藻胆素结合肽及其应用

技术领域

本发明涉及肽及其应用，具体涉及藻胆素结合肽及其应用，属于肽技术领域。

背景技术

炎症，作为机体对外界刺激作出的防御性的反应，能够保护机体免受内部和外部相关因素所造成的损伤。但当炎症系统失调时，过度增殖和分化的炎症细胞以及过表达的炎症因子会对机体造成损伤，引发多种疾病，如肺纤维化、关节炎、慢性阻塞性肺病和慢性结肠炎等。

血红素加氧酶1（HO-1）是一种负责血红素分解的诱导酶。由于HO-1具有抗炎特性，所以HO-1成为治疗炎症的一个靶点。传统的HO-1诱导剂主要是金属卟啉，它们能显著上调HO-1的表达，但由于存在严重的毒性问题，所以不适合临床使用。最近的研究表明，胆红素等线性四吡咯也可以激活HO-1，但是胆红素等线性四吡咯的临床给药不仅存在毒性问题，还存在生物利用度低等问题。因此，亟需找到使用安全、耐受性好的线性四吡咯替代品。

藻类是光合自养的低等植物，复杂的外部逆境赋予了藻类独特的生物活性功能，使藻类具有十分广阔的应用前景，我国历代本草文献所载具有药用价值的食物也常常涉及藻类，例如：昆布、紫菜、鹿角菜等。藻蓝蛋白是存在于蓝藻、红藻、隐藻和少数一些甲藻中的捕光色素蛋白，由脱辅基蛋白和藻蓝胆素（Phycocyanobilin，PCB）通过硫醚共价键连接而成。藻蓝蛋白由α亚基和β亚基组成，α亚基通过Cys84连接一个PCB分子，而β亚基通过Cys82和Cys153连接两个PCB分子，PCB分子的结构以及其与Cys连接的位置见图1，由图1可知：PCB分子具有线性四吡咯结构。α亚基和β亚基首选组装成为单体（αβ），单体（αβ）进一步聚合形成三聚体（αβ）

发明内容

本发明的目的在于从藻胆蛋白中制备出使用安全和具有抗炎等效果的线性四吡咯替代品——藻胆素结合肽。

为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：

藻胆素结合肽，其特征在于，制备过程如下：

步骤1、酶解：将藻胆蛋白粉倒入装有纯水的酶解罐中，藻胆蛋白粉质量：纯水质量=1:50～80，自然pH值，将酶解罐内的水的温度升至45～50℃，加入藻胆蛋白粉质量1～2%的复合蛋白酶MC101，搅拌均匀，酶解4h，得到藻胆素结合肽料液1；

步骤2、灭活：将藻胆素结合肽料液1加热至70～78℃，保持6～8min，灭活，得到藻胆素结合肽料液2；

步骤3、离心：将藻胆素结合肽料液2泵入到离心机内进行离心，离心速率为3000～4000r/min，得到藻胆素结合肽料液3；

步骤4、板框压滤：将藻胆素结合肽料液3倒入到板框压滤机内进行压滤，板框压滤机上设有助滤剂，得到藻胆素结合肽料液4；

步骤5、负压浓缩：将藻胆素结合肽料液4泵入到单效蒸发器内进行负压浓缩，去除90%以上的水分，得到藻胆素结合肽料液5；

步骤6、瞬时喷雾干燥：将藻胆素结合肽料液5快速升温到90℃，然后泵入到干燥塔内进行瞬时喷雾干燥，形成干粉，即藻胆素结合肽；

整个制备过程避光。

前述的藻胆素结合肽，其特征在于，在步骤1中，前述藻胆蛋白粉包括：藻红蛋白粉、藻蓝蛋白粉和别藻蓝蛋白粉。

前述的藻胆素结合肽，其特征在于，在步骤4中，前述助滤剂选用的是AG-1000#硅藻土。

前述的藻胆素结合肽，其特征在于，在步骤5中，负压浓缩过程控制温度为50℃，负压0.1MPa。

前述的藻胆素结合肽，其特征在于，在步骤6中，干燥温度为140～155℃。

前述的藻胆素结合肽，其特征在于，在步骤6中，前述藻胆素结合肽包括：藻尿胆素结合肽、藻紫胆素结合肽、藻红胆素结合肽和藻蓝胆素结合肽。

本发明的有益之处在于：本发明从藻胆蛋白中制备得到的藻胆素结合肽使用安全，抗炎效果突出，同时还具有抗氧化和抗肺纤维化的效果，分子量小、易吸收。

附图说明

图1是PCB分子的结构图；

图2是藻蓝蛋白原料和藻蓝胆素结合肽的光谱扫描图谱；

图3是线性四吡咯藻蓝胆素标准品的甲醇溶液、酸性甲醇溶液及藻蓝蛋白的紫外-可见光光谱图；

图4是藻蓝胆素结合肽的分子量分布图；

图5是图藻蓝胆素结合肽对RAW264.7细胞增殖的影响图；

图6是藻蓝胆素结合肽对LPS诱导的小鼠RAW264.7细胞NO释放量的影响图；

图7是藻蓝胆素结合肽对细胞上清液中TNF-α表达水平的影响图；

图8是藻蓝胆素结合肽对细胞上清液中IL-6表达水平的影响图；

图9是藻蓝胆素结合肽对TGF-β1诱导的A549细胞形态的影响图；

图10是藻蓝胆素结合肽对TGF-β1诱导的A549细胞Collagen Ⅰ表达量的影响图；

图11是藻蓝胆素结合肽对TGF-β1诱导的A549细胞EMT相关标志蛋白表达的影响图；

图12是TGF-β1诱导HLF-1细胞α-SMA表达量免疫荧光染色结果图。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。

第一部分、制备藻蓝胆素结合肽

藻蓝蛋白对光敏感，藻蓝胆素结合肽容易在光下被氧化，所以整个制备过程需要避光。

步骤1：酶解

将藻蓝蛋白粉倒入装有纯水（通过反渗透膜技术制得）的酶解罐中，藻蓝蛋白粉质量﹕纯水质量=1:65，自然pH值（7左右），将酶解罐内的水的温度升至48℃，加入藻蓝蛋白粉质量1.5%的复合蛋白酶MC101（200000u/g，烟台麦特尔生物技术有限公司），搅拌均匀，酶解4h，得到藻蓝胆素结合肽料液1。

固液比对于藻蓝蛋白的酶解至关重要，直接影响其出成率（藻蓝蛋白肽冻干粉的质量/藻蓝蛋白原料的质量），通过试验发现，固液比为藻蓝蛋白粉质量﹕纯水质量=1:50～80时，出成率都在96%以上，较高。

藻蓝蛋白对温度敏感，温度过高，会有褪色现象，将直接影响藻蓝胆素结合肽最终的颜色，所以酶解温度不宜过高，通过试验发现，当酶解温度在45～50℃这个范围内时，藻蓝胆素结合肽最终的颜色为蓝绿色，与藻蓝蛋白的蓝色相比，颜色改变较少。

藻蓝蛋白中的藻蓝胆素对pH、温度都比较敏感，酶解过程中容易造成颜色改变，为了尽量减少最终产品——藻蓝胆素结合肽的颜色的改变并保证藻蓝胆素结合肽的活性，经过大量筛选实验，首次将复合蛋白酶MC101应用至藻蓝蛋白的酶解过程中，复合蛋白酶MC101的活性高，藻蓝蛋白肽出成率达到96%，藻蓝胆素出成率达到4.7%（藻蓝胆素的质量/藻蓝蛋白的质量=4.9%，4.9%*96%=4.7%），藻蓝蛋白原料和其经复合蛋白酶MC101酶解后得到的藻蓝胆素结合肽的光谱扫描图谱见图2，由图2可知：酶解肽在620nm处的吸光度显著下降，形成的吸收光谱的性质与线性四吡咯藻蓝胆素标准品形成的吸收光谱（图3）的性质非常接近，表明藻蓝蛋白已经被充分分解为线性藻蓝胆素结合肽，也进一步的证实了复合蛋白酶MC101的酶解效果好。采用复合蛋白酶MC101酶解藻蓝蛋白得到的藻蓝胆素结合肽，其颜色为蓝绿色，与藻蓝蛋白的蓝色相比，颜色改变少。

通过试验发现，复合蛋白酶MC101的用量为藻蓝蛋白粉质量的1%和2%时，酶解时间适宜，更加适合工业大生产，同时得到的藻蓝蛋白肽出成率较高；如果用量低于藻蓝蛋白粉质量的1%，会增加藻蓝蛋白粉的酶解时间，影响最终产品的色泽，同时造成酶解不彻底的现象；如果用量高于藻蓝蛋白粉质量的2%，会增加生产成本，造成不必要的浪费，所以复合蛋白酶MC101的用量在藻蓝蛋白粉质量的1～2%这个范围内都是可以的。

步骤2：灭活

将步骤1得到的藻蓝胆素结合肽料液1加热至75℃，保持7min，灭活，得到藻蓝胆素结合肽料液2。

灭活温度不宜过高，既要确保灭活充分，又要最大可能的减少温度对藻蓝胆素结合肽中的藻蓝胆素的破坏。通过试验发现，如果灭活温度超过80℃，藻蓝胆素结合肽料液的颜色会由蓝色逐渐变为紫色，就失去了藻蓝胆素结合肽原有的颜色，当灭活温度在70～78℃这个范围内、灭活时间在6～8min这个范围内时，藻蓝胆素结合肽料液的颜色都是蓝色的，没有改变。

步骤3：离心

将步骤2得到的藻蓝胆素结合肽料液2泵入到卧式离心机内进行离心，离心速率为3500r/min，留上清，得到藻蓝胆素结合肽料液3。

复合蛋白酶MC101的酶解效果好，离心沉淀量少，所以离心速率不需过高，在3000～4000r/min这个范围内都是可以的，这样可以降低能耗。

步骤4：板框压滤

将步骤3得到的藻蓝胆素结合肽料液3倒入到板框压滤机内进行压滤，板框压滤机上设有AG-1000#硅藻土（助滤剂），收集料液，得到藻蓝胆素结合肽料液4。

AG-1000#硅藻土具有良好的微孔结构，不仅能使藻蓝胆素结合肽料液获得较好的流速比，并且能滤除微细的悬浮物，保证了藻蓝胆素结合肽产品的澄清度。最重要的一点是：AG-1000#硅藻土pH值呈中性，对线性藻蓝胆素结合肽中的藻蓝胆素呈色成分的吸附性极小，使得藻蓝胆素结合肽原有的颜色能够得到保持。

步骤5：负压浓缩

将步骤4得到的藻蓝胆素结合肽料液4泵入到单效蒸发器内进行负压浓缩，过程控制温度为50℃，负压0.1MPa，每20min排放蒸发冷凝水，去除90%以上的水分，得到藻蓝胆素结合肽料液5。

步骤6：瞬时喷雾干燥

将步骤5得到的藻蓝胆素结合肽料液5快速升温到90℃，然后泵入到干燥塔内进行瞬时喷雾干燥，干燥温度为140℃（可适当升高至155℃），形成干粉，即藻蓝胆素结合肽。

该方法制备得到的藻蓝胆素结合肽为蓝绿色粉末，藻蓝蛋白肽出成率约为96%，藻蓝胆素出成率约为4.7%。

经检测，该方法制备得到的藻蓝蛋白肽的分子量分布如图4所示，与图4对应的表格如下：

由图4和上表可知，该方法制备得到的藻蓝蛋白肽平均分子量为583Da，<1000Da的组分达到了89.66%。

此外，根据模拟酶解推算：藻蓝胆素的平均分子量约为586Da，占总肽含量的4.9%左右，藻蓝胆素结合肽的分子量为700～1000Da，占总肽含量的4.7%左右。

目前，常用的HO-1激活剂——胆红素为脂溶性，这是由于其两个羧基分别与羰基、吡啶环中的N形成了氢键。而在藻蓝胆素结合肽中，肽的存在可能破坏了藻蓝胆素结合肽内部的氢键，因此藻蓝胆素结合肽的水溶性较好，这意味着：藻蓝胆素结合肽溶解性好。经试验发现，该藻蓝胆素结合肽的2wt‰的溶液是澄清透明的。

藻胆蛋白是存在于蓝藻、红藻、隐藻和少数一些甲藻中的捕光色素蛋白，可分为三种类型，分别是：藻红蛋白、藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白。每个藻胆蛋白亚基由一个脱辅基蛋白和1～5个线性四吡咯组成，线性四吡咯可以通过硫醚键的形式与藻胆蛋白的脱辅基蛋白上的半胱氨酸残基（Cys）相连。在藻胆蛋白中，常见的线性四吡咯有四种，分别是藻蓝胆素（phycocyanobilin，PCB）、藻红胆素（phycoerythrobilin，PEB）、藻尿胆素（phycourobilin，PUB）和藻紫胆素（phycobiliviolin，PXB或PVB），它们的最大吸收峰分别为620～650nm（PCB）、540～565nm（PEB）、568nm（PXB）和490nm（PUB）。在隐藻中，也存在有线性四吡咯，具体为15，16-二氢胆绿素（Cryptoviolin15，16-dihydrobiliverdin，DBV）和中胆绿素（Mesobiliverdin，MBV）。这些线性四吡咯在藻胆蛋白中也被称为藻胆素。经核磁共振光谱证实，这些藻胆素分子的碳骨架基本相同，分子量大小约为586kDa，都含有2个酮基（C=O）、七个碳碳双键（C=C）等，差异表现在双键位置与数量的不同。

因此，除了可以从藻蓝蛋白粉中制备得到藻蓝胆素结合肽以外，还可以从藻红蛋白粉和别藻蓝蛋白粉中制备得到具有线性四吡咯结构的藻蓝胆素结合肽、藻红胆素结合肽、藻尿胆素结合肽和藻紫胆素结合肽等。

第二部分、研究本发明制备得到的藻蓝胆素结合肽的抗炎作用

选用RAW264.7小鼠巨噬细胞作为细胞模型，采用脂多糖（LPS）对RAW264.7细胞进行诱导，使其表达相关炎症因子，并使用本发明制备得到的藻蓝胆素结合肽处理细胞上清液，通过Griess法和Elisa法对炎症因子的含量进行测量，研究该藻蓝胆素结合肽对炎症因子的清除能力。

1、试验方法

（1）RAW264.7细胞存活率测定

采用DMEM培养基将样品稀释至50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、；取对数生长的RAW264.7细胞，调整细胞浓度约为5×10

（2）RAW264.7细胞上清中NO的含量测定

给药组和LPS组加入100ng/mL LPS溶液50μL，对照组加入同等体积的DMEM培养液，培养24h后，吸取上清液100μL，采用碧云天NO检测试剂盒，按照试剂盒所示的方法对NO含量进行测定。

（3）RAW264.7细胞上清中TNF-α和IL-6的含量测定

给药组和LPS组加入100ng/mL LPS溶液50μL，对照组同等体积的DMEM培养液，培养24h后，吸取上清液100μL，采用华尔博思Elisa检测试剂盒，对TNF-α和IL-6进行检测，按照试剂盒所指示的步骤进行。

2、试验结果

（1）对RAW264.7细胞存活率的影响

采用CCK-8法，观察本发明制备得到的藻蓝胆素结合肽对RAW264.7细胞增殖的影响，进而观察该藻蓝胆素结合肽是否对细胞有毒性。

以相对细胞存活率≥90%为无细胞毒性为标准，该藻蓝胆素结合肽对RAW264.7细胞增殖的影响结果见图5。

由图5可知，不同浓度（50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml）的藻蓝胆素结合肽对RAW264.7细胞生长影响差异不明显，高浓度（200μg/ml）的藻蓝胆素结合肽对RAW264.7细胞增殖起到微弱的促进作用，也就是说，本发明制备得到的藻蓝胆素结合肽在0～200μg/ml这个浓度范围内均无明显的细胞毒性。

（2）对RAW264.7细胞NO的抑制作用

NO是生物体内的一种活性氮自由基，能够介导许多生物功能。巨噬细胞来源的NO在生理、病理中起着重要的作用，适量的NO能够促进机体的免疫应答，而NO的过表达会导致诸如类风湿性关节炎、动脉粥状硬化、组织损伤等炎症疾病。因此NO的表达水平决定了样品对炎症的诱导或者抑制作用。

实验采用Griess法检测本发明制备得到的藻蓝胆素结合肽对LPS诱导的小鼠RAW264.7细胞NO释放量的影响，检测结果见图6。

由图6可知，经过LPS诱导后的RAW264.7细胞上清液中NO释放量与对照组相比显著增加，也就是说，给予本发明制备得到的藻蓝胆素结合肽进行干预后，能够抑制RAW264.7细胞上清液中NO的表达水平，表明本发明制备得到的藻蓝胆素结合肽具有一定的抗炎活性。

（3）对RAW264.7细胞TNF-α和IL-6的抑制作用

TNF-α和IL-6是由巨噬细胞产生的重要的炎症因子，过度表达的TNF-α和IL-6往往会导致多种疾病的产生。因此通过检测TNF-α和IL-6含量的变化，可以研究样品的抗炎能力。

本实验在NO抑制试验的基础上，采用Elisa法测定本发明制备得到的藻蓝胆素结合肽对细胞上清液中TNF-α和IL-6表达水平的影响，进一步对其抗炎活性进行验证，检测结果见图7和图8。

由图7和图8可知，本发明制备得到的藻蓝胆素结合肽能有效地抑制上清液中TNF-α和IL-6的表达水平，且与模型组相比，TNF-α和IL-6的分泌量显著降低。

综上，本发明制备得到的藻蓝胆素结合肽具有显著的抗炎作用。也就是说，本发明制备得到的藻蓝胆素结合肽可以应用在抗炎药物的制备中。

由于其他三种藻胆素分子——藻尿胆素、藻紫胆素、藻红胆素的碳骨架与藻蓝胆素的碳骨架相同，差异仅表现在双键位置与数量的不同，因此，藻尿胆素结合肽、藻紫胆素结合肽和藻红胆素结合肽也和藻蓝胆素结合肽一样，都具有显著的抗炎作用，都可以应用在抗炎药物的制备中。

第三部分、研究本发明制备得到的藻蓝胆素结合肽对A549细胞和HLF-1细胞的抗纤维化作用

特发性肺纤维化（IPF）被认为是一种慢性、间质性肺炎。在组织病理上主要表现为肺泡上皮细胞受损、纤维化部位存在炎性细胞浸润、ECM堆积、EMT过表达以及成肌成纤维细胞的转化，最终导致气体交换及呼吸功能受损。虽然IPF的成因复杂，但是目前研究已经证实在IPF的发展过程中往往与炎症反应有关。在LPS的诱导下，巨噬细胞能够分泌TGF-β1等炎症因子，诱导成纤维细胞转化为肌成纤维细胞，加重IPF。因此本部分实验选用人肺上皮细胞A549细胞和人肺成纤维细胞HLF-1细胞，使用TGF-β1进行诱导，在体外模拟纤维化形成条件，采用本发明制备得到的藻蓝胆素结合肽处理细胞，检测其EMT相关标志物以及胶原蛋白Collagen Ⅰ的合成量的变化，观察本发明制备得到的藻蓝胆素结合肽抗肺纤维化效果。

1、试验方法

（1）对A549细胞形态的影响

细胞选用A549细胞，细胞培养条件及分组见下表。

表 细胞培养条件及分组

培养完成后用光学显微镜对A549细胞形态进行观察，并进行对比分析。

（2）对A549细胞Collagen I表达的影响

细胞选用A549细胞，细胞培养条件及分组与上表相同。继续培养24h；去上清后，细胞用PBS清洗两次；细胞用4%多聚甲醛过夜固定，PBS清洗5min，共计3次；PBS配制的1%TritonX-100孵育5min，PBS清洗5min；3%H

（3）对A549细胞EMT相关蛋白表达的影响

细胞选用A549细胞，细胞培养条件及分组与上表相同，待细胞密度达到60%时给与本发明制备得到的藻蓝胆素结合肽，72h后取培养细胞板，弃去培养基，100µl PBS冲洗3次，每次冲洗时间间隔为3min；采用4%甲醛室温对细胞进行固定，时间为20min；100µl PBS冲洗3次，每次冲洗时间间隔为5min；加入100µl封闭液，室温孵育1h；弃去封闭液，不进行洗涤，加入100µl稀释的一抗，4℃过夜放置；回收一抗，100µl PBS洗3次，每次冲洗时间间隔为5min；在暗处加入稀释的荧光二抗，立即放入盒内，避光放置，室温孵育1h；将二抗弃去，100µl PBS洗3次，每次冲洗时间间隔为5min；加50µl DAPI避光孵育5min，对标本进行核染，回收DAPI后，荧光显微镜观察。

（4）对HLF-1细胞α-SMA表达的影响

细胞选用HLF-1细胞，细胞培养条件及分组与上表相同；继续培养24h；去上清后，细胞用PBS清洗两次；细胞用4%多聚甲醛过夜固定，PBS清洗5min，共计3次；PBS配制的1%TritonX-100孵育5min，PBS清洗5min；3% H

2、实验结果

（1）藻蓝胆素结合肽对A549细胞形态的影响

在TGF-β1的诱导下，人肺上皮细胞（A549）会发生极化，细胞呈现出较为细长的梭型，并且发生EMT过程，显示出纤维化活性。藻蓝胆素结合肽对TGF-β1诱导的A549细胞形态的影响见图9，其中，（a）为对照组，（b）为模型组，（c）为低剂量组，（d）为高剂量组，低剂量为10μg/mL，高剂量为30μg/mL。

由图9可以看出，经过TGF-β1后的A549细胞形态有了较为明显的变化，从原来的鹅卵石状的细胞，变为非常明显的梭状细胞，细胞细长。经过本发明制备得到的藻蓝胆素结合肽处理后，在低剂量下A549细胞形态的恢复并不明显，大多数的细胞仍呈现梭状，而在高剂量下A549细胞形态的恢复较为明显，呈现出与对照组相似的鹅卵石状的细胞。

由此可见，本发明制备得到的藻蓝胆素结合肽能够有效的缓解TGF-β1诱导的A549细胞形态的变化，使A549细胞保持较为正常的细胞形态，并且高剂量（30μg/mL）下恢复效果较好，A549细胞形态基本恢复。也就是说，藻蓝蛋白及本发明制备得到的藻蓝胆素结合肽在一定程度上可以恢复由肺上皮细胞极化所引起的肺组织纤维化症状。

（2）藻蓝胆素结合肽对A549细胞Collagen I表达的影响

IPF一个非常显著的病症就是组织间细胞外基质过度沉积，过度沉积的ECM会加重IPF的发展。Collagen Ⅰ作为ECM的主要组成成分，在ECM过度沉积中发挥着重要的作用，并且胶原蛋白不易被降解，其转化速率非常的缓慢，对一般的蛋白酶具有较强的抵抗能力，因此胶原蛋白一旦生成，就很难被人体所清除，从而持续的加重IPF。因此，Collagen Ⅰ作为IPF非常重要的指标，通过检测A549细胞Collagen Ⅰ在藻蓝蛋白和本发明制备得到的藻蓝胆素结合肽作用前后的表达量的差异，就可以研究其对IPF的抑制作用。

胶原蛋白的生成速度相对于其他EMT标志性蛋白较慢，因此本实验对A549胶原蛋白表达模型的构建进行了摸索，结果显示在10ng/mL TGF-β1诱导72h后，胶原蛋白的表达量较好，能够作为肺纤维化细胞模型使用。

本发明制备得到的藻蓝胆素结合肽对A549细胞Collagen Ⅰ表达量的影响见图10，其中，（a）为对照组，（b）为模型组，（c）为低剂量组，（d）为高剂量组，低剂量为10μg/mL，高剂量为30μg/mL。

从图10中可以看出，对照组细胞基本不表达Collagen Ⅰ，在TGF-β1诱导72h后，A549细胞的Collagen Ⅰ表达量显著上升。低剂量（10μg/mL）的藻蓝胆素结合肽对A549细胞Collagen Ⅰ表达虽有一定的缓解作用，但影响并不明显，而在高剂量（30μg/mL）下，藻蓝胆素结合肽对Collagen Ⅰ表达的抑制作用最好，绿色荧光消退的幅度较大。

（3）藻蓝胆素结合肽对A549细胞EMT相关蛋白表达的影响

EMT是指上皮细胞转化为间质细胞的过程，在组织炎症以及组织纤维化过程中具有非常重要的作用。TGF-β能够通过NF-κB途径，诱导A549细胞发生EMT过程，表达诸如α-SMA、E-cadherin、N-cadherin以及Vimentin等标志性蛋白，通过测定细胞上清液中几种标志性蛋白表达含量的变化，可以研究样品对肺纤维化的作用效果。α-SMA、N-cadherin以及Vimentin的表达均能够促进IPF的发展，在肺纤维化的发生过程中起着非常重要的作用。而E-cadherin能够起到维持上皮细胞连接的作用，当E-cadherin的表达量发生下调，上皮细胞之间的联系被破坏，失去粘附性，使细胞的迁移能力大幅增加，形态发生改变，最终导致纤维化的发生。

藻蓝胆素结合肽对TGF-β1诱导的A549细胞EMT相关标志蛋白表达的影响见图11，其中，低剂量为10μg/mL，高剂量为30μg/mL。

由图11可以看出，经过TGF-β1诱导后的A549细胞α-SMA、N-cadherin以及Vimentin的表达量有着非常显著的上升，而E-cadherin的表达量则下降，证明A549细胞发生了EMT过程。也就是说，采用藻蓝胆素结合肽处理后，A549细胞EMT减弱，尤其在高计量（30μg/mL）下抑制Vimentin的作用效果较好。

（4）藻蓝胆素结合肽对HLF-1细胞α-SMA表达的影响

在IPF发展的过程中，成纤维细胞被诱导转化为肌成纤维细胞，而肌成纤维细胞同时具有成纤维细胞和平滑肌细胞的特点，参与到组织损伤修复和纤维化过程中，炎症损伤最终往往都是通过激活肌成纤维细胞，而导致肺纤维化的。α-SMA作为肌成纤维细胞活化的重要指标，其表达量的上升往往预示着肌成纤维细胞的激活以及肺纤维化的发展。因此，只需要测定成纤维细胞在TGF-β1诱导下α-SMA表达量的变化，就能够说明样品对肺纤维化的抑制作用。本实验采用TGF-β1诱导人肺成纤维细胞（HLF-1），然后加入不同浓度的藻蓝胆素结合肽进行处理，使用免疫荧光染色的方法测定处理72h后HLF-1细胞α-SMA表达量的情况，与对照组以及模型组进行对比，研究本发明制备得到的藻蓝胆素结合肽的抗肺纤维化能力。

TGF-β1诱导HLF-1细胞α-SMA表达量免疫荧光染色结果见图12，其中，（a）为对照组，（b）为模型组，（c）为低剂量组，（d）为高剂量组，低剂量为10μg/mL，高剂量为30μg/mL。

从图12中可以看出，模型组在经过TGF-β1诱导72h后，表达出大量的α-SMA，细胞逐渐由成纤维细胞向肌成纤维细胞转化。而经过藻蓝胆素结合肽处理过的HLF-1细胞其绿色荧光明显减少。

综上，本发明制备得到的藻蓝胆素结合肽在A549细胞和HLF-1细胞实验中均表现出较好的抗肺纤维化活性。也就是说，本发明制备得到的藻蓝胆素结合肽可以应用在抗肺纤维化药物的制备中。

由于其他三种藻胆素分子——藻尿胆素、藻紫胆素、藻红胆素的碳骨架与藻蓝胆素的碳骨架相同，差异仅表现在双键位置与数量的不同，因此，藻尿胆素结合肽、藻紫胆素结合肽和藻红胆素结合肽也和藻蓝胆素结合肽一样，都具有较好的抗肺纤维化活性，都可以应用在抗肺纤维化药物的制备中。

第四部分、藻胆素结合肽的其他应用

由于藻尿胆素结合肽、藻紫胆素结合肽、藻红胆素结合肽也和藻蓝胆素结合肽都具有大量的共轭双键，因此，这些藻胆素结合肽在抗氧化方面也具有良好的应用前景。

此外，由于藻尿胆素结合肽、藻紫胆素结合肽、藻红胆素结合肽也和藻蓝胆素结合肽都具有良好的颜色，并且比藻蓝蛋白的颜色更为稳定，因此，这些藻胆素结合肽也都可以作为新型色素使用。

需要说明的是，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。