纳米氧化铜的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及兽用生物制药技术领域，尤其涉及纳米氧化铜的制备方法及其应用。

背景技术

多年来由于抗生素在畜禽养殖业的大量使用，导致了环境中抗生素残留、多重耐药性等一系列问题的产生，严重威胁了人们的食品、健康安全。

2017年世卫组织发布了全球重大疫病名录，并指出某些革兰氏阴性菌已无法用目前市面上现有的抗生素治疗。为此，欧美发达国家从上世纪80年开始逐步禁用饲用抗生素。农业农村部已发布194号公告，要求自2020年起，饲料中全面禁止添加抗生素，健康养殖势在必行。因此，在当前“减抗、替抗”政策背景下，疫苗和中兽药成为研究的热点，但疫苗的研发无法往往及时满足病原的快速变异，而中兽药则存在药效成分不清楚等问题，这些因素制约了它们的快速发展。

近年来，随着纳米科技的进步，多种纳米材料已被广泛应用于病原诊断、治疗以及动物营养等畜牧兽医相关领域。纳米氧化铜具有价廉、高稳定性以及广谱抗菌活性的优点而被大量用于抗菌材料的制备。此外，还有学者研究发现纳米氧化铜能够破坏病毒的完整性，造成基因组降解。因此，纳米氧化铜为解决细菌耐药性、病毒疫苗失活等问题提供了新的思路。

发明内容

本发明解决的技术问题在于提供一种纳米氧化铜的制备方法，且本申请制备的纳米氧化铜可作为制备兽用抗病毒药物的应用。

有鉴于此，本申请提供了一种纳米氧化铜的制备方法，包括以下步骤：

A)将枇杷叶进行水提取，得到枇杷叶提取物；

B)将所述枇杷叶提取物和铜盐溶液混合，加热、反应，得到纳米氧化铜。

优选的，所述枇杷叶提取物的制备具体为：

将枇杷叶剪碎后和水混合，加热煮沸，冷却后抽滤，得到枇杷叶提取物。

优选的，所述铜盐溶液为硫酸铜溶液或氯化铜溶液，所述铜盐溶液的浓度为20～30mM/L；所述枇杷叶提取物浓度为20～100g/L；所述铜盐溶液和所述枇杷叶提取物的体积比为1：(3～6)。

优选的，所述加热、反应的过程具体为：

将得到的混合物加热至沸腾再冷却，重复间断加热至1～2h。

优选的，所述反应之后还包括：

将得到的反应物冷却至室温，离心后的沉淀物清洗，再进行灼烧。

优选的，所述离心的转速为6000～10000r/min，时间为10～30min。

优选的，所述灼烧的温度为300～500℃，时间为1～2h。

本申请还提供了所述的制备方法所制备的纳米氧化铜在制备兽用抗病毒药物中的应用。

优选的，所述病毒为猪繁殖与呼吸综合征病毒。

本申请提供了一种纳米氧化铜的制备方法，其首先将枇杷叶进行水提取，得到枇杷叶提取物，再将枇杷叶提取物和铜盐溶液混合，加热、反应，即得到纳米氧化铜。在制备纳米氧化铜的过程中，本申请以枇杷叶提取物作为还原剂，快速高效合成了纳米氧化铜；同时枇杷叶水提取物本身含有萜类、黄酮类、有机酸类、多酚类等多种生物活性物质，还具有一定的抗肿瘤、抗氧化作用，其可自然降解，使得纳米氧化铜的合成环保性好。进一步的，本申请制备的纳米氧化铜对病毒尤其是PRRSV具有较强的阻断和杀灭作用。

附图说明

图1为本发明制备纳米氧化铜的流程示意图；

图2为本发明实施例1制备的纳米氧化铜颗粒的紫外-可见光谱分析图；

图3为本发明实施例1制备的纳米氧化铜颗粒的扫描电镜照片和EDS分析照片；

图4为本发明实施例1制备的纳米氧化铜颗粒的透射电镜照片。

具体实施方式

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。

鉴于现有技术中抗菌材料的应用需求以及纳米氧化铜颗粒的性能特点，本申请提供了一种纳米氧化铜的制备方法，具体如图1所示，其以枇杷叶水提取物作为还原剂，环保、高效的合成了纳米氧化铜；具体的，本发明首先公开了一种纳米氧化铜的制备方法，包括以下步骤：

A)将枇杷叶进行水提取，得到枇杷叶提取物；

B)将所述枇杷叶提取物和铜盐溶液混合，加热、反应，得到纳米氧化铜。

在制备纳米氧化铜的过程中，本申请首先将枇杷叶进行水提取，得到枇杷叶提取物，在此过程中，所述枇杷叶需要经过预处理，即将新鲜的枇杷叶风干后剪碎。在枇杷叶处理完毕后，则将其与水混合，煮沸，冷却后抽滤，得到枇杷叶提取物；所述煮沸的时间为1～2h，所述抽滤采用0.3～0.6μm的滤膜进行抽滤，更具体地，采用0.4～0.5μm的滤膜进行抽滤。

按照本发明，然后利用上述制备的枇杷叶提取物进行铜盐的还原，以得到纳米氧化铜；具体为：将枇杷叶提取物和铜盐溶液混合，加热、反应，即得到纳米氧化铜。在上述过程中，所述铜盐溶液选自铜盐的可溶性溶液，更具体地选自硫酸铜溶液或氯化铜溶液。所述铜盐溶液的浓度为20～30mM/L，所述枇杷叶提取物浓度为20～100g/L；所述铜盐溶液和所述枇杷叶提取物的体积比为1：(3～6)；在上述溶液浓度的基础上，所述铜盐溶液和所述枇杷叶提取物的体积比为1：4或1:5。上述加热、反应的过程具体为：将铜盐溶液和枇杷叶提取物的混合物加热至沸腾再冷却，重复间断加热至1～2h。将上述得到的反应物冷却后，得到的反应液以6000～10000r/min离心10～30min，清洗后以300～500℃灼烧1～2h，即得到纳米氧化铜颗粒粉末。

本方法上述制备的纳米氧化铜的方法主要采用全年可采、随处可得的枇杷叶水提取物作为还原剂，其本身含有萜类、黄酮类、有机酸类、多酚类等多种生物活性物质，还具有一定的抗肿瘤、抗氧化作用、抗炎、抗过敏作用，在环境中自然降解，不会对环境造成任何危害；制备工艺简单，植物提取液采用水作为助溶剂、高温蒸煮即可；设备要求不高，合成效率高：采用微波炉短时间加热即可。实验结果证明，本申请制备的纳米氧化铜颗粒的直径为5～10nm，形状呈球体或圆柱体。本申请制备的纳米氧化铜颗粒的直径其粒径小于目前国内报道的葡萄糖预还原-水合肼液相法(20～30nm)和水合肼化学还原硫酸铜法(50.2nm)。

本申请还提供了上述纳米氧化铜在制备兽用抗病毒药物中的应用，更具体地是在抵抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)上的应用。

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的纳米氧化铜的制备及其应用进行详细说明，本发明的保护范围不受以下实施例的限制。

实施例1

纳米氧化铜制备：精确称取15g干燥的枇杷叶，剪切成条状，放于装有250mL水的烧杯中，电磁炉加热煮沸1h，冷却后采用0.45μm滤膜进行抽滤，并用水补齐至250mL；将50mL现配的30mM/L硫酸铜溶液与250mL枇杷叶提取物(浓度为60g/L)混匀，微波炉高火加热至沸腾再冷却，重复间断加热至1h；待反应物冷却至室温，收集反应液8000r/min离心20min，取底部沉淀用水清洗两遍，马弗炉400℃灼烧1h，得到纳米氧化铜颗粒。

将上述制备的纳米氧化铜颗粒检测，检测项目以及结果具体如下所示：

1)纳米氧化铜紫外-可见光谱吸收特征：

分散在水中的纳米氧化铜颗粒紫外-可见光谱如图1所示，在波长265-285nm处检测到有强吸收峰存在，与此前报道的最大吸收波段相同，这是由纳米氧化铜核心电子带间跃迁现象造成的；反应液的颜色变化(从橙黄-棕红)同样证实了纳米氧化铜成功合成，这是因为纳米氧化铜在形成过程中会产生表面等离子体共振。

2)纳米氧化铜颗粒形貌表征

图2中左图为纳米氧化铜的扫描电镜图片，如图可见大部分纳米氧化铜颗粒聚集成团，因此大部分颗粒粒径为300nm左右；X射线能谱分析(EDS)表明纳米氧化铜颗粒含质量百分比为55.1％的Cu原子和44.9％的O原子(如图2中的右图)，这与Kumar等的报道一致。如图3所示，将纳米铜颗粒在乙醇中超声20min分散后进行透射电镜观察，颗粒直径为5～10nm之间，形状呈球体、或圆柱体。

3)纳米氧化铜对细胞的安全浓度及抗病毒活性

细胞安全浓度测定结果表明药物最大安全浓度为0.3125mg/mL(见表1)，高于利巴韦林(0.016mg/mL)与龙胆草总苷(0.020mg/mL)，低于半边莲总生物碱(0.63mg/mL)与蜘蛛香醇提物(0.625mg/mL)。由表2可知，纳米氧化铜对PRRSV的预防作用较弱，最高抑制率为46.07％，与蜘蛛香水提物(44.6％)接近，远低于半边莲总生物碱(91.2％)和蜘蛛香醇提物(107.1％)；纳米氧化铜对PRRSV的阻断和杀灭作用较强，其最高抑制率分别为84.24％和89.78％,高于半边莲水提取物(60.2％和52.6％)和利巴韦林(68.9％和64.7％)。

表1绿色合成纳米氧化铜颗粒对Marc-145细胞的抑制率及安全浓度

表2不同处理方式下绿色合成纳米氧化铜颗粒对PRRSV的抑制率

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。