低巨噬细胞粘附、活化培养装置及其用于骨髓培养的方法

技术领域：

本发明涉及新的组织培养装置，其整个内部的底部和侧壁表面覆盖有或整个装置由旨在减少巨噬细胞的粘附和促炎激活的材料组成；巨噬细胞的粘附和促炎激活会产生细胞因子(cytokines),趋化因子(chemokines),裂解酶,一氧化氮(NO)，活性氧(reactiveoxygen species或ROS)和其他吞噬或巨噬细胞产生的因子，这些因子中有许多是对造血干细胞和祖细胞有害。这些新的培养装置为创造非炎性或抗炎性的培养环境提供了物理基础；在该非炎性或抗炎性的环境中，造血干细胞可以持续数月扩增以及生产大多数类型的血球(包括红血球和巨核细胞(megakaryocytes))和造血祖细胞(progenitors)。此外，组织培养的起始细胞群可以是未纯化，半纯化或纯化的骨髓(Bone marrow或BM)，脐带血(cordblood或CB)或外周循环血液中的造血干细胞(peripheral blood stem cells或PBSC),所以无需花很长时间纯化造血干细胞或选择性清除某些不想要的白血球。这些低巨噬细胞粘附/激活(Low-Macrophage-Adhesion/Activation或“LoMAC”)的培养装置和相关的培养方法相辅相成支持造血干细胞和祖细胞在体外的长期存活和增殖。本发明具体的涉及低巨噬细胞粘附、活化培养装置及其用于骨髓培养的方法。

背景技术：

造血干细胞(hematopoietic stem cell或HSC)凭借其自我更新和分化成谱系受限祖细胞(lineage-restricted progenitors)的能力，可终生生产所有类型的血球，这些祖细胞可在终末分化之前大量增殖。尽管大多数类型的造血祖细胞的短期(1-2周)培养已变得相当容易，但要在体外维持造血干细胞超过2-3周仍然非常困难，更不用说扩增了。

最著名的长期骨髓培养方法(long-term bone marrow culture或LTBMC)是德克斯特培养(Dexter culture)方法(1)。当前德克斯特骨髓培养方法涉及两个连续步骤。第一步，先在组织培养处理的聚苯乙烯(TC-PS)培养皿或培养瓶中培养整个骨髓2-4周，以建立由巨噬细胞(macrophage)，成纤维细胞样基质细胞(fibroblasoid stromal cell；也称为间充质细胞或mesenchymal stem cell)，内皮细胞(endothelial cell)，破骨细胞(osteoclast)和成骨细胞(osteoblast)组成的粘附基质层(adhesive stromal layer)。然后，对已建立的基质层进行X射线辐射照射，以杀死所有残留的造血细胞。最后，加入第二个骨髓以提供新的起始造血干细胞和祖细胞。为了提高长期骨髓培养的寿命，基质层的建立和长期骨髓培养的维持均在33℃下进行而不是37℃。在最早期研究中，仅少数预先筛选过的马血清能够支持长期骨髓培养。后来发现，在添加10

单核细胞-巨噬细胞谱系(monocyte-macrophage lineage)以其功能表型的多样性和可塑性而著称，其中M1(也称为“促炎”或“经典激活”)和M2(也称为“抗炎”或“交替激活”)分化/激活状态仅代表其宽广的分化状态(3-5)的极端。在关于微生物感染和异物反应(foreign body reaction)过程中巨噬细胞(以及单核细胞)的激活或分化的许多研究表明，氢化可的松可以将巨噬细胞(或单核细胞)从M1促炎性激活/分化状态重编程到M2抗炎状态。M1促炎性激活/分化状态之特征在于产生促炎介质例如白血球介素-1(interleukin-1或IL-1)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α或TNF-α)；M2抗炎状态之特征则在于产生抗炎介质，例如白血球介素-10(interleukin-10或IL-10)和组织金属蛋白酶抑制-1(tissue inhibitor of metalloprotease-1或TIMP-1)(3-6)。由于M1巨噬细胞(或单核细胞或嗜中性粒细胞)分泌的许多促炎性细胞因子，趋化因子，NO和ROS对造血干细胞和祖细胞具有抑制，毒性或促凋亡作用(7-10)，因此M1至M2的激活/分化巨噬细胞(或单核细胞或嗜中性粒细胞)的转换可解释氢化可的松在长期骨髓培养中的许多有益作用。低温(33℃)总体上进一步降低了细胞(特别是巨噬细胞)的代谢和有丝分裂，从而有助于提高长期骨髓培养的寿命。

尽管上述德克斯特骨髓培养方法在非常有经验的手中可以在33℃支持数月的长期造血，但是更最常见的经验是造血干细胞和祖细胞在2-6周内迅速减少或衰竭，这通常发生在单核细胞，巨噬细胞和嗜中性粒细胞大量生产后。当骨髓培养是在37℃进行时，这种衰退更是加速。可靠的信息表明德克斯特骨髓培养系统不能支持造血干细胞更新(11)。添加造血生长因子(hematopoietic growth factors)，例如干细胞因子(stem cell factor或SCF；也称为c-kit ligand或KL)，粒细胞及巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor或GM-CSF)和白血球介素-3(interleukin-3或IL-3)并不能提高长期骨髓培养的寿命。此外，长期骨髓培养中的造血功能非常偏向白血细胞(单核细胞，巨噬细胞和嗜中性粒细胞的产生)的生成(1)。即使用高浓度的促红细胞生成素(erythropoietin或EPO)或血小板生成素(thrombopoietin或TPO)来刺激,德克斯特骨髓培养的红细胞生成功能极少超越红系爆发形成单位(burst forming unit-erythroid或BFU-E；这是在半固体培养基中可通过短期集落分析检测到的最原始的红细胞系祖细胞)的阶段；同样的,巨核细胞生成极少超越巨核细胞集落形成单位(colony forming unit-megakaryocyte或CFU-Meg；这是在半固体培养基中可通过短期集落分析检测到的最原始的巨核细胞系祖细胞)的阶段。绝大多数德克斯特骨髓培养在2-5周后，BFU-E和CFU-Meg的频率都非常低或无法检测到(12)。综上所述，这些观察结果表明传统的德克斯特长期骨髓培养的环境不利于造血干细胞或红细胞系或巨核细胞系祖细胞的存活和/或增殖。这些观察使人怀疑传统的长期骨髓培养环境会导致造血抑制性因子或细胞毒素的产生。

在研究长期骨髓培养的过程中，我们注意到长期骨髓培养造血功能的迅速下降在时间上与最初2-4周期间大量巨噬细胞，单核细胞和中性粒细胞的产生相吻合。尽管小鼠中性粒细胞在成熟后4-7天就死亡，巨噬细胞可以存活数周至数月；另外，一部分巨噬细胞保留有限的有丝分裂的能力。因此，巨噬细胞的数量和影响超过了传统长期骨髓培养中嗜中性粒细胞的数量和影响。在已经形成的长期骨髓培养中，大多数巨噬细胞牢固地粘附于组织培养表面或基质细胞的细胞外基质(extracellular matrix或ECM)。这些粘附的巨噬细胞由于细胞质中存在大量溶酶体(lysosome)，吞噬体(phagosome)，吞噬溶酶体(phagolysosome)，包涵体(inclusion body；细胞吞噬残余物)，内吞(endocytic)和分泌(secretory)性囊泡，从而显示出带有“泡沫状”细胞质的形态，他们通常展示宽广或延长(迁移)的形状。许多粘附的和非粘附的巨噬细胞可融合在一起形成多核“异物巨细胞”(foreign body giant cells或FBGC；也称为“多核巨细胞”(multinuclear giant cells或MNG)。在长期骨髓培养中，尽管存在添加的高浓度(10

鉴于大量粘附巨噬细胞和异物巨细胞的发展与长期骨髓培养中造血功能下降之间的时间相关性，我们的结论是HC无法将所有在基于聚苯乙烯(PS)的组织培养设备中建立的传统长期骨髓培养中的M1巨噬细胞转化为M2巨噬细胞或完全废除M1巨噬细胞(包括异物巨细胞)的促炎活性。这可能是因为长期骨髓培养中的单核细胞/巨噬细胞群包括了骨髓已经有的或新生的各类具有不同发展史和功能状态的单核细胞/巨噬细胞，所以反应并不一致或完整。此外，几乎所有关于巨噬细胞活化/分化的研究一向都是在组织培养处理的聚苯乙烯(tissue culture-treated PS或TC-PS)制成的组织培养装置中进行。因此，聚苯乙烯或TC-PS对巨噬细胞活化/分化的影响可能无法检测到或被轻忽了。

大多数经典活化的M1巨噬细胞粘附于聚苯乙烯组织培养表面，他们显示出宽广的或延长(具迁移性)的细胞质形状，并且拥有吞噬性。细胞的粘附，例如通过整联蛋白受体(integrin receptor)，对包括巨噬细胞在内的大多数细胞的是强烈的，有效的刺激，可以触发代谢活动，引起基因表达和分化过程的深刻变化。在尝试吞噬塑料(塑料本身代表一种“异物”)失败后，粘附的M1巨噬细胞会出现“沮丧的吞噬细胞反应”(frustrated phagocyteresponse)，在这个反应中巨噬细胞(或其他吞噬细胞)会在吞噬细胞和组织培养塑料表面之间分泌大量水解酶，酸，NO和ROS，以试图在细胞外消化异物(15)。巨噬细胞也可融合在一起形成大的多核异物巨细胞，以摄入或吞噬大(>10微米)的异物。在含有10

上面概述的程序为长期骨髓培养在大量粘附和非粘附巨噬细胞发展后造血干细胞和祖细胞下降提供了潜在的解释。巨噬细胞和其他细胞(例如单核细胞，嗜中性粒细胞和成纤维细胞)对组织培养皿表面的粘附取决于已吸附到组织培养皿表面的各种血清蛋白，例如纤维蛋白原(fibrinogen)，纤连蛋白(fibronectin)，玻连蛋白(vitronectin)，免疫球蛋白(immunoglobulins)，补体(complements)和白蛋白(albumin)。通常聚苯乙烯(及组织培养处理的聚苯乙烯)是通过疏水，亲水和离子性相互作用与蛋白质相互作用吸附。不同的烃类聚合物(hydrocarbon polymers)对不同的血清蛋白有不同的亲和及吸附力，这些组织培养皿表面吸附的蛋白的差异进一步会影响巨噬细胞的粘附和/或活化和/或分化(16、17)。大多数组织培养装置均由经过氧离子体(oxygen plasma)或其他材料(例如蛋白肽，蛋白质和细胞外基质)处理的聚苯乙烯制成，目的是使其带更多负电荷和更亲水性，以结合更多的蛋白质，最终目标都是为了增加细胞粘附。一些实验已经确实表明，在相对亲水性更高的组织培养处理过的聚苯乙烯表面培养的单核细胞主要经历M1激活/分化，并分泌促炎性细胞因子和活跃的吞噬作用，而在未处理，疏水性相对较强的聚苯乙烯表面培养的单核细胞则大部分经过M2分化，分泌抗炎细胞因子，且无吞噬作用(17)。最后，我们不能排除某些化学特征(例如PS或TC-PS的重复酚环)可能通过模式识别受体(pattern recognitionreceptors)而有助于巨噬细胞激活/分化的可能性。几乎所有关于M1与M2激活/分化的研究都将聚苯乙烯(或组织培养处理过的聚苯乙烯)的培养表面视为无关的惰性物质，尽管实际上它对巨噬细胞而言是一个非常重大的“异物”，必须通过吞噬或细胞外消化(extracellular digestion)(即所谓的”异物巨细胞反应”)消解掉。

一个测试组织培养表面对巨噬细胞粘附/激活及对造血作用的影响的方法是用培养表面与TC-PS在亲水性，蛋白质结合，电荷和细胞粘附方面与聚苯乙烯非常不同的组织培养装置来进行骨髓培养。在这一点上，聚乙烯(polyethylene或PE；也称为polyethene)(18)只由与氢原子连接的碳原子线性链([-CH2-CH2-]n)组成，没有任何其他原子或化学键(19)。聚乙烯(PE)与蛋白质的相互作用仅通过疏水相互作用，而聚苯乙烯(TC-PS)主要是通过亲水相互作用与蛋白质结合。因此，我们可以预期它们具有非常不同的蛋白质吸附特性。一般来说，聚乙烯对蛋白质的亲和力低于聚苯乙烯。一些估计将聚乙烯的蛋白质结合能力确定为聚苯乙烯的一半至十分之一。实际上，聚乙烯是自然界最简单的烃类聚合物，也是生产替代性组织培养设备的候选材料，因其对蛋白质的结合和巨噬细胞的粘附/激活的可能性很低。然而，由于聚乙烯有(厚薄有关的)不透明性，柔软性，低蛋白质/细胞结合力和成型麻烦的特性，一直被认为不适合制作组织培养皿或簇板(cluster plate；也称为多孔板)或培养瓶(flask)。另一方面，聚苯乙烯由于其透明性，刚度，优异的成型特性，高蛋白结合能力和方便的照射灭菌，被几乎所有当前的组织培养皿或簇板或培养瓶的制造商采用。聚苯乙烯制成的组织培养设备通常经过“组织培养处理”(例如，通过在大气中进行电晕放电corona discharge或在真空下通过氧(O2)等离子体(oxygen plasma)将更多的O2掺入聚苯乙烯中，从而使其组织培养表面变为亲水性且带负电荷)或通过涂覆多肽(例如聚赖氨酸polylysine，或精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸arginine-glycine-aspartic acid或RGD)或蛋白质(例如胶原蛋白collagen，纤连蛋白fibronectin，玻连蛋白votronectin)或细胞外基质(extracellular matrix)成分，以进一步增强细胞粘附。相反的，由于聚乙烯的低蛋白质和细胞结合能力，(厚度有关的)不透明性，柔软性和成型麻烦，因此它从未用于生产组织培养皿，簇板(多孔板)或培养瓶。

注，本发明涉及引用的文献：

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发明内容：

本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺点，提供一种结构简单，使用方便的具有高度的透明度和形状保持性的低巨噬细胞粘附、活化培养装置及其用于骨髓培养的方法。

本发明是一种低巨噬细胞粘附、活化培养装置，其中，该装置使用与巨噬细胞粘附和刺激巨噬细胞促炎活性的能力低于聚苯乙烯(或经组织培养处理的聚苯乙烯)75％至100％的材料所制成的细胞培养皿，该装置为拥有2至96个相同培养孔的细胞培养簇板或细胞培养瓶；其中每个培养皿或培养孔的底部的内直径为6至150毫米，每个培养皿或培养孔或培养瓶不仅作为细胞培养装置的容器，同时也可贮存大量的培养基。

进一步的，该装置由密度为0.91至0.94克/毫升的低密度聚乙烯所制成。

进一步的，该装置由聚(4-甲基-1-戊烯)所制成。

进一步的，该装置由低密度聚乙烯和聚(4-甲基-1-戊烯)以外的聚烯烃(polyolefins)或聚烯烃共聚物(polyolefin copolymers)所制成。

进一步的，该装置作为培养皿时，具有超深皿的结构特征，使得侧壁高度与底部的内直径之比大于一般培养皿之高度对底部内直径比:若直径为150毫米的培养皿，此比应等于或大于0.2；若直径为100毫米的培养皿，此比应等于或大于0.25；若直径为60毫米的培养皿，此比应等于或大于0.4；若直径为35毫米的培养皿，此比应等于或大于0.5，以便容纳比一般培养皿更多的培养基，以提供大量细胞所需要的营养及酸碱缓冲的能力，并且减少在更换培养基时对培养皿底部细胞的干扰。

进一步的，该装置中所有可能与细胞接触的培养装置的内表面均覆盖有50至300微米厚的薄膜，此薄膜是用与巨噬细胞粘附和刺激巨噬细胞促炎活性的能力低于聚苯乙烯(或经组织培养处理的聚苯乙烯)75％至100％的材料所制成的。

进一步的，该装置内表面覆盖有密度为0.91至0.94克/毫升的低密度聚乙烯薄膜。

进一步的，该装置内表面覆盖有聚(4-甲基-1-戊烯)的薄膜。

进一步的，该装置内表面覆盖有除了低密度聚乙烯和聚(4-甲基-1-戊烯)以外的聚烯烃或聚烯烃共聚物的薄膜。

进一步的，该装置具有可移动的50至300微米厚，柔软的，非透水薄膜袋插入物，每个薄膜袋的顶部都有一个带孔的顶棚或带环形固定襟翼的开口，每个薄膜袋的尺寸适合插入具有2到96个群集孔的簇板中的单个培养皿或单个培养孔；每个薄膜袋是用与巨噬细胞粘附和刺激巨噬细胞促炎活性的能力低于聚苯乙烯(或经组织培养处理的聚苯乙烯)75％至100％的材料所制成；并且其中所述薄膜袋未使用任何物理或化学方法结合到顶棚或襟翼以下的任何刚性支撑结构，以将所述薄膜袋的刚硬性和张力降至最低。

进一步的，所述薄膜袋由密度为0.91至0.94克/毫升的低密度聚乙烯制成。

进一步的，所述薄膜袋由聚(4-甲基-1-戊烯)制成。

进一步的，所述其薄膜袋由除低密度聚乙烯和聚(4-甲基-1-戊烯)以外的聚烯烃或聚烯烃共聚物制成。

为更好的实现本发明目的，本发明又公开了一种使用本发明的低巨噬细胞粘附、活化培养装置用于骨髓培养的方法，该方法包括以下步骤：

a)将造血细胞以一个细胞至五百万个细胞每毫升的细胞密度加入适当体积的培养基中；

b)加入有效量的氢化可的松或糖皮质激素(glucocorticoid)以抑制促炎性巨噬细胞活化，并加入有效量的c-kit配体和血小板生成素(thrombopoietin)，以及造血干细胞和祖细胞存活和增殖所必需的其他物质；

c)将细胞/培养基混合物转移至权利要求1-13中任一项的装置；

d)在合适的空气，二氧化碳，饱和湿度及摄氏37度或其他温度下，在组织培养箱中孵育培养装置中的细胞/培养基混合物；

e)每隔1至3天用新鲜培养基替换一半至四分之一的培养基，尽量减少干扰培养装置底部的细胞；

f)每隔5或更多天或当细胞过度拥挤时以1：2划分比例继代培养细胞；

g)避免不必要的培养操作或干扰。

进一步的，该方法能够使造血干细胞和祖细胞在低巨噬细胞粘附/激活环境中连续增长扩增260天或更久。

我们寻求通过使用与一般常用的所谓”组织培养处理”过的聚苯乙烯(tissueculture-treated polystyrene或TC-PS)有非常不同的蛋白质结合(protein binding)特性的聚合物所组成或覆盖的组织培养装置来减少在长期骨髓细胞培养时所遭遇到的巨噬细胞的粘附和活化。这些巨噬细胞的粘附和活化取决于培养装置吸附的蛋白质并且对骨髓培养有抑制作用或不利影响。所述聚合物包括聚乙烯(polyethylene或PE)和其它聚烯烃(polyolefins)。这些聚合物(聚乙烯和其它聚烯烃)主要是通过疏水性相互作用(hydrophobic interactions)来与蛋白质结合。相反的，一般所谓组织培养处理过的聚苯乙烯主要是通过亲水性(hydrophilic)和离子性(ionic)相互作用来与蛋白质结合。因此，相较于聚苯乙烯(或组织培养处理过的聚苯乙烯),聚乙烯和其它聚烯烃结合不同种类的,而且很低量的蛋白质。此外，聚乙烯不含有类似聚苯乙烯的酚环(phenolicring)或其它化学特征，这些多余的化学特征可能进一步增加蛋白质结合以及巨噬细胞的粘附/活化。我们使用这些新的,低蛋白结合的培养装置开发了显著不同的长期骨髓培养，所谓的"低巨噬细胞粘附/活化"骨髓培养(Low-Macrophage-Adhesion/Activation Bone Marrow Culture,缩写为“LoMAC BM Culture”).

在本申请中，我们使用新开发的聚乙烯包被的组织培养装置或完全由聚乙烯样材料(例如其他聚烯烃或其共聚物)制成的装置来进行截然不同的长期骨髓培养，这些新组织培养装置旨在减少巨噬细胞的粘附/活化，但同时保留造血干细胞和祖细胞的一些粘附。为了避免在骨髓细胞的培养和操作过程中巨噬细胞的意外或短暂激活，组织培养装置的整个底部和侧壁表面都覆盖有一层聚乙烯(100-200微米)薄膜。或者，整个装置由类聚乙烯(就原子组成，疏水性，蛋白质结合而言)的材料制成，这些类聚乙烯具有较高的透明度和形状保持性，例如聚(4-甲基-1-戊烯)(poly-4-methyl-1-pentene或PMP)。如以下实例所证实，巨噬细胞与聚乙烯(或其他聚烯烃)培养物表面的粘附性很低，并且没有像在聚苯乙烯或组织培养处理的聚苯乙烯培养物表面上那样有效地促炎性活化，也没有吞噬性。绝大多数骨髓培养实验包括了氢化可的松(HC)以进一步抑制巨噬细胞的促炎激活。在这种独特的“低巨噬细胞粘附/活化”(low-macrophage-adhesion/activation,缩写为LoMAC)培养环境中，造血干细胞和祖细胞可以在完全没有基质层(stromal layer)的情况下维持和扩展数月。重要的是，如果将已经成立的LoMAC骨髓培养物转移至通常使用的聚苯乙烯或组织培养处理的聚苯乙烯培养设备，造血作用立即迅速下降，由此证明了聚苯乙烯或组织培养处理的聚苯乙烯是长期骨髓培养造血作用下降的关键因素。有重大意义的是，在小鼠LoMAC骨髓培养中，新生(de novo)红细胞和巨核细胞持续不断生成。这种程度的新生红细胞生成和巨核细胞生成从未在使用组织培养处理的聚苯乙烯培养设备的传统长期骨髓培养中发生。实际上，在聚乙烯包被的培养装置中建立的小鼠LoMAC骨髓培养中常见的祖细胞(HSC，BFU-E，CFU-Meg)和成红细胞和巨核细胞前体(erythroid and megakaryocytic precursors)正是传统小鼠长期骨髓培养中所缺少的。使用其他具有超低细胞结合力的组织培养装置的进一步观察表明，全面抑制细胞粘附本身不足以为体外长期造血创造适当的环境。培养表面的化学性质也很重要。

本发明涉及新的组织培养装置(例如，培养皿，簇板，培养瓶，培养管，培养袋和生物反应器)，其中底部和侧壁均覆盖有低密度聚乙烯(low-density polyethylene或LDPE)或线性低密度聚乙烯(linear low-density polyethylene或LLDPE)的目的是减少巨噬细胞(以及单核细胞和嗜中性粒细胞)的粘附和促炎激活/分化，以及随后产生的对造血干细胞和祖细胞有害的促炎介质。或者，整个装置是由聚烯烃制成的，这些聚烯烃具有类似聚乙烯的特性，例如疏水性和低蛋白质/细胞结合力，但具有高度的透明度和形状保持性。

附图说明：

图1是可移动的单孔(single well)LDPE插入件，顶部有带孔的顶棚。

图2是可移动的单孔LDPE插入件，顶部有环形固定襟翼。

图3是带有6个深孔和连接这些孔的平顶的可移动6簇孔LDPE插入件。

图4示出了具有“超深培养皿”设计的三种不同尺寸的培养皿，其中底部和侧壁培养表面均被LDPE覆盖，或者整个培养皿由透明的刚性聚烯烃例如PMP制成。

图5比较了OP-9成纤维细胞基质细胞在PS或TC-PS(即经”组织培养处理”的PS)或PE培养表面的粘附力。

图6比较了巨噬细胞样的WEHI 3B细胞在PS或TC-PS或PE培养表面的粘附力。

图7比较了巨噬细胞样的WEHI 3B细胞在TC-PS或PE包被的组织培养装置中0-21天的生长曲线。

图8比较了小鼠骨髓在TC-PS或PE包被的组织培养装置中培养0-48天的生长曲线。

图9中的图9A是小鼠骨髓在传统TC-PS组织培养皿中培养的第18天的相差显微照片；图9B是小鼠骨髓在PE包被的组织培养皿中培养的第18天的相差显微照片。

图10比较了在TC-PS或PE包被的培养皿中培养的小鼠骨髓在培养12日后巨噬细胞与包涵体(吞噬作用后残留的碎物)的百分比。

图11比较了在有或没有氢化可的松的情况下在TC-PS或PE包被的培养孔中培养的小鼠骨髓培养物中TNF-α的浓度。

图12比较了小鼠骨髓在TC-PS或PE包被的培养装置中培养了0、12、24和36天后的CAFCd35的数目。

图13比较了使用比图12中的培养物更多的起始细胞和更少的采样的小鼠骨髓在具有TC-PS或PE包被的组织培养设备中培养了0、28和56天后的CAFCd35的数目。

图14比较了5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)化疗剂注射后第5天取得的小鼠骨髓在TC-PS或PE包被的组织培养装置中培养了0、12、24和36天后的CAFCd35的数目。

图15中的图15A显示小鼠骨髓LoMAC培养物在没促红细胞生成素刺激下培养160天后的Wright-Giemsa染色的细胞形态；图15B显示小鼠骨髓LoMAC培养物在培养160天并经过促红细胞生成素刺激16天后的Wright-Giemsa染色的细胞形态。

图16比较了小鼠骨髓LoMAC培养物在培养260天后被转移至TC-PS或PE涂覆的培养装置之后的生长曲线。

图17中的图17A是人类骨髓LoMAC培养物在培养80天后的相差显微照片，所示为仅具有巨噬细胞的区域；图17B是人类骨髓LoMAC培养物在培养80天后的相差显微照片，显示了具有巨噬细胞和活跃造血功能的区域；图17C是人类骨髓LoMAC培养物在培养100天后的相差显微照片，显示了(大部分是非粘附的)巨噬细胞和成千上万的凋亡小体(apoptoticbody)。

具体实施方式：

以下实施例描述了在“低巨噬细胞-粘附/激活”培养环境中连续数月持续造血和扩增造血干细胞和祖细胞的相关方法。

图1-图4中：

LDPE插入件的底部11，该插入件可植入相配套的6孔簇板的每个培养孔内。

LDPE插入件的侧壁12，该插入件可植入相配套的6孔簇板的每个培养孔内。

LDPE插入件的带孔顶棚13，该插入件可植入相配套的6孔簇板的每个培养孔内。

LDPE插入件顶棚的开口14，该插入件可植入相配套的6孔簇板的每个培养孔内。

有顶部环形固定襟翼的LDPE插入件的底部15，该插入件适合植入相配套的6孔簇板的每个培养孔。

有顶部环形固定襟翼的LDPE插入件的侧壁16，该插入件适合植入相配套的6孔簇板的每个培养孔。

LDPE插入件顶部的环形固定襟翼17，该插入件适合植入相配套的6孔簇板的每个培养孔。

六簇孔LDPE插入物的之一孔的底部18，该插入件适合植入相配套的6孔簇板。

六簇孔LDPE插入件的扁平顶部连接膜19。

由PS制成的具有“超深培养皿”设计的60毫米培养皿的侧壁，以及覆盖底部和侧壁培养面的LDPE膜20。或者，整个培养皿可以由透明的刚性聚合物制成，该聚合物应具有类似于LDPE的蛋白质和细胞结合特性，例如PMP。

具有“超深培养皿”设计的60毫米培养皿的盖子21。盖子可由任何透明的刚性聚合物(例如PS)制成。

图1是可移动的单孔(用于6孔板)LDPE插入物(厚度为100-200微米)，顶部有带孔的顶棚。带孔的顶棚有助于保持插入物的整体形状，并减少培养基的蒸发。顶棚是与其他塑料材料(例如PS，PE或聚丙烯(PP；polypropylene))层压或粘在一起，以提高其刚性和耐用性。mm＝毫米。

图2是可移动的单孔(用于6孔板)LDPE插入件(厚度为100-200微米)，顶部带有环形固定襟翼。环形固定襟翼是与其他塑料材料(例如PS，PE或PP)层压或粘在一起，以提高其刚性和耐用性。mm＝毫米。

图3是带有6个深孔的可移动6簇孔LDPE插入物(厚度为100-200微米)。每个孔的深度约为22.5毫米，以便容纳更多的培养基，并在频繁更换培养基时将底部细胞的干扰或损失降至最低。孔之间的扁平连接顶部是与其他塑料材料(例如PS，PE或PP)层压或粘在一起，以提高其刚性和耐用性。6簇孔插入件可安装在带有深孔的相配套6孔板(PS或TC-PS)内，并且可以保持可移动或通过粘合剂固定在6孔簇板上。mm＝毫米。

图4显示了具有“超深培养皿”设计的三种不同尺寸(直径分别为35、60和100毫米)的PS培养皿，其中底部和侧壁培养面均覆盖有LDPE或LLDPE(厚度为100-200微米)。“超深培养皿”设计的培养皿高度与底部直径之比必须大于0.2，以允许使用更多的培养基，以提供更多的营养和缓冲能力，避免污染并减少在媒体交换时底部造血细胞的干扰和损失。所示的35毫米，60毫米和100毫米直径培养皿的实际比例分别为0.51、0.42和0.32。另外，整个超深培养皿也可以由烃类聚合物(hydrocarbon polymer)注塑成型，使用的聚合物必须具有与LDPE相似的蛋白质结合和细胞粘附特性，但具有更好的透明度和形状保持性，例如聚(4-甲基-1-戊烯)(PMP)。所示尺寸均为外部尺寸。mm＝毫米。

图5是比较OP-9成纤维细胞基质细胞在PS或TC-PS或LDPE培养表面上的粘附的条形图。实验步骤是将总共4x10

图6是比较WEHI 3B巨噬细胞样细胞在PS或TC-PS或PE培养表面上的粘附的条形图。实验步骤是将3.0x10

图7比较的是WEHI 3B巨噬细胞样细胞在具有TC-PS或PE(LDPE)培养表面的装置中的生长曲线。实验步骤是将0.5x10

图8比较了在TC-PS(对照组；虚线)或PE(LDPE)包被的(实线)培养孔中培养的骨髓的生长曲线。每个骨髓培养都是用20周龄雄性C57BL/6小鼠的骨髓细胞(2.2x10

图9A，图9B，显示了在TC-PS或PE包被的组织培养装置中建立的小鼠骨髓培养物的相差显微照片。图9A是在TC-PS培养孔中建立的对照培养物在培养的第18天的相差显微照片。标记为“Mac”(macrophage)的是具有良好细胞质扩散的三个粘附巨噬细胞。“FBGC”(foreign body giant cell)标签标识异物巨细胞。中小圆形折光性细胞是单核细胞，嗜中性粒细胞和祖细胞。图9B是在LDPE包被的培养孔中建立的LoMAC培养物在第18天的相差显微照片。巨核细胞标记为“Meg”(megakaryocyte)，巨噬细胞标记为“Mac”。剩余的中小圆形折光性细胞是在各种分化阶段的单核细胞，嗜中性粒细胞和祖细胞。值得注意的是，具有广泛分布的细胞质的贴壁巨噬细胞或FBGC在LoMAC培养物中是极为罕见的。比例尺长＝50微米。

图10是在TC-PS或PE包被的培养装置中建立的小鼠骨髓培养物在培养12日后含有包涵体(作为吞噬活性的衡量)的巨噬细胞的百分比的比较。在LoMAC培养物中PE显着降低了既存骨髓巨噬细胞的吞噬活性，并且几乎完全防止了新产生的巨噬细胞的吞噬活性(参见下面的图15A和图17C)。％with Inclusion Bodies＝有包涵体的百分比。TC-PS＝组织培养处理的聚苯乙烯Tissue culture-treated polystyrene；PE＝聚乙烯Polyethylene(LDPE)。数据是根据一式三份测定。

图11条形图比较了在有(+HC)或没有氢化可的松(-HC)的TC-PS(组织培养处理的聚苯乙烯Tissue culture-treated polystyrene)或PE(聚乙烯聚乙烯Polyethylene；LDPE)包被的培养装置中培养12天后的小鼠骨髓培养物的(3天)养成基中的TNF-α水平(通过ELISA确定)。LDPE和HC均可降低TNF-α的产生。数据是根据一式三份测定。

图12比较在有TC-PS或PE(LDPE)包被的培养表面的6孔板中培养的小鼠骨髓在第0、12、24和36天后的CAFCd35的数量。每种培养始于1.0x10

图13比较在TC-PS或PE包被的培养装置中培养的小鼠骨髓在第0、24和56天的CAFCd35数目。这些培养物由来自20周龄(即身体更大)的雄性C57BL/6小鼠，而且还用了更多的骨髓细胞(每孔2.2×10

图14是比较在有TC-PS或PE包被的6孔培养板中培养的(经5-氟尿嘧啶注射后)小鼠骨髓在培养0、12、24和36天后的CAFCd35的数量。所使用的C57BL/6小鼠在采集骨髓前5天，在腹腔内注射了5-氟尿嘧啶(剂量是150毫克/公斤体重)。5-氟尿嘧啶杀死了所有快速细胞分裂的骨髓细胞，但保留了静止的或不分裂的细胞，例如骨髓干细胞。每个培养物均以等同于一根骨头(每个股骨或胫骨均视为一根骨头)经5-氟尿嘧啶注射后的骨髓启始使，用6毫升IMDM/RPMI(1：1混合液)培养基补充了20％(体积/体积)HS，5x10

图15A，图15B，显示了160天龄(即培养了160天后)的骨髓LoMAC培养物在用促红细胞生成素(EPO；2单位/毫升)刺激16天之前(图15A)和之后(图15B)的细胞形态。在图15A中，两个大的巨核细胞(一个成熟，另一个还在发育)标记为“Meg”(megakaryocyte)，两个大的巨噬细胞标记为“Mac”(macrophage)。成熟的巨核细胞(具有苍白的细胞质)的核倍数约为32N(一般细胞的核倍数为2N)。请注意，LoMAC培养物中的巨噬细胞均不含包涵体，表明他们完全没有吞噬作用。图15B显示了用EPO刺激16天后的培养物。标记为“EB”的是一大群小的带凝结核的正色红细胞(位于顶部中心)和六个嗜碱性成色红细胞(位于左侧边缘)。培养物中约50％的细胞是属于红细胞系列。标记为“Meg”的是大型成熟巨核细胞。位于中心的巨核细胞的核倍数为32N或更高。培养物中约10-15％的细胞是在各分化阶段的巨核细胞，不管有或没有EPO的刺激。所示为Wright-Giemsa染色的细胞形态。比例尺长＝25微米。

图16比较了小鼠骨髓LoMAC培养物在培养260天后被转移至TC-PS或PE涂覆的培养装置后的新生长曲线。(在260天，该LoMAC培养物已按1：2的比例进行了60次亚培养(即2

图17A，图17B，图17C，是80天龄(或100天龄的)的人类骨髓LoMAC培养物的显微照片，其显示了仅巨噬细胞区域(图17A；80天龄)，巨噬细胞加上活性造血区域(图17B；80天龄)以及巨噬细胞加上许多小的凋亡小体(图17C；100天龄的培养物)。由于完全没有巨噬细胞提供的吞噬作用，所有凋亡小体(每个凋亡小体代表经由apoptosis机制死亡的细胞)在数周和数月后仍未被消化，他们常常形成稠密，完全脱水的凋亡细胞的汇合片。请注意，图17C中有许多巨噬细胞，其细胞表面布满了凋亡小体，但是没有任何吞噬活动的迹象。Mac＝巨噬细胞群Macrophage。比例尺长＝50微米。

本发明中所用各种术语的定义:在本文中造血干细胞(Hematopoietic Stem Cell或HSC)是指在体内具有造血谱系所有潜能和长期繁殖能力的造血干细胞。造血干细胞可以通过体外培养第35天“鹅卵石形成区域的细胞”(cobblestone area-forming cell day 35或CAFCd35)分析或通过体内骨髓移植研究进行枚举。术语“鹅卵石区域”是指紧密堆积成类似于堆积在一起的鹅卵石的相暗(phase-dark)祖细胞样细胞(blast cells)的细胞群或斑块(patch)。科学家们同意每个鹅卵石区域应包含5到100,000个相暗祖细胞样细胞。在本申请提供的实际例子中的数据，我们排除了少于8个相暗细胞的鹅卵石区域。因此，我们的数据是用比一般更严格更严格的标准计算。术语“造血祖细胞”是指HSC后代具有有限谱系潜能的半分化细胞，它们在完成终末分化之前可以进一步增殖。“淋巴样”(lymphoid)的细胞是指诸如B淋巴细胞，T淋巴细胞，自然杀伤(natual killer或NK)细胞，NKT细胞及其祖先。“髓样”(myeloid；相对于lymphoid)细胞是指是指除淋巴谱系以外的所有造血谱系细胞。在某些情况下，术语“髓样”也可用于表示单核细胞/巨噬细胞和嗜中性粒细胞谱系，以与“类红细胞”(erythroid)谱系形成对比。“粒细胞”包括嗜中性粒细胞(neutrophil)，嗜碱性粒细胞(basophil)，肥大细胞(mast cell)和嗜酸性(eosinophilic)细胞，它们包含嗜中性或嗜碱性或嗜酸性细胞质颗粒。“促红细胞”是指没有完成所有终末分化过程如血红蛋白合成或去核的有核类红细胞前体。“MNC”代表“单核细胞”，通常是血液，骨髓或脾细胞通过密度梯度离心(例如NYCODENZ和FICOLL-HYPAQUE(密度＝1.077克/毫升))分离而获得的，并且密度低于1.077克/毫升。它们包括HSC，祖细胞，单核细胞，巨噬细胞和淋巴细胞，但不包括成熟红细胞(RBC)，中性粒细胞或其他粒细胞，这些后者的密度均大于1.077克/毫升。“吞噬细胞”(phagocyte)是指能够吞噬的白细胞，包括巨噬细胞，单核细胞和嗜中性白细胞。巨噬细胞在正常的生理和病理状态中起着许多作用，并具有根据环境分化为具有不同表型的细胞的能力。巨噬细胞的“激活”或“激活/分化”通常是指响应感染或其他刺激而导致巨噬细胞功能的进一步变化或分化,然后产生促炎性细胞因子(例如TNF-α，IL-1，IL-6，IL-12)，趋化因子(例如IL-8，巨噬细胞抑制蛋白-1α或MIP1α，MIP1β)和酶(例如基质金属蛋白酶或MMP)。这样的巨噬细胞常被描述为“M1”巨噬细胞或“经典激活的”巨噬细胞。吞噬作用是M1巨噬细胞的重要功能。某些细胞因子和激素(例如氢化可的松)可以将巨噬细胞分化从促炎状态(M1)重新定向到“M2”(也称为“抗炎”或“替代激活”)状态，M2状态的特征是促炎介质的产生减少而促进愈合和组织修复的因素(例如精氨酸酶或arginase，转化生长因子-β或TGFβ，血管内皮生长因子-α或VEGFα，成纤维细胞生长因子或FGF，血小板衍生生长因子或PDGF，胰岛素样生长因子-1或IGF-1)产量增加。(3-5)

以下是本领域中用于各种类型的造血细胞的常用术语和缩写。HSC：造血干细胞。CMLP：骨髓淋巴双谱系祖细胞；CLP：共同淋巴样祖细胞；CFU-GEMM：粒细胞，红细胞，巨噬细胞，巨核细胞共同集落形成单位；BFU-E：红系爆发形成单位；CFU-EM：红系及巨核细胞共同集落形成单位；CFU-Mk：巨核细胞集落形成单位；CFU-E：红系集落形成单位；CFU-GM：粒细胞及巨噬细胞共同集落形成单位；CFU-G：粒细胞集落形成单位；CFU-M：巨噬细胞(或单核细胞)集落形成单位。此申请中使用以下造血生长因子的缩写：KL代表c-kit-配体，也称为干细胞因子或steele因子。EPO代表促红细胞生成素；TPO代表血小板生成素，也称为mpl配体；GM-CSF代表粒细胞及巨噬细胞集落刺激因子；G-CSF代表粒细胞集落刺激因子；M-CSF代表巨噬细胞集落刺激因子。总有核细胞(total nucleated cells或TNC)计数是通过在3％乙酸/0.1％亚甲蓝(methylene blue；可强烈地染细胞核)染色细胞悬液来确定的。它包括所有具有核的细胞，但不包括成熟的红细胞和血小板。粗(未纯化)BM或全BM是指从骨髓腔中收获的所有BM细胞。BM或外周血(PB)或脐带血(CB)MNC是指在诸如NYCODENZ或FICOLL-HYPAQUE的溶液上通过密度梯度离心法获得的BM或CB或PB的轻密度(<1.077公克/毫升)MNC。富集的BM，CB或PB是指已通过诸如密度梯度离心，基于抗体的净化或富集，基于磁珠分离和荧光激活细胞分选(fluorescence-activated cell sorting或FACS)等技术富集到的BM，CB或PB细胞)。ELISA是“酶联免疫吸附测定”(enzyme-linked immunosorbent assay)的缩写。

术语“组织培养装置”是指单独的组织培养皿(或培养碟)，多孔簇板(例如6孔，12孔，24孔，48孔，96孔等)，培养瓶，培养管，培养袋和其他组织培养容器(例如生物反应器)。术语“培养表面”是指在培养或操作(例如进料，移液和洗涤)过程中与细胞或培养基暂时或永久接触的所有组织培养表面。它可能包括组织培养装置的整个底部加上侧壁，但通常不包括培养皿或培养瓶的盖子。如果用于培养瓶，则包括在正常操作中可能与培养基或细胞接触的所有内表面。

术语“烃”(hydrocarbon)是指仅包含氢和碳原子的分子。术语“烯烃”(olefin；字意是“形成油的”)，也称为“alkene”，是指天然存在的包含两个或多个碳原子和一个或多个碳原子之间的双键的烃。烯烃是不饱和烃的实例。最简单的烯烃是乙烯(H2C＝CH2)，是在石油或天然气中发现或衍生自石油或天然气的气体。乙烯可以通过C＝C双键聚合形成聚乙烯(PE)，这是世界上产量最高的塑料。PE是“聚烯烃”的实例，其还包括聚丙烯(PP)和聚(4-甲基-1-戊烯)(PMP)。在此用的术语“聚烯烃”(polyolefins)是指烯烃的聚合物及其共聚物(copolymers)。聚烯烃整体上具有许多相似的特性，例如高疏水性，耐化学性和低润湿性，但其他属性可能很大不同。例如，PE和PP不是很透明而PMP是透明的。PE，PP和PMP也具有不同的成型特性。低密度聚乙烯(LDPE)具有高度的短支链和长支链，密度范围为0.910-0.940公克/毫升。LDPE的抗拉强度较低，但延展性较高。线性低密度聚乙烯(LLDPE)是一种相对线性的聚合物，但短支链较少，密度范围为0.915-0.925公克/毫升。LLDPE比LDPE具有更高的拉伸强度，抗穿刺性和透明度。高密度聚乙烯(HDPE；密度＝0.930-0.970公克/毫升)具有很少的支链和高的拉伸强度。非常广泛使用在组织培养装置的非聚烯烃塑料是聚苯乙烯(PS)，它是苯乙烯的聚合物。PS由长链烃组成，其中交替的碳原子连接到六边形苯基(苯环)，而不是PE中的氢原子。

几乎所有目前使用的塑料组织培养皿，多孔培养簇板和培养瓶都是通过聚苯乙烯注塑制成的，其培养表面进一步用电离氧等离子体处理，以将许多O2掺入聚苯乙烯中，目的是增加其亲水性和负电荷因此具有更高的蛋白质结合能力，从而达到更高的细胞粘合能力。

实施例使用的材料和方法。

制备PE膜包被的组织培养装置。

为了制备有PE膜包被的6孔簇板，我们通过金属模具及模具穹顶的开口施加的真空，将模压LDPE或LLDPE膜(厚度为100-200微米)加热成型。成品包括单个(图1和2)或每块6个(图3)插入物，成型后包被膜与单个培养皿或带有深孔的6孔簇板的孔的形状和内部尺寸相匹配。该成型方法基本上与自1957年以降用于制造BUBBLE WRAP密封空气半球形气泡的部分的方法相同。每个6孔簇板深孔的容量为16毫升或以上，每个深孔底部的表面积约为9.5平方厘米。“深孔”或“超深培养皿”每孔或每培养皿比普通细胞培养皿能容纳更多的培养基，以便为大量骨髓细胞提供更多的营养和缓冲能力，避免溢出，更重要的是，最大程度地减少(在交换培养基时)对在培养皿底部的骨髓细胞的干扰。6孔簇板的基板是用未经处理的PS或TC-PS制成，因为PS或TC-PS基板仅作为LDPE或LLDPE插入物(从此称为“PE插入物”)的支持外壳，并不会与组织培养基或细胞接触。因此，基板材料可以用任何透明材料代替，例如其他烃类聚合物，聚碳酸酯，丙烯酸或玻璃。PE插件可以保持可移动性，也可以通过粘合剂固定在PS或TC-PS基板上。PE插件的顶部(图1-3)可以与PE，PP，PS，聚碳酸酯或丙烯酸树脂层压或粘在一起，以提高其刚性和耐用性。所得组合称为“PE涂层皿”或“PE涂层板”或“PE涂层孔”。在基于PS或TC-PS的培养皿或孔上涂覆PE薄层可保留原始PS或TC-PS培养皿或孔的刚性和光学清晰度，并允许对培养细胞进行明场或相差显微镜检查。重要的是必须将每个培养皿或孔的底部和整个侧壁(周边)都用PE覆盖，以使培养基或细胞从不与PS或TC-PS接触，以防止吞噬细胞的意外粘附/激活。PE插入物可用70％乙醇或环氧乙烷气体(ethylene oxide)灭菌。培养板的盖子可以用PS或任何透明的硬质塑料制成，因为它们不会与培养基或细胞接触。

当制备单独的PE涂覆的培养皿时，基础皿应具有如图7所示的“超深皿”设计(图4)。超深皿的盘高与底部内直径的理想比率将随直径而变化，但通常至少必须>0.2。如图4所示，用于35、60和100mm的皿的高度与直径之比分别为0.51、0.42和0.32。“超深培养皿”设计提供很重要的功能，因为它允许使用(与传统的组织培养皿相比)更多的培养基，以便为大量BM细胞提供足够的营养和酸碱缓冲能力，避免溢出和污染，并且在频繁的培养基交换和非常长的培养期(数月)中，将对底部细胞的干扰降至最低。单个超深皿的盖子可以由任何透明的硬质塑料材料制成。

PMP组织培养设备。

聚(4-甲基-1-戊烯)(poly(4-methyl-1-pentene),缩写为PMP)，是具有类似于PE的性质，例如疏水性和低蛋白/细胞结合力，但具有更高的透明度，熔点(240℃)和形状保持性的聚烯烃。PMP培养皿或其他形式的组织培养皿是使用标准注射成型技术制成的，然后用环氧乙烷气体灭菌

成纤维细胞与PS，TC-PS和PE涂层板粘附的比较。

永生化的成纤维细胞样骨髓基质细胞系OP-9(20)是在补充有10％胎牛血清，1毫摩尔(mM)L-谷氨酰胺(L-glutamine；Gibco)，青霉素(100国际单位/毫升)和链霉素(100微克/毫升；Gibco)的Dulbecco's Modified Eagle’s培养基(DME，含4.5克/分升葡萄糖；Gibco)中培养。OP-9生存与成长完全需要和组织培养皿表面粘附。为了比较OP-9对不同培养表面的粘附力，将对数生长的OP-9细胞用磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline或PBS；pH 7.4)洗涤，并用胰蛋白酶/EDTA(Gibco)分离，计数并一式三份接种于未经组织培养处理的聚苯乙烯6孔板或经过组织培养处理的聚苯乙烯6孔板(TC-PS)或在PE包被的聚苯乙烯6孔板中，每孔4x10

巨噬细胞与PS，TC-PS和PE涂层板粘附的比较。

WEHI-3B细胞系是小鼠骨髓单核细胞系，它拥有许多巨噬细胞的特性，例如吞噬作用和巨噬细胞细胞因子的分泌(21)。它在某些研究中被用来替代巨噬细胞(22)。WEHI 3B可能以悬浮培养物的形式生长，但大多数细胞会迅速粘附到未经组织培养处理的聚苯乙烯6孔板或经过组织培养处理的聚苯乙烯6孔板培养物表面。为了比较WEHI-3B细胞对不同培养板的粘附力，将对数生长的培养物的非粘附WEHI-3B细胞一式三份接种在未经组织培养处理的聚苯乙烯6孔板或经过组织培养处理的聚苯乙烯6孔板或PE包被的6孔板中，每孔3.0x10

用PE包被的LoMAC培养设备培养小鼠骨髓。

基本的长期骨髓培养基由罗斯威尔公园纪念研究所1640(Rosewell ParkMemorial Research Institute 1640缩写为RPMI 1640；Gibco)培养基和Iscove'sModified Dulbecco's培养基(IMDM；Gibco)的1：1混合物组成，并补充了20％(体积/体积)供体马血清(Donor HS；Gibco)，1毫摩尔浓度谷氨酰胺，青霉素100国际单位/毫升，链霉素100微克/毫升，2-巯基乙醇(2-ME；5x10

第35天形成鹅卵石区域的细胞(CAFCd35)测定。

标准的CAFCd28测定被认为是小鼠造血干细胞的最佳体外测定方法(28-30)，因其数值与通过骨髓移植测定方法所获得的所谓长期造血干细胞(造血>4个月)的数值相同或一致(28、29)。在我们的研究中，我们使用了比标准的CAFCd28更为严格的CAFCd35分析,并且是在37℃测定。我们的CAFCd35测定基本上按照Ploemacher等人描述的CAFCd28测定，但进行了以下的修改使它更精确严格(28、29)。例如我们使用成纤维样基质细胞系OP-9细胞克隆(20)代替原代骨髓混合巨噬细胞-成纤维细胞群，因为OP-9细胞克隆可提供更均匀一致的环境。另一个优点是OP-9不会像原代骨髓混合巨噬细胞-成纤维细胞群一样的产生使分析复杂化的巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和其他因素。由于典型的BM LoMAC培养物中的造血祖细胞浓度很高，因此用24孔板而不是96孔板来做CAFC分析，以确保基质细胞区域不会被拥挤或被造血祖细胞破坏或受到其他限制。为了防止在较长的分析期间(35天)OP-9细胞脱离，我们将TC-PS 24孔板预涂0.5％明胶(gelatin)的水溶液(重量/体积)2小时并风干。在CAFC分析之前3-4天，将OP-9基质细胞系接种到涂有明胶的24孔板中，使其生长至汇合。然后将OP-9单层细胞以5-8微克/毫升的丝裂霉素C(mitomycin C；Sigma)处理1小时，并在添加造血细胞之前用PBS洗涤两次。每个CAFCd35分析中至少使用四个不同的祖细胞剂量(连续稀释)，每个细胞剂量用6-12个重复孔。用于CAFCd35分析的培养基由RPMI 1640和IMDM的1：1混合物组成，辅以15％(体积/体积)HS，1毫摩尔L-谷氨酰胺，青霉素/链霉素，2-ME(5x10

红细胞，髓样(myeloid)和淋巴样分化的测定。

骨髓LoMAC培养物中除了部分分化的祖细胞和各种谱系的未分化胚芽之外，通常还包含单核细胞/巨噬细胞，嗜中性粒细胞，巨核细胞和少量嗜碱性成红细胞。为了在半固体培养基中的集落形成细胞测定中评估各种造血祖细胞的频率，将等份量LoMAC培养物接种在含有0.8％甲基纤维素(methylcellulose)的IMDM中，IMDM培养基含有20％胎牛血清,胎牛血清白蛋白(bovine serum albumin或BSA；Sigma)，青霉素-链霉素，2-ME(5x10-5摩尔浓度)，mKL(10毫微克/毫升)，mTPO(10毫微克/毫升)，mIL-3(5毫微克/毫升；PeproTech)和小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(mGM-CSF；5毫微克/毫升；PeproTech)，并在37℃的湿度箱，5％二氧化碳和95％空气中孵育14-16天。在第10-16天对细胞集落进行分类计数。

为了研究从小鼠骨髓LoMAC培养物中生产的细胞的淋巴样潜能，我们将收集的细胞与丝裂霉素C处理的OP-9细胞在24孔板中以DME和RPMI1：1的混合物混合培养。此外补充5％胎牛血清，青霉素-链霉素，5x10

细胞表面谱系标记及免疫荧光检测。

用补充有5％胎牛血清和0.009％叠氮化钠(sodium azide))的汉克斯缓冲盐溶液(Hank’s Balanced Salt Solution；HBSS)(整个混合物称为H5FAH)洗涤培养的细胞，并与FcBlock孵育(抗CD16/CD32；每105个细胞加0.125微克)(BioLegend)20分钟，然后染40分钟。用抗CD45.2，B220，CD19，CD3，NK1.1，CD41和其他单克隆抗体(mAb)的直接结合物洗涤并用H5FAH洗涤两次，然后再进行流式细胞术(flow cytometry)或免疫荧光显微镜检查。

PE包被板中的人类LoMAC培养物。

人类骨髓LoMAC培养基本上与小鼠骨髓LoMAC一样进行，但有一些差异。我们使用市售或已存档的骨髓冷冻保存的单核细胞(mononuclear cells或MNC)代替整个骨髓，这些MNC来自没有标识符的健康供体。在某些实验中，使用BHK/KL，BHK/TPO和J558L7的养成基代替纯化的人因子，因为mKL，mTPO和mIL-7均对人细胞有活性。人类脐带血LoMAC培养基本上与人类骨髓LoMAC培养一样，使用市售或来自脐带的脐带血的冷冻保存的MNC(无标识符)进行。人类外周血LoMAC本质上与人类骨髓LoMAC培养相同，使用的是市售的或冷冻保存的来自健康供体的外周血MNC(无标识符)。

具体的实施例

实施例1

与PS或TC-PS相比，成纤维细胞和巨噬细胞对PE的粘附力非常低。

为了比较成纤维细胞对不同培养物表面的粘附，我们在PS相对于TC-PS相对于PE包被的6孔板中接种了相等数量的OP-9成纤维细胞基质细胞。在37℃下孵育24小时后，对粘附的细胞进行胰蛋白酶消化分离细胞并计数。如图5所示，OP-9非常有效地粘附于PS和TC-PS表面，在粘附部分中发现多于100％的输入细胞，因为在培养期间发生了一些有丝分裂。相反的，OP-9细胞结合到PE涂层板的效率小于PS或TC-PS的1％。接下来，我们使用巨噬细胞样细胞株WEHI 3B进行了平行研究。同样的，WEHI 3B有效地粘附到PS和TC-PS表面，但仅少量粘附到PE培养表面，效率是PS或TC-PS的2-3％(图6)。这些结果与基于PS，TC-PS和PE的蛋白质结合能力差异所作的预测相符。

有趣的是，在PE包被的培养装置中生长的巨噬细胞样细胞系WEHI 3B，一旦达到一定的种群密度，能够降低细胞的循环(有丝分裂)和新陈代谢，然后进入静止期，所以即使在整个实验期间(21天)没有添加或交换新鲜培养基，培养基也不会变成酸性(图7，实线)。相反的，在TC-PS培养装置中生长的WEHI 3B生长迅速，并在达到细胞密度峰值后继续以高速率循环和代谢。结果，培养基迅速变酸性(pH＜6.7)，随后由于营养物的耗尽和酸性而导致细胞死亡(图7，虚线)。这些结果表明，WEHI 3B细胞对TC-PS的粘附(例如通过整联蛋白受体)提供了强烈的有丝分裂和/或功能的刺激，使得当营养耗尽时它们不能减速并退出细胞分裂循环周期。相反，在PE包被的培养装置中生长的WEHI 3B能够逐渐放慢甚至变成静止状态，这无疑地是由于缺乏细胞粘附到培养表面的缘故。我们用新鲜小鼠骨髓巨噬细胞进行的实验也获得了类似的结果(未显示)。

在骨髓LoMAC培养中，PE包被的培养装置能防止巨噬细胞样细胞系WEHI 3B过度活跃的特性是非常有用的性质。我们的观察表明，在PE包被的培养装置中进行骨髓的长期培养期间，即使在5-10天之内未添加任何新鲜培养基，培养基也很少会变成酸性，并且细胞生长能够放慢然后进入静止状态。这与传统的长期骨髓培养有很大的不同，因传统的长期骨髓培养一直处于营养耗尽和高酸度的危险状态，因此需要天天密切关注并及时更换培养基。所有这些证据都表明巨噬细胞是造成长期骨髓培养营养迅速耗尽和高酸度的主要罪魁祸首。

实施例2

使用PE包被的培养设备进行LoMAC长期骨髓培养。

为了检验传统的长期骨髓培养物中的巨噬细胞可能对造血干细胞和祖细胞有害的假说，我们比较了TC-PS与PE包被的板中的小鼠骨髓长期培养物。假设涂有PE的培养设减少了巨噬细胞的粘附，因此导致较少的巨噬细胞活化(特别是M1活化)，这将有助于创建非炎性或抗炎环境。骨髓培养是在生理温度37℃下培养的，而不是传统长期骨髓培养所用的33℃。与使用OP-9基质细胞系所做实验的发现一致(图5)，PE完全阻止了成纤维样骨髓基质细胞的粘附，该细胞在不锚定的情况下非常快地凋亡。结果，在PE包被的培养装置中建立的骨髓培养物中没有成纤维细胞样基质细胞但有少量粘附的巨噬细胞，其中大多数仅轻轻地，松散地粘附至PE表面(参见下图9B)。这些巨噬细胞的形状是圆球形的，并且没有显示出在TC-PS培养装置中建立的骨髓培养物中粘附巨噬细胞典型的细胞质良好分布的，扁平的形态(参见下图9A)。总体而言，与在TC-PS井中建立的骨髓培养相比，巨噬细胞的粘附性大大降低。此外，在用PE包被的培养装置中建立的骨髓培养物中未观察到异物巨细胞(FBGC)，而在TC-PS培养装置中建立的骨髓培养物中它们非常众多(参见图9A)。

由于成纤维样基质细胞是KL(c-kit ligand)的主要来源，且大多数造血干细胞和祖细胞依赖KL才能生存(19-22)，因此必须在PE包被的组织培养皿中进行的骨髓培养提供外来KL。因此，我们将重组mKL(40毫微克/毫升)或4-5％(体积/体积)BHK/KL养成基添加入在PE包被培养皿设置的所有小鼠骨髓培养物中。虽然仅加KL可以在一定程度上支持在PE包被培养皿中建立的培养物的长期造血作用，但再添加重组mTPO(40毫微克/毫升)或4-5％(vol/vol)BHK/TPO养成基(小鼠TPO的来源)显着改善了此类培养物的性能，并大大增加了巨核细胞(megakaryocytes)的产量。这并不奇怪，因为造血干细胞同时表达c-kit和c-mpl受体(分别针对KL和TPO)，并且KL或TPO可以独立刺激造血干细胞以及许多造血祖细胞的增殖(32、33)。对照组(控制组)培养物则设置在传统的TC-PS培养板中，并加入含有氢化可的松(10-6摩尔浓度)，mKL和mTPO的相同培养基进行平行处理。

图8比较了使用PE包被的培养装置与TC-PS培养装置的骨髓培养物的生长曲线。尽管TC-PS培养装置中的培养物在第20-24天后细胞数量下降，而在第36-48天之后就衰落了，但在PE涂布培养装置中，细胞数在第40天及以后继续以准对数方式扩展。尽管许多在PE包被的装置中建立的小鼠骨髓培养物可继续扩展到300天以上，但我们通常会在120天后将其冷冻保存。在未经处理的PS装置中建立骨髓培养物的结果与那些使用TC-PS装置建立骨髓培养物相似。在TC-PS和PE包被的培养装置中建立的培养物之间对比表明，在TC-PS(或PS)培养装置中建立的骨髓培养物中产生了造血抑制剂或毒素，这是很难在体外培养造血干细胞的原因之一。这个结果表明使用PE包被的装置可以克服这障碍。

图9比较了在TC-PS与PE包被的培养装置中建立的小鼠骨髓培养物的形态(外观)。图9A是在TC-PS培养装置中培养的对照组骨髓培养物第18天的相差显微照片。“Mac”标记的是粘附的巨噬细胞。“FBGC”标记的是异物巨细胞。中小型圆形具有屈光性的细胞是祖细胞，单核细胞和嗜中性粒细胞。图9B是在PE包被的培养装置中建立的小鼠骨髓培养物第18天的相差显微照片。“Meg”标记的是巨核细胞，在PE包被的培养装置中建立的骨髓培养物中巨核细胞的数量很多，而在TC-PS培养装置中建立的对照培养物中巨核细胞的数量很少。“Mac”标记的是漂浮的巨噬细胞。其余的中小圆形有屈光性的细胞是单核细胞，中性粒细胞和祖细胞。在以TC-PS培养装置中建立的骨髓培养含有大量分布广泛的，粘附性的巨噬细胞或FBGC。相反的，在以PE包被的培养装置中建立的骨髓培养物中，这类细胞非常罕见。

实施例3

在PE包被的培养装置和PS培养装置中培养的小鼠骨髓培养物中的吞噬活动和TNF-α产生的比较。

除了有较低的粘附力，在PE包被的培养装置中建立的骨髓培养物中的巨噬细胞(既存的和新产生的)的吞噬能力与在TC-PS培养装置中建立的骨髓培养物中的巨噬细胞相比是较低的(根据包涵体的频率)(图10)。实际上，在PE包被的培养装置中建立的骨髓培养物中新世代(新产生)的巨噬细胞完全没有吞噬活动，因为这些巨噬细胞都没有包涵体(参见下面图15A和图17C)。

为了比较TC-PS与PE对促炎性细胞因子(作为巨噬细胞促炎性激活的指标)产生的影响，我们用TC-PS的培养皿与PE-涂层的培养皿建立了骨髓培养物。比较是在有和没有氢化可的松(10

实施例4

在TC-PS与PE包被的培养装置中建立的骨髓培养物中造血干细胞的数量。

我们通过在37℃下进行的CAFCd35测定来确定起始骨髓接种物中以及在骨髓长期培养的第12、24和36天存在的造血干细胞的数目，该测定比在33℃下进行的标准CAFCd28测定更为严格。为简洁起见，从现在开始我们将在PE涂层培养装置中建立的骨髓培养物称为LoMAC(Low-Macrophage-Adhesion/Activation或低巨噬细胞粘附/激活)培养物。如图12所示，每个骨髓LoMAC培养物中CAFCd35的数量为262(从平均一个腿骨中收获的细胞开始)，这与通过竞争性骨髓移植确定的每腿骨造血干细胞数量一致(34、35)。在LoMAC培养(图12实线)的第12天，CAFCd35的数量增加到579。CAFCd35在第24天为300，在LoMAC培养第36天为305(图12，实线)。相反的，在常规TC-PS培养装置中建立的骨髓培养物中，CAFCd35非常迅速地下降，并且在第12天后无法检测到(图12，虚线)。类似地，在未经处理的PS(Petri皿；

在上一节中描述的培养物(图12)是以每孔(6孔簇板)1.0x10

接下来我们用12周大的C57BL/6小鼠(如图12中)在注射5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil或5-FU)第5天后采集的骨髓所建立骨髓培养物。图14比较了在第0、12、24和36天培养后CAFCd35的数目。图14是使用相当于图12和图13中的一条腿骨(但在注射5-氟尿嘧啶后第5天收获的)骨髓建立的培养物，所以这些比较是基于同一基础(即一条腿骨的骨髓)。5-氟尿嘧啶选择性杀死迅速循环(有丝细胞分裂)的细胞。因此，注射5-氟尿嘧啶后的第5天骨髓中主要含有静止(没有细胞分裂)的造血干细胞，细胞分裂缓慢的原始造血祖细胞和一些成熟的细胞，所以注射5-氟尿嘧啶后第5天的骨髓可提供有关半纯化或富集的骨髓干细胞/祖细胞(因为组成类似于注射5-氟尿嘧啶后第5的天骨髓)在LoMAC培养物中如何表现的相关信息。如图14所示，造血干细胞(CAFCd35)再次从在TC-PS培养装置中建立的培养物中迅速消失(图14，虚线)。相反的，在用PE包被的培养装置中建立的培养物中的CAFCd35不仅存活下来，而且随着时间而增加(图14，实线)。

实施例5

小鼠骨髓LoMAC培养物中造血祖细胞的谱系(lineage)潜能。

小鼠骨髓LoMAC自发并连续产生多种成熟造血细胞以及部分分化的前体。这些包括单核细胞/巨噬细胞，分段(segmented)和带状(band-form)嗜中性粒细胞，单核细胞，早幼粒细胞(promyelocytes)，成髓细胞(myeloblasts)，巨核细胞，嗜碱性红细胞和嗜酸性粒细胞，嗜碱性粒细胞和肥大细胞(mast cells)。在小鼠骨髓LoMAC培养物中加入1-5个单位/毫升的hEPO至少8-10天，可以使红系祖细胞完全分化。只要存在EPO，就会持续生成成红细胞。在连续EPO刺激16天后，培养物中约50％细胞是成红细胞，这现象是在传统长期骨髓培养长期骨髓培养物中从未见过的。此外，在有代表性的LoMAC骨髓培养物的第160天，用半固体培养基祖细胞集落分析进行分析(在KL，TPO，IL-3和EPO的刺激下)时，很容易检测到各种造血祖细胞，其频率如下：

(每1.45x10

6.7 CFU-GEMM，

6.3 CFU-EMeg(双能红系/巨核细胞)，

11.3 BFU-E，

112.0 CFU-GM，

9.7 CFU-Meg，

36.7 CFU-G，

280.0 CFU-M。

总之，除CAFCd35外，小鼠骨髓LoMAC培养物产生的大多数白细胞系或红细胞系祖细胞可通过半固体培养基中的细胞集落测定法检测到，其频率与中度富集的骨髓相似。此外，某些在传统的长期骨髓培养中通常很少检测得到祖细胞细胞集落(例如CFU-GEMM，CFU-EM和CFU-Mk细胞集落)比新鲜的正常骨髓所形成的集落更大，细胞更健壮。

实施例6

骨髓LoMAC培养液相中的新生红细胞和巨核细胞生成。

传统长期骨髓培养一个非常困惑的现象是即使用EPO刺激也完全不能形成红细胞。全新新的红系分化仅限于(如果有的话)少量BFU-E的产生。在大多数情况下，长期骨髓培养开始后2-4周即没有可检测的BFU-E。这个失败的原因在过去未知。相比之下，在PE包被的培养装置中建立的骨髓LoMAC在EPO持续10-16天刺激下(1-2个单位/毫升)不仅产生了大量的巨核细胞(图15A)，BFU-E和BFU-EMeg，而且还产生了许多所有分化阶段的成红细胞(图15B)。由于第一个有血红蛋白的成血红细胞至少需要8-10天EPO持续刺激才会出现在小鼠骨髓LoMAC培养物中，因此我们可以结论在添加EPO之前，小鼠骨髓LoMAC培养物中最成熟(分化)的类红细胞祖细胞是BFU-E。

图15B是小鼠骨髓LoMAC培养物(在培养160天)用EPO刺激16天后的(经过莱特-吉姆萨染色)的细胞离心制备(cytospin preparation)玻片。没有EPO刺激的对照培养物示于图15A。如图15B所示，在加入EPO(1-2单位/毫升)16天后，在骨髓LoMAC培养物的液相中，由数百至数千个成红细胞组成的嗜碱性，多嗜铬和正色红细胞大集落大量出现。在连续暴露于EPO 16天后，约50％的细胞是成红细胞(图15B)。由于在骨髓LoMAC培养物中出现第一个成红细胞簇需要8-10天或更长时间的EPO刺激，我们得出的结论是，这些成红细胞是由非常原始的类红细胞祖细胞(例如BFU-E，CFU-EMeg或CFU-GEMM)产生的。EPO刺激可以重复施加而不会损害小鼠骨髓LoMAC培养物。

除了大量的成红细胞，在骨髓LoMAC培养物中还存在许多处于各个分化阶段的巨核细胞。像成红细胞和红细胞祖细胞一样，巨核细胞及其祖细胞(CFU-Meg或CFU-EMeg)在传统LTBMC中是无法检测到或几乎检测不到的。相反，在EPO刺激之前(图15A)和之后(图15B)，在骨髓LoMAC培养物中产生了所有分化的阶段(核倍性高达32N)的巨核细胞及其祖细胞。TPO显然是主要的巨核细胞发育刺激因素，但EPO也提供了协同刺激。

由于BFU-E，CFU-Meg，CFU-EMeg和CFU-GEMM是寿命短暂(1-2周)的祖细胞，除非通过必需的生长因子(例如EPO，TPO，GM-CSF)刺激/拯救才可以生存，所以根据推论它们在小鼠骨髓LoMAC培养物中，必须从HSC(或CMLP)产生，才可以在以上所述(图15)细胞集落分析或液体培养物中检测到。由于在小鼠骨髓LoMAC培养物中很容易检测到成红细胞，巨核细胞，BFU-E，CFU-Meg，CFU-EMeg和CFU-GEMM，但在传统长期骨髓培养(即使添加了EPO和TPO)中却几乎检测不到，我们可以推论这种逆转源于传统长期骨髓培养的促炎环境之不同于LoMAC培养的非炎性或抗炎环境特性。这对于将来设计用以扩大造血干细胞和红系及巨核细胞祖细胞的培养系统具是个重要启示。

实施例7

小鼠骨髓LoMAC培养物中含有可重新产生淋巴细胞的原始祖细胞。

骨髓LoMAC培养物不能自发产生在形态上可识别的或可用抗体标志的B，NK或T淋巴细胞，这是因为高浓度氢化可的松杀死了所有先前存在淋巴细胞，并阻止了新淋巴细胞的产生。然而，如用三阶段淋巴细胞生成测定方法，可以从骨髓LoMAC产生大量的前pro-B，pro-B和NK细胞。在第一阶段，将骨髓LoMAC培养物中的细胞洗去氢化可的松，并在低浓度的KL，Flt3L和IL-7的存在下与OP-9基质细胞共同培养14-20天，在此期间，定型淋巴祖细胞将产生。然后在OP-9共培养物中补充高浓度的IL-7，持续10-20天或更长时间，以支持B和NK祖细胞的下一阶段(即第二阶段)发育，连续数周连续产生大量可以回应KL/IL-7的B220+CD19-pro B细胞，随后(即第三阶段)出现B220+CD19+pro B细胞。在出现大量半成熟的NK1.1+NK细胞(以及pre-pro B细胞)后，如我们以前报道的，OP-9基质层会被半成熟的NK细胞破坏溶解(31)。此后，如向培养物补充KL(取代OP-9生产的KL)，IL-7和IL-2，可以支持半成NK细胞进一步分化(31)。用这种方法可以产生类似KIL C.2细胞系(31)的连续NK细胞系。

结合CAFCd35测定法，液体培养物，半固体培养基祖细胞集落分析落测定法和三阶段B/NK测定法的数据，我们得出结论，小鼠骨髓LoMAC培养物包含造血干细胞，CMLP，CLP，CFU-GEMM，CFU-EM，BFU-E，CFU-Meg，CFU-E，CFU-GM，CFU-G和CFU-M。小鼠骨髓LoMAC培养物中存在少量其他造血谱系细胞，例如肥大细胞(mast cell)，嗜碱性粒细胞(basophil)和嗜酸性粒细胞(eosinophil)(未显示)。

尽管在TC-PS和PE包被的细胞培养装置建立的骨髓培养物中都存在大量巨噬细胞，但是PE包被的培养装置(即LoMAC培养物)产生的巨噬细胞几乎没有或没有包涵体(吞入的细胞碎片)(图15A)，表明它们本质上是非炎症性的。

实施例8

TC-PS强烈抑制了先前建立的小鼠骨髓LoMAC培养物。

如将已经成立260天的小鼠骨髓LoMAC培养物转移至基于TC-PS的细胞培养皿时，培养物迅速下降，如图16(虚线)所示。伴随细胞培养物急剧下降的是包括异物巨细胞在内大量的粘附和非粘附巨噬细胞。相反的，转移到新的PE-涂布的细胞培养皿的细胞继续像以前一样增殖(图16，实线)。这两个相反的结果凸显及证明了TC-PS在传统长期骨髓培养中造血功能的下降所扮演的角色。

实施例9

人类骨髓和脐带血LoMAC。

我们还使用冷冻保存的人类骨髓MNC(而不像是新鲜的完整的小鼠骨髓)进行了LoMAC培养。培养基与小鼠骨髓LoMAC培养物相同，但是使用了略高浓度的KL和TPO(重组hKL50毫微克/毫升，重组hTPO 80毫微克/毫升)，或使用BHK/mKL(5％体积/体积)和BHK/m TPO(8％体积/体积)养成基(因为老鼠mKL和mTPO可与人类细胞交叉反应)。在这些条件下，人类骨髓MNC像小鼠骨髓LoMAC培养一样增殖，主要区别在于：(i)人类巨核细胞的发育在早期被阻滞，大多数巨核细胞表现为仅包含一个核(2N倍性)的微巨核细胞，偶尔含有2个核(4N倍性)。EPO(4单位/毫升)的添加能够驱动更多的微巨核细胞趋向4N倍性。然而，在第30天以后，人类骨髓LoMAC培养物中很少见到分化良好的巨核细胞。该观察结果表明，人类巨核细胞的发育需要其他因子才能继续发育。(ii)在人类骨髓LoMAC培养物中的红系分化中观察到类似的分化阻滞。大多数人类BFU-E和/或CFU-E在LoMAC环境中无法有效地响应KL，TPO和EPO(4-5单位/毫升)完成增殖。取而代之的是，它们直接分化为单个大的(～12-15微米)低血红蛋白的成血红细胞，而没有通常伴随红系末端分化的细胞增殖。因此，与小鼠红系祖细胞相比，人类红系祖细胞在体外发育需要其他促进有丝分裂因子。hFlt3L(2-6毫微克/毫升)的添加改善了人类骨髓LoMAC培养物的增殖和寿命。然而，hFlt3L也显着增加了巨噬细胞和树突状细胞(dendritic cell)的产生，其影响无疑是复杂的，需要进一步研究。

图17A是80天的人类骨髓LoMAC一区域的相差显微照片，显示巨噬细胞的典型外观，其中大多数是不粘附的，此外具有聚集成团的趋势。少数巨噬细胞微弱地附着在PE膜上，很容易分离。图17B示出了在相同培养物中活跃的造血区域。图中的大多数小圆形细胞是处于所有分化阶段的单核细胞，中性粒细胞和祖细胞。在左边缘可以看到一簇大的巨噬细胞。

人类骨髓LoMAC培养物的一个非常不寻常的特征是逐渐形成直径为1-2微米的数千万个凋亡小体(apoptotic bodies)(图17C)。这是以前从未观察到的现象。该发现表明，在骨髓LoMAC培养物中形成的巨噬细胞是非吞噬性的。已建立的人类骨髓或脐带血或外周血干细胞LoMAC培养物中的巨噬细胞也完全没有包涵体，进一步的证明了这一点。这与前述小鼠骨髓LoMAC培养物中的发现(图10&15A)是非常一致的。

实施例10

在聚(4-甲基-1-戊烯)(poly(4-methyl-1-pentene)或PMP)制造的组织培养装置中进行LoMAC培养。

诸如PE，PP(polypropylene)和PMP的聚烯烃具有相似的特性，例如高疏水性，低蛋白结合力，低细胞结合力和高耐化学性。但是，它们在许多其他方面有所不同，例如透明度，熔融温度，拉伸强度，形状保持性和成型特性。由于其低蛋白结合，高透明性和刚性，PMP是制造组织培养装置的可能候选，该组织培养装置可能提供与PE涂层的培养装置类似的益处。因此，我们测试了由PMP制造的组织培养装置在LoMAC培养物中支持长期造血的能力。结果表明，与TC-PC培养装置相比，PMP组织培养装置为长期造血提供了较好的支持，产生的结果与图5-17所示的结果有些类似。

超越已有技术的优势

与现有的组织培养装置相比，PE(聚乙烯)涂层和基于PMP的培养装置具有明显的优势。

实际上，所有用于改进用于长期骨髓培养的基于PS之培养装置(如组织培养处理的聚苯乙烯TC-PS)的方法均旨在通过氧离子体修饰聚苯乙烯表面或通过掺入多肽，粘附蛋白或复杂生物分子来增强细胞对组织培养表面的粘附。后一种方法包括用肽(例如聚D-赖氨酸，RGD肽)或粘附蛋白(例如胶原蛋白，层粘连蛋白，纤连蛋白)或粘多糖(例如硫酸肝素heparin sulfate，透明质酸hyaluronidate和硫酸软骨素chondroitin sulfate)覆盖组织培养表面。例如，

优于现有”超低结合”组织培养装置。

绝大多数“改良型”组织培养表面的目标旨在实现与我们在本发明中所追求的目标(即低蛋白和低细胞/吞噬细胞粘附)正好相反。一个罕见的例外是“超低附着”组织培养装置(“ULA”表面；

另一个低蛋白结合表面是具有非离子亲水表面的CORNING NBS(非结合表面Non-Binding Surface)，其使分子相互作用最小化。NBS表面由非离子亲水环结构组成，该结构与聚环氧乙烷样接头(polyethylene oxide-like linker)的末端相连，后者与PS表面相连。NBS表面的特性是非常低的蛋白质和核酸结合力。它们设计用于小液体量，高通量生化分析(不是用于组织培养)，这些分析需要非常低的蛋白质和低核酸结合力，并且仅以96、384和1536小孔形式提供。它们与细胞培养的相容性尚不清楚，也没有可以用于细胞培养的NBS产品。

另一种设计用于低细胞结合的组织培养装置是“PlusS”培养装置(Alpha PlusScientific Corporation)，其使用2-甲基丙烯酰氧基氧乙基磷酸胆碱共聚物(2-methacryloyloxyethyl phosphocholine copolymer)涂层来抑制细胞结合。PlusS培养装置与PE涂层培养装置的直接比较显示，PlusS装置在抑制成纤维细胞和巨噬细胞粘附方面非常有效。与ULA装置不同的是，PlusS培养装置不会诱导FBGC的形成。但是，PlusS培养装置仍然不能支持长期造血。这些发现表明仅仅抑制巨噬细胞粘附不足以产生有利于长期造血的环境。培养装置表面的化学和其他性质还必须具有非常低的巨噬细胞活化潜力并能长期支持造血干细胞的生存。

优于PolyHEMA涂层培养装置。

一个用于从胚胎干细胞(embryonic stem cells或ES)产生胚状体(embryoidbodies或EB)的方法是使用涂有聚甲基丙烯酸2-羟乙酯(poly(2-hydroxyethylmethacrylate；也称为“polyHEMA”)的PS或TC-PS培养皿，PolyHEMA可以防止ES细胞粘附于培养皿(37)。与水混合后，PolyHEMA形成水凝胶层。如上所述，完全抑制细胞粘附并不利于造血干细胞和祖细胞的存活。只抑制巨噬细胞促炎活化也不够。经过长时间的温育后，水凝胶也诱导FBGC的形成。此外，polyHEMA未与TC-PS共价连接，因此会随着时间分离。因此，polyHEMA包被的培养装置也不适合长期骨髓培养。

与现有使用纯化的造血干细胞作为起始的现有造血干细胞扩展方法相比，LoMAC骨髓培养具有几个优势。

最近，有报道称用聚乙烯醇(polyvinyl alcohol或PVA)替代血清白蛋白可扩增高度纯化的小鼠造血干细胞(38)。该方法的前提假设是:血清白蛋白(包括纯化的重组白蛋白)包含未鉴定的”杂质”，如果改用100％纯化的大分子替代物(例如PVA)替代白蛋白将可解决该问题。报道表明，先天免疫的介质(基本上是巨噬细胞和嗜中性粒细胞产生的促炎性细胞因子，例如TNF-α，IL-1，IL-6和MIP-1α)是随着单核细胞，巨噬细胞和嗜中性粒细胞的出现而产生的。重要的是，这种骨髓培养的养成基(含有巨噬细胞和嗜中性粒细胞产生的先天免疫介质)抑制了造血干细胞的增殖(38)。尽管所引用的研究并未鉴定在养成基中的干细胞抑制剂种类，但它暗示了就是所谓的“天然免疫介质”(促炎细胞因子和趋化因子)。这与我们实施例的发现一致。在所引用的研究中，造血干细胞的扩增方法需要使用高度纯化(100％或接近100％)的造血干细胞作为起始细胞种群，显然这是为了避免其他细胞(如巨噬细胞和嗜中性粒细胞)分泌的促炎细胞因子的作用。相反的，在本申请中描述的LoMAC培养方法如果用于未纯化的造血细胞仍然非常有效。使用未纯化的骨髓细胞作为造血干细胞培养的起始种群的益处是提供一些旁分泌刺激，而这些旁分泌刺激在LoMAC骨髓培养物中是有积极作用的(图12与图13)。这是一个很大的优势。因为用于治疗应用的体外造血干细胞扩增的任何方案都可能涉及使用相对大量的未经纯化或至多半纯化的造血细胞作为起始群体。因此，一种适用于未纯化或部分纯化的人类造血干细胞的扩增方法可以节省时间，劳动力和材料，并减少造血干细胞损失和微生物污染。另一个很大的不同是我们的LoMAC骨髓培养方法可实现有效率且连续的红细胞生成和巨核细胞生成。据我们所知，这是唯一可以实现这一目标的长期骨髓培养系统。LoMAC骨髓培养的时间长度也远远超过(20-30倍)上文提到的的PVA方法。

在骨髓LoMAC培养物中，较慢的造血干细胞扩展的优势。

在PE包被的培养装置中，使用LoMAC培养方法的造血干细胞扩增缓慢发生。我们的计算表明，在小鼠骨髓LoMAC培养物中，造血干细胞的数量大约每5-10天增加一倍(图13，实线)。该速率似于体内造血干细胞的速率。实际上，这种缓慢的扩展速率可能更可好，因为它为造血干细胞中的DNA修复提供了更多时间,以减少基因突变。

带有PE涂层或基于PMP的培养装置的区别性特征。

LoMAC培养方法的显着特征是用不带电荷的，疏水的，低蛋白结合，低细胞结合的PE层覆盖在细胞孵育或操作过程中可能与组织培养基和/或细胞接触的整个组织培养表面。这包括组织培养装置的底部和侧壁，或者组织培养瓶和组织培养袋子的整个内表面。相比之下，大多数具有修饰表面的组织培养装置仅聚焦在装置底面上。除了PE涂层，整个组织培养装置可以由透明的刚性聚烯烃(例如聚(4-甲基-1-戊烯)或PMP)制成，但与典型的PE涂层具有共同的特性(无电荷，疏水性，低蛋白和细胞结合力，CC和CH之外没有其他可能有助于巨噬细胞活化的化学键)。PE和PMP具有高度疏水性，而大多数TC培养设备(使用TC-PS，其他涂层，玻璃)具有带负电荷的，亲水性培养表面。相比之下，PE和PMP与TC-PS结合的蛋白质种类不同而且总量要小得多。PE和PMP也没有额外的特殊的化学部分，例如PS的酚环。这些额外的特殊化学部分可能通过模式识别受体参与细胞信号传导。这些差异造成巨噬细胞(炎症反应和组织修复的关键细胞)不同之粘附和激活潜能。

LoMAC培养装置中聚烯烃培养表面的目的有两个方面：(i)减少巨噬细胞和其他吞噬细胞对培养表面的粘附，和(ii)防止巨噬细胞和其他吞噬细胞的促炎性活化。如上所述，它们还应为造血干细胞的粘附和存活提供一些支持。上述实施方案的数据证明PE包被的(或基于PMP的)装置可以提供体外正常造血所需的非炎性或抗炎环境，因此它们特别适合于长期骨髓和造血干细胞培养。除了扩展造血干细胞外，这些新设备还可用于重新检视巨噬细胞的各种激活状态，特别是``非炎性”状态(17)，不再受限于极偏向M1激活的TC-PS组织培养表面。它们还可应用在其他细胞类型(例如T淋巴细胞，NK细胞，树突状细胞，类胚体或类器官)的培养或分化，以避免细胞对培养表面的粘附及促炎性活化。

结论，多样延伸和覆盖范围。

本申请描述中最重要的启示是，当前所有组织培养装置中使用的TC-PS培养表面是传统骨髓培养骨髓干细胞及造血功能下降的根本原因，而PE涂层或PMP组织培养装置解决了这个问题。另一个启示是造血作用(特别是红细胞生成和巨核细胞生成)在正常情况下一定是在非炎性或抗炎性微环境中进行。这对未来骨髓干细胞体外扩增或体外产生红细胞和血小板的所有策略都有影响。

科学家们普遍认为，由巨噬细胞，内皮细胞，成骨细胞，破骨细胞和成纤维细胞样基质细胞组成的预制基质层对于维持造血干细胞和祖细胞至关重要，而HC(10

LoMAC培养系统之绝对必要(缺之不可)的条件是PE包被的或基于PMP的低巨噬细胞粘附、活化培养装置。由于PE和PMP的蛋白质结合能力低，并且除了C-C和C-H键没有特殊的化学特征，因此很少有单核细胞/巨噬细胞粘附在PE或PMP表面或被激活。在此应当指出，PE和PMP对单核细胞/巨噬细胞的作用也多少适用于嗜中性粒细胞。

若干证据表明，LoMAC骨髓培养物中的长期培养维持细胞是造血干细胞：首先，CAFCd35已证明在数值上与造血干细胞相关(28，29)；其次，我们第0天骨髓样本的CAFCd35数据(图12和图13)与所报道的小鼠骨髓的造血干细胞数量一致(28-30、34、35)；第三，LoMAC骨髓培养物可自发产生所有髓系细胞，并在转移至适当环境后可产生NK和B淋巴样前体祖细胞。第四，LoMAC骨髓培养物中的所有未成熟祖细胞(例如CLP，CFU-GEMM，CFU-E/Meg，BFU-E，CFU-GM)和成熟细胞的寿命有限(数小时至数天)，因此必须从多能造血干细胞连续再生补充；第五，OP-9共培养中B和NK祖细胞发育的时程(4-5周)与其是从造血干细胞起源的时程是一致的；最后，造血干细胞是唯一已知的能够在3-4个月内维持多谱系淋巴及造血功能的骨髓细胞。

当前研究中的一个惊奇是，即使在外加KL，TPO和氢化可的松的帮助下，在使用TC-PS的培养装置所做骨髓培养于开始后的2周之内，大多数小鼠造血干细就消失了(图12-14)。考虑到目前大多数扩增人类造血干细胞的方案的培养期为10-14天(40-43)时且使用TC-PS的培养装置，这个发现应该引起关注。如改用LoMAC培养设备将显着改善结果。

尽管上述实施例集中于PE覆盖的或基于PMP的培养装置，但相同的原理可以应用于其他组织培养装置，例如单个培养皿(理想情况下采用“超深”设计)，簇板，培养瓶，培养管，培养袋和细胞培养生物反应器。关键要素是疏水性，低蛋白结合和低巨噬细胞粘附/活化的培养表面。用于产生低巨噬细胞粘附/活化培养表面的材料不必限于聚烯烃，并且可以是具有非常低的巨噬细胞粘附/活化潜力并且对造血干细胞无毒的任何材料。但是，聚烯烃具有实证过，成本低，耐久性和安全记录时间长的优点。

PE包被的或基于PMP的培养装置的应用可不限于LoMAC骨髓培养。它们可以用于任何需要抑制细胞粘附(特别是抑制巨噬细胞粘附)的情况。例如，基于PE的涂层或基于PMP的培养装置可用于培养ES细胞或神经干细胞(NSC)或β胰岛细胞或肠上皮干细胞或肿瘤细胞，通过消除细胞对培养表面的粘附，以促进球状体(spheroid body)或类器官的形成。当巨噬细胞(例如在组织外植体中)是污染物或副产物，并且它们的粘附/活化对是主要研究对象的细胞类型具有负面影响时，这些培养装置是特别有用的。基于PE的涂层或基于PMP的设备以及相关的培养方法也可用于人类细胞的培养和扩增，例如脐带血干/祖细胞，骨髓，外周循环血干/祖细胞，T或B淋巴细胞，NK细胞和树突状细胞(dendritic cell)。对于T淋巴细胞，NK和树突状细胞，涂有PE或PMP的培养装置的低细胞粘附特性有助于收获培养的细胞，而无需使用蛋白水解酶，钙螯合剂或低渗溶液，因为所有这些操作都可能损坏或改变细胞的特性或降低产量。

权利要求书(按照条约第19条的修改)

1.低巨噬细胞粘附、活化培养装置，其特征在于，该装置使用与巨噬细胞粘附和刺激巨噬细胞促炎活性的能力低于聚苯乙烯或经组织培养处理的聚苯乙烯75％至100％的材料所制成的细胞培养装置，该装置为单个培养皿或拥有2至96个相同培养孔的细胞培养簇板或细胞培养瓶；其中每个培养皿或培养孔的底部的内直径为6至150毫米，每个培养皿或培养孔或培养瓶不仅作为细胞培养装置的容器，同时也可贮存大量的培养基。

2.根据权利要求1所述低巨噬细胞粘附、活化培养装置，其特征在于，该装置由密度为0.91至0.94克/毫升的低密度聚乙烯所制成。

3.根据权利要求1所述的低巨噬细胞的粘附、活化培养装置，其特征在于，该装置由聚(4-甲基-1-戊烯)所制成。

4.根据权利要求1所述的低巨噬细胞粘附、活化培养装置，其特征在于，该装置由低密度聚乙烯和聚(4-甲基-1-戊烯)以外的聚烯烃或聚烯烃共聚物所制成。

5.根据权利要求1-4中任一所述低巨噬细胞粘附、活化培养装置，其特征在于，该装置作为培养皿时，具有超深皿的结构特征，使得侧壁高度与底部的内直径之比大于一般培养皿之高度对底部内直径比:若直径为150毫米的培养皿，此比应等于或大于0.2；若直径为100毫米的培养皿，此比应等于或大于0.25；若直径为60毫米的培养皿，此比应等于或大于0.4；若直径为35毫米的培养皿，此比应等于或大于0.5，以便容纳比一般培养皿更多的培养基，以提供大量细胞所需要的营养及酸碱缓冲的能力，并且减少在更换培养基时对培养皿底部细胞的干扰。

6.根据权利要求5所述低巨噬细胞粘附、活化培养装置，其特征在于，该装置中所有可能与细胞接触的培养装置的内表面均覆盖有50至300微米厚的薄膜，此薄膜是用与巨噬细胞粘附和刺激巨噬细胞促炎活性的能力低于聚苯乙烯或经组织培养处理的聚苯乙烯75％至100％的材料所制成的。

7.权利要求6所述低巨噬细胞粘附、活化培养装置，其特征在于，该装置内表面覆盖有密度为0.91至0.94克/毫升的低密度聚乙烯薄膜。

8.权利要求6所述低巨噬细胞粘附、活化培养装置，其特征在于，该装置内表面覆盖有聚(4-甲基-1-戊烯)的薄膜。

9.权利要求6所述低巨噬细胞粘附、活化培养装置，其特征在于，该装置内表面覆盖有除了低密度聚乙烯和聚(4-甲基-1-戊烯)以外的聚烯烃或聚烯烃共聚物的薄膜。

10.根据权利要求6所述低巨噬细胞粘附、活化培养装置，其特征在于，该装置具有可移动的50至300微米厚，柔软的，非透水薄膜袋插入物，每个薄膜袋的顶部都有一个带孔的顶棚或带环形固定襟翼的开口，每个薄膜袋的尺寸适合插入单个培养皿或具有2到96个群集孔的簇板中的单个培养孔；每个薄膜袋是用与巨噬细胞粘附和刺激巨噬细胞促炎活性的能力低于聚苯乙烯或经组织培养处理的聚苯乙烯75％至100％的材料所制成；并且其中所述薄膜袋未使用任何物理或化学方法结合到顶棚或襟翼以下的任何刚性支撑结构，以将所述薄膜袋的刚硬性和张力降至最低。

11.根据权利要求10所述低巨噬细胞粘附、活化培养装置，其特征在于，所述薄膜袋由密度为0.91至0.94克/毫升的低密度聚乙烯制成。

12.根据权利要求10所述低巨噬细胞粘附、活化培养装置，其特征在于，所述薄膜袋由聚(4-甲基-1-戊烯)制成。

13.根据权利要求10所述低巨噬细胞粘附、活化培养装置，其特征在于，所述其薄膜袋由除低密度聚乙烯和聚(4-甲基-1-戊烯)以外的聚烯烃或聚烯烃共聚物制成。

14.一种使用如权利要求1-13中任一项的低巨噬细胞粘附、活化培养装置用于骨髓培养的方法，该方法包括以下步骤：

a)将造血细胞以一个细胞至五百万个细胞每毫升的细胞密度加入适当体积的培养基中；

b)加入有效量的氢化可的松或糖皮质激素以抑制促炎性巨噬细胞活化，并加入有效量的c-kit配体和血小板生成素，以及造血干细胞和祖细胞存活和增殖所必需的其他物质；

c)将细胞/培养基混合物转移至权利要求1-13中任一项的装置；

d)在合适的空气，二氧化碳，饱和湿度及摄氏37度或其他温度下，在组织培养箱中孵育培养装置中的细胞/培养基混合物；

e)每隔1至3天用新鲜培养基替换一半至四分之一的培养基，尽量减少干扰培养装置底部的细胞；

f)每隔5或更多天或当细胞过度拥挤时以1：2划分比例继代培养细胞；

g)避免不必要的培养操作或干扰。

15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，该方法能够使造血干细胞和祖细胞在低巨噬细胞粘附/激活环境中连续增长扩增260天或更久。