一种血管生成素1突变体的设计及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种血管生成素1突变体的设计及其制备方法和应用。

背景技术

脓毒症（Sepsis）是由细菌等病原微生物侵入机体，引起器官功能失调导致全身炎症，具有极高致死率的综合征，据全球最新统计，每年大约有4900万人感染此病，其中近1100万人死亡，占全球死亡人数的20%（Rudd KE，Lancet，2020，395(10219)：200-11）。2017年，世界卫生组织（WHO）将脓毒症列为需极高度优先使用医疗资源的疾病（Reinhart K，

Ang-Tie轴包含血管生成素（Ang1、Ang2和Ang4，Ang3是小鼠中Ang4的同源物）和具有免疫球蛋白和表皮生长因子同源性结构域的酪氨酸蛋白激酶（Tie1和Tie2）。尽管Ang1和Ang2以相似的亲和力与Tie2结合，但它们对内皮细胞具有不同的调控作用（Teichert M，

Ang1是Tie2的重要激动剂。Ang1非常紧密地结合Tie2，其亲和力在纳摩尔级别，使Tie2簇在内皮细胞-内皮细胞（EC-EC）连接处诱导形成，进而增加血管稳定性（尤其是在血管生成过程后），抑制组织纤维化，并在抗血管生成治疗期间调节血管正常化。在正常生理条件下，Ang2水平较低，但炎症和缺氧刺激会增加Ang2的表达，降低血管稳定性，促进内皮细胞活化、血管生成和重塑（Eklund L，

发明内容

本发明的目的在于针对上述DIC现状，提供一种增强与Tie2结合的血管生成素1的突变体Ang1

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明首先提供了一种血管生成素1的突变体Ang1

进一步的，所述突变体Ang1

进一步的，所述突变体Ang1

进一步的，所述突变体Ang1

本发明还提供了上述一种血管生成素1的突变体Ang1

本发明还提供了上述一种血管生成素1的突变体Ang1

本发明的优点在于：

本发明公开了一种增强与Tie2结合的血管生成素突变体Ang1

附图说明

图1：Ang1-Tie2结构图以及预测的突变位点。橙色为Ang1-RBD晶体结构，蓝色为Tie2晶体结构；基于晶体复合物，MD模拟计算出降低Ang1与Tie2结合自由能的突变点。

图2：pCMV3-SP-N-FLAG-Ang1的质粒图谱。

图3：相关蛋白的表达与纯化。（A）Ang1-RBD经Superdex 200 Increase 10/300 GL纯化色谱图；（B）Ang1-RBD色谱图上洗脱洗脱16.78 mL处样品12% SDS-PAGE鉴定结果；（C）Ang1-RBD

图4：表面等离子体共振测定Ang1-RBD与sTie2结合。（A）sTie2与Ang1-RBD结合动力学曲线；（B）sTie2与Ang1-RBD结合亲和力曲线。（C）sTie2与Ang1-RBD

图5：Ang1

图6：Ang1

图7：Ang1

具体实施方式

下面将结合附图和实施例对本发明的方法和其优点作进一步说明，但这些实施例并不构成对本发明权利要求范围的限制。在不脱离本发明主要特征的范围下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进均落入本发明保护的范围内。

实施例一：Ang1突变点的选择和筛选

基于Ang1-Tie2复合物晶体结构（PDB code：4K0V）分析人血管生成素1 Ang1和酪氨酸蛋白激酶受体Tie2之间的相互作用位点（图1），其中Ang1的RBD结构域介导了与Tie2的相互作用。我们逐一分析相互作用面上的Ang1侧的氨基酸，并提出了可能会增强Ang1对Tie2亲和力的5个氨基酸突变位点（图1），接着通过分子动力学（Molecular Dyanimcs，MD）计算了预测的5个点突变对Ang1和Tie2结合自由能的影响（表1），亲和力大小与自由能成负相关，亲和力越强其自由能就会越低，以期提高与Tie2结合力并增强Tie2的激活从而进一步增强Ang-Tie轴的信号。根据结果，我们最终确定了A451D作为突变实验的位点。

表1. 利用MD法计算Ang1点突变对其与Tie2结合自由能的影响（单位为kcal/mol）

注：加粗为自由能绝对值较大的突变点。

实施例二：Ang1与sTie2的构建、表达和纯化

天然的Ang1含有多个结构域，且稳定性较差，做为治疗剂应用的可能性较低，且该分子具有高度复杂的调节模式，且涉及多个结构相似分子，实验纯化难度较大，在分析Ang1-Tie2复合物晶体结构（图1）时，我们发现与受体Tie2结合的是配体Ang1的C端RBD结构域，因此我们对蛋白Ang1进行了截短，获得蛋白Ang1-RBD，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

(1)Ang1及其突变体的表达载体的构建。

以含有Ang1全长DNA的质粒（pCMV3-SP-N-FLAG-Ang1，质粒图谱如图2所示）为模板，使用引物：5’-TTTAGAGACTGTGCAGATGTATATCAAGCTGG-3’（上游引物），5’-GCTACCGCCTCCACCCTTATCG-3’（下游引物），通过PCR的方法扩增出Ang1-RBD基因片段（核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示），用限制性内切酶KpnI和XhoI切割质粒pCMV3-SP-N-FLAG-Ang1，使用核酸外切酶Ⅲ将Ang1-RBD片段连接到pCMV3-SP-N-FLAG质粒中。将酶连产物经过42℃热激发转化至大肠杆菌DH5α，涂平板，挑单菌落，进行基因测序，将含有正确Ang1-RBD序列的

通过PCR技术，使用定点突变引物：5’-GGTGGTTTGATGACTGTGGCCCCTC-3’（上游引物），5’-ATCCTCCTGTTAACATGAGGGCACATTTGC-3’（下游引物），分别以含有Ang1-RBD基因片段及Ang1全长DNA的质粒为模板，扩增得到Ang1-RBD

分别加入1µL DpnI（Takara）至上述PCR产物中，37℃水浴锅消化3h。采用EZNA胶回收试剂盒（OMEGA）对PCR产物进行胶回收。42℃热激发转化至大肠杆菌

（2）蛋白的表达与纯化。

将质粒Ang1-RBD、Ang1-RBD

实施例三：表面等离子体共振测定Ang1-RBD及其突变体与sTie2的结合常数

所有表面等离子体共振（SPR）测定均在Biacore T200仪器（GE Health SciencesInc.）上进行，运行缓冲液含有10 mM HEPES、150 mM NaCl、3 mM EDTA和0.05%（v/v）Surfactant P20，所有溶液均通过0.22 μm孔径过滤器过滤并在室温下脱气。CM5芯片放入仪器后，首先用运行缓冲液冲洗一遍管路，然后使用N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）和1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺（EDC）以20 μL/min的流速激活7 min。接着固定sTie2，将40μM的sTie2蛋白在10 mM乙酸钠（pH=5.0）中的溶液偶联到芯片上，直到达到>10000（RU）。使用1 M乙醇胺将芯片上活化的游离结合位点再封闭7 min。所有实验均在25℃下以30 μL/min的流速和120 s的接触时间进行，然后在pH 1.5甘氨酸解离600 s以及60 s再生。使用BIACORE评价软件，采用1:1动力学拟合，计算动力学参数（

表2. 表面等离子体共振测定Ang1-RBD与sTie2结合常数

实施例四：Ang1

根据Ang-Tie轴相关调节情况，我们用将LPS、Ang1和Ang1

将HUVEC细胞消化后铺在12孔板中，2×10

结果显示与未处理细胞组相比，加入LPS组HUVEC内源的

实施例五：Ang1

Ang-Tie轴正常情况下，Ang2表达很低，Ang1决定Ang2的表达水平，Ang1结合并激活Tie2，Tie2被磷酸化后，会激活下游PI3K/AKT信号通路，磷酸化的AKT使核外排的FOXO1失活，进一步抑制Ang2的表达；炎症情况下，Ang2上调与Ang1竞争结合Tie2，协同受体Tie1的胞外域被切割，从而抑制Tie2的磷酸化和PI3K/AKT信号通路失活。因此，有活性的FOXO1增加Ang2的表达，从而抑制Tie2信号通路的正反馈，从而使血管不稳定或者渗漏，本实验要验证与sTie2结合更强的突变体是否能够调节此通路，用核定位的方法来研究突变体Ang1

将EA.hy926细胞消化后铺在96孔板中，每孔5000个细胞，将铺好后的孔板放入37ºC，5% CO

获得结果（图6）显示：体外加入Ang1和Ang1

实施例六：Ang1

动物实验上，检测了Ang1

(a)材料

8-12周龄雄性C57BL/6J小鼠，购买自福州吴氏实验动物（福州，中国）。

Ang1和Ang1

E. coli

(b)步骤

1. 将8-12周龄雄性C57BL/6J小鼠随机分为4组，每组4只；按照分组1×PBS，16mg/kg LPS，16 mg/kg LPS+10 mg/kg Ang1，16 mg/kg LPS+10 mg/kg Ang1

2. 通过尾静脉注射预先准备好的蛋白；

3. 注射药物30 min后腹腔注射LPS，分别在1.5 h和4 h进行颌下取血，至少200 μL；

4. 3000 rpm，5 min取血浆进行Elisa实验，Elisa所有标准品和样品一式三份，每次测定都需要做一条标准曲线；

5. 包被：稀释包被中的捕获抗体缓冲液，96孔板每孔100 μL，密封板在4°C冰箱孵育过夜；

6. 洗板：次日，将高吸附板用PBST洗涤三次，并将板倒置在吸水纸上用力敲击残留缓冲液；

7. 封闭：每孔加入100 μL 3% BSA（PBS溶解）的封闭液，密封置于室温摇床封闭1h；

8. 加血浆样品：将血浆用3% BSA（PBST溶解）适量倍数稀释，100 μL/孔，密封置于室温摇床封闭2 h；

9. 洗板：操作如上；二抗：加入HRP-抗体缓冲液，100 μL/孔，密封置于室温摇床封闭40 min-1 h；

10. 显色：洗板后100 μL/孔TMB显色液，密封置于室温摇床封闭10-30 min，等到标曲第四个显色即可；

11. 终止：每孔加入100 μL终止液，分别在450 nm和570 nm处测吸收。

结果（图7）显示，与加入LPS的模型组相比，加入Ang1

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。