血小板功能抑制剂及其使用方法

本申请要求于2018年4月17日提交的美国临时专利申请第62/659,024号的优先权，其公开内容以全文引用的方式合并于此。

本发明是在政府支持下在由美国国家卫生研究院(National Institutes ofHealth)授予的GM105671下进行。政府在本发明中享有某些权利。

技术领域

本公开涉及血小板功能抑制剂，以及使用所述抑制剂治疗如血小板止血和血栓形成的疾病的方法。

背景技术

血小板激活在与危及生命的心血管缺血性事件(如心肌梗塞和中风)相关的血栓形成并发症中起关键作用。通过使用阿司匹林和P2Y

作为膳食补充剂的多不饱和脂肪酸(“PUFA”)因其潜在的心脏保护作用(包括其抗血小板作用)而已被习惯性地使用。二高-γγ-亚麻酸(“DGLA”)，即ω-6PUFA，已显示能抑制血小板在活体外聚集(Farrow和Willis，《英国药理学杂志(Br J Pharmacol)》55：第316页-第317页，1975；Kernoff等人，《英国医学杂志(Br Med J)》2：1441-1444，1977；Willis等人，《前列腺素(Prostaglandins)》8：509-519，1974)。另外，从接受每日口服剂量DGLA的人类以及狒狒、兔子和大鼠中分离的血小板在活体外聚集方面有显著降低。主要认为PUFA通过被加氧酶转化成生物活性脂质(氧化脂类)而对血小板功能发挥其调控作用(Wada等人，《生物化学杂志(J Biol Chem)》282：22254-22266，2007)。在血小板中，可以在主要通过细胞质磷脂酶A

抗血小板疗法的进展已显著降低了由于血栓形成所致的发病和死亡的风险。然而，即使现有标准护理的抗血小板疗法是可获得的，由于闭塞性血栓性事件所致的心肌梗塞和中风仍然是全球发病率和死亡率的主要原因之一。在服用抗血小板药物的个体中，缺血性事件的发生率仍然保持较高(参见Diener等人，《柳叶刀》364：331-337，2004)，这一事实强调了尚未满足的临床需求，即在不促进出血风险增加的情况下减少闭塞性血栓性事件的替代疗法。另外，虽然传统的抗血小板疗法已可用于限制血小板激活，但其在涉及免疫受体在血小板上的免疫靶向的病症(如免疫性血小板减少症(“ITP”))中的效用由于其引起出血的倾向和预防或抑制血小板清除的有限能力而受到限制。出于这些原因，引起血小板清除、血栓形成和出血的血栓性病症对于有疗效地治疗来说仍然是一个挑战。

发明内容

一方面，本文提供式(I)的化合物或其药学上可接受的盐：

在一些实施例中，R

在一些实施例中，R

在一些情况下，r和s各自是1。在各种情况下，Cy包含亚环丁基、亚环戊基或亚环己基。在一些实施例中，Cy包含亚环戊基或亚环己基。在各种实施例中，Cy包含亚环己基。在一些情况下，m是1。在各种情况下，n是1或2。在一些实施例中，n是1。在各种实施例中，n是2。

在一些情况下，r和s各自是0。在各种情况下，n+m是3、4、5或6。在一些实施例中，n+m是3。在各种实施例中，n+m是4。在某些情况下，n+m是5。在各种情况下，n+m是6。

本公开的具体预期化合物包括选自由以下组成的群组的化合物：

本文还提供一种药物组合物，其包含本文所描述的化合物或其盐和药学上可接受的载剂。

本文还提供一种抑制细胞中的血小板聚集的方法，其包含使所述细胞与呈有效抑制血小板聚集的量的本文所描述的化合物或组合物接触。

本文还提供一种抑制细胞中的血小板整合素激活的方法，其包含使所述细胞与呈有效抑制血小板整合素激活的量的本文所描述的化合物或组合物接触。在一些实施例中，Rap1激活被抑制。

本文还提供一种在细胞中激活Gα

本文还提供一种在有需要的受试者中抑制血栓生长的方法，其包含向所述受试者施用治疗有效量的本文所描述的化合物或组合物。

本公开的另一方面涉及一种在有需要的受试者中治疗血栓性病症的方法，其包含向所述受试者施用治疗有效量的本文所描述的化合物或组合物。在一些实施例中，所述血栓性病症选自动脉血栓形成、深静脉血栓形成(“DVT”)、肺栓塞(“PE”)、缺血性中风、免疫性血小板减少症(“ITP”)、肝素诱导的血小板减少症(“HIT”)和肝素诱导的血小板减少症合并血栓形成(“HITT”)。

本文还提供一种在受试者中预防血栓形成的方法，其包含向所述受试者施用治疗有效量的本文所描述的化合物或组合物。

本文还提供一种在有需要的受试者中治疗血小板减少症的方法，其包含向所述受试者施用治疗有效量的本文所描述的化合物或组合物。

通过结合附图审阅以下具体实施方式，其它方面和优点对于本领域普通技术人员将是显而易见的。下文的描述包括具体实施例，应理解本公开为说明性的，且并不旨在将本发明限制于本文所描述的具体实施例。

附图说明

图1描绘在3个时间点(2小时、4小时和7小时)所监测的小鼠(n＝3)血浆中经口或静脉内施用的化合物A3(30mg/kg)的浓度，如在实例部分中进一步描述。

图2描绘对于1μM、5μM、10μM和20μM化合物A1、A2和A3的胶原蛋白诱导的血小板聚集的百分比，如在实例部分中进一步描述。

图3描绘对于1μM、5μM、10μM和20μM化合物A1、A2和A3的凝血酶诱导的血小板聚集的百分比，如在实例部分中进一步描述。

图4描绘通过蛋白质印迹法(Western Blot)使用奥德赛成像系统(Odysseyimaging system)(LI-CoR)定量的具有化合物A3的总-及磷酸化-VASP(丝氨酸157)。

图5A-5E描绘化合物A3在VASP磷酸化期间在不同浓度下对倍数变化的影响。

图6描绘在用聚乙二醇(“PEG”；对照，上部)治疗的野生型(“WT”)对照动物、用化合物CCG26368(6mg/kg，一天两次持续2天；中间)治疗的WT和用化合物A3(6mg/kg，一天两次持续2天；下部)治疗的WT中的提睾肌微动脉中生长的血栓中血小板聚集(绿色)和纤维蛋白形成(红色)的代表性图像，如在实例部分中进一步描述。

图7描绘在对照小鼠和用化合物A3(6mg/kg，一天两次持续2天)治疗的小鼠中随时间推移记录的损伤部位处的血小板聚集的平均荧光强度(“MFI”)，如在实例部分中进一步描述。数据表示平均值±SEM；双因素方差分析(two-way ANOVA)。

图8描述在对照小鼠和用化合物A3(6mg/kg，每天两次持续2天)治疗的小鼠中随时间推移记录的损伤部位处的纤维蛋白聚集的平均荧光强度(“MFI”)，如在实例部分中进一步描述。数据表示平均值±SEM；双因素方差分析。

具体实施方式

本文公开的是具有式(I)结构的化合物或其药学上可接受的盐：

其具有抗血小板活性并且可用于例如在不妨碍止血的情况下通过预防或抑制血栓形成、血小板减少症和/或局部缺血来治疗血栓性病症。本公开的化合物和方法会削弱活体内的血栓形成，通过减弱血小板功能而提供心脏保护作用。与其它会导致过量出血的抗血小板药物不同(Ahrens和Peter，《自然·生物技术(Nat Biotechnol)》26：62-63，2008；Capodanno等人，《美国心脏病学会杂志(J Am Coll Cardiol)》66：1639-1640，2015；Lee等人，《英国药理学杂志(Br J Pharmacol)》166：2188-2197，2012)，本公开的化合物和方法没有显著改变止血，而是相反发挥了抗血栓形成作用，又同时维持了原发性止血。

本文所描述的化合物优于也具有抗血小板活性的12(S)-羟基二十碳四烯酸(“12(S)-HETrE”)，在于其可以在单一纳摩尔范围内抑制血小板功能，可以完全抑制促效剂诱导的聚集，并且可以在将化合物以低至10nM的浓度添加到人类血小板之后诱导血管扩张刺激的磷蛋白磷酸化(“VASP-磷酸化”)。此外，本文所描述的化合物并会不诱导出血，可以经口或静脉内施用，并且稳定于血液中。

如本文所用，术语“烷基”是指含有一个到三十个碳原子，例如一个到二十个碳原子或一个到十个碳原子的直链和支链饱和烃基。术语C

如本文所使用的，术语“环烷基”是指含有三个到八个碳原子(例如，3个、4个、5个、6个、7个或8个碳原子)的单价脂肪族环状烃基。术语C

如本文所用，术语“亚环烷基”是指二价环烷基。例如，术语“亚环烷基-芳基”是指被芳基取代的亚环烷基。术语C

如本文所用，术语“芳基”是指环状芳香族基团，如单环芳香族基团，例如苯基。除非另外指示，否则芳基可以是未被取代的或被一个或多个(并且具体地说，一个到四个)基团取代，所述基团独立地选自例如卤基、烷基、烯基、OCF

如本文所用，术语“杂芳基”是指具有总共五个到十二个环原子(例如具有总共5-6个环原子的单环芳香族环)并且在芳香族环中含有一个到三个选自氮、氧和硫原子的杂原子的环状芳香族环。除非另外指示，否则杂芳基可以是未被取代的或被一个或多个(并且具体地说，一个到四个)取代基取代，所述取代基选自例如卤基、烷基、烯基、OCF

如本文所用，术语“卤基”是指氟、氯、溴或碘基。

如本文所用，术语“被取代的”当用于修饰化学官能团时，是指官能团上的至少一个氢基被取代基替代。取代基可包括但不限于烷基、环烷基、烯基、环烯基、炔基、杂环烷基、硫醚、聚硫醚、芳基、杂芳基、羟基、氧基、烷氧基、杂烷氧基、芳氧基、杂芳氧基、酯、硫酯、羧基、氰基、硝基、氨基、酰胺基、乙酰胺和卤基(例如氟基、氯基、溴基或碘基)。当化学官能团包括一个以上的取代基时，这些取代基可键合至同一个碳原子或键合至两个或更多个不同的碳原子。被取代的化学官能团本身可以包括一个或多个取代基。

如本文所用，术语“治疗有效量”意指改善、减弱或消除特定疾病或病况的一种或多种症状、或预防或延迟特定疾病或病况的一种或多种症状发作的化合物或治疗活性化合物组合的量。

如本文所用，术语“患者”和“受试者”可以互换使用，并且意指动物(如狗、猫、牛、马和绵羊(例如，非人类动物))和人类。特定的患者或受试者是哺乳动物(例如人类)。术语患者和受试者包括雄性和雌性。

如本文所用，术语“治疗(treating、treat或treatment等)”等包括预防性(例如预防疾病的)治疗和缓解性治疗。在一些情况下，治疗是指治疗如本文所公开的病症或疾病的症状。

本文提供式(I)的化合物或其药学上可接受的盐：

其中：

(a)R

(b)R

HET是含有1、2或3个氮原子和总共5或6个环原子并且任选地被选自C

L是-(CO

Cy是C

m是1或2；

n是1、2、3、4或5；并且

r和s中的每一个独立地是0或1。

在一些实施例中，R

在一些实施例中，R

在一些情况下，r和s各自是1。在各种情况下，Cy包含亚环丁基、亚环戊基或亚环己基。在一些实施例中，Cy包含亚环戊基或亚环己基。在各种实施例中，Cy包含亚环己基。在一些情况下，m是1。在各种情况下，n是1或2。在一些实施例中，n是1。在各种实施例中，n是2。

在一些情况下，r和s各自是0。在各种情况下，n+m是3、4、5或6。在一些实施例中，n+m是3。在各种实施例中，n+m是4。在某些情况下，n+m是5。在各种情况下，n+m是6。

本公开的具体预期化合物包括选自由以下组成的群组的化合物：

本文所提供的化合物可使用本领域技术人员已知的常规技术和可容易获得的起始材料合成。一般来说，本文所提供的化合物宜经由标准有机化学合成方法获得。

例如，苯基硼酸或碘苯可与4-氯苯胺反应形成4-氯-N-苯基苯胺。氨基可与三光气反应形成碳酸基，所述碳酸基可与适当的(环己烷-14,-二基)二甲醇基团反应形成所需的(4-氯苯基)(苯基)氨基甲酸4-(羟甲基)环己基)甲酯化合物。氨基甲酸酯化合物可以被醇保护并且与5-巯基-2,4-二氢-3H-1,2,4-三唑-3-酮反应形成所需化合物。或者，可以将氨基甲酸酯化合物氧化形成醛并使所述化合物经历维蒂希反应(Wittig reaction)以形成烯烃。烯烃可与硼试剂反应形成醇，所述醇可受保护并与5-巯基-2,4-二氢-3H-1,2,4-三唑-3-酮反应形成所需化合物。

作为另一实例，适当的酮(例如丙酮)可与4-氨基丁醇反应形成所需的4-(氨基)丁-1-醇，所述醇可与5-溴基-2,3-二苯基吡嗪反应形成所需的4-((5,6-二苯基吡嗪-2-基)氨基)丁-1-醇化合物。接着可以使氯基与5-巯基-2,4-二氢-3H-1,2,4-三唑-3-酮反应形成所需化合物。

用于制备本文所公开的抑制剂的额外合成程序可见于实例部分中。

维持止血需要足够的血小板反应性。然而，过度的血小板反应性还可导致闭塞性血栓的形成。已发现本文所描述的化合物(例如式(I)的化合物，化合物A1、A2和A3以及前述化合物的药学上可接受的盐)能够抑制血小板聚集，这对血栓形成和止血具有可能的影响。因此，本文提供一种抑制细胞中的血小板聚集的方法，其包含使所述细胞与呈有效抑制血小板聚集的量的本文所公开的化合物(例如式(I)的化合物，化合物A1、A2或A3或前述化合物的药学上可接受的盐)接触。在一些实施例中，接触是在活体内。在各种实施例中，接触是在活体外。

本文所公开的化合物可通过对细胞内信号传导产生影响，特别是通过抑制Rap1的激活来抑制血小板聚集，Rap1是整合素α

本文还提供向有需要的受试者施用治疗有效量的本文所公开的化合物(例如式(I)的化合物，化合物A1、A2或A3或前述化合物的药学上可接受的盐)。本文所公开的化合物在有需要的受试者中抑制血小板激活、血小板减少症和/或血栓形成的能力在治疗广泛范围的血栓性病症方面提供治疗功效。可以经由施用本文所公开的化合物而治疗或预防的特别预期的血栓性病症包括动脉血栓形成、深静脉血栓形成(“DVT”)、肺栓塞(“PE”)、缺血性中风、免疫性血小板减少症(“ITP”)、肝素诱导的血小板减少症(“HIT”)和肝素诱导的血小板减少症合并血栓形成(“HITT”)。

本文还提供在受试者中抑制血栓生长、预防血栓形成和/或治疗血小板减少症的方法，其包含向所述受试者施用治疗有效量的本文所公开的化合物(例如式(I)的化合物，化合物A1、A2或A3，或前述化合物的药学上可接受的盐)，其量在受试者中可有效抑制血栓生长、预防血栓形成和/或治疗血小板减少症。

关于使用本文所公开的具有抗血小板活性的化合物(例如式(I)的化合物，化合物A1、A2或A3或前述化合物的药学上可接受的盐)的进一步指导可见于以下实例部分中。

本文所提供的方法包括制造和/或使用药物组合物，其包括本文所提供的化合物中的一种或多种。还包括药物组合物本身。药物组合物通常包括药学上可接受的载剂。因此，本文提供药物配制物，其包括如本文先前所描述的本文所描述的化合物(例如式(I)的化合物，化合物A1、A2或A3，或前述化合物的药学上可接受的盐)，和一种或多种药学上可接受的载剂。

短语“药学上可接受的”在本文中用以指在合理医学判断范围内，适用于与人类和动物的组织接触而无过量毒性、刺激、过敏反应或其它问题或并发症，与合理效益/风险比相称的那些配体、材料、组合物和/或剂型。

如本文所用，短语“药学上可接受的载剂”意指药学上可接受的材料、组合物或媒剂，如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或囊封材料。如本文所用，用语“药学上可接受的载剂”包括与药物施用相容的缓冲剂、注射用无菌水、溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂及抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。每种载剂在与配制物的其它成分相容且对患者无害的意义上必须是“可接受的”。可充当药学上可接受的载剂的材料的一些实例包括：(1)糖，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，如玉米淀粉、马铃薯淀粉和被取代或未被取代的β-环糊精；(3)纤维素和其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；(4)粉末状黄芪胶；(5)麦芽；(6)明胶；(7)滑石；(8)赋形剂，如可可脂和栓剂蜡；(9)油，如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(10)二醇，如丙二醇；(11)多元醇，如甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；(12)酯，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)褐藻酸；(16)无热原水；(17)等渗盐水；(18)林格氏溶液(Ringer's solution)；(19)乙醇；(20)磷酸缓冲溶液；和(21)在药物配制物中采用的其它无毒相容性物质。在某些实施例中，本文所提供的药物组合物为非热原性的，即，当向患者施用时不会诱导显著的温度升高。

术语“药学上可接受的盐”是指本文所提供的化合物的相对无毒的无机和有机酸加成盐。这些盐可以在本文所提供的化合物的最终分离和纯化期间原位制备，或者通过使呈游离碱形式的化合物与合适的有机酸或无机酸单独反应并分离由此形成的盐来制备。代表性的盐包括氢溴酸盐、盐酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、硝酸盐、醋酸盐、戊酸盐、油酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、月硅酸盐、苯甲酸盐、乳酸盐、磷酸盐、甲苯磺酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、萘甲酸盐(napthylate)、甲磺酸盐、葡庚糖酸盐、乳糖酸盐、十二烷基磺酸盐和氨基酸盐等。(参见例如Berge等人，(1977)“药用盐(Pharmaceutical Salts)”，《药物科学期刊(J.Pharm.Sci)》66:1-19。)

在一些实施例中，本文所提供的化合物可含有一种或多个酸性官能团并且因此能够与药学上可接受的碱形成药学上可接受的盐。在这些情况下，术语“药学上可接受的盐”是指本文所提供的化合物的相对无毒的无机和有机碱加成盐。这些盐可同样地在化合物的最终分离和纯化期间原位制备，或通过使纯化的化合物以其游离酸形式与合适的碱(如药学上可接受的金属阳离子的氢氧化物、碳酸盐或碳酸氢盐)、与氨或与药学上可接受的有机伯胺、仲胺或叔胺单独地反应来制备。代表性碱金属盐或碱土金属盐包括锂、钠、钾、钙、镁和铝盐等。可用于形成碱加成盐的代表性有机胺包括乙胺、二乙胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌嗪等(参见例如Berge等人，同上)。

润湿剂、乳化剂和润滑剂(如月桂基硫酸钠和硬脂酸镁)以及着色剂、脱模剂、包衣剂、甜味剂、调味剂和芳香剂、防腐剂和抗氧化剂也可存在于组合物中。

如本领域所熟知，如本文所描述制备的组合物可取决于待治疗的病症和患者的年龄、病况和体重以各种形式施用。例如，在组合物经口施用的情况下，所述组合物可被配制成片剂、胶囊剂、颗粒剂、粉剂或糖浆剂；或对于肠胃外施用，所述组合物可被配制成注射剂(静脉内、肌内或皮下)、滴液输注制剂或栓剂。对于通过眼粘膜途径施用，所述组合物可被配制成滴眼剂或眼药膏。这些配制物可通过常规方式结合本文所描述的方法制备，并且如果需要，可将活性成分与任何常规的添加剂或赋形剂混合，如粘结剂、崩解剂、润滑剂、矫味剂、增溶剂、悬浮助剂、乳化剂或包衣剂。

可改变本文提供的药物组合物中的活性成分的实际剂量水平，以便获得“治疗有效量”，其为有效地实现针对特定患者、组合物和施用模式的所需治疗反应而对患者无毒的活性成分的量。

药学上可接受的混合物中的本文提供的化合物的浓度将取决于几个因素而变化，包括待施用的化合物的剂量、采用的(一种或多种)化合物的药代动力学特征和施用途径。在一些实施例中，本文所提供的组合物可以含有约0.1％-10％w/v的本文所公开的化合物以及其它物质的水溶液形式提供，用于肠胃外施用。典型的剂量范围可包括每天每公斤体重约0.01到约50mg，以1-4个分次剂量给予。每个分次剂量可含有相同或不同的化合物。剂量将为取决于几个因素的治疗有效量，包括患者的整体健康状况以及所选择的(一种或多种)化合物的配制物和施用途径。

可制备含有在0.005％到100％范围内的如本文所描述的化合物的剂型或组合物，其中余量由无毒载剂补足。这些组合物的制备方法是本领域技术人员已知的。预期的组合物可含有0.001％-100％活性成分，在一个实施例中为0.1％-95％，在另一个实施例中为75％-85％。尽管剂量将取决于患者的症状、年龄和体重、待治疗或预防的病症的性质和严重程度、施用途径和药物形式而变化，但一般来说，建议成年人类患者的日剂量为0.01至2000mg的化合物，并且此剂量可以单次剂量或以分次剂量施用。可与载剂材料组合以产生单一剂型的活性成分的量将一般为化合物产生治疗效果的量。

在禁止对在人体上实践的方法授予专利权的权限中，将组合物“施用”于人类受试者的含义应限于开出一种人类受试者将通过任何技术(例如，口服、吸入、局部施用、注射、插入等)自我施用的受控物质。旨在与定义可获专利的主题的法律或法规相一致的最广泛的合理解释。在不禁止对在人体上实践的方法授予专利权的权限中，“施用”组合物包括在人体上实践的方法以及还有前述活动两者。

应理解，虽然已经结合其具体实施方式阅悉本公开，但前述描述旨在说明而非限制本公开的范围，本公开的范围由所附权利要求书的范围限定。其他方面、优点以及修改都处于所附权利要求书的范围内。

实例

提供以下实例用于说明，且并不旨在限制本发明的范围。

流程1.试剂和条件。(i)Cu(OAc)

4-氯-N-苯基苯胺(1)。向4-氯苯胺(0.32g，2.5mmol)和苯基硼酸(0.46g，3.75mmol)于无水DMSO(5mL)中的溶液中添加DBU(0.75mL，5mmol)和Cu(OAc)

(4-氯苯基)(苯基)氨基甲酰氯(2)。在0℃下向4-氯-N-苯基苯胺1(0.2g，0.98mmol)于无水DCM(3mL)中的溶液中添加三光气(0.32g，1.08mmol)。将预溶解于1mL DCM中的吡啶(0.11mL，1.38mmol)缓慢添加到反应混合物中。将反应物再搅拌15分钟，且接着使其升温到室温并搅拌2小时。通过缓慢添加水在冷却下将其淬灭(溶液变成粉红色)。萃取混合物并且用DCM再次洗涤水层。经合并的有机萃取物用盐水洗涤，经MgSO

(4-氯苯基)(苯基)氨基甲酸((1r,4r)-4-(羟甲基)环己基)甲酯(3)。在密封管中将氨基甲酰氯2(0.2g，0.75mmol)和(1r,4r)-环己烷-1,4-二基二甲醇(0.12g，0.83mmol)溶解在吡啶(0.81mL)中。在回流下加热反应混合物过夜。在冷却之后，将混合物在1M HCl与EtOAc之间分配。用EtOAc萃取水层，并用盐水洗涤经合并的有机萃取物，经MgSO

4-甲基苯磺酸((1r,4r)-4-((((4-氯苯基)(苯基)氨甲酰基)氧基)甲基)环己基)甲酯(4)。向醇3(0.24g，0.64mmol)于无水CH

(4-氯苯基)(苯基)氨基甲酸((1r,4r)4-(((5-氧代-4,5-二氢-1H-1,2,4-三唑-3-基)硫代)甲基)环己基)甲酯(A1)。向5-巯基-2,4-二氢-3H-1,2,4-三唑-3-酮(47mg，0.40mmol)于DMF(2mL)中的溶液中添加氢化钠(60％于矿物油中的分散液，21mg，0.53mmol)。在15分钟之后，逐滴添加甲苯磺酸酯4(0.14g，0.27mmol)于DMF(3.2mL)中的溶液。将反应混合物在室温下搅拌过夜，且接着在冷却下用1N HCl淬灭。将所得悬浮液用DCM(2次)和EtOAc(2次)萃取。有机萃取物用盐水洗涤，经MgSO

流程1.试剂和条件：(a)K

4-氯-N-苯基苯胺(3)。向1-氯-4-碘苯(2.5g，10mmol)和甘油(54ml)的混合物中添加苯胺(1.9ml，21mmol)、KOH(1.2g，21mmol)和CuI(40mg，0.21mmol)。将反应混合物在100℃下搅拌16个小时。将反应混合物冷却至室温，并用水稀释。混合物用EtOAc萃取(3次)。有机层用盐水洗涤，经Na

(4-氯苯基)(苯基)氨基甲酰氯(4)。向三光气(400mg，1.35mmol)和无水DCM(13ml)于0℃冰浴中的溶液中添加4-氯-N-苯基苯胺和吡啶(0.65ml，8.09mmol)。将反应物在环境温度下搅拌16小时。将反应混合物用饱和NH

(4-氯苯基)(苯基)氨基甲酸((1s,4s)-4-(羟甲基)环己基)甲酯(5)。向(4-氯苯基)(苯基)氨基甲酰氯(1.1g，4.13mmol)和吡啶(4.4ml，55.06mmol)的溶液中添加((1r,4r)-环己烷-1,4-二基)二甲醇(1.19g，8.27mmol)。将反应混合物在120℃下在回流下搅拌18小时。将反应混合物冷却到室温并加以浓缩。将浓缩物再悬浮于1:1EtO

(4-氯苯基)(苯基)氨基甲酸((1s,4s)-4-甲酰基环己基)甲酯(6)。向(4-氯苯基)(苯基)氨基甲酸((1s,4s)-4-(羟甲基)环己基)甲酯(610mg，1.63mmol)和DCM(5ml)于-78℃丙酮/干冰浴中的溶液中缓慢添加DMP(1.04g，2.45mmol)于DCM(20ml)中的溶液。将反应混合物在环境温度下搅拌3小时。反应混合物用1:1饱和NaHCO

(4-氯苯基)(苯基)氨基甲酸((1s,4s)-4-乙烯基环己基)甲酯(8)，向甲基三苯基碘化鏻(750mg，1.85mmol)和THF(5.4ml)的混合物中添加叔丁醇钾(218mg，1.94mmol)。将反应混合物在环境温度下搅拌4小时以获得于THF中的维蒂希试剂(Wittig reagent)。向(4-氯苯基)(苯基)氨基甲酸((1s,4s)-4-甲酰基环己基)甲酯(0.37g，0.99mmol)和THF(1ml)的溶液中添加所述混合物。将反应混合物在环境温度下搅拌16小时，并用水淬灭。将混合物用DCM萃取(3次)。有机层用水、盐水洗涤，经Na

(4-氯苯基)(苯基)氨基甲酸((1s,4s)-4-(2-羟乙基)环己基)甲酯(9)。向(4-氯苯基)(苯基)氨基甲酸((1s,4s)-4-乙烯基环己基)甲酯(227mg，0.61mmol)和THF(2ml)于0℃冰浴中的溶液中添加BH

4-甲基苯磺酸2-((1s,4s)-4-((((4-氯苯基)(苯基)氨甲酰基)氧基)甲基)环己基)乙酯(10)。向(4-氯苯基)(苯基)氨基甲酸((1s,4s)-4-(2-羟乙基)环己基)甲酯(9)(137mg，.35mmol)和DCM(5ml)的溶液中添加DMAP(86.3mg，0.71mmol)和4-甲基苯磺酰氯(135mg，0.71mmol)。将反应混合物在环境温度下搅拌4小时。用水淬灭混合物，并用DCM萃取(3次)。将有机层用盐水洗涤，经Na

(4-氯苯基)(苯基)氨基甲酸((1s,4s)-4-(2-((5-氧代-4,5-二氢-1H-1,2,4-三唑-3-基)硫代)乙基)环己基)甲酯(A2)。向5-巯基-2,4-二氢-3H-1,2,4-三唑-3-酮(39mg，0.33mmol)和DMF(1ml)于0℃冰浴中的溶液中添加NaH(18mg，0.44mmol)。将混合物在环境温度下搅拌20分钟。将4-甲基苯磺酸2-((1s,4s)-4-((((4-氯苯基)(苯基)氨甲酰基)氧基)甲基)环己基)乙酯(0.12g，0.22mmol)溶解于DMF(5ml)中并添加到所述混合物中。将混合物在环境温度下搅拌4小时，用冰水淬灭并用EtOAc萃取(3次)。用2N HCl中和水层直到pH为7，并用EtOAc萃取(2次)。将有机层用盐水洗涤，经Na

流程3.试剂和条件：(a)氧化铂(IV)，EtOH，环境温度，7天；(b)5-溴-2,3-二苯基吡嗪，KI，140℃，2天；(c)DMAP，4-甲基苯磺酰氯，DCM，环境温度，18小时；(d)5-巯基-2,4-二氢-3H-1,2,4-三唑-3-酮，NaH，DMF，环境温度，2天。

4-(异丙基氨基)丁-1-醇(3)。向4-氨基丁-1-醇(2.7ml，29mmol)于丙酮(3.5ml，47mmol)中的溶液中添加氧化铂(IV)(67mg，0.29mmol)。将混合物在H

4-((5,6-二苯基吡嗪-2-基)(异丙基)氨基)丁-1-醇(4)。向5-溴-2,3-二苯基吡嗪(1g，3.21mmol)和4-(异丙基氨基)丁-1-醇(2.32g，17.7mmol)的混合物中添加碘化钾(266mg，1.6mmol)。在140℃下将所述混合物在压力容器中搅拌2天。将反应混合物冷却至室温，并用水稀释。将混合物用EtOAc萃取(4次)，并将经合并的有机层用盐水洗涤，经Na

N-(4-氯丁基)-N-异丙基-5,6-二苯基吡嗪-2-胺(5)。向4-((5,6-二苯基吡嗪-2-基)(异丙基)氨基)丁-1-醇(200mg，0.55mmol)和无水DCM(8ml)的溶液中添加4-甲基苯磺酰氯(320mg，1.68mmol)和DMAP(210mg，1.72mmol)。将反应物在环境温度下搅拌18小时。用水稀释所述反应混合物，并用DCM萃取(3次)。将有机层用盐水洗涤，经Na

5-((4-((5,6-二苯基吡嗪-2-基)(异丙基)氨基)丁基)硫代)-2,4-二氢-3H-1,2,4-三唑-3-酮(A3)。向5-巯基-2,4-二氢-3H-1,2,4-三唑-3-酮(92.5mg，0.79mmol)和DMF(2ml)于0℃冰浴中的溶液中添加NaH(55mg，1.38mmol)。将N-(4-氯丁基)-N-异丙基-5,6-二苯基吡嗪-2-胺(150mg，.4mmol)溶解于DMF(9ml)中，并添加到混合物中。将反应物在环境温度下搅拌2天。将反应混合物用冰水淬灭，并用EtOAc萃取(3次)。用2N HCl将水层的pH调节至7，之后用EtOAc萃取(2次)。将有机层用盐水洗涤，经Na

在经口口服(“PO”)化合物施用和静脉内(“IV”)施用之后，测定化合物A3在小鼠中的血浆浓度

特异性.空白血浆和空白血浆/外加有内标物(CE302)的色谱图显示，空白血浆对化合物A3和IS的测定没有显著干扰。

校准曲线.化合物A3的浓度范围评估为1-5000ng/ml。用具有加权(1/X2)的线性回归构建曲线。通过绘制峰面积比(y)相对于浓度(x)(以ng/mL为单位)的曲线进行线性回归分析。峰面积比与浓度之间的线性关系由线性回归获得的相关系数(R)证明。

仪器条件.以下显示所测试化合物的LC-MS和质谱分析条件。

质谱分析条件：

结果.IV和PO给药组的个别和平均化合物A3浓度-时间数据列于表1中，并以图形方式呈现于图1中。

表1.PO和IV施用之后在2、4和7小时小鼠血浆中化合物A3浓度。

*异常值

将柠檬酸化的全血离心(200g，持续10分钟)以分离富血小板血浆。用酸性柠檬酸右旋糖(2.5％柠檬酸钠，1.5％柠檬酸，2.0％D-葡萄糖)和腺苷三磷酸双磷酸酶(0.02U/mL)处理富血小板血浆，且接着离心(2000g，持续10分钟)以使血小板沉淀。除非另外说明，否则血小板以3.0×10

将经洗涤的人类血小板以3×10

经洗涤的血小板用福斯高林(forskolin)(0.5μM)、12-HETre(20μM)或化合物A3(5nm、10nm、25nm、50nm、100n、、250nm、1μM、5μM、10μM和20μM)处理一分钟，接着直接在5倍Laemmeli样品缓冲液(1.5M Tris-HCl，pH 6.8，甘油、5％β-巯基乙醇、10％十二烷基硫酸钠(SDS)和1％溴酚蓝)中溶解。将样品煮沸五分钟，且接着在10％SDS-PAGE凝胶上运行。通过蛋白质印迹法使用奥德赛成像系统(LI-CoR)定量总-及磷酸化-VASP(丝氨酸157)的含量。如所期望，经福斯高林处理的血小板在VASP磷酸化方面也有所增加。化合物A3以低至10nm的浓度诱导VASP磷酸化。参见图4和图5。

向小鼠经口施用化合物A3(30mg/kg)，并且在8个时间点(0.25、0.5、1、2、4、8、12和24小时)监测小鼠(n＝3)中血浆的药物浓度并且通过如以上所描述的PK分析评估小鼠中血浆的药物浓度。

C57BL/6野生型(WT)对照小鼠购自杰克逊实验室(Jackson Laboratories)(美国缅因州巴尔港(Bar Harbor，ME，USA))并且饲养于密歇根大学(University of Michigan)的研究机构中。合成化合物A1并在聚乙二醇300(PEG 300)中专门配制以在小鼠中进行经口灌饲给药，用于活体内血栓形成和止血研究。对于激光诱导的提睾肌微动脉血栓形成模型，用化合物A1(3mg/kg)或用PEG 300通过每天经口施用2次持续2天治疗小鼠，之后在第三天进行活体内显微镜检查研究。

如上所述对成年小鼠(10-12周龄)进行麻醉并如详细所述进行手术准备，并且插入气管导管以便于呼吸。在整个实验过程中，准备提睾肌并用预热的碳酸氢盐缓冲盐水灌注。在血管损伤之前，通过颈静脉插管施用DyLight 488结合的大鼠抗小鼠血小板GP1bβ抗体(0.1μg/g；EMFRET Analytics)和Alexa Fluor647结合的抗纤维蛋白(0.3μg/g)或AlexaFlour 647大鼠抗小鼠CD62P(3μg/小鼠)。通过激光消融系统(消融！光消融系统(Ablate！photoablation system)；智能成像创新公司(Intelligent Imaging Innovations)，美国科罗拉多州丹佛(Denver,CO,USA))，在每只小鼠的微动脉(30-50μm直径)中诱导出多个独立的血栓。用配备固体激光发射系统(LaserStack；智能成像创新公司)和高速sCMOS相机的Zeiss Axio Examiner Z1荧光显微镜在63倍水浸物镜下实时获取受伤微动脉部位处的血栓形成图像。使用Slidebook程序，在减去在血管未损伤部分上定义的荧光背景后，分析所有捕获的图像在血栓形成过程中荧光强度的变化。

用聚乙二醇(PEG；对照，上部)治疗的野生型(WT)对照动物、用化合物CCG26368(6mg/kg，一天两次持续2天；中间)治疗的WT和用化合物A3(6mg/kg，一天两次持续2天；下部)治疗的WT中的提睾肌微动脉中生长的血栓中血小板聚集(绿色)和纤维蛋白形成(红色)的代表性图像在图6中示出，证明化合物A3在激光诱导的提睾肌微动脉血栓形成模型中会削弱血栓形成。

随时间推移记录在对照小鼠和用化合物A3(6mg/kg，每天两次持续2天)治疗的小鼠中损伤部位处血小板和纤维蛋白聚集的平均荧光强度(MFI)。用化合物A3治疗的野生型小鼠能够在激光诱导的提睾肌微动脉损伤之后减少血栓的生长(血小板和纤维蛋白聚集度)。参见图7和图8。

仅出于清楚理解的目的给出前述描述，且不应由此理解为不必要的限制，因为在本发明范围内的修改可对于本领域普通技术人员显而易见。

在本说明书全文以及随附权利要求书中，除非上下文另外要求，否则措辞“包含(comprise)”和变化形式(如“包含(comprises)”和“包含(comprising)”)应理解成暗示纳入所述整数或步骤或整数或步骤的群组，但不排除任何其它整数或步骤或整数或步骤的群组。

在整个说明书中，除非以其它方式描述，否则当将组合物描述为包括组分或材料时，预期组合物也可主要由所叙述组分或材料的任何组合组成或由其组成。同样，除非以其它方式描述，否则当将方法描述为包括具体步骤时，预期方法也可主要由所叙述步骤的任何组合组成或由其组成。在不存在非特定公开于本文中的任何要素或步骤的情况下，可适当地实践本文所说明性地公开的本发明。

本文中所公开的方法和其个别步骤的实践可手动地和/或借助于电子设备或由电子设备提供的自动化来执行。尽管已经参考具体实施例对方法进行了描述，但是本领域普通技术人员将容易了解，可使用与方法相关的行为的其它执行方式。例如，除非以其它方式描述，否则在不脱离所述方法的范围或精神的情况下，可改变各种步骤的次序。另外，可将个别步骤中的一些进行组合、省略或进一步再分成额外步骤。

本文中所引用的所有专利、出版物以及参考文献以引用的方式全部并入于此。在本公开与所并入的专利、出版物以及参考文献之间发生冲突的情况下，应以本公开为准。