用于治疗退行性关节炎的脐血干细胞的培养方法

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，具体涉及用于治疗退行性关节炎的脐血干细胞的培养方法。

背景技术

脐带血是指胎儿娩出，将脐带结扎并离断后，残留在胎盘和脐带中的血液，脐带血中含有大量的干细胞，包括造血干细胞和多种其他干细胞，统称为脐带血干细胞，目前还有多项脐带血在再生医学方面的临床研究，目的是利用脐带血干细胞促进机体组织和器官的损伤修复，为了方便存储和临床应用，脐带血经过分离制备的过程尽可能的去除红细胞及血浆，其有核细胞成分被富集起来，富集的细胞里即含有多种干细胞，具有自我更新能力及分化为多种成熟细胞的潜能；同时还含有大量的免疫细胞，具有很好的免疫调节和抗感染作用，富集的脐带血细胞最终将被保存在深低温的液氮罐中，处于休眠状态，对于脐带血在液氮中可永久保存的理论已得到医学界的广泛认同，干细胞是具有自我更新、高度增殖和多项分化潜能的细胞群体，这些细胞可以通过分裂维持自身细胞的特性和数量，又可进一步分化为各种组织细胞，从而在组织修复等方面发挥积极作用。

现有的脐血干细胞在培养时，分离成功率低，培养过程中细胞增殖率低，不能有效在临床治疗中发挥作用，因此，发明用于治疗退行性关节炎的脐血干细胞的培养方法很有必要。

发明内容

为此，本发明提供用于治疗退行性关节炎的脐血干细胞的培养方法，通过对脐带上的脐带血进行高效提取后，置于恒温振荡仪内，通过筛网过滤收集细胞，然后调整细胞密度，置于饱和湿度、温度为37℃、体积分数为5％的CO

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：用于治疗退行性关节炎的脐血干细胞的培养方法，具体操作步骤如下：

S1：将脐带浸泡在含有0.9％生理盐水的培养基里，在培养基内添加抗生素，在4℃环境下运输；

S2：在操净台内取出脐带，用D-PBS冲洗净脐动脉和脐静脉内的残余血液，用止血钳和剪刀剔除上述血管，将脐带剪成1mm^3大小的组织块后放入200mL 蓝盖试剂瓶；

S3：加入质量/体积比为0.1％的II型胶原酶30mL，置于恒温振荡仪内持续消化5h，100目筛网过滤收集细胞；

S4：加入生理盐水冲洗细胞4次，每次2000rpm，8min；

S5：用含体积分数为10％胎牛血清的DMEMF/12培养液重悬细胞，调整细胞密度为1x108cells/ml，接种于6孔板培养瓶中，置于饱和湿度、体积分数为 5％的CO

S6：3天后全量换为MesenPRORSrMMedium培养液，弃去未贴壁的细胞与杂质，根据细胞生长情况，每2天换液一次；

S7：获得的细胞长到80％融合时，用0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA混合液消化，显微镜下观察，控制消化时间，待胞质回缩，加含10％FBS的DMEM/F12培养液终止消化；

S8：将细胞悬液1000rpm离心3min，原代细胞以1:1的比例进行传代，记为P1代；

S9：传代第二天培养液换为MesenPRORSa-MMedium培养液，P2代以后按1:3、 1:4的比例传代，直至细胞彼此融合。

作为本发明所述的用于治疗退行性关节炎的脐血干细胞的培养方法的一种优选方案，其中：步骤S1中，抗生素采用庆大霉素，浓度为25mg/L。

作为本发明所述的用于治疗退行性关节炎的脐血干细胞的培养方法的一种优选方案，其中：步骤S2中，脐血收集时间与制备时间的间隔小于5h。

作为本发明所述的用于治疗退行性关节炎的脐血干细胞的培养方法的一种优选方案，其中：步骤S5中，细胞培养的CO

作为本发明所述的用于治疗退行性关节炎的脐血干细胞的培养方法的一种优选方案，其中：步骤S6中，当细胞贴壁生长至80％-90％汇合后，吸出培养液，用D-Hanks液冲洗2次，加入胰蛋白酶混合液进行消化。

本发明的有益效果是：

通过对脐带上的脐带血进行高效提取后，置于恒温振荡仪内，通过筛网过滤收集细胞，然后调整细胞密度，置于饱和湿度、温度为37℃、体积分数为5％的CO

具体实施方式

以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明提供的用于治疗退行性关节炎的脐血干细胞的培养方法；

进一步地，具体操作步骤如下：

S1：将脐带浸泡在含有0.9％生理盐水的培养基里，在培养基内添加抗生素，在4℃环境下运输，抗生素采用庆大霉素，浓度为25mg/L，抗生素还可以采用链霉素、青霉素和两性霉素B，抗生素具有保持脐带为无菌条件，有效避免脐带的污染，在培养细胞过程中，使用浓度适合的抗生素，可以防止污染以及污染引起的形态或生理变化，除了防止污染外，抗生素还用于筛选转染、基因修饰的细胞；

S2：在操净台内取出脐带，用D-PBS冲洗净脐动脉和脐静脉内的残余血液，用止血钳和剪刀剔除上述血管，将脐带剪成1mm^3大小的组织块后放入200mL 蓝盖试剂瓶，脐血收集时间与制备时间的间隔小于5h，脐带血是指胎儿娩出，将脐带结扎并离断后，残留在胎盘和脐带中的血液，脐带血中含有大量的干细胞，脐带血尽管量不多，能用来进行造血干细胞移植，脐带血干细胞移植所引发的后遗症更低，而且干细胞的排斥机率也低，脐带血的干细胞与人体的配对率很高，脐带血干细胞的浓度十分高而且品质优良，约骨髓细胞浓度的10到20 倍，细胞的增生能力也比较高，移植脐带血干细胞也比移植骨髓或周边血干细胞带感染到病毒的可能性也较低，因为胎盘拥有很好的过滤能力同时脐带血干细胞拥有极高的纯度，利用脐带血干细胞促进机体组织和器官的损伤修复，脐带血中还含有丰富的其他类干细胞，例如间充质干细胞、内皮祖细胞、非限制性体干细胞和极小胚胎样干细胞；

S3：加入质量/体积比为0.1％的II型胶原酶30mL，置于恒温振荡仪内持续消化5h，100目筛网过滤收集细胞，II型胶原酶对细胞进行解离，II型胶原酶是一种蛋白酶，一种肽链内切酶，能够切割序列中性氨基酸和甘氨酸之间的肽键，胶原酶可以降解具有三股超螺旋结构的天然胶原纤维的蛋白酶，胶原纤维广泛存在结缔组织内，恒温振荡仪是培养细胞组织生长的理想设备，恒温振荡仪采用电磁振荡原理，是通过电子线路板组成部分产生交变磁场、不锈钢材质容器即切割交变磁力线而产生交变的电流，涡流使容器壁铁分子高速无规则运动，分子互相碰撞、摩擦而产生热能，同时由于涡流存在，水分子受电磁力作用，带动玻璃容器内液体运动，达到震荡的效果，恒温振荡仪测量准确，免调试，测量范围线性度好，采用微处理器，比例调宽式加热原理，实现控温精度高、均匀性好，稳定性可靠，具有超温报警功能，定时功能智能选择，从而确保实验物品的安全；

S4：加入生理盐水冲洗细胞4次，每次2000rpm，8min，生理盐水的渗透压和细胞外的一样，不会让细胞脱水或过度吸水而导致的破裂，渗透压和细胞外的一样，所以不会让细胞脱水或者过度吸水；

S5：用含体积分数为10％胎牛血清的DMEMF/12培养液重悬细胞，胎牛血清是品质最高的，因为胎牛还未接触外界，血清中所含的抗体、补体等对细胞有害的成分最少，胎牛血清是细胞培养中用量最大的天然培养基，含有丰富的细胞生长必需的营养成分，是细胞贴壁培养基质上所需因子来源，提供蛋白酶抑制剂，使在细胞传代时使剩余胰蛋白酶失活，保护细胞不受伤害，调整细胞密度为1x108cells/ml，接种于6孔板培养瓶中，置于饱和湿度、体积分数为5％的CO

S6：3天后全量换为MesenPRORSrMMedium培养液，MesenPRORSrMMedium培养液为人间充质干细胞介质培养基，支持人间充质干细胞培养物的生长和扩增，能够更多的分化骨细胞、成软骨细胞和成脂肪细胞，弃去未贴壁的细胞与杂质， MesenPRORSrMMedium培养液在2至8℃条件下避光储存，可保持稳定15天，根据细胞生长情况，每2天换液一次，当细胞贴壁生长至80％-90％汇合后，吸出培养液，用D-Hanks液冲洗2次，加入胰蛋白酶混合液进行消化，胰蛋白酶为肽链内切酶，对精氨酸和赖氨酸肽链具有选择性水解作用，可使天然蛋白、变性蛋白、纤维蛋白和黏蛋白等水解为多肽或氨基酸，由于血清中含有非特异性抑肽酶，故胰蛋白酶不会消化正常组织，而能分解黏痰、脓性痰等黏性分泌物，能促进抗生素、化疗药物向病灶渗透；

S7：获得的细胞长到80％融合时，用0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA混合液消化，显微镜下观察，控制消化时间，待胞质回缩，加含10％FBS的DMEM/F12培养液终止消化，胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散，不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样。胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关，使用胰酶时，应把握好浓度、温度和时间，以免消化过度造成细胞损伤，终止消化时，可用含有血清培养液或者胰酶抑制剂终止胰酶对细胞的作用；

S8：将细胞悬液1000rpm离心3min，原代细胞以1:1的比例进行传代，记为P1代；

S9：传代第二天培养液换为MesenPRORSa-MMedium培养液，P2代以后按1:3、 1:4的比例传代，直至细胞彼此融合，MesenPRORSa-MMedium培养液是人脂肪干细胞优良的培养基，具有良好的细胞形态，在增殖速度，细胞集落，以及成脂，成骨及成软骨能力等方面优越。

在具体加工时，将脐带浸泡在含有0.9％生理盐水的培养基里，在培养基内添加抗生素，在4℃环境下运输，然后在操净台内取出脐带，用D-PBS冲洗净脐动脉和脐静脉内的残余血液，脐带血的干细胞与人体的配对率很高，脐带血干细胞的浓度十分高而且品质优良，约骨髓细胞浓度的10到20倍，细胞的增生能力也比较高，移植脐带血干细胞也比移植骨髓或周边血干细胞带感染到病毒的可能性也较低，因为胎盘拥有很好的过滤能力同时脐带血干细胞拥有极高的纯度，用止血钳和剪刀剔除上述血管，将脐带剪成1mm^3大小的组织块后放入 200mL蓝盖试剂瓶，然后加入质量/体积比为0.1％的II型胶原酶30mL，置于恒温振荡仪内持续消化5h，100目筛网过滤收集细胞，然后加入生理盐水冲洗细胞4次，每次2000rpm，间隔8min，用含体积分数为10％胎牛血清的DMEMF/12 培养液重悬细胞，胎牛血清是细胞培养中用量最大的天然培养基，含有丰富的细胞生长必需的营养成分，是细胞贴壁培养基质上所需因子来源，提供蛋白酶抑制剂，使在细胞传代时使剩余胰蛋白酶失活，保护细胞不受伤害，调整细胞密度为1x108cells/ml，接种于6孔板培养瓶中，置于饱和湿度、体积分数为5％的CO

以上，仅是本发明的较佳实施例，任何熟悉本领域的技术人员均可能利用上述阐述的技术方案对本发明加以修改或将其修改为等同的技术方案。因此，依据本发明的技术方案所进行的任何简单修改或等同置换，尽属于本发明要求保护的范围。