一种发酵小麦降压肽及其制备方法、降压肽组合和应用

技术领域

本发明属于多肽技术领域，具体涉及一种发酵小麦降压肽及其制备方法、降压肽组合物和应用。

背景技术

高血压是世界上最为常见的一种慢性疾病，以收缩压≥140mmHg，舒张压≥90mmHg的动脉血压增高为主要特征，同时也是各种心脑血管病最主要的诱发因素。现如今，合成的降压类药物种类繁多，但是这些药物都会造成一定的副作用。因此，天然来源的可食用蛋白越来越受关注，它们大多数不会产生副作用。很多学者已经证明了降血压肽可以来源于食物中，其中植物蛋白质制备ACE抑制肽具有较大的潜力。

许多谷物本身并不具备降血压活性，但是通过发酵和酶解，其中的蛋白质被分解后可以释放出具有降血压活性的肽段，例如公开号CN106434815A的专利公开了利用膜分离-电渗析技术制备大豆降压肽。再例如公开号CN103052717A的专利公开了以玉米胚芽蛋白为原料工业化生产降压活性肽的方法。这种天然的肽段可以避免“普利”类药物的副作用。但目前报道的植物来源的降压肽种类有限，而且降压活性也参差不齐，亟需开发出新的植物降压肽。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种发酵小麦降压肽，丰富植物来源的降压肽的种类的同时具有较高的抑制ACE酶的活性。

本发明提供了一种发酵小麦降压肽，氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明提供了一种所述发酵小麦降压肽的制备方法，包括以下步骤：

将小麦原料在酵母菌的作用下发酵，得到发酵液；

从所述发酵液中富集小于3kDa的组分；

将所述小于3kDa的组分进行色谱柱纯化，收集有体外抑制ACE酶活性的组分；

将所述有体外抑制ACE酶活性的组分经C18色谱柱分离和质谱测序，得到发酵小麦降压肽。

优选的，所述酵母菌的接种量为4％～12％；所述发酵的温度为20～35℃，所述发酵的时间为24～96h，所述发酵期间，小麦原料和体系中水分的质量比为1：(5～20)。

优选的，所述色谱柱包括Sephadex G-15凝胶色谱柱或Phenomenex SEC YarraSec-2000 Prep色谱柱；

所述Sephadex G-15凝胶色谱柱的规格为3.7cm×100cm；采用所述Sephadex G-15凝胶色谱柱纯化时，洗脱流速为4mL/min；所述有体外抑制ACE酶活性的组分为体外抑制ACE酶抑制率不低于50％的组分；

所述Phenomenex SEC Yarra Sec-2000 Prep色谱柱的规格为21.20mm×300mm，采用所述Phenomenex SEC Yarra Sec-2000 Prep色谱柱纯化时，洗脱流速为10mL/min。

优选的，所述C18色谱柱分离的洗脱液包括流动相A和流动相B；

所述流动相A为含体积浓度0.1％甲酸的超纯水，所述流动相B为含体积浓度0.1％甲酸的乙腈；洗脱液的流速为350nL/min；

分离梯度为：0-5min，体积百分含量6％流动相B，体积百分含量94％流动相A；

5-57min，体积百分含量6％～12％流动相B，体积百分含量88％～94％流动相A；

57-71min，体积百分含量12％～29％流动相B，体积百分含量71％～88％流动相A；

71-72min，体积百分含量29％～40％流动相B，体积百分含量60％～71％流动相A；

72-80min，体积百分含量40％～95％流动相B，体积百分含量5％～60％流动相A。

本发明提供了一种发酵小麦降压肽组合物，包括所述降压肽和多肽；所述多肽包括以下至少一种：氨基酸序列如SEQ ID NO:2～SEQ ID NO:3所示的肽段。

优选的，所述降压肽和多肽的摩尔比为1～100:1～100。

本发明提供了所述降压肽、所述制备方法得到的降压肽或所述降压肽组合物在制备降压药中的应用。

本发明提供了所述降压肽、所述制备方法得到的降压肽或所述降压肽组合物在制备ACE酶抑制剂中的应用。

本发明提供了一种ACE酶抑制剂，包括所述降压肽或权利要求6或7所述降压肽组合物和辅料。

本发明提供了一种发酵小麦降压肽，氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明首次从酵母发酵的小麦发酵液中分离得到一种降压作用的多肽，所述多肽的体外抑制ACE酶活性达到90％以上。并且经过自发性高血压大鼠实验验证，所述多肽具有良好的体内抑制血压升高的特性，从灌胃第2周开始呈良好的降低血压效果。因此本发明提供的降压肽能够用于体外抑制ACE酶活性以及制备降血压的药物，丰富了降压药的种类，同时大大提高了小麦的药用价值。

附图说明

图1为发酵小麦的降压肽分离结果，下方数字表示收集馏分的编号；

图2为不同种类微生物发酵小麦的发酵上清液体外抑制ACE酶的活性柱形图；

图3为SHR大鼠在灌注降压肽四周内血压变化的折线图。

具体实施方式

本发明提供了一种发酵小麦降压肽，氨基酸序列如SEQ ID NO:1(Val-Leu-Gly-Phe-Gly-Thr-Phe(VLGFGTF))所示。

本发明提供了一种所述发酵小麦降压肽的制备方法，包括以下步骤：

将小麦原料在酵母菌的作用下发酵，得到发酵液；

从所述发酵液中富集小于3kDa的组分；

将所述小于3kDa的组分进行色谱柱纯化，收集有体外抑制ACE酶活性的组分；

将所述有体外抑制ACE酶活性的组分经C18色谱柱分离和质谱测序，得到发酵小麦降压肽。

本发明将小麦原料在酵母菌的作用下发酵，得到发酵液。

在本发明中，所述小麦原料的形式优选为粉碎的全麦。所述小麦粉的制备方法优选为见小麦筛选和清洗后，干燥，粉碎得到。所述小麦粉的粒径优选为5～100目，更优选为10～50目。本发明对所述小麦的种类没有特殊限制，采用本领域所熟知的小麦品种的籽粒即可。在发酵前优选将所述小麦粉进行灭菌处理。本发明对所述灭菌的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的灭菌方法即可，例如高压蒸汽灭菌法、紫外照射灭菌等。

在本发明中，所述酵母菌的接种量优选为2％～8％，更优选为4％。所述酵母菌株的菌液浓度优选为(1～10)×10

得到发酵液后，本发明从所述发酵液中富集小于3kDa的组分。

在本发明中，所述富集的方法优选采用超滤方法完成，具体为所述发酵液经过离心后收集上清液，通过截留分子量3kDa超滤管，收集滤液，经过冷冻干燥收集粉末。

得到小于3kDa的组分后，本发明将所述小于3kDa的组分进行色谱柱纯化，收集有体外抑制ACE酶活性的组分。

在本发明中，所述小于3kDa的组分优选用纯水配制上样溶液。所述上样溶液的浓度优选为50mg/mL。所述色谱柱优选包括Sephadex G-15凝胶色谱柱或Phenomenex SECYarra Sec-2000 Prep色谱柱。所述Sephadex G-15凝胶色谱柱的规格为3.7cm×100cm；采用所述Sephadex G-15凝胶色谱柱纯化时，洗脱流速为4mL/min。所述Phenomenex SECYarra Sec-2000 Prep色谱柱的规格为21.20mm×300mm，采用所述Phenomenex SEC YarraSec-2000 Prep色谱柱纯化时，洗脱流速为10mL/min。在本发明实施例中，收集体外抑制ACE酶抑制率不低于50％的组分。

得到洗脱物后，本发明将所述洗脱物经C18色谱柱分离和质谱测序，得到降压肽。

在本发明中，所述C18色谱柱的规格优选为15cm×150μm，3μm。所述精细分离时，优选采用夹心法上样，上样体积为5nl。

在本发明中，所述质谱分析的条件优选为离子源参数：喷雾电压：2.1kV；漂移管温度：250℃；离子源：EASY-Spray source；DP能量：100；全扫描分辨率：70000FWHM；扫描范围：350-1800m/z；二级质谱分辨率：17500FWHM；自动增益控制目标：5e6；强度阈值：5.00E+03；裂解方式：HCD；NCE：29％；Top N：20。

在本发明中，对制备的降压肽进行体外ACE酶抑制活性的检测。结果表明，所述降压肽的ACE酶抑制率为90％以上。同时采用原发性高血压大鼠模型作为对象，将所述降压肽灌胃2周后表现出降低血压的作用。

本发明提供了一种发酵小麦降压肽组合物，包括所述降压肽和多肽；所述多肽包括以下至少一种：氨基酸序列如SEQ ID NO:2～SEQ ID NO:3所示的肽段。

在本发明中，所述氨基酸序列如SEQ ID NO:2～SEQ ID NO:3所示的肽段的体外ACE酶抑制率达到86％以上。

在本发明中，所述降压肽和多肽的摩尔比优选为1～100:1～100，更优选为3～85；2～90，进一步优选为5～70:8～79，再进一步优选为7～50:1～30，最优选为1:0.01。所述多肽中各肽段的摩尔比优选为1:1。

鉴于所述降压肽和降压肽组合物具有良好的体外ACE酶抑制活性以及体内降压活性，因此本发明提供了所述降压肽、所述制备方法得到的降压肽或所述降压肽组合物在制备降压药中的应用。

本发明对所述降压药的剂型和制备方面没有特殊限制，采用本领域所熟知的降压药的剂型和制备方法即可。

鉴于所述降压肽和降压肽组合物具有良好的体外ACE酶抑制活性，本发明提供了所述降压肽、所述制备方法得到的降压肽或所述降压肽组合物在制备ACE酶抑制剂中的应用。本发明对所述ACE酶抑制剂的剂型和制备方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的酶抑制剂的剂型和制备方法即可。

本发明提供了一种ACE酶抑制剂，包括所述降压肽或所述降压肽组合物和辅料。

本发明对所述辅料没有特殊限制，采用本领域所熟知的酶抑制剂的辅料即可。

下面结合实施例对本发明提供的一种发酵小麦降压肽及其制备方法、降压肽组合物和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

酵母菌株发酵小麦的条件筛选方法

1)小麦预处理：小麦经过筛选和清洗后，充分干燥，机械粉碎后，经过高温蒸汽灭菌，得到灭菌后的小麦粉。

2)酵母菌株活化方法：配制酵母活化培养基(YPD培养基：葡萄糖20g/L，酵母膏10g/L，蛋白胨20g/L)，灭菌后，按照5％的接种量接种酵母菌液，在180r/min，活化48h，得到活化的酵母菌液。其中酵母为假丝酵母(Candida catenulate)。

3)发酵方法：将浓度为10

表1酵母菌发酵小麦正交试验因素水平表L9(3

4)发酵液的体外ACE抑制活性评价方法：取待测样品用硼酸盐缓冲液调节pH值至8.3，10000g离心后取50μL上清液和50μL浓度为6.5mM的马尿酰-组氨酰-亮氨酸组合物的硼酸盐缓冲液(pH＝8.3)，混合均匀后加入10μL使用上述硼酸盐缓冲液溶解的ACE酶以启动反应。30min后整个反应体系加入10％的三氯乙酸进行灭活，经过0.22μm滤膜过滤后用于液相分析产物马尿酸的量。用硼酸盐缓冲液代替样品重复上述反应作为对照组。液相测定条件如下：Hypersil GOLD(50×2.1mm，1.9μm)，流动相为含有0.1三氯乙酸的5％乙腈的水溶液，流速0.3ml/min；紫外检测波长228nm；柱温：35℃；进样量：3μl。检测结果见表2。

表2正交实验结果

结果表明，在接种量8％发酵温度28℃，发酵时间24h，料液比(小麦粉：水)1:20可以使降压肽的产率最大化。但是过高的水比例会增加后续分离纯化的成本，因此综合考虑将料液比定为1：5。

实施例2

一种发酵小麦降压组分的制备方法

小麦预处理：称取一定量的小麦，用清水清洗干净并干燥，使用研磨机粉碎，随后将粉碎的小麦再121℃下高压灭菌20分钟。

酵母菌活化：配制酵母活化培养基(YPD培养基：葡萄糖20g/L，酵母膏10g/L，蛋白胨20g/L)，灭菌后，接种假丝酵母(Candida catenulate)菌液，温度28℃、摇床180r/min，活化48h；

接种酵母菌发酵：将浓度为10

降压组分的分离：小麦发酵离心分离出上清液，使用截留分子量为3kDa的超滤管，进行超滤，并收集超滤后分子量小于3kDa的组分。将小于3kDa的组分经过冷冻干燥得到粉末，再用纯水配制50mg/ml的上样溶液，上样体积为10ml，使用Sephadex G-15凝胶色谱柱(3.7*100cm)进行纯化，洗脱液为纯水，流速为4mL/min，收集洗脱物，每80mL收集成一份，直至没有明显有紫外吸收的组分流出为止，共得到27份馏分，将收集管内洗脱物进行体外抑制ACE酶活性检测，检测方法同实施例1记载。各区段洗脱物的体外ACE酶抑制率结果见表3和图1。

结果表明：馏分6、7和8具有较高的ACE酶抑制活性，分别达到了92.1±3.5％，89.6±7.2％和91±1.3％，表明这三个收集的组分中含有降压肽。

实施例3

一种小麦降压肽的制备方法

将实施例2中剩余的收集管内洗脱物分别进行精细分离和序列测定，具体方法如下：

使用液质联用平台(Thermo，EASY-nLC 1000System Q-Exactive HFX)对纯化后得到的组分中的肽段序列进行鉴定。

色谱条件为：C18色谱柱(EASY-Spray column，15cm x 150μm，3μm)，流动相A：100％超纯水，0.1％甲酸；流动相B：100％乙腈，0.1％甲酸；上样体积5nL(1μg多肽)，采取夹心法上样。Loading Pump流速350nL/min，15min。分离流速350nL/min，分离梯度为：0-5min，6％B；5-57min，6-12％B；57-71min，12-29％B；71-72min，29-40％B；72-80min，40-95％B。

质谱条件为：离子源参数：喷雾电压：2.1kV；漂移管温度：250℃；离子源：EASY-Spray source；DP能量：100；全扫描分辨率：70000FWHM；扫描范围：350-1800m/z；二级质谱分辨率：17500FWHM；自动增益控制目标：5e6；强度阈值：5.00E+03；裂解方式：HCD；NCE：29％；Top N：20。

结果表明：通过PEAKS Studio 10.0进行数据分析，一共得到39条肽段从纯化物中测定了多种肽段(表3)，其中肽段1为本发明所要保护的降压肽。

实施例4

将实施例3中分离鉴定的肽段合成方法获得纯品，并进行降压活性检测，具体方法如下：

1.称取2.0g空白Wang树脂于洁净干燥的反应管中，加入15mL DMF，室温活化30min左右。

2.抽滤掉溶剂，加入1mmol 5倍摩尔过量的C端第一个氨基酸，5倍摩尔过量的DMAP，5倍摩尔过量的DIC，DMF做溶剂室温反应3h。反应完毕用DMF洗4～6次，每次5-6mL。再加入体积比为1:1的适量吡啶和乙酸酐，反应30min。反应完毕用DMF洗4～6次，每次5-6mL。

3.抽滤去掉溶剂，将10mL 20％的哌啶DMF溶液加入到树脂中，N2搅拌10min后滤出溶液，再加入10mL 20％的哌啶DMF溶液，N2吹动搅拌5min再滤去溶液，反复重复此操作两次后，用DMF洗4次，甲醇洗2次，每次5-6mL。并用茚三酮法检测脱出效果。

4.称取3倍摩尔过量的C端第二个氨基酸，3倍摩尔过量的HBTU和3倍摩尔过量的HOBT于反应管中，加入适量DMF溶液使其完全溶解后，再加入10倍摩尔过量的(纯的)DIEA，室温反应40min，用DMF洗4～6次，每次5-6mL。取少量树脂用茚三酮检测试剂检测，显无色后加入10mL 20％的哌啶DMF溶液脱Fmoc，进行两次，分别为10min、5min，之后用DMF洗4次，甲醇洗2次，每次5-6mL。取出少量树脂用茚三酮检测试剂检测，检测为蓝色后继续合成下一个氨基酸，重复上述步骤，直至合成全部氨基酸序列。

将合成的肽段分别定容至10mg/mL，采用实施例1记载的方法对新合成的各肽段进行体外ACE酶抑制活性检测。结果见表3。

结果表明：制备得到的肽段普遍具有抑制ACE酶活性的能力，即这些肽段属于降压肽，其中肽段1具有最佳体外抑制ACE酶的活性。

表3质谱检测的肽段序列及肽段的体外ACE酶抑制活性

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实施例5

分别活化酿酒酵母、异常威克汉逊酵母、仙人掌有孢汉逊酵母、异常威克汉逊酵母、酿酒酵母、毕赤酵母、拜耳接合酵母、假丝酵母、枯草芽孢杆菌、根霉菌和红曲霉菌，10种酵母菌和枯草枯草芽孢杆菌定容至10

表4质谱肽段检测参数：

结果表明：上述微生物在一定的条件下发酵小麦的产物都具有体外抑制ACE酶的活性，其中假丝酵母J14-4的抑制活性最强(图2)；液质分析表明，除了异常威克汉逊酵母DTM9和假丝酵母L9-6外，其余的微生物发酵物中都检测到了降压肽。

实施例6

小麦发酵降压肽对原发性高血压大鼠的血压影响实验

原发性高血压大鼠(SHR)，雄性，健康清洁级，体重200-250g，共32只，检测环境条件，温度范围25℃，相对湿度范围70％，标准饲料喂养，自由进食和饮

结果见图3。结果表明：灌胃生理盐水的阴性对照组和未发酵小麦的实验组血压没有明显的降低，喂食卡托普利的阳性对照组血压呈明显下降趋势，第三周到第四周血压达到稳定，降低了21mmgh。灌注降压肽的实验组至第三周血压开始下降，到第四周血压降幅与降压药卡托普利相近。此外，灌胃未发酵小麦样品的大鼠血压没有明显的改善。上述结果表明，本发明的降压肽在体内也具有良好的降低血压效果。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，上述对于本技术领域的普通技术人员在理解了上述发明内容之后，不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。同时，以上实施例并不限制本发明，在本发明的精神和原则之内做出的修改、等同替换和改进等，军营包含在本发明的保护范围之内。