用于蛋白质制造的载体

相关申请的交叉引用

本申请要求2018年12月4日提交的美国临时申请号62/775,194的优先权，所述临时申请的全部内容以引用方式并入本文。

技术领域

本发明涉及载体和其开发用于产生所关注蛋白质的宿主细胞系的用途，并且尤其涉及利用弱启动子驱动选择标记的载体。

背景技术

治疗性蛋白质药物是为最需要新型疗法的患者提供服务的一类重要药物。已开发出近期获得批准的重组蛋白治疗剂来治疗多种临床适应症，包括癌症、自身免疫性/炎症、暴露于感染物和遗传病症。蛋白质工程技术的最新进展使药物开发人员和制造商可以微调和利用所关注蛋白质的理想功能特性，同时保持(在某些情况下可以提高)产品安全性或功效或两者。

治疗性蛋白质的制造和生产是高度复杂的过程。例如，典型的蛋白质药物可能包括超过5,000个关键工艺步骤，是制造小分子药物所需步骤数量的许多倍。

类似地，包括单克隆抗体以及大的蛋白质或融合蛋白在内的蛋白质治疗剂的大小可以比分子量超过100kDa的小分子药物大几个数量级。另外，蛋白质治疗剂表现出必须维持的复杂的二级和三级结构。蛋白质治疗剂不能完全通过化学工艺来合成，并且必须在活细胞或生物体中制造；因此，细胞系、物种来源和培养条件的选择都会影响最终产品的特性。而且，大多数的生物活性蛋白需要翻译后修饰，当使用异源表达系统时，这些修饰可能会受到损害。另外，由于产物是由细胞或生物体合成的，因此涉及复杂的纯化过程。此外，还实施病毒清除过程，例如通过使用过滤器或树脂去除病毒颗粒，以及通过使用低pH值或清洁剂的灭活步骤，以防止蛋白质原料药被病毒污染的严重安全性问题。考虑到治疗性蛋白质在其巨大分子尺寸、翻译后修饰以及制造过程中涉及的多种生物材料方面的复杂性，增强特定功能属性同时保持通过蛋白质工程策略实现的产品安全性和功效的能力是非常合乎需要的。

尽管整合新颖策略和方法来修饰蛋白质药物产品并非易事，但潜在的治疗优势已推动在药物开发过程中增加这类策略的使用。当前正在使用多种蛋白质工程平台技术来增加新颖治疗性蛋白质药物的循环半衰期、靶向性和功能性，以及提高产量和产品纯度。例如，蛋白质缀合和衍生化方法，包括Fc融合、白蛋白融合和PEG化，目前正用于延长药物的循环半衰期。

蛋白质药物(生物制剂)的生产昂贵且耗时。在本领域中需要更有效的工具和方法来生产这类重要药物。

发明内容

本发明涉及载体和其开发用于产生所关注蛋白质的宿主细胞系的用途，并且尤其涉及利用弱启动子驱动选择标记的载体。

因此，在一些优选的实施方案中，本发明提供了用于表达所关注蛋白质的载体，所述载体包含与第一启动子序列可操作地缔合的编码选择标记的核酸序列和可操作地连接至第二启动子序列的编码所关注蛋白质的核酸序列，所述第一启动子序列已被改变成与第一启动子序列的未改变或野生型形式相比启动子活性降低。

在一些优选的实施方案中，已被改变成与第一启动子序列的未改变或野生型形式相比启动子活性降低的第一启动子序列是病毒自灭活(SIN)长末端重复(LTR)启动子序列。在一些优选的实施方案中，SIN LTR启动子序列与SEQ ID NO:3具有至少95％同一性。在一些优选的实施方案中，SIN LTR启动子序列是SEQ ID NO:3。

在一些优选的实施方案中，选择标记是谷氨酰胺合成酶(GS)。在一些优选的实施方案中，选择标记是二氢叶酸还原酶(DHFR)。

在一些实施方案中，载体包含与选择标记和编码所关注蛋白质的核酸可操作地缔合的单个poly A信号序列。在其它实施方案中，载体包含与选择标记可操作地缔合的第一poly A信号序列和与编码所关注蛋白质的核酸可操作地缔合的第二poly A信号序列。

在一些优选的实施方案中，所关注蛋白质选自由以下组成的组：Fc融合蛋白、酶、白蛋白融合物、生长因子、蛋白受体、单链抗体(scFv)、单链Fc(scFv-Fc)、双功能抗体和微型抗体(scFv-CH3)、Fab、单链Fab(scFab)、免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链。在一些优选的实施方案中，所关注蛋白质是Fc融合蛋白。

在一些实施方案中，载体是质粒。在一些优选的实施方案中，载体是病毒载体。在一些优选的实施方案中，载体是逆转录病毒载体。在一些优选的实施方案中，载体是慢病毒载体。

在一些优选的实施方案中，本发明提供了包含如上所述的载体的宿主细胞。在一些优选的实施方案中，宿主细胞系是GS敲除细胞系。在一些优选的实施方案中，宿主细胞系是DHFR敲除细胞系。在一些优选的实施方案中，宿主细胞系是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系。在一些优选的实施方案中，宿主细胞系是HEK 293或CAP细胞系。在一些优选的实施方案中，宿主细胞包含载体的约1个、20个、50个至1000个拷贝。在一些优选的实施方案中，宿主细胞包含载体的约10个至200个拷贝。在一些优选的实施方案中，宿主细胞包含载体的约10个至100个拷贝。在一些优选的实施方案中，宿主细胞包含载体的约20个至100个拷贝。

在一些优选的实施方案中，宿主细胞还包含至少第二载体，其编码并允许表达第二所关注蛋白质，并且其中所述第二载体不包括选择标记。在一些优选的实施方案中，宿主细胞还包含至少第二载体，其编码并允许表达第二所关注蛋白质，并且其中所述第二载体包括与第一载体中的选择标记不同的选择标记。在一些优选的实施方案中，第一载体中的第一所关注蛋白质是免疫球蛋白重链或轻链中的一个，并且第二载体中的第二蛋白质是免疫球蛋白重链或轻链中的另一个。在一些优选的实施方案中，第一所关注蛋白质是免疫球蛋白重链，并且第二所关注蛋白质是免疫球蛋白轻链。在一些优选的实施方案中，宿主细胞包含第二载体的约1个、20个、50个或100个至1000个拷贝。在一些优选的实施方案中，宿主细胞包含第二载体的约10个至200个拷贝。在一些优选的实施方案中，宿主细胞包含第二载体的约10个至100个拷贝。在一些优选的实施方案中，宿主细胞包含第二载体的约20个至100个拷贝。

在一些优选的实施方案中，本发明提供一种包含如上所述的宿主细胞的宿主细胞培养物。在一些优选的实施方案中，培养物产生1至50克/升/天的所关注蛋白质。在一些优选的实施方案中，培养物产生2至10克/升/天的所关注蛋白质。

在一些优选的实施方案中，本发明提供了一种用于产生所关注蛋白质的方法，所述方法包括培养如上所述的宿主细胞并从宿主细胞培养物中纯化所关注蛋白质。

在一些优选的实施方案中，本发明提供了一种感染性逆转录病毒颗粒，其包含以5'至3'顺序的以下元件：1)5'LTR；2)逆转录病毒包装区域；3)编码选择标记的核酸；4)内部启动子；5)可操作地连接至内部启动子的编码所关注蛋白质的核酸序列；和6)SIN 3'LTR。在一些优选的实施方案中，5'LTR是MoMuSV LTR或SIN LTR。在一些实施方案中，3'LTR包含poly A信号序列。在一些实施方案中，包装区域包含多个潜在的翻译起始位点。在一些优选的实施方案中，选择标记是GS。在一些优选的实施方案中，内部启动子是CMV启动子。在一些实施方案中，颗粒包含在编码所关注蛋白质的核酸的下游的单个poly A信号序列。在一些实施方案中，颗粒包含与选择标记可操作地缔合的第一poly A信号序列和与编码所关注蛋白质的核酸可操作地缔合的第二poly A信号序列。

其它实施方案提供了一种质粒，其包含以5'至3'顺序的以下元件：1)5'LTR(例如，SIN LTR)；2)包装区域；3)选择标记(例如，GS)；4)内部启动子(例如，CMV启动子)；5)可操作地连接至内部启动子的编码所关注蛋白质的核酸序列；以及6)poly A信号序列。在一些实施方案中，质粒包含在编码所关注蛋白质的核酸的下游的单个poly A信号序列。

另外的实施方案提供了一种系统，其包含：a)第一载体，其包含与第一启动子序列可操作地缔合的编码选择标记的核酸序列和可操作地连接至第二启动子序列的编码第一所关注蛋白质的核酸序列，所述第一启动子序列已被改变成与第一启动子序列的未改变或野生型形式相比启动子活性降低；和b)第二载体，其包含可操作地连接至启动子序列的编码第二所关注蛋白质的核酸序列，并且其中第二载体不包括选择标记。

在一些优选的实施方案中，本发明提供了一种用于产生所关注蛋白质的方法，所述方法包括：用如上所述的感染性逆转录病毒颗粒、质粒或载体系统转导或转染一个或多个宿主细胞，发展从所述一个或多个宿主细胞表达所关注蛋白质的宿主细胞系；在使宿主细胞系产生所关注蛋白质的条件下培养宿主细胞；以及从宿主细胞培养物中纯化所关注蛋白质。

在一些优选的实施方案中，本发明提供了如上所述的感染性逆转录病毒颗粒或质粒，其用于转导一个或多个宿主细胞以产生所关注蛋白质。

附图说明

图1.全长MMLV构建体的图。

图2.SIN MMLV LTR构建体的图。

图3.全长MMLV构建体的序列(SEQ ID NO:1)。

图4.SIN MMLV LTR构建体的序列(SEQ ID NO:2)。

图5.全长MMLV构建体与SIN MMLV LTR构建体之间的合并的细胞系滴度比较。

图6.使用全长MMLV构建体与SIN MMLV LTR构建体的方法之间的合并的细胞系滴度比较。

图7.SIN LTR序列(SEQ ID NO:3)。

图8.前病毒质粒构建体的图(SEQ ID NO:4)。

图9.前病毒质粒构建体的序列(SEQ ID NO:4)。

定义

为了便于理解本发明，下面定义了许多术语。

如本文所用，术语“宿主细胞”是指任何真核细胞(例如哺乳动物细胞、鸟类细胞、两栖动物细胞、植物细胞、鱼类细胞以及昆虫细胞)，无论位于体外还是体内。

如本文所用，术语“细胞培养物”是指细胞的任何体外培养物。此术语内包括连续细胞系(例如具有永生化表型)、原代细胞培养物、有限细胞系(例如非转化细胞)以及在体外维持的任何其它细胞群体，包括卵母细胞和胚胎。

如本文所用，术语“载体”是指当与适当的控制元件缔合时能够复制并且可以在细胞之间转移基因序列的任何遗传元件，例如质粒、噬菌体、转座子、粘粒、染色体、病毒、病毒粒子等。因此，所述术语包括克隆和表达媒介物以及病毒载体。

如本文所用，术语“感染复数”或“MOI”是指在宿主细胞转染或转导期间使用的载体：宿主细胞整合比率。例如，如果使用1,000,000个载体转导100,000个宿主细胞，那么感染复数为10。该术语的使用不限于涉及转导的事件，而是涵盖通过例如脂质体转染、显微注射、磷酸钙沉淀和电穿孔等的方法将载体引入宿主中。

如本文所用，术语“基因组”是指生物体的遗传物质(例如染色体)。

术语“所关注核苷酸序列”是指任何核苷酸序列(例如RNA或DNA)，出于任何原因(例如治疗疾病、赋予改良的质量、在宿主细胞中表达所关注蛋白质、表达核酶等)，本领域普通技术人员认为对其进行的操作是合乎需要的。这样的核苷酸序列包括但不限于结构基因的编码序列(例如报道基因、选择标记基因、致癌基因、耐药基因、生长因子等)，以及不编码mRNA或蛋白质产物的非编码调控序列(例如启动子序列、多聚腺苷酸化序列、终止序列、增强子序列等)。

如本文所用，术语“所关注蛋白质”是指由所关注核酸编码的蛋白质。

如本文所用，术语“编码……的核酸分子”、“编码……的DNA序列”、“编码……的DNA”、“编码……的RNA序列”和“编码……的RNA”是指沿着脱氧核糖核酸或核糖核酸的链的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的顺序或次序。这些脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的顺序决定了沿着多肽(蛋白质)链的氨基酸的顺序。因此，DNA或RNA序列编码氨基酸序列。

如本文所用，术语“启动子”、“启动子元件”或“启动子序列”是指当与所关注核苷酸序列连接时能够控制所关注核苷酸序列转录成mRNA的DNA序列。尽管不是必须的，但是启动子通常位于其控制转录成mRNA的所关注核苷酸序列的5'(即上游)，并提供用于RNA聚合酶和其它转录因子特异性结合的位点以启动转录。

如本文所用，术语“改变”在关于启动子使用时是指与参考野生型序列相比具有改变的核酸序列的启动子。例如，可以通过缺失某些启动子和/或增强子元件来改变序列启动子。

真核生物中的转录控制信号包含“启动子”和“增强子”元件。启动子和增强子由与参与转录的细胞蛋白发生特异性相互作用的DNA序列的短阵列组成(Maniatis等人,Science 236:1237[1987])。已经从多种真核来源分离了启动子和增强子元件，包括酵母、昆虫和哺乳动物细胞以及病毒中的基因(在原核生物中也发现了类似的控制元件，即启动子)。具体启动子和增强子的选择取决于要用来表达所关注蛋白质的细胞类型。一些真核启动子和增强子具有广泛的宿主范围，而其它在有限小组的细胞类型中起作用(综述参见Voss等人,Trends Biochem.Sci.,11:287[1986]；和Maniatis等人,上述)。例如，SV40早期基因增强子在来自许多哺乳动物物种的多种细胞类型中都非常活跃，并已被广泛用于在哺乳动物细胞中表达蛋白质(Dijkema等人,EMBO J.4:761[1985])。在广泛的哺乳动物细胞类型中活跃的启动子/增强子元件的两个其它实例是来自人延伸因子1α基因的启动子/增强子元件(Uetsuki等人,J.Biol.Chem.,264:5791[1989]；Kim等人,Gene 91:217[1990]；和Mizushima和Nagata,Nuc.Acids.Res.,18:5322[1990])和劳氏肉瘤病毒的长末端重复序列(Gorman等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79:6777[1982])和人巨细胞病毒(Boshart等人,Cell 41:521[1985])。

如本文所用的术语“启动子/增强子”表示含有能够提供启动子和增强子功能(即，由启动子元件和增强子元件提供的功能，参见以上对这些功能的讨论)的序列的DNA区段。例如，逆转录病毒的长末端重复序列包含启动子和增强子功能。增强子/启动子可以是“内源的”或“外源的”或“异源的”。“内源的”增强子/启动子是天然地与基因组中给定的基因连接的增强子/启动子。“外源的”或“异源的”增强子/启动子”是如下的增强子/启动子：借助于基因操纵(即，分子生物技术，如克隆和重组)其与基因并列放置，使得所述基因的转录通过所连接的增强子/启动子指导。

如本文所用，术语“LTR”的“长末端重复序列”是指位于逆转录病毒基因组的U3区域5'和3'中或与之分离的转录控制元件。如本领域已知的，长末端重复序列可以用作逆转录病毒载体中的控制元件，或从逆转录病毒基因组中分离出来，并用于控制从其它类型载体的表达。

如本文所用，术语“互补的”或“互补性”用于指通过碱基配对规则而相关的多核苷酸(即核苷酸序列)。举例来说，序列“5'-A-G-T-3'”与序列“3'-T-C-A-5'”互补。互补可以是“部分的”，其中仅一些核酸的碱基根据碱基配对规则匹配。或者，核酸之间可能存在“完全”或“全部”互补性。核酸链之间的互补性程度对核酸链之间杂交的效率和强度具有显著影响。这在扩增反应以及依赖于核酸之间的结合的检测方法中特别重要。

当关于核酸使用时，术语“同源性”和“同一性百分比”是指互补性程度。可能存在部分同源性(即部分同一性)或完全同源性(即完全同一性)。部分互补序列是至少部分抑制完全互补序列与靶核酸序列杂交的序列，并且使用功能性术语“基本上同源”来指代。可以在低严格性条件下使用杂交测定法(DNA印迹或RNA印迹、溶液杂交等)来检查完全互补序列与靶序列的杂交的抑制。基本上同源的序列或探针(即能够与另一所关注寡核苷酸杂交的寡核苷酸)在低严格性条件下将与完全同源的序列竞争并抑制其与靶序列的结合(即杂交)。这并不是说低严格性的条件允许非特异性结合；低严格性条件要求两个序列彼此的结合是特异性(即选择性)相互作用。可以通过使用甚至缺乏部分程度的互补性(例如小于约30％同一性)的第二靶标来测试非特异性结合的不存在；在不存在非特异性结合的情况下，探针将不与第二非互补靶标杂交。

如本文所用，术语“呈可操作的组合”、“呈可操作的顺序”和“可操作地连接”是指核酸序列以产生能够指导给定基因的转录和/或所需蛋白质分子的合成的核酸分子的方式进行连接。所述术语还指氨基酸序列以产生功能蛋白的方式进行连接。

如本文所用，术语“选择标记”是指编码酶活性的基因，或赋予在缺乏原本将是必需营养素的培养基中生长的能力的其它蛋白质；另外，选择标记可以赋予表达选择标记的细胞对抗生素或药物的抗性。

如本文所用，术语“逆转录病毒”是指如下逆转录病毒颗粒，其能够进入细胞(即，该颗粒含有可以与宿主细胞表面结合并促进病毒颗粒进入宿主细胞的细胞质中的膜相关蛋白，例如包膜蛋白或病毒G糖蛋白)，并将逆转录病毒基因组(作为双链前病毒)整合到宿主细胞的基因组中。术语“逆转录病毒”包括致瘤病毒亚科(Oncovirinae)(例如莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)、莫洛尼鼠肉瘤病毒(MoMSV)和小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)、泡沫病毒亚科(Spumavirinae)和慢病毒(例如人免疫缺陷病毒、猿猴免疫缺陷病毒、马感染性贫血病毒和山羊关节炎-脑炎病毒；参见例如美国专利第5,994,136号和第6,013,516号，两者通过引用并入本文中)。

如本文所用，术语“逆转录病毒载体”是指已经被修饰成表达所关注基因的逆转录病毒。逆转录病毒载体可用于通过利用病毒感染过程将基因有效地转移到宿主细胞中。克隆(即，使用分子生物技术插入)到逆转录病毒基因组中的外源或异源基因可以有效地被递送至易受逆转录病毒感染的宿主细胞中。通过众所周知的基因操纵，可以破坏逆转录病毒基因组的复制能力。所得到的复制缺陷型载体可以用于将新的遗传物质引入细胞，但它们无法复制。辅助病毒或包装细胞系可以用于允许载体颗粒组装并从细胞中流出。这类逆转录病毒载体包含复制缺陷型逆转录病毒基因组，其含有编码至少一个所关注基因的核酸序列(即，多顺反子核酸序列可编码超过一个所关注基因)、5'逆转录病毒长末端重复序列(5'LTR)；和3'逆转录病毒长末端重复序列(3'LTR)。

术语“假型化逆转录病毒载体”是指含有异源膜蛋白的逆转录病毒载体。术语“膜相关蛋白”是指与病毒颗粒周围的膜相关的蛋白(例如病毒包膜糖蛋白或弹状病毒科(Rhabdoviridae)病毒如VSV、Piry、金迪普拉(Chandipura)和莫科拉(Mokola)的G蛋白)；这些膜相关蛋白介导病毒颗粒进入宿主细胞。膜相关蛋白可以结合于特定的细胞表面蛋白受体，如逆转录病毒包膜蛋白那样，或者膜相关蛋白可以与宿主细胞的质膜的磷脂组分相互作用，如来源于弹状病毒科成员的G蛋白那样。

术语“异源膜相关蛋白”是指如下一种膜相关蛋白，其所源自的病毒不是与载体颗粒的核衣壳蛋白所源自的病毒相同的病毒类别或家族的成员。“病毒类别或家族”是指国际病毒分类学委员会指定的类别或家族的分类学等级。

如本文所用，术语“慢病毒载体”是指能够整合至非分裂细胞中的来源于慢病毒科的逆转录病毒载体(例如人免疫缺陷病毒、猿猴免疫缺陷病毒、马传染性贫血病毒和山羊关节炎-脑炎病毒)(参见例如美国专利第5,994,136号和第6,013,516号，其通过引用并入本文)。

术语“假型化慢病毒载体”是指含有异源膜蛋白(例如病毒包膜糖蛋白或弹状病毒科病毒如VSV、Piry、金迪普拉和莫科拉的G蛋白)的慢病毒载体。

如本文所用，术语“转座子”是指可从基因组中的一个位置移动或转座到另一位置的可转座元件(例如Tn5、Tn7和Tn10)。通常，转座由转座酶控制。如本文所用，术语“转座子载体”是指编码侧接转座子末端的所关注核酸的载体。转座子载体的实例包括但不限于美国专利第6,027,722号、第5,958,775号、第5,968,785号、第5,965,443号和第5,719,055号(其全部通过引用并入本文中)中所述的那些。

如本文所用，术语“腺相关病毒(AAV)载体”是指衍生自腺相关病毒血清型的载体，包括但不限于AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAVX7等。AAV载体可全部或部分缺失AAV野生型基因中的一个或多个，优选rep和/或cap基因，但保留功能性侧接ITR序列。

可以使用本领域已知的重组技术来构建AAV载体，以包括在两个末端(5'和3')侧接功能性AAV ITR的一个或多个异源核苷酸序列。在本发明的实践中，AAV载体可包括位于异源核苷酸序列上游的至少一个AAV ITR和合适的启动子序列，以及至少一个位于异源序列下游的AAV ITR。“重组AAV载体质粒”是指重组AAV载体的一种类型，其中载体包含质粒。通常，与AAV载体一样，5'和3'ITR位于选择的异源核苷酸序列的侧翼。

AAV载体还可以包括转录序列，例如聚腺苷酸化位点，以及选择标记或报告基因、增强子序列以及允许诱导转录的其它控制元件。在上文描述这类控制元件。

如本文所用，术语“AAV病毒粒子”是指完整的病毒颗粒。AAV病毒粒子可以是野生型AAV病毒颗粒(包含与AAV衣壳，即蛋白质外壳相关的线性单链AAV核酸基因组)或重组AAV病毒颗粒(如下所述)。在这方面，单链AAV核酸分子(有义/编码链或反义/反编码链，如那些术语一般所定义)可以被包装到AAV病毒粒子中；有义链和反义链具有同等的感染力。

如本文所用，术语“重组AAV病毒粒子”或“rAAV”定义为一种感染性复制缺陷型病毒，其由将异源核苷酸序列衣壳化(即，被蛋白外壳包围)的AAV蛋白壳构成，所述异源核苷酸序列又在5'和3'两侧侧接AAV ITR。用于构建重组AAV病毒粒子的许多技术是本领域已知的(参见例如美国专利第5,173,414号；WO 92/01070；WO 93/03769；Lebkowski等人,Molec.Cell.Biol.8:3988-3996[1988]；Vincent等人,Vaccines 90[1990](Cold SpringHarbor Laboratory Press)；Carter,Current Opinion in Biotechnology 3:533-539[1992]；Muzyczka,Current Topics in Microbiol.and Immunol.158:97-129[1992]；Kotin,Human Gene Therapy 5:793-801[1994]；Shelling和Smith,Gene Therapy 1:165-169[1994]；和Zhou等人,J.Exp.Med.179:1867-1875[1994]，其全部通过引用并入本文中)。

用于AAV载体(以及实际上，本文所述的任何载体)的合适核苷酸序列包括任何功能上相关的核苷酸序列。因此，本发明的AAV载体可以包含任何期望的基因，其编码靶细胞基因组中有缺陷或缺失的蛋白质，或者编码具有期望的生物学或治疗作用(例如抗病毒功能)的非天然蛋白质，或者序列可以对应于具有反义或核酶功能的分子。合适的基因包括用于治疗以下疾病的基因：炎性疾病、自身免疫、慢性和感染性疾病，包括例如AIDS、癌症、神经疾病、心血管疾病、高胆固醇血症等病症；各种血液疾病，包括各种贫血、地中海贫血和血友病；基因缺陷，例如囊性纤维化、高雪氏病(Gaucher's Disease)、腺苷脱氨酶(ADA)缺乏症、肺气肿等。已经在本领域中描述了可用于针对癌症和病毒疾病的反向疗法的许多反义寡核苷酸(例如与mRNA的翻译起始位点(AUG密码子)周围的序列互补的短寡核苷酸)(参见例如Han等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:4313-4317[1991]；Uhlmann等人,Chem.Rev.90:543-584[1990]；Helene等人>,Biochim.Biophys.Acta.1049:99-125[1990]；Agarwal等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:7079-7083[1989]；和Heikkila等人,Nature328:445-449[1987])。关于合适的核酶的讨论，参见例如Cech等人(1992)J.Biol.Chem.267:17479-17482和美国专利第5,225,347号，其通过引用并入本文中。

如本文所用，术语“纯化的”是指从正常环境中去除、分离或分开的分子，无论是核酸序列还是氨基酸序列。因此，“分离的核酸序列”是纯化的核酸序列。“基本上纯化的”分子至少60％不含，优选至少75％不含，并且更优选至少90％不含与它们通常相关的其它组分。

具体实施方式

本发明涉及载体和其开发用于产生所关注蛋白质的宿主细胞系的用途，并且尤其涉及利用弱启动子驱动选择标记的载体。

在一些优选的实施方案中，本发明的表达系统利用表达载体，所述表达载体包括与具有各种功能的另外的核酸序列可操作地缔合的编码所关注蛋白质(即，治疗性蛋白质或期望产生的其它蛋白质)的核酸序列。因此，例如，所关注核酸序列可以包括在用于表达多肽的多种表达载体中的任一种中。在本发明的一些实施方案中，载体包括但不限于逆转录病毒载体、染色体DNA序列、非染色体DNA序列和合成DNA序列(例如SV40的衍生物、细菌质粒、噬菌体DNA；杆状病毒、酵母质粒、衍生自质粒与噬菌体DNA的组合的载体以及病毒DNA，例如牛痘、腺病毒、鸡痘病毒和伪狂犬病)。考虑可以使用任何载体，只要它在宿主中可复制和可存活即可。在一些优选的实施方案中，载体是如以下中所述的逆转录病毒载体：美国专利第6,852,510号和第7,332,333号以及美国专利公布第200402335173号和第20030224415号，都通过引用整体并入本文中。在一些特别优选的实施方案中，载体是假型化逆转录病毒载体。在本发明的一些优选的实施方案中，哺乳动物表达载体包含复制起点、合适的启动子和增强子以及任何必需的核糖体结合位点、聚腺苷酸化位点、剪接供体和受体位点、转录终止序列和非5'侧接非转录序列。在其他实施方案中，源自SV40剪接的DNA序列和多腺苷酸化位点可以用于提供所需的非转录基因元件。

在一些优选的实施方案中，载体为逆转录病毒载体。许多逆转录病毒的基因组的组织是本领域众所周知的，并且这允许逆转录病毒基因组适应以产生逆转录病毒载体。携带所关注基因的重组逆转录病毒载体的产生通常在两个阶段完成。

首先，将所关注基因插入逆转录病毒载体中，该载体含有有效表达所关注基因所需的序列(包括可以由病毒长末端重复序列(LTR)或内部启动子/增强子和相关的剪接信号提供的启动子和/或增强子元件)、将病毒RNA有效包装到感染性病毒粒子中所需的序列(例如，包装信号(Psi)、tRNA引物结合位点(-PBS)、逆转录所需的3'调控序列(+PBS))和病毒LTR。LTR含有病毒基因组RNA缔合所需的序列、逆转录酶和整合酶功能、以及参与指导要包装在病毒颗粒中的基因组RNA表达的序列。出于安全原因，许多重组逆转录病毒载体缺乏病毒复制所必需的基因的功能性拷贝(这些必需基因被缺失或失能)；因此，所得病毒称为复制缺陷型。

其次，在构建重组载体之后，将载体DNA引入包装细胞系中。包装细胞系提供将病毒基因组RNA反式包装到具有期望宿主范围的病毒颗粒中所需的蛋白质(即，病毒编码的gag、pol和env蛋白)。宿主范围部分地由在病毒颗粒表面表达的包膜基因产物的类型控制。包装细胞系可以表达亲单嗜性、双嗜性或异嗜性包膜基因产物。或者，包装细胞系可能缺乏编码病毒包膜(env)蛋白的序列。在这种情况下，包装细胞系将病毒基因组包装到缺乏膜相关蛋白(例如env蛋白)的颗粒中。为了产生含有允许病毒进入细胞的膜结合蛋白的病毒颗粒，用编码膜结合蛋白(例如水疱性口炎病毒的G蛋白)的序列转染含有逆转录病毒序列的包装细胞系(VSV))。然后，转染的包装细胞将产生病毒颗粒，其包含由转染的包装细胞系表达的膜相关蛋白；这些病毒颗粒被称为假型化病毒颗粒，其含有来源于被另一种病毒的包膜蛋白衣壳化的一种病毒的病毒基因组RNA。

本发明的逆转录病毒载体可以被进一步修饰以包括另外的调控序列。如上所述，本发明的逆转录病毒载体包括处于可操作的缔合的以下元件：a)5'LTR；b)包装信号；c)3'LTR和d)位于5'与3'LTR之间的编码所关注蛋白质的核酸。在本发明的一些实施方案中，当期望从内部启动子转录时，所关注核酸可以处于与5'LTR相反的方向排列。合适的内部启动子包括但不限于α-乳清蛋白启动子、CMV启动子(人或猿猴)和胸苷激酶启动子。

在本发明的其它实施方案中，在希望分泌所关注蛋白质的情况下，通过包括与所关注蛋白质可操作地缔合的信号肽序列来修饰载体。几种合适的信号肽的序列是本领域技术人员已知的，包括但不限于来源于组织纤溶酶原激活物、人生长激素、乳铁蛋白、α-酪蛋白和α-乳清蛋白的信号肽序列。

在本发明的其它实施方案中，通过将RNA输出元件在3'或5'掺入编码所关注蛋白质的核酸序列来修饰载体(参见例如美国专利号5,914,267、6,136,597和5,686,120；和WO99/14310，都通过引用并入本文)。考虑使用RNA输出元件可以在不将剪接信号或内含子掺入编码所关注蛋白质的核酸序列中的情况下使所关注蛋白质高水平表达。

在其它实施方案中，载体还包含至少一个内部核糖体进入位点(IRES)序列。可获得几种合适的IRES的序列，包括但不限于来源于口蹄疫病毒(FDV)、脑心肌炎病毒和脊髓灰质炎病毒的序列。可以将IRES序列插入两个转录单元(例如编码不同的所关注蛋白质的核酸或多亚基蛋白如抗体的亚基)之间，以形成多顺反子序列，从而从相同的启动子转录两个转录单元。

最常使用的重组逆转录病毒载体来源于双嗜性莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)(参见例如Miller和Baltimore Mol.Cell.Biol.6:2895[1986])。MoMLV系统具有几个优点：1)这种特定的逆转录病毒可以感染许多不同的细胞类型，2)建立的包装细胞系可用于产生重组MoMLV病毒颗粒，并且3)转移的基因永久整合到靶细胞染色体中。建立的MoMLV载体系统包含DNA载体，其含有逆转录病毒序列的一小部分(例如病毒长末端重复序列或“LTR”和包装或“psi”信号)和包装细胞系。将要转移的基因插入DNA载体中。DNA载体上存在的病毒序列提供了将载体RNA插入或包装到病毒颗粒中以及表达所插入基因所需的信号。包装细胞系提供了颗粒装配所需的蛋白质(Markowitz等人,J.Virol.62:1120[1988])。

在一些优选的实施方案中，将逆转录病毒载体进行假型化，并且例如利用VSV的G蛋白作为膜相关蛋白。与结合特定细胞表面蛋白受体以进入细胞的逆转录病毒包膜蛋白不同，VSV G蛋白与质膜的磷脂组分相互作用(Mastromarino等人,J.Gen.Virol.68:2359[1977])。由于VSV进入细胞并不取决于特定蛋白质受体的存在，因此VSV具有极为广泛的宿主范围。带有VSV G蛋白的假型化逆转录病毒载体具有VSV所特有的改变的宿主范围(即，它们可以感染几乎所有脊椎动物，无脊椎动物和昆虫物种的细胞)。重要的是，VSV G假型化逆转录病毒载体可通过超速离心浓缩2000倍或更多倍，而不会显著损失感染性(Burns等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:8033[1993])。

当将病毒G蛋白用作病毒颗粒内的异源膜相关蛋白时，本发明不限于VSV G蛋白的使用(参见例如美国专利号5,512,421，其通过引用并入本文中)。除VSV以外水泡病毒属病毒中的G蛋白(例如Piry和金迪普拉病毒)与VSV G蛋白高度同源，并且像VSV G蛋白一样，含有共价连接的棕榈酸(Brun等人Intervirol.38:274[1995]和Masters等人,Virol.171:285(1990])。因此，可以使用Piry和金迪普拉病毒的G蛋白代替VSV G蛋白来对病毒颗粒进行假型化。另外，在丽沙病毒(Lyssa virus)属内的病毒例如狂犬病病毒和莫科拉病毒的VSV G蛋白表现出与VSV G蛋白的高度保守性(氨基酸序列以及功能保守性)。例如，已显示莫科拉病毒G蛋白的功能类似于VSV G蛋白(即，介导膜融合)，因此可代替VSV G蛋白用于病毒颗粒的假型化(Mebatsion等人,J.Virol.69:1444[1995])。如实施例2所述，可以使用Piry、金迪普拉或莫科拉G蛋白对病毒颗粒进行假型化，不同的是使用含有在合适的启动子元件(例如，CMV中间早期启动子；可以使用许多含有CMV IE启动子的表达载体，例如pcDNA3.1载体(Invitrogen))的转录控制下编码Piry、金迪普拉或莫科拉G蛋白的序列的质粒代替pHCMV-G。可以使用编码来源于弹状病毒科其它成员的其它G蛋白的序列；可以从GenBank数据库中获得编码多种弹状病毒G蛋白的序列。

在一些优选的实施方案中，载体为慢病毒载体。慢病毒(例如马传染性贫血病毒、山羊关节炎-脑炎病毒、人免疫缺陷病毒)是能够整合到非分裂细胞中的逆转录病毒的一个亚科。慢病毒基因组和前病毒DNA具有在所有逆转录病毒中发现的三个基因：gag、pol和env，其侧接两个LTR序列。gag基因编码内部结构蛋白(例如基质蛋白、衣壳蛋白和核衣壳蛋白)；pol基因编码逆转录酶、蛋白酶和整合酶蛋白；并且pol基因编码病毒包膜糖蛋白。5'和3'LTR控制病毒RNA的转录和聚腺苷酸化。慢病毒基因组中的另外的基因包括vif、vpr、tat、rev、vpu、nef和vpx基因。

多种慢病毒载体和包装细胞系是本领域已知的，并且可以在本发明中使用(参见例如美国专利第5,994,136号和第6,013,516号，均通过引用并入本文中)。此外，VSV G蛋白也已用于基于人免疫缺陷病毒(HIV)对逆转录病毒载体进行假型化(Naldini等人,Science272:263[1996])。因此，VSV G蛋白可用于产生多种假型化逆转录病毒载体，并且不限于基于MoMLV的载体。慢病毒载体也可以如上所述进行修饰，以含有各种调控序列(例如信号肽序列、RNA输出元件和IRES)。产生慢病毒载体后，如上文针对逆转录病毒载体所述，可将它们用于转染宿主细胞。

在一些优选的实施方案中，载体为腺相关病毒(AAV)载体。AAV是人DNA细小病毒，属于依赖病毒属(Dependovirus)。AAV基因组由含有约4680个碱基的线性单链DNA分子构成。基因组包括在每个末端的反向末端重复序列(ITR)，所述ITR顺式作用，作为DNA复制起点和病毒的包装信号。基因组的内部非重复部分包括两个大的开放阅读框，分别称为AAVrep和cap区域。这些区域编码参与病毒粒子复制和包装的病毒蛋白。从AAV rep区域合成至少四种病毒蛋白的家族，Rep 78、Rep 68、Rep 52和Rep 40(根据其表观分子量命名)。AAVcap区域编码至少三种蛋白质，VP1、VP2和VP3(对于AAV基因组的详细描述，参见例如Muzyczka,Current Topics Microbiol.Immunol.158:97-129[1992]；Kotin,Human GeneTherapy 5:793-801[1994])。

AAV需要与无关的辅助病毒，如腺病毒、疱疹病毒或牛痘共感染，以进行生产性感染。在没有这种共感染的情况下，AAV通过将其基因组插入宿主细胞染色体来建立潜伏状态。辅助病毒随后的感染挽救了整合的拷贝，所述拷贝然后可以复制以产生感染性病毒后代。与未假型化逆转录病毒不同，AAV具有广泛的宿主范围，并且能够在任何物种的细胞中复制，只要与也会在所述物种中繁殖的辅助病毒共感染即可。因此，例如，人AAV将在与犬科动物腺病毒共感染的犬科动物细胞中复制。此外，与逆转录病毒不同，AAV不与任何人或动物疾病相关，在整合后似乎不会改变宿主细胞的生物学特性，并且能够整合到非分裂细胞中。最近还发现，AAV能够位点特异性地整合到宿主细胞基因组中。

鉴于上述性质，已经开发了许多用于基因递送的重组AAV载体(参见例如美国专利第5,173,414号；第5,139,941号；WO 92/01070和WO 93/03769，都通过引用并入本文中；Lebkowski等人,Molec.Cell.Biol.8:3988-3996[1988]；Carter,Current Opinion inBiotechnology 3:533-539[1992]；Muzyczka,Current Topics in Microbiol.andImmunol.158:97-129[1992]；Kotin,(1994)Human Gene Therapy 5:793-801；Shelling和Smith,Gene Therapy 1:165-169[1994]；和Zhou等人,J.Exp.Med.179:1867-1875[1994])。

可以在已被AAV辅助质粒和AAV载体转染的合适的宿主细胞中产生重组AAV病毒粒子。AAV辅助质粒通常包括AAV rep和cap编码区，但缺少AAV ITR。因此，辅助质粒既不能复制也不能自身包装。AAV载体通常包括由提供病毒复制和包装功能的AAV ITR界定的选定的所关注基因。通过瞬时转染将辅助质粒和带有所选基因的AAV载体都引入合适的宿主细胞中。然后，将转染的细胞用辅助病毒(例如腺病毒)感染，所述辅助病毒可将存在于辅助质粒上的指导AAV rep和cap区域的转录和翻译的AAV启动子反式激活。形成带有所选基因的重组AAV病毒粒子，并且该重组AAV病毒粒子可以从制剂中纯化。一旦产生AAV载体，就可以将它们用于以期望的感染复数转染(参见例如美国专利5,843,742，通过引用并入本文中)宿主细胞以产生高拷贝数的宿主细胞。如本领域技术人员将理解的，AAV载体也可以如上所述进行修饰以含有各种调控序列(例如，信号肽序列、RNA输出元件和IRES)。

在一些优选的实施方案中，载体为基于转座子的载体。转座子是可移动的遗传元件，其可以从基因组中的一个位置移动或转座到另一个位置。基因组内的转座由转座子编码的转座酶控制。转座子的许多实例是本领域已知的，包括但不限于Tn5(参见例如de laCruz等人,J.Bact.175:6932-38[1993]、Tn7(参见例如Craig,Curr.TopicsMicrobiol.Immunol.Immunol.204:27-48[1996]；和Tn10(参见例如Morisato和Kleckner,Cell 51:101-111[1987])。转座子整合到基因组中的能力已被用于创建转座子载体(参见例如美国专利第5,719,055号；第5,968,785号；第5,958,775号；和第6,027,722号；所有均通过引用并入本文中。)因为转座子不是感染性的，所以经由本领域已知的方法(例如，电穿孔、脂转染或显微注射)将转座子载体引入宿主细胞中。因此，可以调节转座子载体与宿主细胞的比率，以提供期望的感染复数以产生本发明的高拷贝数宿主细胞。

适用于本发明的转座子载体通常包含插入两个转座子插入序列之间的编码所关注蛋白质的核酸。一些载体还包含编码转座酶的核酸序列。在这些载体中，插入序列之一位于转座酶与编码所关注蛋白质的核酸之间，从而在重组过程中不掺入宿主细胞的基因组中。或者，可以通过合适的方法(例如，脂质体转染或显微注射)提供转座酶。如本领域技术人员将理解的，转座子载体也可以如上所述进行修饰以含有各种调控序列(例如，信号肽序列、RNA输出元件和IRES)。

在一些优选的实施方案中，载体包括选择标记。合适的选择标记包括但不限于谷氨酰胺合成酶(GS)、二氢叶酸还原酶(DHFR)等。这些基因在美国专利第5,770,359号、第5,827,739号、第4,399,216号、第4,634,665号、第5,149,636号和第6,455,275号中描述；所有这些专利都通过引用并入本文中。在一些特别优选的实施方案中，选择标记是GS，并且具有与SEQ ID NO:2的位置1789至2910的序列共享至少80％、90％、95％、99％或100％同一性的序列。在一些优选的实施方案中，所利用的选择标记与缺乏由选择标记核酸序列编码的酶的产生的宿主细胞系相容。合适的宿主细胞系在下文更详细地描述。在其它实施方案中，选择标记是抗生素抗性标记，即产生的蛋白质为表达所述蛋白质的细胞提供对抗生素的抗性的基因。合适的抗生素抗性标记包括提供对新霉素的抗性的基因(新霉素抗性基因(neo))、潮霉素(潮霉素B磷酸转移酶基因)、嘌呤霉素(嘌呤霉素N-乙酰基转移酶)等。

在一些实施方案中，编码所述选择标记的核酸序列可操作地连接至启动子序列。在一些特别优选的实施方案中，已经例如通过突变改变启动子序列，使得与启动子的未改变形式相比启动子活性降低。这些启动子可以描述为弱启动子，因为与启动子连接的基因的表达以低水平(相对于高水平)发生。与由弱启动子调控的基因相比，由强启动子调控的基因产生更多的mRNA，从而产生更多的产物蛋白质。因此，本发明优选地使用已被改变以产生比可比较的未改变的启动子更少的mRNA的选择标记的启动子。

在一些优选的实施方案中，可操作地连接至选择标记的启动子是来自逆转录病毒或慢病毒的长末端重复序列(LTR)。在一些特别优选的实施方案中，启动子是已经通过去除LTR的U3区的全部或一部分而改变的LTR。在一些实施方案中，可操作地连接至选择标记的启动子是自灭活(SIN)LTR。合适的SIN LTR是本领域已知的。在一些优选的实施方案中，本发明的SIN LTR优选与SEQ ID NO:3具有至少80％、90％、95％、99％或100％的同一性，并且与当在U3区域中没有缺失时的启动子活性相比，SIN LTR最优选具有在其中的在U3区域中降低启动子活性的缺失。

应当理解，在载体是逆转录病毒载体的情况下，构建载体使得SIN LTR是逆转录病毒载体序列的3'LTR。由于在逆转录过程中U3缺失被拷贝到5'和3'LTR，因此整合的SIN载体仅包含缺失U3的LTR。本发明的示例性逆转录病毒载体的图如图2所提供。如可见，载体含有SIN 3'LTR。当逆转录时，载体图中所描绘的hCMV-MOMuSV LTR被载体图中所描绘的SIN 3'LTR替代，使得当载体整合到宿主细胞染色体中时，SIN LTR可操作地连接至所描绘的GScDNA并驱动它的表达。

在本发明的某些优选实施方案中，在表达载体中编码所关注蛋白质的核酸序列可操作地连接至适当的表达控制序列(启动子)以指导mRNA合成。适用于本发明的启动子包括但不限于LTR或SV40启动子、大肠杆菌lac或trp、噬菌体λP

如上文所提及，本发明的载体的示例性图提供于图3中并且对应于SEQ ID NO:2。在一些优选的实施方案中，载体包含以5'至3'顺序的以下元件：

-5’LTR(以hCMV-MoMuSV LTR为例)

-逆转录病毒包装区域

-编码选择标记的核酸(由GS cDNA例示)

-内部启动子(以猿猴CMV(sCMV)启动子为例

-可操作地连接至内部启动子的编码所关注蛋白质的核酸序列(以“anyway”序列为例)

-WPRE序列

-SIN 3'LTR。

在一些实施方案中，载体是包含以5'至3'顺序的以下元件的质粒：1)5’LTR(例如SIN LTR)；2)包装区域；3)选择标记(例如GS)；4)内部启动子(例如CMV启动子)；和5)可操作地连接至内部启动子的编码所关注蛋白质的核酸序列。

在一些实施方案中，载体包含在编码所关注蛋白质的核酸的下游单个poly A信号序列。例如，在一些实施方案中，载体包含以5'至3'顺序的以下组件：启动子(例如，SIN)-选择标记-终止密码子-启动子(例如CMV)-所关注蛋白质-终止密码子-polyA。

在一些实施方案中，本发明提供了宿主细胞和宿主细胞培养物，其中宿主细胞从上述载体表达所关注蛋白质。在优选的实施方案中，宿主细胞是哺乳动物宿主细胞。许多哺乳动物宿主细胞系是本领域已知的。通常，当将这些宿主细胞置于含有适当营养物和生长因子的培养基中进行单层培养或悬浮培养时，它们能够生长和存活，如下文更详细地描述。通常，细胞能够表达大量特定的所关注蛋白质并分泌至培养基中。合适的哺乳动物宿主细胞的实例包括但不限于中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1，ATCC CCl-61)；牛乳腺上皮细胞(ATCCCRL 10274；牛乳腺上皮细胞)；由SV40转化的猴肾CV1细胞系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚肾细胞系(被亚克隆用于悬浮培养生长的293或293细胞；参见例如Graham等人,J.GenVirol.36:59[1977])；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；小鼠塞托利细胞(sertoli cell)(TM4，Mather,Biol.Reprod.23:243-251[1980])；猴肾细胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人子宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；buffalo大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等人,Annals N.Y Acad.Sci.383:44-68[1982])；MRC 5细胞；FS4细胞；大鼠成纤维细胞(208F细胞)；MDBK细胞(牛肾细胞)；CAP(CEVEC's Amniocyte Production)细胞；以及人肝肿瘤细胞系(Hep G2)。

在一些特别优选的实施方案中，修饰宿主细胞，使得它们缺乏或天然缺乏在选择剂存在下细胞生长或存活所必需的并且由选择标记提供的酶活性。例如，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞已被修饰为缺乏GS。在载体包括GS选择标记的一些优选实施方案中，宿主细胞系缺乏GS。在一些特别优选的实施方案中，缺乏GS的宿主细胞系是可从Merck KGaA获得的

可以通过任何合适的方式将载体引入宿主细胞。在一些优选的实施方案中，已经产生了编码所关注蛋白质的载体(例如逆转录病毒载体)，它们可以用于转染或转导宿主细胞。优选地，以足以引起至少1个，优选至少2个或更多个逆转录病毒载体的整合的感染复数，用整合载体转染或转导宿主细胞。在一些实施方案中，可以利用10至1,000,000的感染复数，使得被感染的宿主细胞的基因组含有整合载体的2至1000个拷贝，优选整合载体的5至1000个拷贝，并且最优选整合载体的20至500个拷贝。在其它实施方案中，利用10至10,000的感染复数。当利用未假型化逆转录病毒载体进行感染时，将宿主细胞与来自逆转录病毒生产细胞的培养基一起温育，所述培养基含有所需滴度(即，集落形成单位，CFU)的感染性载体。当利用假型化逆转录病毒载体时，通过超速离心将载体浓缩至合适的滴度，然后加入至宿主细胞培养物中。或者，可以在适合于细胞类型的培养基中稀释浓缩的载体。另外，当期望宿主细胞表达超过一种所关注蛋白质时，可以用各自含有编码不同所关注蛋白质的核酸的多个载体转染宿主细胞。

在每种情况下，将宿主细胞暴露于含有感染性逆转录病毒载体的培养基中足够长的时间，以允许感染和随后整合载体。通常，用于覆盖细胞的培养基的量应保持尽可能小的体积，以促使每个细胞进行最大量的整合事件。作为一般准则，每毫升集落形成单位(cfu)的数目应约为10

在一些实施方案中，在转染或转导后，使细胞繁殖，然后进行胰蛋白酶消化和重新涂铺。然后选择单个集落以提供经过克隆选择的细胞系。在更进一步的实施方案中，通过DNA印迹或PCR测定法筛选经过克隆选择的细胞系，以验证已经发生所需数目的整合事件。还考虑克隆选择允许鉴定出产生优质蛋白质的细胞系。在其它实施方案中，转染后不对细胞进行克隆选择。

在一些实施方案中，用编码不同所关注蛋白质的载体转染宿主细胞。编码不同所关注蛋白质的载体可以用于同时转染细胞(例如，使宿主细胞暴露于含有编码不同所关注蛋白质的载体的溶液)，或者转染可以是连续的(例如，首先用编码第一种所关注蛋白质的载体转染宿主细胞，经过一段时间，然后用编码第二种所关注蛋白质的载体转染宿主细胞)。在一些优选的实施方案中，用编码第一所关注蛋白质的整合载体转染宿主细胞，选择(例如进行克隆选择)含有整合载体的多个整合拷贝的高表达细胞系，并用编码第二种所关注蛋白质的整合载体转染所选择的细胞系。可以重复这个过程以引入多种所关注蛋白质。在一些实施方案中，可以操纵感染复数(例如，增加或减少)以增加或减少所关注蛋白质的表达。同样，可以使用不同的启动子来改变所关注蛋白质的表达。考虑这些转染方法可以用于构建含有完整外源代谢途径的宿主细胞系，或为宿主细胞提供增强的蛋白质加工能力(例如，可为宿主细胞提供翻译后修饰所需的酶)。

在更进一步的实施方案中，用编码相同基因的载体连续转染细胞系。在一些优选的实施方案中，用编码所关注蛋白质的整合载体转染宿主细胞(例如，MOI为约10至1,000,000，优选100至10,000)，选择(例如，进行克隆选择)含有整合载体的单个或多个整合拷贝或表达高水平的所需蛋白质的细胞系，并用所述载体再转染所选择的细胞系(例如，MOI为约10至1,000,0000；优选100至10,000)。在一些实施方案中，鉴定和选择包含载体的至少两个整合拷贝的细胞系。这个过程可以重复多次直到获得所需水平的蛋白质表达，并且也可以重复以引入编码多种所关注蛋白质的载体。意外地，用相同基因进行连续转染引起所产生的细胞的蛋白质产量增加，不仅仅是累加。

本发明考虑多种连续转染程序。在一些实施方案中，在利用逆转录病毒载体的情况下，提供连续转导程序。在优选的实施方案中，对细胞集合进行连续转导。在这些实施方案中，使初始宿主细胞集合与逆转录病毒载体接触，优选感染复数在约0.5至约1000个载体/宿主细胞的范围内。然后将细胞在适当的培养基(例如，具有选择剂)中培养几天。然后取细胞的等分试样来确定整合的载体的数目并冷冻以备将来使用。然后将剩余的细胞与逆转录病毒载体重新接触，再次优选感染复数在约0.5至约1000个载体/宿主细胞的范围内。重复这个过程，直到获得具有所需数目的整合载体的细胞。例如，所述过程可以重复高达10至20次或更多次。在一些实施方案中，如果需要，可以在任何特定的转导步骤之后克隆选择细胞，但是，在不存在转导的情况下利用细胞集合会减少获得所需的整合载体拷贝数的时间。

在本发明的一些实施方案中，在合适的宿主株转化和宿主株在培养基中生长到适当的细胞密度之后，在宿主细胞培养期间分泌所关注蛋白质。在利用可扩增标记的一些优选实施方案中，考虑在包含基因抑制剂的培养基中培养转导的宿主细胞。合适的抑制剂包括但不限于用于抑制DHFR的甲氨蝶呤(methotrexate)和用于抑制GS的甲硫氨酸亚砜亚胺(Msx)或膦丝菌素(phosphinothricin)。考虑随着在细胞培养系统中这些抑制剂的浓度的增加，选择具有较高拷贝数的可扩增标记(以及因此所关注的一种或多种基因)或含有产生更高插入的细胞。

因此，根据本领域已知的方法培养含有如上所述的载体的宿主细胞。哺乳动物细胞的合适培养条件是本领域众所周知的(参见例如，J.Immunol.Methods(1983)56:221-234[1983],Animal Cell Culture:A Practical Approach第2版,Rickwood,D.和Hames,B.D.编辑,Oxford University Press,New York[1992])。

在适合于所培养的特定细胞的培养基中制备本发明的宿主细胞培养物。可商购的培养基例如ActiPro培养基(HyClone)、ExCell Advanced补料分批培养基(SAFC)、Ham'sF10(Sigma,St.Louis,MO)、最小必需培养基(MEM，Sigma)、RPMI-1640(Sigma)和达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)(DMEM，Sigma)是示例性营养溶液。合适的培养基还描述在美国专利第4,767,704号、第4,657,866号、第4,927,762号、第5,122,469号、第4,560,655号以及WO 90/03430和WO 87/00195中；它们的公开内容通过引用并入本文中。这些培养基中的任何一种可以根据需要补充血清、激素和/或其它生长因子(例如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(例如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲液(例如HEPES)、核苷(例如腺苷和胸苷)、抗生素(例如庆大霉素(gentamycin))、微量元素(定义为通常以微摩尔范围的最终浓度存在的无机化合物)、脂质(例如亚油酸或其它脂肪酸)和其合适承载体以及葡萄糖或同等的能量来源。在一些优选的实施方案中，在利用选择标记如GS的情况下，例如，培养基将缺乏谷氨酰胺。也可以本领域技术人员已知的适当浓度包含任何其它必需补充剂。

本发明还考虑将多种培养系统(例如，培养皿、96孔板、滚瓶和生物反应器)用于转染的宿主细胞。例如，可以在灌注系统中培养转染的宿主细胞。灌注培养是指通过保持高细胞密度的培养物提供培养基的连续流动。将细胞悬浮，并且不需要固体支撑物就可以继续生长。通常，必须连续提供新鲜营养，同时去除有毒代谢物，并且理想情况下，选择性去除死细胞。过滤、截留和微囊化方法都适合以足够的速率更新培养环境。

作为另一实例，在一些实施方案中，可以采用补料分批培养程序。在优选的补料分批培养中，首先将哺乳动物宿主、细胞和培养基提供给培养器皿，并且在培养过程中连续或以不连续的增量将另外的培养营养物供给至培养物中，在终止培养之前定期收获或不收获细胞和/或产物。补料分批培养可以包括例如半连续补料分批培养，其中定期去除整个培养物(包括细胞和培养基)，并用新鲜培养基替换。补料分批培养不同于简单的分批培养，在简单的分批培养中，用于细胞培养的所有组分(包括细胞和所有培养营养物)都在培养过程开始时被供应到培养器皿中。补料分批培养还可以与灌注培养区别开来，不同之处在于在此过程中没有从培养器皿中去除上清液(在灌注培养中，通过例如过滤、囊封、锚定至微载体等将细胞限制在培养物中，并且将培养基连续或间断地引入培养器皿中并从培养器皿中移出)。在一些特别优选的实施方案中，分批培养在滚瓶中进行。

此外，可以根据可能适合于具体宿主细胞和所考虑的具体生产计划的任何方案或例程来繁殖培养物的细胞。因此，本发明考虑单步或多步培养程序。在单步培养中，将宿主细胞接种到培养环境中，并且在细胞培养的单个生产阶段中采用本发明的方法。或者，设想多阶段培养。在多阶段培养中，可以分多个步骤或阶段培养细胞。例如，可以使细胞在第一步或生长阶段培养中生长，其中将可能从储存库中移出的细胞接种到适合于促进生长和高生存力的培养基中。通过将新鲜培养基加入到宿主细胞培养物中，可以将细胞维持在生长阶段持续合适的时间段。

设计补料分批或连续细胞培养条件，以在细胞培养物的生长阶段增强哺乳动物细胞的生长。在生长阶段，使细胞在使生长最大化的条件下和时间内生长。例如温度、pH值、溶解氧(dO2)等培养条件是用于具体宿主的培养条件，并且是普通熟练的技术人员将显而易见的。通常，使用酸(例如，CO2)或碱(例如，Na2CO3或NaOH)将pH值调节至介于约6.5与7.5之间的水平。培养哺乳动物细胞如CHO细胞的合适温度范围是约30℃至38℃之间，并且合适的dO2是空气饱和度的5-90％。

在多肽产生阶段之后，使用本领域确认的技术从培养基中回收所关注多肽。尽管所关注蛋白质也可以从宿主细胞溶解物中回收，但是优选从培养基中以分泌的多肽形式回收所关注蛋白质(例如，所关注蛋白质的分泌由信号肽序列指导)。第一步，将培养基或溶解物离心以除去颗粒状细胞碎片。此后，从污染物可溶的蛋白质和多肽中纯化多肽，以下程序是合适的纯化程序的示例：通过在免疫亲和或离子交换柱上分级分离；乙醇沉淀；反相HPLC；在二氧化硅上或在阳离子交换树脂(如DEAE)上进行色谱法；色谱聚焦；SDS-PAGE；硫酸铵沉淀；使用例如Sephadex G-75进行凝胶过滤；以及蛋白A琼脂糖凝胶柱，以去除如IgG等污染物。蛋白酶抑制剂，例如苯基甲基磺酰氟(PMSF)也可用于抑制纯化过程中的蛋白水解降解。另外，所关注蛋白质可以与允许纯化所关注蛋白质的标记序列同框融合。标记序列的非限制性实例包括六组氨酸标签，其可以由载体、优选pQE-9载体提供；和血凝素(HA)标签。HA标签对应于源自流感血凝素蛋白的表位(参见例如，Wilson等人,Cell,37:767[1984])。本领域技术人员将理解，顾及在重组细胞培养物中表达后多肽特性的变化，适合于所关注多肽的纯化方法可能需要修改。

实验

本发明提供了将逆转录病毒转导(在本文中称为

实验1:

从两种不同的病毒载体产生两种合并的细胞系。两种细胞系使用常规GPEx转导方法和GS敲除细胞系CHOZN产生。两种表达载体均被设计成表达测试蛋白“Anyway”。Anyway是一种Fc融合蛋白。两种表达载体之间的唯一区别是，一种载体在插入细胞系后将具有驱动GS基因表达的全长莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)LTR，而另一种载体将具有驱动GS表达的MMLV SIN LTR。在图1和图2中提供了用于产生逆转录载体颗粒的基因构建体。在图3和4中提供了基因构建体的序列。

CHOZN细胞系开发

逆转录载体的产生：将上述表达构建体引入HEK 293细胞系中，所述细胞系组成性地产生MLV gag、pro和pol蛋白。还将含有包膜的表达质粒与每个基因构建体共转染。共转染引起不具有复制能力的高滴度逆转录载体产生，所述载体通过超速离心浓缩并用于细胞转导(1,2)。使用由上述构建体产生的逆转录载体转导至CHO细胞中，导致3'LTR序列复制到序列的5'末端，代替hCMV-MoMuSV 5'LTR，并随后控制合并的细胞系中GS基因的表达。

用逆转录载体转导CHOZN细胞∶通过用由被开发用于表达Anyway蛋白的基因构建体制成的逆转录载体转导CHOZN中国仓鼠卵巢亲本细胞系来制备含有来自上述每个构建体的逆转录载体插入的合并的细胞系。进行单个转导周期以为两个构建体中的每一个生成合并的细胞系。在细胞转导完成后，将细胞系置于无谷氨酰胺的培养基中以进行GS选择。

Anyway从两种合并的细胞群体的补料分批产生∶转导后，在补料分批研究中，在一式两份的250mL摇瓶中将合并的细胞系按比例放大以提高产率。每个摇瓶均以在50mL工作体积的ExCell Advanced补料分批培养基(SAFC)中每毫升300,000个活细胞接种，并在具有5％CO

结果

结果在表1和图5中呈现。这些结果令人惊讶。在两个集合的平均基因拷贝数相似的情况下，两个合并的细胞系之间存在较大滴度差异。因此，即使平均基因拷贝数略高，野生型或全长LTR基因构建体也得到显著较低的滴度，这转化为每个基因插入物的细胞比生产率显著较低。含有基因构建体的SIN形式的高表达细胞出现了选择或竞争优势。

表1.两种基因构建体之间的合并的细胞系的比较。

实验2:

根据先前的结果，设计实验，以比较传统上实践GPEx技术的方法与方法完全相同但使用上述SIN-GS载体与CHOZN GS敲除细胞系组合来实践所述技术。保持方法尽可能相似，只有两个主要区别。首先是传统GPEx使用

GCHO和CHOZN细胞系开发：

逆转录载体的产生：将表达构建体引入HEK 293细胞系中，所述细胞系组成性地产生MLV gag、pro和pol蛋白。还将含有包膜的表达质粒与每个基因构建体共转染。共转染引起不具有复制能力的高滴度逆转录载体产生，所述载体通过超速离心浓缩并用于细胞转导(1,2)。

用逆转录载体转导CHOZN细胞∶通过用由被开发用于表达Anyway蛋白的含有GS的基因构建体或不具有GS的基因构建体制成的逆转录载体转导CHOZN中国仓鼠卵巢亲本细胞系或GCHO中国仓鼠卵巢亲本细胞系来制备含有来自每个构建体的逆转录载体插入的合并的细胞系。进行三个转导周期以在相应细胞系中为两个构建体中的每一个生成合并的细胞系。额外的周期通常会增加细胞系中插入物的数目，进而增加基因拷贝数。在每个转导周期完成后，将基于CHOZN的细胞集合置于无谷氨酰胺的培养基中进行GS选择。传统的GPEx细胞没有像正常程序那样进行选择。

结果

正如预期的那样，在重复转导周期下两种方法都增加了拷贝数。但是，与传统的GPEx相比，在每个新的GPEx细胞集合中观测到显著较高的基因拷贝数，如表2所示。

表2.在两个不同方法之间比较的合并的细胞系的基因拷贝数

Anyway从两个合并的细胞群体(3个转导周期)的补料分批产生：转导后，在补料分批研究中，在一式两份的250mL摇瓶中将合并的细胞系按比例放大以提高产率。每个摇瓶均以在50mL工作体积的ActiPro培养基(HyClone)中每毫升300,000个活细胞接种，并在具有5％CO

结果提供于表3和图6中。再次，观测到非常意外的结果。优化的传统GPEx克隆细胞系产生的Anyway产物最大表达为1.8g/L并且在任何克隆选择之前，新的GPEx集合超过所述表达量的两倍。新的GPEx集合具有更高的拷贝数以及每个基因插入物的更高产量，就像在实验#1中看到的那样。这两个因素共同引起细胞比生产率的显着差异，新的GPEx集合接近高3倍皮克/细胞/天。与传统集合相比，新GPEx集合的总体活细胞密度也更高，这也有助于所观测到的显著的滴度差异。

表3.两种不同方法之间关于Anyway的合并的细胞系比较

实验3和4:

以上数据是关于从单个基因产生的Fc融合蛋白。实验3和4利用

逆转录载体产生∶将表达构建体引入HEK 293细胞系中，所述细胞系组成性地产生MLV gag、pro和pol蛋白。还将含有包膜的表达质粒与每个基因构建体共转染。共转染引起不具有复制能力的高滴度逆转录载体产生，所述载体通过超速离心浓缩并用于细胞转导(1,2)。

用逆转录载体转导CHOZN细胞∶通过用由被开发用于表达两种不同的抗体的含有GS的重链和轻链基因构建体或不具有GS的基因构建体制成的逆转录载体转导CHOZN中国仓鼠卵巢亲本细胞系或GCHO中国仓鼠卵巢亲本细胞系来制备含有来自每个构建体的逆转录载体插入的合并的细胞系。进行两个轻链转导周期和三个重链转导周期，以在每个对应的抗体细胞系中为四个构建体中的每一个生成合并的细胞系。额外的周期通常会增加细胞系中插入物的数目，进而增加基因拷贝数。在每个转导周期完成后，将基于CHOZN的细胞集合置于无谷氨酰胺的培养基中进行GS选择。传统的GPEx细胞没有像正常程序那样进行选择。

Peelaway和Yourway从合并的细胞系群体(2个轻链转导周期和3个重链转导周期)的补料分批产生：转导后，在补料分批研究中，在一式两份的250mL摇瓶中将合并的细胞系按比例放大以提高产率。每个摇瓶均以在50mL工作体积的ActiPro培养基(HyClone)中每毫升300,000个活细胞接种，并在具有5％CO

结果

结果呈现在表4和表5中。观测到用新的载体和方法在滴度方面的显著优点。

表4.两种不同方法之间关于Peelaway抗体的合并的细胞系比较

表5.两种不同方法之间关于Yourway抗体的合并的细胞系比较

对4个Yourway细胞集合进行额外的拷贝数分析。将在1个轻链转导周期和2个重链转导周期后生成的细胞集合与在2个轻链转导周期和3个重链转导周期后生成的细胞集合进行比较。将这两个合并的细胞系中的每一个设置为在含有谷氨酰胺的培养基中继续生长，或者放置在缺乏谷氨酰胺的培养基中。对于四个合并的细胞系中的每一个，计算基因总数、重链基因数和轻链基因数的基因拷贝数。

表6.

这些数据表明，即使这些集合中的每个细胞都有大量拷贝的GS基因被SIN LTR驱除，对于拷贝数更多的那些，仍存在明显的选择，并且根据上述数据，这些拷贝的表达水平更高。

实验5

对于这个实验，使用Yourway抗体产品。用于生成细胞系的重链基因构建体与实验4中使用的相同。轻链基因构建体在所有方面都与重链基因构建体相同，除了它含有轻链编码序列并且缺少GS基因。对含有逆转录载体的每个轻链(-GS)和重链(+GS)进行单个转导以生成合并的细胞系。

逆转录载体产生∶将表达构建体引入HEK 293细胞系中，所述细胞系组成性地产生MLV gag、pro和pol蛋白。还将含有包膜的表达质粒与每个基因构建体共转染。共转染引起不具有复制能力的高滴度逆转录载体产生，所述载体通过超速离心浓缩并用于细胞转导(1,2)。

用逆转录载体转导CHOZN细胞：通过用由不具有GS的轻链基因构建体和含有GS的重链构建体制成的逆转录载体转导CHOZN中国仓鼠卵巢亲本细胞系来制备含有来自上述每个构建体的逆转录载体插入的合并的细胞系。进行一个轻链转导周期和一个重链转导周期以生成合并的细胞系。在两个转导周期完成后，将基于CHOZN的细胞集合分开，将一半置于无谷氨酰胺的培养基中，另一半在细胞扩增和随后的产率评估期间继续补充谷氨酰胺。

Yourway从合并的细胞系群体的补料分批产生(1个轻链转导和1个重链转导)∶在补料分批研究中，在250mL摇瓶中将合并的细胞系按比例放大以提高产率。摇瓶以在50mL工作体积的ActiPro培养基(HyClone)中每毫升300,000个活细胞接种，并在具有5％CO

结果

结果呈现在表7中。通过去除谷氨酰胺进行的选择显著增加细胞集合的重链基因拷贝数。有点出乎意料的是，轻链拷贝数也增加了，但没有达到重链的程度。总抗体产生也显著高于未选择的培养物，其中仅进行两次转导，而不是针对所述实验完成五次转导，水平即达到表5所示的水平。

表7.进行和不进行谷氨酰胺选择的Yourway抗体的合并的细胞系比较合并的细胞系由单个轻链转导(-GS)和单个重链转导(+GS)产生。

实验6

设计并产生一种基因构建体，以测试与逆转录载体转导相比，使用传统细胞转染方法，所述技术的操作是否相似。生成的传统质粒转染构建体的一个实例显示在图8(质粒图)和图9(实际质粒序列；SEQ ID NO:4)中。

1.Bleck,G.T.2005An alternative method for the rapid generation ofstable,high-expressing mammalian cell lines(A Technical Review)。BioprocessingJ.9月/10月第1-7页。

2.Bleck,G.T.,2010。

以上说明书中提到的所有公布和专利以引用方式并入本文。在不脱离本发明的范围和精神的情况下，本发明所描述的方法和系统的各种修改和变化对于本领域技术人员将是显而易知的。虽然已结合特定优选实施方案描述了本发明，但应理解的是，要求保护的本发明不应不适当地局限于此类特定实施方案。实际上，用于进行本发明的所述方式的各种修改对于本发明领域的技术人员来说是明显的，并且旨在包含在以下权利要求书的范围内。