一种长效多价猪口蹄疫和猪瘟疫苗及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域中的疫苗生产技术，具体涉及一种长效多价猪口蹄疫和猪瘟疫苗及其制备方法和应用。

背景技术

病毒样颗粒(VLP)是由直径20nm到800nm的病毒包膜或衣壳蛋白自组装而成，不含任何感染性成分。VLP是第一批用于疫苗的纳米颗粒，因为设计相对容易，利用了天然的高稳定性和自组装。VLP已被广泛用于临床试验和商业批准的疫苗作为平台。

当VLP作为抗原的平台时，在改善体液免疫反应方面表现突出。然而，由于低表达产量和来自表达系统的宿主细胞污染物的存在，VLP可能难以生产。去除这些污染物涉及复杂的提纯或体外拆解和重组步骤。VLP还存在稳定性问题，可能是由于缺乏病毒基因所致。此外，包膜VLP需要真核宿主表达系统才能获得其脂膜。一种很流行的非病毒平台是铁蛋白，这是一种参与细胞内铁储存的蛋白质，几乎在所有生物体中都能找到，它由24个单体组成，每个单体的分子量为18kDa。该复合体由8个八面体对称的三聚体组成，类似于菱形十二面体：具有三重和四重对称性的多面体。N-末端非常接近三重轴，这使得三聚体抗原很容易附着。相反，C末端被埋藏，不能用于抗原呈递。哺乳动物表达系统已经成为以铁蛋白为基础的疫苗的标准。幽门螺杆菌铁蛋白因其序列与人类铁蛋白不同而被广泛用于疫苗设计；当与HA融合时，幽门螺杆菌铁蛋白可产生比商业流感疫苗更强的抗流感抗体保护作用。最近的一项研究利用哺乳动物分泌表达系统成功地将SARS-CoV-2三聚体与铁蛋白上的C端Spycatcher和N端SpyTag融合在一起。在纳米颗粒中添加N-连接的糖基化位点提高了表达量。通过与SARS-CoV-2抗体结合，表明三聚体呈现成功。铁蛋白是一个强大和成熟的平台，为VLP提供了一个天然的替代品。然而，与VLP相比，铁蛋白也要小得多，所含的亚基也更少。

FMDV基因工程亚单位疫苗主要是利用各种表达系统表达VP1蛋白，制成疫苗。Kupper等(1981)克隆了FMDV VP1基因，将其插入到原核表达载体PL启动子的下游，实现VP1基因的原核表达，并通过间接ELISA和放射免疫试验证实了其表达产物具有抗原性，从而为FMDV基因工程亚单位疫苗的研制提供了理论依据。同年Kield用大肠杆菌表达的A型FMDVVP1蛋白免疫猪和牛，都可诱导中和抗体的产生，用高浓度的VP1蛋白或重复接种牛，可使牛抵抗FMDV强毒的攻击。Morgan证实：用A12-32二聚体多次接种猪，猪也可产生高水平的中和抗体，可以保护猪免受强毒的攻击，但是该技术不适合O型FMDV。已经发现FMDV结构基因和非结构基因2A、3C串联起来表达，可以产生76S的类病毒粒子，提纯该病毒粒子，用来免疫动物，其免疫效果类似于全病毒，可产生高水平的中和抗体，能抵抗强毒的攻击，并彻底解决了FMDV常规疫苗散毒的危险，显示其良好的年个月度年个前景。除此以外，酵母和杆状病毒系统也用来表达VP1蛋白，解决VP1蛋白在原核表达系统中不被修饰加工等问题，以期提高其免疫原性。

E2蛋白为CSFV的另一囊膜糖蛋白，又称为gp55，是病毒主要的抗原蛋白，也是三个病毒糖蛋白中保守性最低、最易变异的分子。gp55常以100kDa的同源二聚体及与gp33形成75kDa的异源二聚体形式存在于病毒粒子及CSFV感染的细胞表面。在体外，E2蛋白可诱导产生病毒的中和抗体，体内可诱导产生抗CSFV的攻击的抗体。gp55的蛋白骨架由370个氨基酸(ORF编码的690-1060氨基酸残基)组成，并以其C端的40个疏水氨基酸锚定在膜上。由于糖基化程度不同，E2的分子量可为51-58kDa。E2分子内的15个Cys残基在属内均保守，其中N端6个Cys残基参与抗原结构域的形成，C端9个Cys残基则参与同源、异源二聚体的形成。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何提高猪口蹄疫VP1猪瘟E2等病毒抗原表达产物免疫效果差，且不能同时实现猪瘟和猪口蹄疫双重免疫的缺陷。

为解决上述技术问题，第一个方面，本发明提供蛋白质，所述蛋白质由融合蛋白GBGAVP1-SpyCatcher-linker-Min3和融合蛋白E2Fc连接而成，

所述融合蛋白GBGAVP1-SpyCatcher-linker-Min3为下述A1)-A3)中任一种：

A1)、氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质；

A2)、A1)所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且与猪口蹄疫疫苗相关的蛋白质；

A3)、在A1)或A2)的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；

所述融合蛋白E2Fc为下述B1)-B3)中任一种：

B1)、氨基酸序列是SEQ ID No.4的蛋白质；

B2)、B1)所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与B1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且与猪瘟病毒疫苗相关的蛋白质；

B3)、在B1)或B2)的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质。

其中，SEQ ID No.2第1-58为ProteinG抗体核心结合蛋白GB，SEQ ID No.2第59-116位为ProteinA抗体核心结合蛋白GA，其中SEQ ID No.2的第117-127位为连接肽，第128-340位为O型口蹄疫VP1蛋白，SEQ ID No.2的第341-435位为SpyCatcher蛋白，第436-447位为连接肽，SEQ ID No.2的第448-659位为Min3蛋白，SEQ ID No.2的第660-667位为His标签。

SEQ ID No.4第1-362位为猪瘟病毒E2，SEQ ID No.4第363-379为连接肽，SEQ IDNo.4第380-608为猪IgGFc。

所述融合蛋白GBGAVP1-SpyCatcher-linker-Min3与所述融合蛋白E2Fc通过所述融合蛋白GBGAVP1-SpyCatcher-linker-Min3中的蛋白A和蛋白G与所述融合蛋白E2Fc中的Fc特异性结合而偶联。

蛋白A(Protein A)来源于金黄色葡萄球菌的一个株系，它含有5个可以和抗体IgG分子的Fc段特异性结合的结构域。1个蛋白A分子至少可以结合2个IgG。蛋白G是一种源自链球菌G族的细胞表面蛋白，为三型Fc受体。其通过类似于蛋白A的非免疫机制与抗体的Fc段结合。像蛋白A一样，蛋白G可以与IgG的Fc区域特异性结合，不同的是，Protein GSepharose可以广泛、更强地结合更多类型的IgG、多克隆IgG及人IgG，同时血清蛋白结合水平更低，纯度更高，配基脱落也相对更低。此外，蛋白G还可以和某些抗体的Fab和F(ab’)

上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

所述蛋白标签(protein-tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为Flag蛋白标签、His蛋白标签、MBP蛋白标签、HA蛋白标签、myc蛋白标签、GST蛋白标签和/或SUMO蛋白标签等。

第二个方面，本发明提供核酸分子，所述核酸分子由编码所述融合蛋白GBGAVP1-SpyCatcher-linker-Min3的核酸分子和编码所述融合蛋白E2Fc的核酸分子组成，

所述编码融合蛋白GBGAVP1-SpyCatcher-linker-Min3的核酸分子为下述g11)-g13)中任一种，

g11)、编码链的编码序列是SEQ ID No.1第5076-7079位核苷酸所示的DNA分子；

g12)、编码链的核苷酸序列是SEQ ID No.1第5076-7079位所示的DNA分子；

g13)、与g11)或g12)限定的核苷酸序列具有80％或80％以上同一性，且编码所述融合蛋白GBGAVP1-SpyCatcher-linker-Min3的DNA分子；

所述编码融合蛋白E2Fc的核酸分子为下述g21)-g23)中任一种，

g21)、编码链的编码序列是SEQ ID No.3第5776-7602位所示位核苷酸所示的DNA分子；

g22)、编码链的核苷酸序列是SEQ ID No.3第5776-7602位所示的DNA分子；

g23)、与g21)或g22)限定的核苷酸序列具有80％或80％以上同一性，且编码所述融合蛋白E2Fc的DNA分子。

上述DNA分子可为按哺乳细胞密码子优化合成的。

第三个方面，本发明提供表达盒，所述表达盒含有上述的核酸分子。

第四个方面，本发明提供重组载体，所述重组载体含有上述的核酸分子或含有上述的表达盒。

第五个方面，本发明提供重组微生物，所述重组微生物含有权利含有上述的核酸分子或含有上述的表达盒或含有上述的重组载体。

第六个方面，本发明提供重组转基因细胞系所述重组转基因细胞系含有权利含有上述的核酸分子或含有上述的表达盒或含有上述的重组载体。

第七个方面，本发明提供猪口蹄疫和猪瘟疫苗，其上述的蛋白质。

上述蛋白质的制备方法，包括：使上述融合蛋白GBGAVP1-SpyCatcher-linker-Min3的编码基因和上述融合蛋白E2Fc的编码基因在生物细胞中进行表达得到上述蛋白质的步骤；所述生物为微生物、植物或非人动物。

进一步地，上述的方法中，所述生物细胞为非人哺乳动物细胞。

第八个方面，本发明提供上述的蛋白质或上述的核酸分子或上述的表达盒或上述的重组载体或上述的重组微生物或上述的重组转基因细胞系在制备预防猪口蹄疫和/或猪瘟的产品中的应用。

本发明中，所述产品可为试剂或试剂盒或药品。

进一步地，本发明中，所述药品可为疫苗。

本发明中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambdaratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

本发明中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。

上述用于编码所述融合蛋白GBGAVP1-SpyCatcher-linker-Min3和/或融合蛋白E2Fc的核酸分子，本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码所述融合蛋白GBGAVP1-SpyCatcher-linker-Min3和/或融合蛋白E2Fc的核酸分子的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，与本发明分离得到的编码所述融合蛋白GBGAVP1-SpyCatcher-linker-Min3和/或融合蛋白E2Fc的核酸分子的核苷酸序列具有80％或者更高同一性且编码所述融合蛋白GBGAVP1-SpyCatcher-linker-Min3和/或所述融合蛋白E2Fc，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

术语“编码序列”意指直接指定多肽的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界通常由开放阅读框决定，所述开放阅读框以起始密码子如ATG、GTG或TTG开始，并且以终止密码子如TAA、TAG或TGA结束。编码序列可以是基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。

术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，其包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。

上述生物材料中，所述表达盒，是指能够在重组细胞中表达融合蛋白GBGAVP1-SpyCatcher-linker-Min3或融合蛋白E2Fc的DNA，该DNA不但可包括启动融合蛋白GBGAVP1-SpyCatcher-linker-Min3或融合蛋白E2Fc编码基因转录的启动子，还可包括终止融合蛋白GBGAVP1-SpyCatcher-linker-Min3或融合蛋白E2Fc编码基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。

所述含有编码融合蛋白GBGAVP1-SpyCatcher-linker-Min3的核酸分子的重组表达载体具体可为在载体pET30a(+)的多克隆位点插入编码融合蛋白GBGAVP1-SpyCatcher-linker-Min3的核酸分子得到的重组表达载体。所述含有编码融合蛋白E2Fc的核酸分子的重组表达载体具体可为在载体PCHO1.0的多克隆位点插入编码融合蛋白E2Fc的核酸分子得到的重组表达载体。

所述的重组微生物具体可为哺乳细胞也可以是其他表达系统如酵母类、细菌类、藻类以及植物。哺乳细胞可具体为CHO细胞。

术语“重组载体”意指线性的或环状的DNA分子，其包含编码多肽的多核苷酸，并且所述多核苷酸与提供用于其表达的调控序列可操作地连接。所述重组载体包含本发明的多核苷酸，其连接于一个或多个调控序列，例如启动子和转录和翻译终止信号，所述调控序列指导所述多肽在表达宿主中产生。多种核苷酸和调控序列可以结合在一起以产生重组载体，所述重组载体可以包括一个或多个的限制性酶位点以允许在这些位点插入或取代编码多肽的多核苷酸。可供选择的是，可以通过在适当的用于表达的载体中插入包含所述多核苷酸的核酸构建体或多核苷酸来表达所述多核苷酸。在制备表达载体的过程中，将编码序列置于载体中，从而将该编码序列与适当的调控序列可操作地连接以供表达。重组载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其能够方便地进行重组DNA步骤，并且能够产生多核苷酸的表达。载体的选择将通常依赖于载体与将引入该载体的重组细胞的相容性。载体可以是线状或闭合环状质粒。载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体。载体可以含有任何用于确保自复制的手段；或者，当被引入重组细胞中时，载体可以是一种整合到基因组中并且与整合了该载体的染色体一起复制的载体。此外，可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同含有待引入重组细胞基因组的完整DNA，或可以使用转座子。

所述载体优选地含有一个或多个选择性标记，其允许简单选择经转化、转染、转导等的细胞。所述载体优选含有元件，其允许载体整合入重组细胞基因组或载体在细胞中独立于基因组的自主复制。为了整合入重组细胞基因组，载体可依赖编码多肽的多核苷酸的序列或用于通过同源或非同源重组整合入基因组的任何其它载体元件。或者，载体可以含有额外的多核苷酸，用于指导通过同源重组整合入宿主细胞基因组染色体中的精确位置。为了增加在精确位置整合的可能性，整合元件应含有足够数量的核酸，如100至10000碱基对，400至10000碱基对，和800至10000碱基对，其与相应的目标序列具有高度序列同一性以增强同源重组的概率。整合元件可为任何序列，其与宿主细胞基因组中的目标序列同源。此外，整合元件可为非编码或编码的多核苷酸。另一方面，可以将载体通过非同源重组整合到重组细胞的基因组中。为了自主复制，载体可以进一步包含复制起点，其使载体能够在重组细胞中自主地复制。复制起点可以是介导自主复制的任何质粒复制子，其在细胞中发挥功能。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指能够使质粒或载体体内复制的多核苷酸。

可以将多于一个拷贝的本发明的多核苷酸插入重组细胞以增加多肽的产生。多核苷酸拷贝数的增加可通过如下方法获得：将至少一个额外拷贝的序列整合入宿主细胞基因组，或将可扩增的选择性标记基因包括于多核苷酸，其中可通过在合适的选择剂存在下培养细胞来选择含有选择性标记基因的扩增拷贝，且由此含有多核苷酸的额外拷贝的细胞。用于连接上述元件以构建本发明的重组表达载体的方法是本领域技术人员熟知的。

术语“重组细胞”意指任何细胞类型，所述细胞类型对于使用包含本发明多核苷酸的核酸构建体或表达载体的转化、转染、转导等是易感的。术语“重组细胞”涵盖任何亲本细胞的后代，其由于在复制中发生的突变而不同于亲本细胞。

所述重组细胞，其包含本发明的多核苷酸可操作地连接于一个或多个指导本发明多肽的产生的调控序列。将包含多核苷酸的构建体或载体导入重组细胞，使所述构建体或载体如前所述作为染色体整体或者作为自复制的染色体外载体维持。术语“重组细胞”包括亲本细胞的任何后代，其由于复制过程中发生的突变而不同于亲本细胞。细胞的选择将在很大程度上依赖于编码多肽的基因及其来源。重组细胞可以是在本发明的多肽的重组产生中有用的任何细胞，例如，原核或真核细胞。

本发明产生的有益技术效果为：本发明实现猪瘟和猪口蹄疫的双重免疫。

附图说明

图1为pET30-GBGAVP1-SpyCatcher-linker-Min3的物理图谱。

图2为重组菌株BL21/pET30-GBGAVP1-SpyCatcher-linker-Min3在16℃温度条件下的目的蛋白表达及纯化结果。

图3为纯化的融合蛋白GBGAVP1-SpyCatcher-linker-Min3的SDS-PAGE检测结果。

图4为纯化融合蛋白GBGAVP1-SpyCatcher-linker-Min3的电镜结果。

图5为单克隆细胞斑点杂交结果。

图6为Protein A纯化的融合蛋白E2Fc SDS-PAGE图谱。

图7为两种蛋白融合蛋白GBGAVP1-SpyCatcher-linker-Min3和融合蛋白E2Fc偶联效果。

图8为融合蛋白E2Fc和融合蛋白GBGAVP1-SpyCatcher-linker-Min3组装后电镜结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、GBGAVP1-SpyCatcher-linker-Min3蛋白突变体及其编码基因的获得

1.1、目的基因的合成

为了提高野生型VLPS的长效高免疫原效性，将ProteinA、ProteinG结合抗体Fc功能区域基因与O型口蹄疫VP1基因融合在SpyCatcherMin3基因N段，得到融合蛋白GBGAVP1-SpyCatcher-linker-Min3的编码基因。

委托擎科生物合成融合蛋白GBGAVP1-SpyCatcher-linker-Min3的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1第5076-7079位所示。其中SEQ ID No.1的第5076-5249位为proteinG核心结合蛋白GB，第5250-5423位为proteinA核心结合蛋白GA，第5424-5456位为连接肽，第5457-6095位为为O型口蹄疫VP1基因，第6096-6380位为SpyCatcher基因，第6381-6416位为连接肽，SEQ ID No.1的第6417-7052位为Min3基因，SEQ ID No.1的第7053-7079位为8×His蛋白标签和终止密码子基因。用SEQ ID No.1第5076-7079位所示的DNA分子替换pET30a(+)载体NdeI和XhoI之间序列，保持pET30a(+)载体其它核苷酸序列不变得到的重组表达载体命名为重组表达载体pET30-GBGAVP1-SpyCatcher-linker-Min3，重组表达载体pET30-GBGAVP1-SpyCatcher-linker-Min3的核苷酸序列是SEQ ID No.1。重组表达载体pET30-GBGAVP1-SpyCatcher-linker-Min3的物理图谱如图1所示。

PET30-GBGAVP1-SpyCatcher-linker-Min3表达融合蛋白GBGAVP1-SpyCatcher-linker-Min3，融合蛋白GBGAVP1-SpyCatcher-linker-Min3的氨基酸序列是SEQ ID No.2。其中，SEQ ID No.2第1-58为ProteinG抗体核心结合蛋白GB，SEQ ID No.2第59-116位为ProteinA抗体核心结合蛋白GA，其中SEQ ID No.2的第117-127位为连接肽，第128-340位为O型口蹄疫VP1蛋白，SEQ ID No.2的第341-435位为SpyCatcher蛋白，第436-447位为连接肽，SEQ ID No.2的第448-659位为Min3蛋白，SEQ ID No.2的第660-667位为His标签。

1.2、融合蛋白的表达

将1.1制备的重组表达载体pET30-GBGAVP1-SpyCatcher-linker-Min3转化入宿主菌E.coli BL21(DE3)中。具体步骤含有：将0.5ul重组表达载体pET30-GBGAVP1-SpyCatcher-linker-Min3加入E.coli BL21(DE3)感受态(全式金)EP管中，冰浴30min，42℃热激90S冰浴2min，加入500ul LB培养基中于37℃培养1小时涂布Kana(卡那霉素)抗性平板，37℃过夜，挑单菌接种于LB培养基中，于37℃，200rpm振荡培养6小时，按菌液：50％甘油7：3的比例-80℃保存菌液获得重组菌株BL21/pET30-GBGAVP1-SpyCatcher-linker-Min3。

1.3、产物表达及表达形式的确定

将1.2中甘油保存重组菌株BL21/pET30-GBGAVP1-SpyCatcher-linker-Min3按1％接种到25μg/ml kana抗性的100ml LB培养基中，加1mM TPTG于250mL三角瓶中诱导6小时，培养条件分别为16℃+220rpm转速。诱导表达后，超声破碎后12000rpm离心10min，分别取发酵菌液上清和发酵菌液上清纯化产物进行SDS-PAGE检测。结果如图2所示，图2中，MK(LOT#N51130全式金)自下而上分别是14kDa、25kDa、30kDa、40kDa、50kDa、70kDa、100kDa、120kDa，泳道1和泳道2是发酵菌液上清，泳道3是发酵菌液上清纯化产物。

实施例2、融合蛋白GBGAVP1-SpyCatcher-linker-Min3的发酵及纯化

2.1、在发酵罐中大肠杆菌的高密度发酵

2.1.1、种子液制备或平板培养

重组菌株BL21/pET30-GBGAVP1-SpyCatcher-linker-Min3于含卡那霉素的LB培养基中30-37℃、250-280rpm培养10-12小时。

含卡那霉素的LB培养基的组成为：1％蛋白胨+0.5％NaCL+0.5％酵母粉，卡那霉素25μg/ml，其余为水。

2.1.2、二级种子制备

菌株于含卡那霉素的改良LB培养基30-37℃、220rpm培养12小时。

含卡那霉素的改良LB培养基：0.5％甘油+1％蛋白胨+0.5％NaCL+1％酵母粉，卡那霉素25μg/ml，其余为水。

2.1.3、发酵生产

发酵培养共分为三个阶段：

(1)菌体培养阶段

5L发酵罐中装3L初始发酵培养基灭菌后，按照25μg/mL添加量加入卡那霉素，按照10％接种量(体积比)接种2.1.2制备的种子液，30℃通气搅拌培养7小时，在培养过程中随着菌株的生长，培养基中的糖逐渐消耗，当碳源消耗完后菌体不再生长，溶氧(DO)回升到10％，培养过程中用氨水维持pH值7.0。

(2)源饲喂阶段

确认上一步糖耗完后(以DO回升20％，同时在不加酸的情况下pH上升为标准)，开始此步骤。用补料培养基控制DO在10-20％之间。用氨水维持在pH值7.0，此步骤维持3小时后开始诱导表达。

(3)诱导表达阶段

当补料3小时后开始诱导，降低温度16℃，添加终浓度0.1mM的IPTG诱导12小时，用补料控制DO在10-30％之间，整个诱导过程用氨水维持pH值在7.0，诱导12小时后收集发酵液。

其中，初始发酵培养基和补料培养基的配方如下：

初始培养基组成为(g/L)：葡萄糖5、蛋白胨5、酵母粉5、KH

补料培养基的组成为(g/L)：甘油80、葡萄糖80蛋白胨36、酵母粉36、MgSo

2.2、GBGAVP1-SpyCatcher-linker-Min3蛋白的纯化工艺

S1)、将2.1.3获得的发酵液在5000rpm离心10min，收集菌体-20℃保存；

S2)、按质量比10％的量悬浮于缓冲裂解液中，冰浴下高压均质破菌，10000rpm离心20min分离细胞碎片，取上清液过0.45μm过滤膜，收集过滤液作为粗样以备纯化；

其中，缓冲裂解液的组成为：10mM Tris-HCl，200mM NaCl，10mM咪唑，0.02％溶菌酶，其余为水，调节至pH8.0；

S3)、粗样上镍柱前柱子先用平衡缓冲液1进行平衡，然后用平衡缓冲液1冲洗直到检测线接近上样前的基线，上样(粗样)，上样结束后继续用平衡缓冲液2冲洗直到检测线接近上样前的基线，然后开始洗杂，用目的蛋白洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，即获得纯化的融合蛋白GBGAVP1-SpyCatcher-linker-Min3蛋白；

其中，平衡缓冲液1的组成为：10mM Tris-HCl，200mM NaCl，10mM咪唑，其余为水pH8.0；

平衡缓冲液2的组成为：20mM Tris-HCl，200mM NaCl，20mM咪唑，其余为水，pH8.0；

目的蛋白洗脱缓冲液的组成为：20mM Tris-HCl，500mM NaCl，250mM咪唑，其余为水，pH8.0；

S4)、步骤S3)纯化的融合蛋白GBGAVP1-SpyCatcher-linker-Min3进行SDS-PAGE检测，结果如图3所示，图3中，泳道1和2为纯化的融合蛋白GBGAVP1-SpyCatcher-linker-Min3，MK为Marker，自上而下分别是120kDa、100kDa、70kDa、50kDa、40kDa、30kDa、25kDa、10kDa，蛋白胶结果表明：经过上述步骤纯化获得的目的蛋白无杂质。

目的蛋白稀释到PBS缓冲液中送中国科学院生物物理所电镜观察，结果表明融合蛋白GBGAVP1-SpyCatcher-linker-Min3可以形成VLPS，电镜结果如图4所示，图4中图例为100nm，条件为98000×，120kV。

实施例3、融合蛋白E2Fc的制备

3.1、重组表达载体的构建

对融合蛋白E2Fc的编码基因进行密码子优化后人工合成，合成的序列如SEQ IDNo.3第5776-7602位(也即SEQ ID No.3第9688-11514位)所示，其中SEQ ID No.3第5776-6861位为猪瘟病毒E2的基因，第6862-6912位为连接肽基因，SEQ ID No.3第6913-7602位为猪LgGFc基因。用优化后的序列分别插入pCHO1.0的AVRII酶切位点和EcoR V酶切位点，获得含有双拷贝基因重组表达载体pCHO1.0-E2Fc，pCHO1.0-E2Fc的核苷酸序列是SEQ ID No.3。重组表达载体可表达融合蛋白E2Fc。

融合蛋白E2Fc的氨基酸序列是SEQ ID No.4，其中SEQ ID No.4第1-362位为猪瘟病毒E2，SEQ ID No.4第363-379为连接肽，SEQ ID No.4第380-608为猪IgGFc。

3.2、合成载体抽提

合成菌株于含卡那霉素中100μg/ml的LB培养基中37℃、220rpm培养12小时，用天根无内毒素试剂盒抽提载体。pvul酶切后用胶回收试剂盒回收酶切产物，回收产物准备转染哺乳细胞CHOK1细胞用；

其中，LB培养基的组成为1％蛋白胨+1％NaCL+0.5％酵母粉，其余为水，卡那霉素含量为100μg/ml。

3.3、稳转细胞株的构建

将重组表达载体pCHO1.0-E2Fc用pvul酶切后用胶回收试剂盒回收酶切产物，回收产物准备转染哺乳细胞CHOK1，CHOK1来源于中国科学院细胞库(上海)，货号：SCSP-507。

步骤1、转染前一天，以合适的细胞密度接种到6孔培养板上；转染时，细胞要达到90-95％的融合；

步骤2、将溶液1与溶液2混合，室温下置20min；

溶液1：240μL无血清培养基(浙江壹生科生物技术有限公司，产品名称：CDCHOK1货号：L10001)+10μL Lipofectamine

溶液2：225μL无血清培养基(浙江壹生科生物技术有限公司，产品名称：CDCHOK1货号：L10001+25μl(4μg)质粒/孔(每孔总体积250μL)；

步骤3：将步骤1的6孔板中的细胞用无血清培养基冲洗细胞两遍后，加入2mL无血清培养基；

步骤4：将溶液1与溶液2的混合液逐滴加入孔中，摇动培养板，轻轻混匀；在37℃，5％的CO2中保温6小时；

步骤5：更换含有血清的全培养基培养基90％(浙江壹□科□物技术有限公司,产品名称：CDCHOK1货号：L10001，胎牛血清10％，在37℃，5％的CO2中培养。加抗生素(10μg/mL嘌呤霉素)进行筛选，得到稳定转染后的单克隆细胞。

3.4、克隆筛选

待细胞生长两天贴壁后，换液(CDCHOK1(浙江壹生科生物技术有限公司，货号：L10001)+10％胎牛血清(FBS)加嘌呤霉素浓度为10μg/mL)后加压培养。有大量细胞死亡后直接换液不加压继续培养，待克隆长出。细胞单克隆长至合适大小，准备挑克隆。将所有克隆挑至96孔板中。置培养箱中培养，待克隆长至铺满80％孔底，取上清SDS-PAGE斑点杂交。主要步骤如下：

1.包被：剪一块适当大小的NC膜(0.45μm)，用铅笔在膜上画一个适当大小的圆圈，在膜的角落标记数字1、2、3……放在24孔板中，点1μg体积约1μl的抗原在圆圈的正中心，(若抗原浓度太高就稀释到1μg/μl，若抗原浓度太低则陆续点1μl在圆中心的同一个点上，每次等膜干了再点，以免抗原扩散)37℃孵育2h；

2.封闭：用PBS配制5％的脱脂奶粉作为封闭液，加入500μl到孔中使包被好的膜浸在封闭液中摇晃2h；

3.洗涤：倒掉封闭液，用PBST洗涤膜1次。洗涤过程中加入PBST没过膜，在摇床上晃动3-5分钟，然后再吸出洗涤液；

4.一抗：一抗用PBST稀释相应的倍数后，加入500μl到孔中，使一抗浸没NC膜，室温晃动孵育1h；

5.洗涤：用PBST洗涤3次膜。每次加入足量的PBST晃动3-5分钟后吸出液体重复操作3次，最后一次将洗涤液吸干；

6.二抗：用PBST将相应的二抗以1:5000倍稀释后加500μl至孔中浸没NC膜，室温晃动孵育30分钟；

7.洗涤：用PBST洗涤5次膜。每次加入足量的PBST晃动3-5分钟后吸出液体重复操作5次，最后一次将洗涤液吸干；

8.爆光：将ECL按1:1配置，现配现用，加200μL在孔中润湿膜后，及时爆光；

其中，一抗为猪瘟阳性血清参考品(检测专用)强阳性，货号为Z220，阻断ELISA值88％-98％(购买于中国兽医药品监察所，中国兽医微生物菌种保藏管理中心)；二抗为：辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG货号为SE131(购买于北京索莱宝科技有限公司)；PBST的组成为(以1L计)：NaCl 8.00g、Na

筛选表达量高的细胞株留下继续筛选。筛选结果如图5。图5结果表明获得8株高表达细胞，均高于阳性对照水平，我们选用3F6作为生产用细胞生产抗原用。

3.4、细胞悬浮驯化

将高表达的克隆细胞转移到无血清培养基(CDCHOK1，浙江壹生科生物技术有限公司，货号L10001)的6孔板中培养，连续培养传代2个月，挑选最终适应悬浮培养高产的细胞株作为工程菌株。

3.5、稳定细胞株的10L发酵流加培养

发酵罐采用上海百仑哺乳发酵罐10L反应系统，装液量为5L，转速为80rpm，pH控制为7.2，培养温度为37℃。准备1L种子液，密度为2.0×10

其中发酵培养为CDCHOK1，购自浙江壹生科生物技术有限公司，货号为L10001；

补料培养基为CHONF604，购自浙江壹生科生物技术有限公司，货号为L10302。

3.6、融合蛋白的纯化

收集3.5获得的发酵液，5000rpm离心10min获得上清液待用。

3.6.1、样品准备

将发酵液与结合缓冲液1：1混合，用0.45μm的过滤膜过滤(防止堵塞柱子)；

平衡柱子：用5-10倍体积的结合缓冲液(NaCl，0.5M；Na

3.6.2、上样

将准备好的发酵样品上样，根据柱子的结合能力考虑上样量的体积；

洗脱杂蛋白：用结合缓冲液冲洗柱子，直至结合液中不含蛋白，基线不再变化时开始洗脱蛋白；

洗脱蛋白：用洗脱液(0.1M柠檬酸钠缓冲液；pH3.5)过柱，同时收集洗脱穿出液，收集管中需事先加入约150ul的1M pH8.0 Tris-HCl缓冲液(洗脱液约1ml/管)，直至流出液中不含蛋白。纯化蛋白的SDS-PAGE图谱如图6所示，图6中，MK表示Marker，自上至下依次为150kDa、100kDa、70kDa、50kDa、40kDa、35kDa、25kDa、20kDa、15kDa、10kDa,图中1表示发酵上清液；2表示表示穿透液；3表示洗杂液；4-14表示不同时间段洗脱液取样结果。结果表明：CHOK1细胞能稳定表达E2Fc蛋白，大于预测大小，因为E2基因中有糖基化位点，经过修饰，大于软件预测大小，糖基化修饰均匀，未出现弥漫条带。表达量能达到每升克级别产量，利用Protein A抗体亲和纯化出目的蛋白且纯度较高。

实施例4、偶联病毒样颗粒制备

将融合蛋白GBGAVP1-SpyCatcher-linker-Min3和E2Fc融合蛋白按1：5浓度比例混合，超滤置换抗体结合缓冲液中置换(NaCl，0.5M；Na

实施例5、疫苗的制备

5.1、半成品检验

5.1.1、纯化后蛋白含量测定

考马斯亮蓝(Coomassie Brilliant Blue)法测定蛋白质浓度BSA标准品5mg/ml(货号：PC0001品牌：Solarbio)，

考马斯亮蓝试剂的配制：考马斯亮蓝试剂：

考马斯亮蓝G-250 100mg溶于50ml95％乙醇中，加入100ml85％磷酸，用蒸馏水稀释至1000ml，滤纸过滤。最终试剂中含0.01％(W/V)考马斯亮蓝G-250，4.7％(W/V)乙醇。

测定梯度浓度的牛血清标准品溶液的OD

测得纯化蛋白浓度结果为：融合蛋白E2Fc的浓度为0.891g/L，融合蛋白GBGAVP1-SpyCatcher-linker-Min3的浓度为1.09g/L。

5.1.2、无菌检验

所有蛋白溶液无菌过滤按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。

5.2、疫苗配制与乳化

5.2.1、水相制备

水相偶联试剂1：配置后E2Fc蛋白浓度不低于50μg/ml，即取该纯化的融合蛋白母液19.7ml；融合蛋白GBGAVP1-SpyCatcher-linker-Min3蛋白浓度不低于200μg/ml即取该纯化的融合蛋白65ml，将2种纯化的融合蛋白蛋白按相应浓度混合置于175ml偶联缓冲液(NaCl，0.5M；Na

水相偶联试剂2：配置融合蛋白E2Fc蛋白浓度不低于100μg/ml，即取该纯化的融合蛋白39.5ml；配置融合蛋白GBGAVP1-SpyCatcher-linker-Min3蛋白浓度不低于300μg/m即取该纯化的融合蛋白97.5ml，将2种纯化的融合蛋白蛋白按相应浓度混合置于175ml偶联缓冲液(NaCl，0.5M；Na

水相偶联试剂3：配置融合蛋白E2Fc蛋白浓度不低于150μg/ml，即取该纯化的融合蛋白59ml；配置融合蛋白GBGAVP1-SpyCatcher-linker-Min3蛋白浓度不低于350μg/m即取该纯化的融合蛋白113ml，将2种纯化的融合蛋白蛋白按相应浓度混合置于175ml偶联缓冲液(NaCl，0.5M；Na

5.2.2、油水比例

按照质量比水相：佐剂＝1:1的比例进行乳化。

E2Fc+GBGAVP1Min3-1批疫苗制备：水相偶联试剂1取250ml加Monanide

E2Fc+GBGAVP1Min3-2批疫苗制备：水相偶联试剂2取250mL加Monanide

E2Fc+GBGAVP1Min3-3批疫苗制备：水相偶联试剂3取250ml，加Monanide

5.3、成品检验

5.3.1、性状

外观：肉眼观察试验疫苗应保持分装时白色略带粘滞性乳状液。

剂型：取一清洁吸管，吸取少许疫苗滴于清洁冷水表面，应呈云雾状扩散。应保持稳定的水包油包水型(W/O/W)，

稳定性：吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相应不超过0.5ml，均符合要求。

5.3.2、装量检查

按现行《中国兽药典》附录进行检查，应符合规定。

5.3.3、无菌检验

按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长，结果如表1。

表1.保存不同时间3批疫苗装量检测和无菌检验结果

5.4、安全检验

5.4.1、用小动物检验

用体重350～450g的豚鼠2只(白色豚鼠，购于维通利华品种，来源)，各皮下注射疫苗2m1；用体重18～22g小鼠5只(BALB/c品种，购于维通利华来源)，各皮下注射疫苗0.5m1。逐日观察7日，均不应出现因注射疫苗引起的死亡或明显的局部反应或全身不良反应，结果见表2，实验动物未发生死亡，制备的疫苗安全。

5.4.2、用猪检验

用30～40日龄健康易感仔猪(长白三元杂交猪，购于河北固安某猪场)2头，各两侧耳根后肌肉分点注射疫苗4ml(2头份)，每次2ml，观察14日。均不得出现由疫苗引起的异常反应，结果见表2，实验动物未发生死亡，制备的疫苗安全。

表2.保存不同时间3批疫苗安全性检验结果

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5.4.3、内毒素含量

将待检疫苗放在4℃条件下保存3个月，每月每批样终任意抽样1瓶，破乳后，收集水相并充分混合，按现行《中国兽药典》附录细菌内毒素检查方法进行检验，每头份疫苗内毒素应不大于5EU，破乳疫苗每毫升疫苗VLPs偶联蛋白含量不能有明显的降低视为合格，结果见表3，结果显示，3批制备的疫苗在4℃条件下相对稳定，未见蛋白降解。。

表3.保存不同时间3批疫苗内毒素、蛋白含量含量检测结果

5.5、3批疫苗免疫抗体水平检测

5.5.1、实验材料

(1)实验猪选择60kg左右猪(杜大长外三元猪)来自非免疫健康猪群15头(购买固安某猪场)，采用兰州兽医研究所生产口蹄疫抗体ELISA检测试剂盒和IDEXX公司猪瘟抗体ELISA试剂盒检测，检测O型口蹄疫抗体和猪瘟病毒抗体均为阴性猪，并在严格隔离条件下进行试验。

(2)疫苗

随机抽取实验室生产的3批不同浓度protein GBGAVP1-SpyCatcher-linker-Min3vlps偶联E2融合Fc偶联VLPS疫苗，E2Fc+GBGAVP1Min3-1；E2Fc+GBGAVP1Min3-2；E2Fc+GBGAVP1Min3-3。

(3)猪瘟抗体ELISA检测试剂盒，购自IDEXX公司，(产品货号：99-43220(5块板/可拆板)；判定标准：阻断率大于或等于40％判为阳性；阻断率等于或小于30％判为阴性；阻断率在30％～40％之间判为可疑。

((4)口蹄疫抗体ELISA检测试剂盒，购自兰州兽研所，批号为：01.0020A)；口蹄疫按OIE推荐液相阻断ELISA方法进行抗体检测。按照国家重大疫病免疫抗体检测标准，70％以上免疫猪口蹄疫抗体应不低于1:64，判为合格。具体结果判定：以病毒抗原对照平均OD

(5)试验仪器Bio-Rad Imark型酶联免疫分析仪。

5.5.2、分组及免疫方法

按3批疫苗不同浓度(E2Fc+GBGAVP1Min3-1、E2Fc+GBGAVP1Min3-2、E2Fc+GBGAVP1Min3-3)分为3组，每组5头，每头分别颈部肌肉接种2mL疫苗，所有试验猪分别在首免7日、14日、21日、28日前腔静脉采血，分离血清，用试剂盒检测猪瘟抗体阻断率和O型口蹄疫抗体液相阻断ELISA

5.5.3、猪瘟效力实验结果分析

猪瘟疫苗的免疫评估一般关注两点：

1)阳性率：猪瘟抗体阻断率(Blocking)≥40％，判为阳性结果；30％

2)免疫合格率：阻断率(Blocking)≥50％的，即为免疫合格断奶仔猪猪瘟第一次免疫受母源抗体干扰，≥30％可视为合格。免疫合格的比例即为免疫合格率。有研究表明猪群体中猪瘟抗体阻断率不大于30％时，猪瘟病毒的阳性率为14.3％；猪瘟的抗体阻断率为30％～90％时，猪瘟病毒的阳性感染率仅为2％即免疫合格猪场：检测种猪猪瘟抗体，平均阻断值＞75％，阻断值＞50％的个体占群体的90％以上。

三组猪瘟抗体水平测定结果显示：随着E2Fc有效浓度提高，抗体效价提升明显，其中E2Fc有效成分75μg/头份时结果最优具体结果见表4-表6，当E2Fc有效成分25μg/头份时，平均阻断率7日为15.74％，14日为37.94％，21日为69.58％，28日为77.31％，其中免疫28日达到免疫合格猪场标准(免疫合格猪场：检测种猪猪瘟抗体，平均阻断值＞75，阻断值＞50的个体占群体的90％以上)；但在21日组内个体之间抗体差异较大57.66-77.41％，即使28日抗体水平达到免疫合格猪场还是在68.52-85.07％之间波动；当E2Fc有效成分50μg/头份时，平均阻断率7日为16.62％，14日为47.49％，21日为70.23％，28日为80.07％，其中免疫28日达到免疫合格猪场标准(免疫合格猪场：检测种猪猪瘟抗体，平均阻断值＞75，阻断值＞50的个体占群体的90％以上)；21日组内个体之间抗体差异在65.14-79.23％，28日抗体水平达到免疫合格猪场抗体还是在75.15-86.38％之间波动；当E2Fc有效成分75μg/头份时，平均阻断率7日为20.98％，14日为52.96％，21日为75.20％，28日为84.79％，其中免疫21日刚好达到免疫合格猪场标准(免疫合格猪场：检测种猪猪瘟抗体，平均阻断值＞75，阻断值＞50的个体占群体的90％以上)将保护日期提前7天；组内动物抗体波动较小，结果最优，具体结果见表4、表5、表6。

表4.疫苗E2Fc+GBGAVP1Min3-1免疫试验猪瘟血清抗体阻断率

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表5.疫苗E2Fc+GBGAVP1Min3-2免疫试验猪血清阻断率

表6.疫苗E2Fc+GBGAVP1Min3-3免疫试验猪血清抗体阻断率

5.5.4、口蹄疫效力实验结果分析

口蹄疫被世界动物卫生组织列为法定上报烈性传染病。目前，发展中国家主要采取疫苗免疫的防控策略，而广泛用于疫苗免疫的口蹄疫灭活疫苗具有免疫持续期短，诱导细胞免疫的能力较差的缺点。因此我们利用蛋白表达技术平台，利用ProteinG、ProteinA结合抗体特性以及VLPS高免疫原性特点成功构建了长效口蹄疫的VP1蛋白vlps抗原，单独使用可以在体内结合抗体上减少体内清除时间，再把他和E2Fc偶联形成二价VLPS利用FC受体等途径增强刺激免疫，提高疫苗免疫效果。尤其与ISA206佐剂乳化后，以口蹄疫天然宿主猪为实验动物进行免疫实验。疫苗组的实验动物在每个时间点都含有较高含量的抗体产生，同时，这一结果也印证了口蹄疫主要免疫抗原VP1vlps疫苗也能诱导动物机体产生免疫。这表明该疫苗具有应用于口蹄疫免疫接种前景，能够迅速使易感动物获得免疫保护力，且抗体和VP1vlps浓度成正相关。免疫后第28天，抗体水平相对稳定，没有出现下降的趋势，为研制新型的口蹄疫疫苗和改良口蹄疫常规疫苗开辟了新的途径，具体结果见表7、表8、表9。

表7.疫苗E2Fc+GBGAVP1Min3-1免疫试验猪口蹄疫血清抗体效价

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表8.疫苗E2Fc+GBGAVP1Min3-2免疫试验猪血清抗体效价

表9.疫苗E2Fc+GBGAVP1Min3-3免疫试验猪血清抗体效价

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。