细胞杀伤性T细胞(CTL)活化用组合物

技术领域

本发明涉及含有螺旋藻提取物的用于使细胞杀伤性T细胞(CTL)增殖的CTL活化用组合物、以及含有该CTL活化用组合物的CTL活化用药物组合物及CTL活化用饮食品。

背景技术

螺旋藻(Spirulina)是富含蛋白、糖类、各种维生素、矿物质、植物性色素的蓝细菌种属。

据报道，经口给予螺旋藻(螺旋藻浸提物)可诱导自然杀伤(NK)细胞的活化(例如，非专利文献1)。

另外，近年在广泛研究各种免疫疗法。例如，使用免疫疗法的癌症治疗研究也在活跃地进行。

通常，生物体本来就具备用于清除癌细胞的免疫监视机制，癌症发病得到抑制。这样的所谓“癌免疫”是由各种免疫活性细胞负责的。作为攻击癌细胞的免疫活性细胞，除了NK细胞以外还有细胞杀伤性T细胞(CTL)。细胞杀伤性T细胞(CTL)通过癌细胞中特异性表达的多种分子而识别癌细胞并进行攻击，由此负责癌免疫。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1:Hirahashi T，et al.“Activation of the human innate immunesystem by spirulina：Augmentation of interferon gamma production and NKcytotoxicity by oral administration of spirulina.”InternationalImmunopharmacology 2(2002)423-434.

发明内容

但是，以往并不知晓作为螺旋藻浸提物的螺旋藻提取物能活化特异性攻击肿瘤的细胞杀伤性T细胞(CTL)、依赖于细胞杀伤性T细胞(CTL)而使肿瘤萎缩。

本发明的目的在于，提供含有螺旋藻提取物的细胞杀伤性T细胞(CTL)活化用组合物。

本发明人们对被给予CTL敏感性肿瘤和螺旋藻提取物的小鼠进行了反复研究，结果发现，特异性攻击肿瘤的CTL在螺旋藻提取物作用下自发地活化，依赖于CTL而使肿瘤萎缩，从而完成了本发明。

即，本发明包括以下的方式。

[1]一种用于使细胞杀伤性T细胞(CTL)增殖的CTL活化用组合物，其含有螺旋藻提取物。

[2]根据前述[1]所述的CTL活化用组合物，其为经口用。

[3]一种CTL活化用药物组合物，其含有前述[1]或[2]所述的CTL活化用组合物。

[4]根据前述[3]所述的CTL活化用药物组合物，其用于对恶性黑色素瘤(黑素瘤)、非小细胞肺癌、霍奇金淋巴瘤、头颈癌、胃癌、肾癌、膀胱癌中的任意癌症的治疗。

[5]前述[3]或[4]所述的CTL活化用药物组合物与免疫检查点抑制剂的组合物。

[6]一种对恶性黑色素瘤(黑素瘤)、非小细胞肺癌、霍奇金淋巴瘤、头颈癌、胃癌、肾癌、膀胱癌中的任意癌症的治疗方法，所述方法组合使用前述[3]或[4]所述的CTL活化用药物组合物和免疫检查点抑制剂。

[7]一种CTL活化用饮食品，其含有前述[2]所述的CTL活化用组合物。

根据本发明，可以提供含有螺旋藻提取物的细胞杀伤性T细胞(CTL)活化用组合物。

附图说明

图1为说明实施例1中进行的实验方案的概略图。

图2为示出实施例1中进行的经口给予H

图3为示出实施例2中进行的经口给予H

图4为示出经口给予图3的螺旋藻提取物的小鼠的结果中的、特别显著地出现肿瘤萎缩的小鼠中的肿瘤抑制结果的图。

图5为示出实施例3中进行的经口给予H

图6为说明实施例4中进行的实验方案的概略图。

图7为说明实施例4中进行的共培养的步骤的概略图。

图8为示出实施例4中进行的CFSE标记OT-1细胞中发生了分裂的细胞的比例的结果的图。

图9为示出实施例5中进行的经口给予H

图10为示出实施例5中进行的通过流式细胞术分析CD8+T细胞、CD4+T细胞、及NK细胞的结果的图。

图11为示出实施例6中进行的经口给予H

具体实施方式

以下对本发明的细胞杀伤性T细胞(CTL)活化用组合物进行详细说明，但是以下记载的构成要件说明为本发明的一实施方式的一例，并非限定于这些内容。

(细胞杀伤性T细胞(CTL)活化用组合物)

本发明涉及一种促进细胞杀伤性T细胞(CTL)的活化的CTL活化用组合物，其用于使特异性针对包括人在内的动物的抗原的细胞杀伤性T细胞(CTL：cytotoxic Tlymphocyte)(也称为杀伤性T细胞)增殖。

本发明的CTL活化用组合物含有螺旋藻提取物。

如下述实施例所示，本发明的CTL活化用组合物对于NK细胞不敏感、CTL敏感的肿瘤能够在不追加特异性抗原的情况下活化CTL、抑制肿瘤增殖。

＜螺旋藻提取物＞

螺旋藻提取物为将螺旋藻用水、乙醇等溶剂浸提而得的浸提液、或该浸提液经浓缩/干燥而得到的浸提物。作为制造螺旋藻提取物时使用的浸提液，在能够得到本发明的效果的范围内没有特别限定，可以使用例如热水。本发明中，可优选使用对螺旋藻进行热水浸提而得到的浸提液、或该浸提液经浓缩/干燥而得到的浸提物。

螺旋藻是属于蓝藻类念珠藻目颤藻科螺旋藻属的微细的螺旋藻，含有丰富的蛋白、糖类、各种维生素、矿物质、植物性色素。

作为本发明中使用的螺旋藻，可列举例如钝顶螺旋藻(Spirulina platensis)、极大螺旋藻(Spirulina maxima)、吉特勒氏螺旋藻(Spirulina geitleri)、连体螺旋藻(Spirulina siamese)、大螺旋藻(Spirulina major)、盐泽螺旋藻(Spirulinasubsalasa)、为首螺旋藻(Spirulina princeps)、宽松螺旋藻(Spirulina laxissima)、库塔螺旋藻(Spirulina curta)、宽松螺旋藻(Spirulina spirulinoides)等，特别地，由于能够人工培养而容易获得的优选的是钝顶螺旋藻(Spirulina platensis)、吉特勒氏螺旋藻(Spirulina geitleri)、连体螺旋藻(Spirulina siamese)等。需要说明的是，螺旋藻(Spirulina)也被称为节旋藻(Arthrospira)。

作为得到螺旋藻提取物的方法，没有特别限制，可以使用通常已知的方法，可列举例如上述非专利文献1、日本特开平8-9940号公报等中记载的浸提液的制造方法。更具体而言，可列举以下记载的制造方法。

＜＜螺旋藻提取物的制造方法＞＞

螺旋藻提取物可如下制造：将螺旋藻藻体在超过100℃的温度下进行热水浸提，将该浸提液的pH调节至特定的酸性条件下，之后除去不溶性级分，由此得到螺旋藻浸提液，从而制造。

在以液体状态使用螺旋藻提取物时，可以直接使用如上述那样得到的螺旋藻浸提液。但是，也可以将该螺旋藻浸提液浓缩/干燥而制成粉末后使用。作为本发明中的螺旋藻提取物，可以为将螺旋藻浸提液浓缩或干燥而制造的浸提物。

螺旋藻可以使用市售品，也可以使用自己培养的螺旋藻。另外，可以使用存活状态的螺旋藻，也可以将该存活状态的螺旋藻干燥。

作为培养螺旋藻时的培养方法，按照培养蓝藻时使用的常规方法进行即可。例如，可以在室外在碱性条件下培养螺旋藻，使其增殖。

培养而得到的螺旋藻(以下也称为螺旋藻藻体)可以直接使用，也可以将培养的螺旋藻用滤布、滤纸回收并用水洗涤后悬浮于水而制成悬浮液。进而可以将培养液、悬浮液浓缩制成湿藻体，可以将该湿藻体通过冷冻干燥、喷雾干燥(Spray Dry)等进行干燥而制成干燥藻体，可以将该干燥藻体粉末化。

热水浸提中使用的螺旋藻藻体可以为湿藻体、冷冻干燥藻体、喷雾干燥藻体、破碎藻体等中的任意者。例如，在得到破碎藻体时，可列举对藻体利用常规方法、例如工业上的弗氏压碎(French press)之类的高压挤压法等进行破碎处理。

接下来说明热水浸提操作。例如，将如上述那样加工后的螺旋藻藻体预先在加压容器内悬浮于浸提溶剂中、例如蒸馏水中。悬浮浓度没有特别限制，若考虑浸提效率、回收时的成本等，相对于溶剂为1～20质量％是理想的。浸提溶剂可以为自来水，若考虑将浸提液作为食品原料使用这一点，则优选蒸馏水。浸提温度为超过100℃的温度，优选为105℃～140℃，更优选为110～130℃。作为浸提时的压力，优选为1.0～2.5个大气压。另外，浸提时，可以进行或不进行搅拌操作，在热效率上，进行搅拌操作的方式是理想的。浸提时间越长则浸提量增大，若考虑效率，则通常浸提时间为0.5～4小时即可。

然后，从如上述那样进行浸提操作后的藻体残渣悬浮液(pH＝6.8～7.0左右)中，除去藻体残渣、因热变性而产生的聚集蛋白。例如，可以对该悬浮液进行离心分离、过滤等操作，通过该操作得到上清。但是，该上清中溶解有大量的蛋白，因此更优选进一步除去溶解蛋白为好。为了进一步除去该溶解蛋白，可以向该悬浮液中加入酸而使浸提液的pH为蛋白的等电点以下的酸性条件。由此，使蛋白聚集，通过离心分离、过滤等分离发生聚集的蛋白，得到螺旋藻提取物。或者先不除去藻体残渣等，而是将浸提操作后的藻体残渣悬浮液的pH调节为上述那样的蛋白的等电点以下后同样地通过离心分离、过滤等分离藻体残渣、聚集蛋白。通过将发生聚集的蛋白除去，以高收率得到包含多糖类的螺旋藻提取物。

作为蛋白的等电点以下的酸性条件，优选为pH4.5以下，pH3.75～4.25时蛋白的聚集、沉淀生成达到最大程度，因此更为优选，进一步优选为pH4.0。

作为调节pH时加入的酸，可以为硫酸、盐酸，若考虑实际的操作工序、作为食品原料使用，则相较于无机酸而言优选使用柠檬酸、苹果酸等有机酸。

＜细胞杀伤性T细胞(CTL)的活化的促进＞

螺旋藻提取物如下述实施例所示对于NK细胞不敏感且CTL敏感的肿瘤能够在不注入外源性肿瘤相关抗原(TAA)的情况下使CTL增殖。另外，螺旋藻提取物如下述实施例所示对于NK细胞不敏感且CTL敏感的肿瘤能够抑制肿瘤增殖。在肿瘤释放实质上充分的TAA时，螺旋藻提取物能够影响CTL的活化、诱导肿瘤萎缩。

本发明的CTL活化用组合物能够有效地用于以CTL活化为目标的药物组合物、饮食品。

＜CTL活化用组合物的形态＞

本发明的CTL活化用组合物可以用于为了使CTL增殖而使用的CTL活化用药物组合物中。

另外，本发明的CTL活化用组合物可以作为用于使CTL增殖的CTL活化用饮食品而用于根据需要标示了该主旨的各种饮食品。

例如，可以用于健康食品、功能性标示食品、特殊用途食品、营养辅助食品、补充剂或特定保健用食品等。这些食品中的一部分为得到功能标示许可的食品，因此可以与一般食品进行区分。

作为本发明的CTL活化用组合物、及含有该CTL活化用组合物的CTL活化用药物组合物、CTL活化用饮食品(以下将这些CTL活化用组合物、药物组合物、及饮食品统称为“本发明的CTL活化用的组合物及饮食品”)的形态，没有特别限制，可根据目的而适宜选择，例如可以为固体状、液体状、凝胶状等。另外，例如可以为片剂(包括咀嚼片等)、胶囊、饮料、果冻、颗粒等。

含有本发明的CTL活化用组合物的CTL活化用药物组合物可以添加药学上可接受的常规的载体、结合剂、稳定剂、赋形剂、稀释剂、pH缓冲剂、崩解剂、增溶剂、溶解助剂、等渗剂等各种制剂用配合成分等。另外，本发明的CTL活化用药物组合物可以为经口用或非经口用，更优选为经口用。作为经口用，可以为通常使用的给予形态，例如片剂、粉末、颗粒、胶囊剂、糖浆剂、悬浮液等剂型。作为非经口用，可列举通常使用的给予方式，例如将溶液、乳剂、悬浮液等剂型以注射(皮下注射、静脉内注射、肌肉内注射等)或喷雾剂的类型进行鼻孔内给予等。

本发明的CTL活化用的组合物及饮食品的形态为例如片剂(也称为锭剂)时，可以将螺旋藻提取物与赋形剂、结合剂、崩解剂、润滑剂、保存剂、抗氧化剂、等渗剂、缓冲剂、包衣剂、矫味剂、溶解助剂、基剂、分散剂、稳定剂、着色剂等添加剂适宜地组合并按照常规方法进行制备。

作为赋形剂，可列举淀粉及其衍生物(糊精、羧甲基淀粉等)、纤维素及其衍生物(甲基纤维素、羟丙甲基纤维素等)、糖类(乳糖、白糖、葡萄糖、海藻糖等)等、柠檬酸或其盐类、苹果酸或其盐类、乙二胺四乙酸或其盐类。

作为结合剂，可列举淀粉及其衍生物(α化淀粉、糊精等)、纤维素及其衍生物(乙基纤维素、羧甲基纤维素钠、羟丙甲基纤维素等)、阿拉伯胶、黄芪胶、明胶、糖类(葡萄糖、白糖等)、乙醇等。

作为崩解剂，可列举淀粉及其衍生物(羧甲基淀粉、羟丙基淀粉等)、纤维素及其衍生物(羧甲基纤维素钠、结晶纤维素、羟丙甲基纤维素等)、碳酸盐(碳酸钙、碳酸氢钙等)、黄芪胶、明胶、琼脂等。

作为润滑剂，可列举硬脂酸、硬脂酸钙、硬脂酸镁、滑石、氧化钛、磷酸氢钙、干燥氢氧化铝凝胶、蔗糖脂肪酸酯、食用油脂等。

作为保存剂，可列举对羟基苯甲酸酯类、亚硫酸盐类(亚硫酸钠、焦亚硫酸钠等)、磷酸盐类(磷酸钠、聚磷酸钙、聚磷酸钠、偏磷酸钠等)、脱氢乙酸、脱氢乙酸钠、山梨酸甘油酯、糖类等。

作为抗氧化剂，可列举亚硫酸盐类(亚硫酸钠、亚硫酸氢钠等)、异抗坏血酸、L-抗坏血酸、半胱氨酸、硫代甘油、丁基羟基茴香醚、二丁基羟基甲苯、没食子酸丙酯、抗坏血酸棕榈酸酯、dl-α-生育酚等。

作为等渗剂，可列举氯化钠、硝酸钠、硝酸钾、糊精、甘油、葡萄糖等。

作为缓冲剂，可列举碳酸钠、盐酸、硼酸、磷酸盐(磷酸氢钠等)等。

作为包衣剂，可列举纤维素衍生物(羟丙基纤维素、乙酸邻苯二甲酸纤维素、羟丙甲基纤维素邻苯二甲酸酯等)、虫胶、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙烯基吡啶类(聚-2-乙烯基吡啶、聚-2-乙烯基-5-乙基吡啶等)、聚乙烯基乙酰基二乙基氨基乙酸酯、聚乙烯醇邻苯二甲酸酯、甲基丙烯酸酯-甲基丙烯酸共聚物等。

作为矫味剂，可列举糖类(葡萄糖、白糖、乳糖等)、糖精钠、糖醇类等。

作为溶解助剂，可列举乙二胺、烟酰胺、糖精钠、柠檬酸、柠檬酸盐类、苯甲酸钠、聚乙烯基吡咯烷酮、聚山梨酯类、失水山梨醇脂肪酸酯类、甘油、聚丙二醇、苯甲醇等。

作为基剂，可列举脂肪类(猪脂等)、植物油(橄榄油、芝麻油等)、动物油、羊毛脂酸、凡士林、石蜡、树脂、膨润土、甘油、二醇油等。

作为分散剂，可列举阿拉伯胶、黄芪胶、纤维素衍生物(甲基纤维素等)、藻酸钠、聚山梨酯类、失水山梨醇脂肪酸酯类等。

作为稳定剂，可列举亚硫酸盐类(亚硫酸氢钠等)、氮气、二氧化碳等。

本发明的CTL活化用的组合物及饮食品中的螺旋藻提取物的含量根据药品、食品的种类、成分、及形态等条件而不同，适宜选择即可，例如液体状的药品、饮料中的螺旋藻提取物的含量在其总质量中以该螺旋藻提取物的干燥重量换算计优选为0.1质量％以上，更优选为1质量％以上。另外，液体状的药品、饮料中的螺旋藻提取物的含量在其总质量中以该螺旋藻提取物的干燥重量换算计优选为20质量％以下，更优选为10质量％以下。

另外，例如药品、食品中的螺旋藻提取物的含量在其总质量中以该螺旋藻提取物的干燥重量换算计优选为0.1质量％以上，更优选为1质量％以上。另外，药品、食品中的螺旋藻提取物的含量在其总质量中以该螺旋藻提取物的干燥重量换算计优选为30质量％以下，更优选为20质量％以下。

另外，特别是在本发明的CTL活化用的组合物及饮食品的形态为片剂时，例如片剂中的螺旋藻提取物的含量在其总质量中以该螺旋藻提取物的干燥重量换算计优选为20质量％以上，更优选为50质量％以上。另外，片剂中的螺旋藻提取物的含量在其总质量中以该螺旋藻提取物的干燥重量换算计优选为95质量％以下，更优选为80质量％以下。

本发明中，螺旋藻提取物的摄取量没有特别限定，可根据药品、饮食品的种类、成分等而适宜选择，例如对于1名成人而言，每1天以螺旋藻提取物的干燥重量换算计优选为0.5g以上、更优选为1g以上，另外优选为6g以下、更优选为4g以下。

＜CTL活化用药物组合物＞

本发明的CTL活化用组合物有效地作用于需要CTL活性的多种疾病。例如，可以作为肿瘤治疗药使用。特别是在该肿瘤为NK细胞不敏感且CTL敏感的肿瘤时，可以抑制肿瘤增殖，可以有效地作为癌症的预防药或治疗药使用。

因此，本发明的CTL活化用组合物对于以下记载的肿瘤中的可依赖于CTL而使肿瘤萎缩的肿瘤而言，为有效的抗癌治疗药。

作为成为治疗对象的癌症的种类，可列举例如恶性黑色素瘤(黑素瘤)、非小细胞肺癌、霍奇金淋巴瘤、头颈癌、胃癌、肾癌、膀胱癌等。

＜与免疫检查点抑制剂的组合物＞

本发明的CTL活化用组合物、或含有该CTL活化用组合物的CTL活化用药物用组合物可以进一步与免疫检查点抑制剂组合而制备组合物。

作为免疫检查点抑制剂，只要可发挥本发明的效果就没有特别限制，可列举例如PD-1通路抑制剂。

PD-1通路抑制剂是指抑制PD-1/PD-1配体通路的药剂。作为PD-1通路抑制剂，只要是抑制PD-1/PD-1配体通路的药剂就没有特别限定，可列举例如抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体等。

通过使用PD-1通路抑制剂，可抑制PD-1与PD-L1(PD-1配体)、PD-L2(PD-2配体)结合的过程，改善免疫细胞的活动被抑制的状态。通过激活自身免疫而发挥抗癌作用、抑制肿瘤增殖。

作为抗PD-1抗体的一例，可列举例如纳武单抗(欧狄沃(注册商标))、REGN-2810、派姆单抗(可瑞达(注册商标))、PDR-001、BGB-A317、AMP-514(MEDI0680)、BCD-100、IBI-308、JS-001、PF-06801591、TSR-042等。

作为抗PD-L1抗体的一例，可列举例如阿特珠单抗(RG7446、MPDL3280A)、阿维鲁单抗(PF-06834635、MSB0010718C)、度伐单抗(MEDI4736)、BMS-936559、CA-170、LY-3300054、FAZ053等。

螺旋藻提取物如下述实施例所示可以与抗PD-L1抗体组合使用，在与抗PD-L1抗体组合使用的实验中，对NK细胞不敏感且CTL敏感的肿瘤，抑制了肿瘤增殖。因此，可以出于抑制CTL敏感肿瘤的肿瘤增殖的目的，将抗PD-L1抗体等PD-1通路抑制剂与螺旋藻提取物组合使用。

＜CTL活化用饮食品＞

本发明的CTL活化用组合物可以作为饮料、食品、饮食品添加物等制品的成分使用。

例如，作为饮料，可列举水、清凉饮料水、果汁饮料、乳饮料、酒精饮料、无酒精饮料、运动饮料、营养饮料等。

作为食品，可列举面包类、面类、米类、豆腐、乳制品、酱油、味噌、点心类等。

这样的各种饮食品可以按照常规方法来制备。

在制备各种形态的饮食品时，可以将本发明的螺旋藻提取物与任意的食品材料、或其它有效成分、或食品中可接受的添加物(例如溶剂、软化剂、油、乳化剂、防腐剂、酸味剂、甜味剂、苦味剂、香味剂、pH调节剂、表面活性剂、稳定剂、着色剂、紫外线吸收剂、抗氧化剂、保湿剂、增稠剂、固着剂、分散剂、流动性改善剂、发泡剂、润湿剂、香科、调味剂、风味调整剂等)等适宜地组合，按照常规方法进行制备。

本发明的CTL活化用饮食品上，可以作为以CTL增殖为目的的饮食品而带有“增强CTL”、“通过活化CLT而预防癌变”等标示。

实施例

以下列举实施例进一步详细说明本发明，但是本发明的范围不受这些实施例限定。

(材料)

＜螺旋藻提取物＞

在室外的培养池中在碱性条件下(pH11)使钝顶螺旋藻(Spirulina platensis)增殖。然后，将增殖后的钝顶螺旋藻的经喷雾干燥而得的藻体粉末50g在高压釜中悬浮于500mL的蒸馏水，调节压力，从而在120℃的浸提温度下浸提1小时。

将浸提液用柠檬酸调节至pH4.0。通过离心分离而从其中除去藻体残渣及蛋白(不溶性级分)，得到作为螺旋藻热水浸提液的螺旋藻提取物。

对于小鼠，每次给予200μL的螺旋藻提取物(相对于96mg的螺旋藻粉末)。

＜低内毒素卵清白蛋白(OVA)＞

使用富士胶片和光纯药株式会社制造的OVA。

＜杜尔贝科修饰PBS(D-PBS)＞

基质溶液或向小鼠进行注射时使用的杜尔贝科修饰PBS(D-PBS)使用不含内毒素级别者(默克密理博公司制)。

＜抗PD-L1抗体(Ab)(克隆：10F.9G2)＞

从Bio X Cell公司购买。

＜大鼠IgG2b同种型对照抗体(Ab)(LTF-2)＞

从Bio X Cell公司购买。LTF-2作为针对大鼠IgG2b抗体的同种型对照有用。

＜Pam2CSK4＞

2,3-双(棕榈酰氧基)丙基-Cys-Ser-Lys-Lys-Lys-Lys(Pam2CSK4)委托株式会社Biologica合成。

＜7AAD＞

用于死细胞染色的7-氨基放线菌素D(7AAD、细胞存活溶液)从BD Biosciences公司购买。

＜小鼠＞

近交系野生型C57BL/6小鼠从CLEA Japan,Inc.购买。小鼠在无特定病原体条件下维持，使用7～11周龄的小鼠。

OT-1小鼠为强制表达特异性识别OVA抗原的T细胞受体的小鼠。

＜表达OVA的B16黑素瘤细胞(MO5)＞

表达OVA的B16黑素瘤细胞(MO5)在添加有10％热灭活胎牛血清(FBS、购自GEHealthcare Life Sciences公司)、100IU的青霉素/100μg/mL的链霉素(Thermo FisherScientific公司制)、及100μg/mL的G418(Roche公司制)的RPMI 1640(Thermo FisherScientific公司制)中培养。

＜表达OVA的EL4淋巴瘤细胞(EG7)＞

表达OVA的EL4淋巴瘤细胞(EG7)(ATCC(注册商标)CRL-2113TM)从ATCC公司购买。

表达OVA的EL4淋巴瘤细胞(EG7)在添加有10％热灭活FBS、10mM HEPES(ThermoFisher Scientific公司制)、1mM丙酮酸钠(Thermo Fisher Scientific公司制)、55μM的2-巯基乙醇(Thermo Fisher Scientific公司制)、100IU的青霉素/100μg/mL的链霉素、及500μg/mL的G418的RPMI 1640中培养。

(实施例1)

对于C57BL/6小鼠，向每只小鼠的剃毛的后背皮下注射MO5肿瘤细胞(1×10

关于肿瘤尺寸，使用卡尺进行测定并用下式表示。

肿瘤体积(mm

在肿瘤体积达到约200mm

H

对于最初接受了OVA刺激的组，在肿瘤接种后第1天和第8天，向肿瘤的周围皮下注射100μg的OVA蛋白。

将实验方案示于图1。

将结果示于图2。

图2为示出经口给予H

MO5肿瘤为对NK细胞、CTL均敏感的肿瘤。

如图2所示，可确认：无论是否进行OVA皮下注射，在给予螺旋藻提取物的小鼠中均存在肿瘤萎缩得到促进的小鼠。

(实施例2)

对于C57BL/6小鼠，向每只小鼠的剃毛的后背皮下注射EG7淋巴瘤细胞(2×10

关于肿瘤尺寸，使用卡尺进行测定并用下式表示。

肿瘤体积(mm

在肿瘤体积达到约200mm

H

将结果示于图3～图4。

图3示出经口给予H

EG7肿瘤为NK细胞不敏感且CTL敏感的肿瘤。

如图3～4所示，可以确认在给予了螺旋藻提取物的具有EG7肿瘤的小鼠中存在肿瘤萎缩得到促进的小鼠。

(实施例3)

进行如下实验：在与实施例2同样的条件下进行的小鼠实验中，对于经口给予螺旋藻提取物的小鼠进一步腹腔内注射抗CD8β抗体。

为了耗尽CD8β细胞，在给予螺旋藻提取物的前一天，对于小鼠腹腔内(i.p.)注射包含抗CD8β单克隆抗体(克隆：H35.17-2)的杂交瘤腹水15μL。腹水通常含有10～15mg/mL的IgG。

将结果示于图5。

螺旋藻提取物给予组的小鼠中，示出对螺旋藻提取物的给予作出响应、肿瘤的生长得到抑制的结果，而给予螺旋藻提取物和抗CD8β抗体的小鼠组中，由于CD8β细胞耗尽而生成肿瘤恢复生长的结果。由此可确认，在该实验体系中，CTL与肿瘤生长抑制有关。

也即，可以确认：在给予了螺旋藻提取物的具有EG7肿瘤的小鼠中，随着CD8+CTL增殖而使肿瘤生长变缓慢。

(实施例4)

对于C57BL/6小鼠，每只在7天间经口给予3次(第0、2及4天)200μL的H

对于最初接受OVA刺激的组，在第1天向小鼠的剃毛的后背皮下注射100μg的OVA蛋白。

将实验方案示于图6。

然后，用胶原酶D(Roche Diagnostics K.K.制)处理，从而从经口给予了H

在利用抗CD16/CD32抗体(Ab)封闭的同时，利用CD11c-微珠(Miltenyi Biotec公司制)从脾细胞中分离CD11c+DC细胞。

利用CD8微珠(Miltenyi Biotec公司制)从OT-1小鼠的脾中分离OT-1T细胞。

将分离的OT-1CD8+T细胞用1μM的羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(CFSE、赛默飞世尔公司制)在37℃下标记10分钟。

向U形底的96孔板的孔中接种3次1×10

4小时后，向各孔中加入包含5×10

将共培养的步骤示于图7。

将细胞用抗CD8α抗体、抗CD3抗体及抗TCR Vβ5.1、5.2抗体染色。通过7AAD染色排除死细胞。

通过利用FACS AriaII(BD Biosciences公司制)及Flowjo软件(Tree Star公司制)得到的CFSE衰减，来评价OT-1增殖。

根据本实验体系，可通过将从给予了螺旋藻提取物的小鼠获得的树突细胞(DC)与从其它小鼠获得的T细胞共培养来确认T细胞是否因为从给予了螺旋藻提取物的小鼠获得的树突细胞而活化。

将结果示于图8。

图8的图中示出CFSE标记OT-1细胞中发生了分裂的细胞的比例。

图8所示的数据示出不论有无OVA的、经OVA再刺激的T细胞与CD11c+DC共培养的结果。

图8中示出Exp.1和Exp.2为2个独立实验体系的代表性结果。

图8中，也示出与用Pam2CSK4刺激的CD11c+DC共培养的样品的结果，作为阳性对照的比较实验。

由图8的结果可确认，利用给予了螺旋藻提取物的小鼠的脾DC，可与外源性OVA给予无关地诱导OVA特异性CTL。

通过使用脾CD11c+DC和OT-1CD8+T细胞的混合物的体外试验确认了实验结果。

如Exp.2所示，螺旋藻处理小鼠的DC在OVA再刺激后诱导了CD8+T细胞增殖。该增殖的发生与最初的OVA刺激无关。

(实施例5)

在与实施例1同样的、对于C57BL/6小鼠向每只小鼠的剃毛的后背皮下注射MO5肿瘤细胞(1×10

在肿瘤移植后第11天处死小鼠。

为了分析肿瘤内免疫细胞，将肿瘤组织切碎，在25℃的汉克斯平衡盐溶液(西格玛奥德里奇公司制)中将肿瘤组织用0.05mg/mL的胶原酶I(西格玛奥德里奇公司制)、0.05mg/mL的胶原酶IV(西格玛奥德里奇公司制)、0.025mg/mL的透明质酸酶(西格玛奥德里奇公司制)、及0.01mg/mL的DNase I(Roche Diagnostics K.K.制)处理15分钟。

酶处理后，将红细胞用ACK缓冲液裂解。

将肿瘤浸润CD8+T细胞、CD4+T细胞、及NK细胞用抗体染色，用FACS AriaII(BDBiosciences公司制)及Flowjo软件(Tree Star公司制)进行分析。

将结果示于图9～图10。

图9示出经口给予H

图9中，H

如上所述，图10示出通过流式细胞术对CD8+T细胞、CD4+T细胞、及NK细胞进行分析的结果。图10示出肿瘤内的CD45+细胞中的CD8+T细胞、CD4+T细胞、及NK细胞的各免疫细胞比例与肿瘤增殖的比率的关系。

如图9～图10所示，伴有肿瘤增殖抑制的经口给予了螺旋藻提取物的MO5保有小鼠中，肿瘤的CD8+T细胞增加，肿瘤的CD8+T细胞的比率随着肿瘤萎缩显著增加。另一方面，肿瘤内CD4+T细胞、NK细胞的数量与肿瘤的生长不相关。

可以确认，给予了螺旋藻提取物的可观察到抗肿瘤效果的小鼠中，在肿瘤内诱导了CD8+T细胞。

(实施例6)

对于与实施例1同样的、对于C57BL/6小鼠向每只小鼠的剃毛的后背皮下注射MO5肿瘤细胞(1×10

在肿瘤移植后6天、8天、10天，对小鼠分别腹腔内注射200μg大鼠IgG2b同种型对照抗体(Ab)(LTF-2)或抗PD-L1抗体。

将结果示于图11。

示出经口给予了H

如图11所示，组合给予抗PD-L1抗体和螺旋藻提取物时，与不含抗PD-L1抗体、而是给予H

由此可确认，可以出于抑制CTL敏感的肿瘤的肿瘤增殖的目的将免疫检查点抑制剂(特别是抗PD-L1抗体等PD-1通路抑制剂)与螺旋藻提取物组合使用。

如上述各实施例所示，在螺旋藻提取物作用下，细胞杀伤性T细胞(CTL)自发地活化，依赖于CTL而使肿瘤萎缩。

即，本发明的含有螺旋藻提取物的CTL活化用组合物能够使CTL增殖，另外也能够抑制肿瘤增殖。

因此，本发明的含有CTL活化用组合物的药物组合物及饮食品能够有效地用于以CTL的活化为目的的CTL活化用药物组合物、CTL活化用饮食品。