸或者上述物质的衍生物。

(12)如上述(1)～(11)中任一项所述的酰胺的制备方法，在流通系反应装置中进行与所述胺的反应。

(13)如上述(12)所述的酰胺的制备方法，在流通系反应装置中还进行侧链的两处氨基或亚氨基被保护基保护的精氨酸、精氨酸衍生物或精氨酸类似物同卤化甲酸酯的反应。

发明效果

根据本发明，可以提供反应效率良好、难以发生副反应的酰胺制备方法。

附图说明

图1是示出了流通系反应装置1的概略构成的模式图。

具体实施方式

以下，对本发明的酰胺制备方法的实施方式加以说明。

<酰胺的制备方法>

(第1实施方式)

实施方式的酰胺制备方法包括使侧链的两处氨基或亚氨基被保护基保护的精氨酸、精氨酸衍生物或精氨酸类似物(本说明书中，以下有时称为“精氨酸类”)同卤化甲酸酯反应后，再与碱进行反应，然后与胺进行反应。

实施方式的酰胺制备方法可以是包括下述步骤的方法：使将精氨酸类和卤化甲酸酯混合而得到的混合物进行反应，再将该反应的产物同碱和胺混合。在此，使将精氨酸类和卤化甲酸酯混合而得到的混合物进行反应的产物可以含有混合酸酐。

另外，所述碱可以是生成阳离子性活性物质的物质，也可以是碱(但所述胺除外)。

另外，这里所说的“混合”是指在反应体系中添加原料等物质的动作，在反应体系内将它们混合时，原料等也可变为与添加前不同的物质。

在实施方式的酰胺制备方法中，将侧链的两处氨基或亚氨基被保护基保护的精氨酸类用作酰胺键形成中的羧酸。该制备方法也可以包括以下工序1～工序3。

工序1：使侧链的两处氨基或亚氨基被保护基保护的精氨酸类同卤化甲酸酯反应，得到混合酸酐的工序。

工序2：使上述工序1中得到的上述混合酸酐与碱反应，得到阳离子性活性物质的工序。

工序3：使上述工序2中得到的上述阳离子性活性物质与胺反应，制备酰胺的工序。

以下，对上述各工序进行说明。另外，本发明所述的酰胺制备方法的反应并不限定于下述各工序中举例示出的反应。

<工序1>

工序1是使侧链的两处氨基或亚氨基被保护基保护的精氨酸类同卤化甲酸酯反应，得到混合酸酐的工序。

上述精氨酸类优选具有α-氨基酸的骨架。此外，由于构成生物体内的肽或蛋白质的氨基酸通常为L型，因此上述精氨酸类优选为L型。上述精氨酸类可以是下述通式(1)所示的化合物。

[化1]

(式中，R

精氨酸类也可以被去质子化而成为羧酸根离子，可以由下述通式(1i)表示。

[化2]

(式中，R

上述精氨酸类的去质子化例如可以通过在反应体系内的N,N-二异丙基乙胺(DIEA)等亲核性低的碱的存在下，置入上述精氨酸类来实现。“在碱的存在下”是指例如在添加了碱的溶剂中。该碱的种类只要是能够在反应体系内进行上述精氨酸类的去质子化的碱，不受到特别限定。

在上述精氨酸类为精氨酸时，上述式(1-1)中的R

[化3]

实施方式所述的精氨酸类限定为侧链的两处氨基或亚氨基被保护基保护的精氨酸类。在此，“官能团被保护”是指构成所述官能团的原子被保护基取代。作为两处氨基或亚氨基被保护基保护的精氨酸类的侧链，可以举出下述通式(R

[化4]

(式中，Z

通过保护上述氨基或亚氨基的两处，在经由酸酐的活化条件下，包括异构化和δ-内酰胺的生成在内的副反应得以被显著地抑制。

通式(R

上述精氨酸类中的精氨酸衍生物或精氨酸类似物可以是具有与精氨酸实质上等同性质的化合物，可以是天然存在的天然型化合物，也可以是与天然型不同的具有修饰、加成、官能团取代等改变等的化合物。精氨酸衍生物或精氨酸类似物优选具有由可具有取代基的上述通式(R

作为具有与精氨酸实质上等同性质的情况的实例，举出能够被以精氨酸为底物的酶吸收、或者能够同与精氨酸结合的分子进行结合的情况。

作为精氨酸衍生物的实例，举出官能团被保护基保护的保护氨基酸。保护基具有使反应性官能团失活的作用。还可以对保护基进行去保护，使被保护的官能团恢复到被保护之前的状态。在此，“官能团被保护”是指构成所述官能团的原子被保护基取代的情况。作为被保护基保护的部位，除了上述举例示出的侧链以外，举出氨基和/或羧基。在该工序1中，为了防止羧基以外的反应性官能团的反应，优选氨基和侧链的官能团被保护。

作为保护基的种类，不受到特别限定，可以根据被保护的官能团的种类适当选择。例如，作为氨基的保护基，举出氨基甲酸酯类、磺酰胺类、酰基类、烷基类等保护基，且不限于此。

作为氨基甲酸酯类的保护基，举出2-苄氧基羰基(有时简写为-Z或-Cbz)、叔丁氧基羰基(有时简写为-Boc)、烯丙氧基羰基(有时简写为-Alloc)、2,2,2-三氯乙氧基羰基(有时简写为-Troc)、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基羰基(有时简写为-Teoc)、9-芴基甲氧基羰基(有时简写为-Fmoc)、对硝基苄氧基羰基(有时简写为-Z(NO)

作为磺酰胺类的保护基，举出对甲苯磺酰基(有时简写为-Ts或-Tos)、2-硝基苯磺酰基(有时简写为-Ns)、2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基(有时简写为-Pbf)、2,2,5,7,8-五甲基色满-6-磺酰基(有时简写为-Pmc)、1,2-二甲基吲哚-3-磺酰基(有时简写为-MIS)等。

实施方式所述的酰胺制备方法的工序1是使下述通式(1)所示的精氨酸类与下述通式(1)’所示的卤化甲酸酯反应，得到下述通式(2)所示的混合酸酐的工序。

[化5]

(式中，R

作为烃基R

上述脂肪族烃基的碳原子数可以为1～20，也可以为1～15。

上述烷基可以是直链状、支链状和环状中的任一种。在环状的情况下，上述烷基可以是单环状或多环状的任一种。上述烷基的碳原子数可以为1～20，也可以为1～10，还可以为1～5。

作为直链状或支链状的上述烷基，举例示出甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、叔戊基、1-甲基丁基、正己基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、2,2-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、正庚基、2-甲基己基、3-甲基己基、2,2-二甲基戊基、2,3-二甲基戊基、2,4-二甲基戊基、3,3-二甲基戊基、3-乙基戊基、2,2,3-三甲基丁基、正辛基、异辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基、十九烷基、二十烷基等。

上述卤原子Y是F、Cl、Br、I等在周期表中属于第17族的元素，优选Cl或Br。

从更有效地抑制副反应的观点来看，上述通式(1)’所示的卤化甲酸酯优选上述卤原子Y为Cl或Br，烃基R

另外，工序1的反应也可以同时使用卤化甲酸酯和使卤化甲酸酯活化的N-甲基吗啉等试剂(碱)，令它们反应而使卤化甲酸酯活化，使反应更容易进行。在此，活化的卤化甲酸酯也包括在卤化甲酸酯的概念中。作为使卤化甲酸酯活化的试剂，可以举例示出叔胺、4-甲基吗啉、吡啶、吡啶衍生物、咪唑、咪唑衍生物和1,4-二氮杂双环[2,2,2]辛烷等。作为吡啶衍生物和咪唑衍生物，举出在后述工序2中所示例的物质。对于叔胺，优选与胺的N原子键合的基团中的至少一个为甲基。较优选键合在胺的N原子上的基团中的两个为甲基。由于与叔胺的N原子键合的基团中的至少一个为甲基，N原子周围的空间位阻变小，可以提高与上述卤化甲酸酯的反应效率。

<工序2>

工序2是使上述工序1中得到的上述混合酸酐与碱反应，得到阳离子性活性物质的工序。

实施方式所述的酰胺制备方法的工序2是使下述通式(2)所示的混合酸酐与B所示的碱反应，得到下述通式(4)所示的阳离子性活性物质的工序。另外，在该反应中，作为阳离子性活性物质的平衡阴离子，生成下述通式(5)所示的化合物。

[化6]

(式(4)和式(5)中，R

工序2中的所述碱是与上述酸酐反应生成阳离子性活性物质的物质，优选亲核性高的物质，较优选选自于由吡啶、吡啶衍生物、咪唑、咪唑衍生物和1,4-二氮杂双环[2,2,2]辛烷组成的组中的任意一种以上。

吡啶衍生物可以是吡啶的一个以上的氢原子被其它基团取代的物质，只要具有碱的性质即可，不受到特别限定，吡啶和吡啶衍生物优选为下述通式(3-1)所示的化合物。

[化7]

(式中，X

[化8]

(式中，R

R

作为直链状或支链状的上述烷基，举出上述R

通式(3-1)所示的化合物优选为下述通式(3-1-1)所示的化合物。X

[化9]

(式(3-1-1)中，X

当X

[化10]

作为上述吡啶和吡啶衍生物，可以举例示出吡啶、上述4-吗啉基吡啶、N,N-二甲基-4-氨基吡啶、4-吡咯烷基吡啶和4-甲氧基吡啶作为优选物质。其中，通过使用4-吗啉基吡啶和N,N-二甲基-4-氨基吡啶，单位时间内的酰胺的合成收率高，并且可显著降低副反应物的生成，从这点来看特别优选上述两种化合物。

使用上述举例示出的吡啶和吡啶衍生物时的阳离子性活性物质是酰基吡啶鎓阳离子(酰基吡啶鎓物质)。酰基吡啶鎓物质具有亲电性高的特征。因此，即使是与后述亲核性低的胺的反应，也能够以非常快的速度进行反应，并且能够显著降低副反应物的生成。

咪唑衍生物可以是咪唑的一个以上的氢原子被其它基团取代的物质，只要具有碱的性质即可，不受到特别限定，咪唑和咪唑衍生物优选为下述通式(3-2)所示的化合物。

[化11]

(式中，R

作为R

作为上述咪唑和咪唑衍生物，可以举例示出咪唑和N-甲基咪唑作为优选物质。

此外，除了吡啶、吡啶衍生物、咪唑、咪唑衍生物以外，可以举例示出1,4-二氮杂双环[2,2,2]辛烷(DABCO)作为优选物质。

<工序3>

工序3是使上述工序2中得到的上述阳离子性活性物质与胺反应而制备酰胺的工序。

实施方式所述的酰胺制备方法的工序3是使下述通式(4)所示的阳离子性活性物质与下述通式(6)所示的胺反应，得到下述通式(7)所示的酰胺的工序。

[化12]

(式(4)和式(7)中的R

另外，在上述工序2和工序3中，也可以生成醇负离子(O

上述胺优选为氨基酸或氨基酸衍生物。

上述氨基酸优选为α-氨基酸。此外，由于构成生物体内的肽或蛋白质的氨基酸通常为L型，因此上述氨基酸优选为L型。上述α-氨基酸可以是下述通式(6-1)所示的化合物。

[化13]

(式中，R

上述氨基酸可以是在生物体内构成肽或蛋白质并被编码为遗传信息的20种氨基酸。作为这些氨基酸，举出丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。此外，上述氨基酸也可为胱氨酸等未作为遗传信息编码的种类的氨基酸。

例如，上述式(1-1)中的R

当上述式(6)是氨基酸时，-R

所述氨基酸可以不是α-氨基酸。例如，也可以是β-丙氨酸等β-氨基酸。

上述胺也可以是氨基酸衍生物。氨基酸衍生物可以是具有与氨基酸实质上等同的性质的化合物，也可以是天然存在的天然型化合物，也可以是与天然型不同的具有修饰、加成、官能团的取代等改变等的化合物。

作为具有与氨基酸实质上等同性质的情况的示例，举出能够被以氨基酸为底物的酶获取、或者能够同与氨基酸结合的分子进行结合的情况。

上述胺为精氨酸或精氨酸衍生物时，优选上文中作为酰胺键形成中的羧酸表示的、侧链的两处氨基或亚氨基被保护基保护的精氨酸类。

作为氨基酸衍生物，举出在氨基酸中1个以上的氢原子或基团被除此以外的基团(取代基)取代的氨基酸衍生物。作为氨基酸衍生物的实例，举出官能团被保护基保护的保护氨基酸。作为被保护基保护的部位，可以举出选自于由氨基、羧基和侧链构成的组中的任意一种以上的部位。侧链中所含的官能团可以有一处或两处以上被保护基保护。在该工序3中，优选羧基和/或侧链的官能团被保护，以防止氨基以外的反应性官能团的反应。

作为保护基的种类，不受到特别限定，可以根据被保护的官能团的种类适当选择。羧基的保护可以仅为中和成盐的形式，但通常以形成酯的形式进行保护。作为酯，除了甲基、乙基等烷基酯以外，举出苄基酯(有时简写为Bn或BZl)等，但并不限于此。

对于实施方式的酰胺制备方法，在工序3中使上述阳离子性活性物质与胺反应。在此，由于上述阳离子性活性物质的亲电性高，因此实施方式的酰胺制备方法具有反应速度不受胺的亲核性影响的优点。

因此，实施方式的酰胺制备方法适合于与亲核性低的胺的反应。具体而言，亲核性低的胺可以是比18种氨基酸(从构成蛋白质并作为遗传信息编码的20种氨基酸中除去缬氨酸和异亮氨酸)的亲核性更低的胺，更具体而言，可以举例示出缬氨酸、异亮氨酸或N-烷基化的氨基酸或它们的衍生物。N-烷基化的氨基酸可以是键合于α碳的氨基的1个或2个氢原子被烷基取代的氨基酸，优选1个氢原子被甲基取代的N-甲基氨基酸。这些亲核性低的胺以往难以在酸酐法中用于合成。然而，根据实施方式的酰胺制备方法，即使是以往难以在酸酐法中用于合成的亲核性低的胺也可以使用，在这一点上，实施方式的酰胺制备方法也是划时代的。

在此，例如可以在实施例1所示的条件下进行混合酸酐法，使实施例1中生成的混合酸酐与想要求出亲核性的胺反应，由其反应效率的程度求出胺的亲核性。

在本实施方式中，只要考虑工序1～工序3的反应时各化合物的种类，根据目标反应适当调节各化合物的使用量即可。

羧酸与胺的反应体系内的摩尔当量比(羧酸∶胺)可以为10:1至1/10:1，也可以为5:1至1/5:1，还可以为3:1至1/3:1。根据实施方式的酰胺制备方法，相对于羧酸，即使与接近等当量的较少量胺反应的情况下，也能够高效率地制备酰胺。

在本实施方式中，各工序的反应时间只要根据反应温度等其它条件适当调节即可。作为实例，工序1的反应时间可以是0.5秒～30分钟，也可以是1秒～5分钟，还可以是3秒～1分钟。在同时进行工序2和工序3的情况下，工序2和工序3的反应时间可以为1秒～60分钟，也可以为5秒～30分钟，还可以为1分钟～10分钟。

在本实施方式中，工序1～工序3反应时的温度(反应温度)只要根据工序1～工序3中使用的化合物的种类适当调节即可。作为实例，反应温度优选为0～100℃的范围，较优选为20～50℃的范围。

在本实施方式中，工序1～工序3的反应可以在溶剂的共存下进行。上述溶剂不受到特别限定，优选不妨碍化合物的反应的溶剂，优选反应中所用原料的溶解性高的溶剂。例如举出N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、四氢呋喃(THF)、1,4-二氧六环等。

在本实施方式中，在能够实现酰胺的生成的范围内，工序1～工序3的反应在反应体系内还可以含有不属于上述举例示出的化合物的其它化合物。

在本实施方式中，工序1～工序3的反应可以分别进行，也可以同时进行。从更有效地抑制副反应物的生成的观点来看，优选同时进行工序2和工序3。

在以上说明的实施方式的酰胺制备方法中，可以通过利用NMR、IR、质谱等进行解析得到的光谱的测定、元素分析等，来确认产物的存在和结构。此外，根据需要也可以精制产物，可以通过蒸馏、提取、重结晶、柱层析等作为精制方法进行生成。

根据实施方式的酰胺制备方法，可以非常高效率地制备酰胺。即使是在工序1中得到的酸酐，也处于作为活性物质接受亲核物质(胺)的状态。在该方法中，进一步在工序2中形成阳离子性活性物质，相应于此开始与胺反应。由于此处产生的阳离子性活性物质具有比酸酐显著更高的活性，因此可以以非常快的速度进行反应。在以往的方法中，认为由于阳离子性活性物质的活性高，所以在仅用1个保护基保护侧链的情况下，很可能保护侧链的作用不充分，不能抑制副反应的生成。相对于此，根据实施方式的酰胺制备方法，作为羧酸使用的精氨酸其侧链的两处氨基或亚氨基被保护基保护，由此与以往方法相比，也能够显著抑制副产物的生成。进而，即使是与以往方法中反应困难的反应性低的胺，也能够容易地进行反应。

(第2实施方式)

实施方式的酰胺制备方法包括使侧链的两处氨基或亚氨基被保护基保护的精氨酸类同卤化甲酸酯反应后，与胺进行反应。实施方式的酰胺制备方法也可以是包括将精氨酸类同卤化甲酸酯混合而得到的混合物进行反应，再将该反应的产物与胺进行混合的方法。

该制备方法也可以包括以下工序1和工序3’。

工序1：使侧链的两处氨基或亚氨基被保护基保护的精氨酸类同卤化甲酸酯反应得到混合酸酐的工序。

工序3’：使上述工序1中得到的上述混合酸酐与胺反应制备酰胺的工序。

以下，对上述各工序进行说明。

关于与第1实施方式共通的点，在以下省略说明。

<工序1>

第2实施方式中的工序1与上述第1实施方式中的工序1相同，因此省略说明。

<工序3’>

工序3’是使上述工序1中得到的上述混合酸酐与胺反应，制备酰胺的工序。

实施方式所述的酰胺制备方法的工序3’是使下述通式(2)所示的混合酸酐与下述通式(6)所示的胺反应，得到下述通式(7)所示的酰胺的工序。

[化14]

(式中，R

在第1实施方式的酰胺制备方法中，使阳离子性活性物质与胺反应来制备酰胺。相对于此，在第2实施方式的酰胺制备方法中，使混合酸酐与胺反应来制备酰胺。

对于第2实施方式的酰胺制备方法中的反应条件等，可以将上述第1实施方式中说明的工序1～工序3的反应套用至工序1和工序3’。

在本实施方式中，工序1和工序3’的反应可以分别进行，也可以同时进行。从更有效地抑制副反应物的生成的观点来看，优选同时进行工序1和工序3’。

通过保护上述氨基或亚氨基的两处，在经由酸酐的活化条件下，包括异构化和δ-内酰胺的生成在内的副反应被显著地抑制。

根据本实施方式的酰胺制备方法，能够显著抑制副产物的生成，可以高效率地制备酰胺。虽然认为上述第1实施方式的酰胺制备方法比第2实施方式的酰胺制备方法反应速度快，但在第2实施方式的酰胺制备方法中，由于副反应被有效地抑制，因此与以往的方法(对称酸酐法)相比，能够格外高效率地制备酰胺。

<肽的制备方法>

当上述胺是氨基酸或氨基酸衍生物时，实施方式的酰胺制备方法可以合成肽或蛋白质。肽或蛋白质的制备方法包括在酰胺的制备方法中。

将上述工序3中得到的酰胺用作工序1中的羧酸，在工序1～工序3之后，进一步重复工序1～工序3，由此可以使多肽链延伸。

也就是说，作为上述羧酸，也包括多肽；作为实施方式中所述的精氨酸类(羧酸)，也包括作为多肽的构成单元位于C末端的精氨酸类(羧酸)。这样，实施方式的酰胺制备方法可以适合作为肽或蛋白质的制备方法。

<流通系反应装置>

实施方式的酰胺制备方法可以使用流通系反应装置来实施。流通系反应装置可以举例示出具备以下部件的装置：输送流体的流路，所述流体含有实施方式的酰胺制备方法的反应中使用的原料或中间体；和用于混合该流体的混合器。

以上述第1实施方式为例，对于流通系反应装置的使用，例如：至少可以在流通系反应装置中进行上述工序3中与胺的反应，也可以在流通系反应装置中进行上述工序2和工序3中与碱反应、与胺反应的反应，也可以在流通系反应装置中进行在上述工序1～工序3中侧链的两处氨基或亚氨基被保护基保护的精氨酸类同卤化甲酸酯反应后与碱反应、与胺反应的反应。

以上述第2实施方式为例，至少可以在流通系反应装置中进行上述工序3’中与胺的反应，也可以在流通系反应装置中进行上述工序1和工序3’中侧链的两处氨基或亚氨基被保护基保护的精氨酸类同卤化甲酸酯反应后与胺反应的反应。

另外，实施方式的酰胺制备方法并不限定于使用流通系反应装置来实施。例如，可以使用具有小容积和高速搅拌速度的批式容器(バッチ容器)。批式容器的混合部的体积可以为1mL～100mL，也可以为5mL～50mL。

以下，参照图1说明实施方式所述的流通系反应装置的方式以及使用该装置的第1实施方式的酰胺制备方法。

图1是表示流通系反应装置1的概略构成的模式图。流通系反应装置1具备容纳第1液体的罐11、容纳第2液体的罐12、容纳第3液体的罐13。

作为实例，第1液体可包含精氨酸类，第2液体可包含卤化甲酸酯，第3液体可包含碱和胺。作为实例，第1液体可包含精氨酸类和卤化甲酸酯的活化试剂，第2液体可包含卤化甲酸酯，第3液体可包含碱和胺。作为更具体的实例，如图1所示，第1液体含有侧链的两处氨基或亚氨基被保护基保护的精氨酸(羧酸)、N-甲基吗啉和DIEA，第2液体含有氯甲酸异丙酯，第3液体含有4-吗啉基吡啶和胺。

另外，作为第2实施方式的酰胺制备方法的情况的实例，第3液体可以含有胺。

以上述第1实施方式为例，关于流通系反应装置的使用，例如至少可以在流通系反应装置中进行第1液体和第2液体的混合物同第3液体的混合，进而也可以在流通系反应装置中进行第1液体和第2液体的混合。

流通系反应装置1具备用于输送流体的流路f1、流路f2、流路f3、流路f4、流路f5。作为实例，流路的内径可以为0.1mm～10mm，也可以为0.3mm～8mm。流通系反应装置1具备用于混合流体的混合器31、混合器32。作为实例，混合器内部的流路的内径可以是0.1mm～10mm，也可以是0.3mm～8mm。作为混合器，举出不具有驱动部的静态混合器(スタティックミキサー)。驱动部是指被赋予动力而运作的部分。

上述“流路的内径”可以是在与流路长度方向垂直相交的方向上的流路截面中流路内部分(流体通过的部分)的直径。在流路内部分的形状不是正圆形的情况下，上述流路的内径可以是将上述流路内部分的形状以面积基准换算为正圆时的直径。

作为实例，罐11、罐12、罐13、罐14、混合器31、混合器32以及流路f1、流路f2、流路f3、流路f4、流路f5由塑料或弹性体等树脂、玻璃材料、金属、陶瓷等形成。

罐11与泵21连接，通过泵21的运转，容纳在罐11中的第1液体在流路f1内移动，流入混合器31。罐12与泵22连接，通过泵22的运转，容纳于罐12的第2液体在流路f2内移动而流入混合器31。然后，第1液体和第2液体由混合器31混合而成为第1混合液，并被送至流路f4。在该混合后的过程中，第1液体中所含的羧酸与第2液体中所含的氯甲酸异丙酯发生脱水缩合，得到混合酸酐(酰胺制备方法的工序1)。得到的含有酸酐的第1混合液流入混合器32。

另一方面，罐13与泵23连接，通过泵23的运转，容纳在罐13中的液体在流路f3内移动，向混合器32流入，与第1混合液混合，成为第2混合液，再向流路f5输送。在该混合后的过程中，工序1中得到的混合酸酐与第3液体中含有的4-吗啉基吡啶反应，成为阳离子性活性物质(酰胺制备方法的工序2)，接下来，得到的阳离子性活性物质与第3液体中含有的胺反应，得到酰胺(酰胺制备方法的工序3)。制备的含酰胺的第2混合液被储存在罐14中。

通过实施方式所述的流通系反应装置1，能够增大每单位体积的反应溶液进行热交换的面积。此外，反应时间可以通过流量、流路的长度来控制。因此，能够严格控制反应溶液，从而能够使不期望的副反应的进行得以最小化，能够提高目标产物的收率。

上述工序2中得到的阳离子性活性物质由于活性度高，因此具有即使是反应性低的胺也能够反应的优点，另一方面，反应的控制变得重要。此外，即使是工序1中得到的混合酸酐，活性度也足够高，因此反应的控制变得重要。

根据实施方式所述的流通系反应装置1，通过使液体通过流路连续地流通，化合物的碰撞的机会提高，能够更高效率地进行反应，副反应的抑制也变得容易。例如，能够使工序1中产生的混合酸酐立即与4-吗啉基吡啶(碱)反应，因此能够缩短混合酸酐处于活化状态的时间，能够降低发生异构化等副反应的概率。

另外，在本实施方式所述的流通系反应装置中，举例示出了通过混合器对液体进行混合的方式，但液体的混合可以仅通过流路彼此连通来实现，因此实施方式的流通系反应装置也可以不具备混合器。

如本文所示，实施方式的酰胺制备方法可以通过液相法实施。例如，目前主流的肽(酰胺)的制备方法是固相法，在固相上合成肽。另一方面，液相法适合于大规模的合成，由于分子的自由度提高，因此反应性也良好。液相法在与反应性低的胺的反应中也发挥效果。

另外，在本实施方式所述的流通系反应装置中，将反应的5种化合物分开容纳在3个罐中，但例如也可以分别容纳在共计5个各自的罐中，依次混合。

然而，如作为上述实施方式的第3液体所示，4-吗啉基吡啶(碱)和胺优选预先存在于相同液体中。即，工序2和工序3可以同时进行，由此，容易使工序2中产生的反应性高的阳离子性活性物质立即与目标胺反应，能够缩短阳离子性活性物质处于活化状态的时间，能够有效地抑制不期望的副反应物的生成。

另外，也可以使用流通系反应装置同样地实施第2实施方式的酰胺制备方法。在这种情况下，优选卤化甲酸酯和胺预先存在于同一液体中。即，工序1和工序3’可以同时进行，由此，容易使工序1中产生的混合酸酐立即与目的胺反应，能够缩短混合酸酐处于活化状态的时间，能够有效地抑制不期望的副反应物的生成。

至此，参照化学式以及附图对本发明的实施方式进行了详细说明，但实施方式中的各结构以及它们的组合等只是实例，在不脱离本发明的主旨的范围内，可以进行结构的附加、省略、取代以及其它变更。此外，本发明不受各实施方式的限定，仅受权利要求的范围的限定。

实施例

以下示出实施例对本发明进行更详细的说明，但本发明并不限定于以下的实施例。

<实施例1>混合酸酐法·Fmoc-Arg(Cbz)

作为羧酸使用的氨基酸采用氨基被Fmoc基团保护、侧链的两处被Cbz基保护的精氨酸Fmoc-Arg(Cbz)

[酸酰胺的流动合成]

作为羧酸使用的氨基酸与作为胺使用的氨基酸进行偶联反应。偶联反应使用由PTFE制管(内径0.8mm，外径1.59mm)和T字型混合器构成的流通系反应装置。反应前的溶液分为三种进行调制。第1溶液通过将用作羧酸的Fmoc-Arg(Cbz)

为了在流动体系中进行偶联，首先，将第1溶液和第2溶液在T字型混合器中混合，在流动体系中反应5秒钟，由此得到混合酸酐。然后立即使用新的T字型混合器将含有混合酸酐的反应溶液和第3溶液混合，在流动体系中反应30秒，分配到试管中后反应约5分钟。所有这些反应均在40℃下实施，作为在各反应前的溶液到达混合器之前进行热交换所需的时间设定为20秒。各种溶液由注射泵流出，各泵的流量分别为：第1溶液1.2mL/min，第2溶液2.0mL/min，第3溶液2.0mL/min。

以下示出实施例1中酰胺制备方法的工序1的反应。

[化15]

[式中，R

以下示出实施例1中酰胺制备方法的工序2的反应。

[化16]

[式中，R

以下示出实施例1中酰胺制备方法的工序3的反应。

[化17]

[式中，R

[分析方法]

使用柱色谱法分离目标产物，通过400MHz的H

异构化率的分析使用GC-MS进行。

样品的调制如下进行。将得到的二肽的保护基除去后，将肽/氨基酸衍生物在重氢盐酸(重水素塩酸)中水解，用甲醇中的重氢化物将试样酯化，使试剂蒸发后，使用三氟乙酸酐或五氟丙酸酐将残留物酰基化。

目标产物的收率由分离纯化的目标产物的重量算出。即，将胺的摩尔当量比作为1.0，由分离的二肽的重量计算胺偶联的比例。

[结果]

得到的二肽的NMR数据如下所示。

对反应后的产物进行分析的结果，作为目标产物的二肽的偶联收率为85％，其中Arg部位异构化的比例为0.5％。

根据实施例1的方法，尽管羧酸相对于胺的摩尔当量比为1∶1，但在5分钟的短时间内获得了80％以上的高的偶联收率。此外，目标产物中所含的差向异构体的生成率为1％以下。

<比较例1>对称酸酐法·Boc-Arg(NO

作为羧酸使用的氨基酸采用氨基被Boc基团保护、精氨酸侧链被NO

[酸酰胺的流动合成]

作为羧酸使用的氨基酸与作为胺使用的氨基酸进行偶联反应。偶联反应使用由PTFE制管(内径0.8mm，外径1.59mm)和T字型混合器构成的流通系反应装置。反应前的溶液分为三种进行调制。第1溶液通过将用作羧酸的Boc-Arg(NO

为了在流通系反应装置中进行偶联，首先，将第1溶液和第2溶液用T字型混合器混合，在流通系反应装置中反应1秒钟，得到酸酐。

然后立即使用新的T字型混合器将含有酸酐的反应溶液和第3溶液混合，在流通系反应装置中反应10秒，分配到试管中后反应约90分钟。所有这些反应均在20℃下实施，作为在各反应前的溶液到达混合器之前进行热交换所需的时间设定为20秒。各种溶液由注射泵流出，各泵的流量分别为：第1溶液2.0mL/min，第2溶液1.2mL/min，第3溶液2.0mL/min。

(分析法·结果)

关于目标产物的分离，将反应溶液用酸和碱进行处理后，使用Biotage制的自动色谱柱分离，通过400MHz的H

可以分离出两种主要的化合物，一种是作为目标产物的二肽(Boc-Arg(NO

结果，为进行偶联而对羧酸进行活化得到酸酐，但偶联与副反应呈竞争性进行。由此，确认了约50％的酸酐在副反应中被消耗，作为结果，偶联效率为50％以下。

另外，在实施例1中通过混合酸酐法合成酰胺，在比较例1中通过对称酸酐法合成酰胺，虽然有这样的差异，但通过混合酸酐法生成的酰基吡啶鎓物质比通过对称酸酐法生成的对称酸酐的活性高，因此，认为即使在采用与实施例1相同的混合酸酐法的情况下，在将Boc-Arg(NO

<比较例2>对称酸酐法·Boc-Arg(Cbz)

作为羧酸使用的氨基酸采用氨基被Boc基团保护、精氨酸侧链的两处被Cbz基保护的精氨酸Boc-Arg(Cbz)

[酸酰胺的流动合成]

作为羧酸使用的氨基酸与作为胺使用的氨基酸进行偶联反应。偶联反应使用由PTFE制管(内径0.8mm，外径1.59mm)和T字型混合器构成的流通系反应装置。反应前的溶液分为三种进行调制。第1溶液通过将用作羧酸的Boc-Arg(Cbz)

为了在流通体系中进行偶联，首先，将第1溶液和第2溶液用T字型混合器混合，在流通系反应装置中反应1秒钟，得到酸酐。然后立即使用新的T字型混合器将含有酸酐的反应溶液和第3溶液混合，在流通系反应装置中在0℃下实施10秒，分配到试管中后在室温(约24℃)下反应约40分钟。对于所有这些反应，作为在各反应前的溶液到达混合器之前进行热交换所需的时间设定为20秒。各种溶液由注射泵流出，各泵的流量分别为：第1溶液2.0mL/min，第2溶液1.2mL/min，第3溶液2.0mL/min。

[分析法·结果]

用TLC展开反应溶液并分析，结果出现与原料不同的斑点(スポット)，确认了1点为产物。然而，确认了如果向反应溶液中添加水，则产物分解，原料的斑点变浓。

结果，产物为对称酸酐的可能性高，在Arg的侧链的两处导入保护基，它们生成对称酸酐，因此认为由于与胺的偶联反应和δ-内酰胺生成反应中的反应点周围体积变大，通常在作为不稳定中间体的对称酸酐的状态下反应停止。

因此，在比较例2的方法中，通过向精氨酸侧链导入两处保护基，可以抑制作为副产物的δ-内酰胺的生成反应，但偶联反应不进行，无法制备酰胺。

符号说明

1…流通系反应装置

11、12、13、14…罐

21、22、23…泵

31、32…混合器

f1、f2、f3、f4、f5…流路