转化生长因子-β应答多肽及其使用方法

本申请是申请号为201680077053.0、发明名称为“转化生长因子-β应答多肽及其使用方法”的中国专利申请的分案申请，该母案申请是2016年10月28日提交的PCT国际专利申请PCT/US2016/059444进入中国国家阶段的申请。

相关申请的交叉引用

本专利申请要求于2015年10月30日提交的美国临时专利申请号62/248,685的优先权权益。上文引用的公开内容的全部内容以引用的方式明确并入本文，而无免责声明。

本发明在由美国国立卫生研究院(National Institute of Health)授予的基金号：CA183528和OD012133下由政府支持完成。政府在本发明中拥有一定权利。

技术领域

本发明一般涉及生物技术和医学领域。更具体地，它涉及可用于在TGF-β的存在下刺激免疫应答的多肽和含有多肽的细胞。

背景技术

TGF-β是多效性细胞因子，在各种致病状态包括实体瘤、纤维化和失调的创伤下以高水平发现。用于实体瘤的治疗设计已针对中和肿瘤微环境中的TGF-β。虽然存在许多抗TGF-β抗体，但作为治疗剂的抗体具有一些缺点。例如，与其它抗原结合分子相比，抗体可以很大，并且是由多重基因编码的多链蛋白质。这两方面均导致更高的生产成本。抑制TGF-β的化学品也已得到鉴定，但通常伴随着来自肝脏代谢副产物的毒性问题。

已经探索，使用具有表达显性失活TGF-β受体的TGF-β不敏感T细胞的过继性T细胞疗法治疗的策略。然而，仅TGF-β信号的中和可能是不够的，并且将TGF-β信号从免疫抑制剂逆转为免疫刺激剂可提供更有希望的治疗策略。

因此，本领域需要更有效的对抗TGF-β作用、并且还提供了更具成本效益的生产的益处的疗法。

发明内容

本文描述的多肽通过提供在细胞中表达时，不仅能够中和TGF-β，还能够在TGF-β的存在下特异性触发T细胞激活的多肽来满足本领域的需求。T细胞激活刺激免疫细胞以产生免疫刺激性细胞因子并增殖，从而将TGF-β从免疫抑制信号转变为激活刺激。相应地，本公开内容的方面涉及包含信号肽、具有可变重(VH)和可变轻(VL)区的抗原结合结构域、肽间隔物、跨膜结构域和胞内结构域的多肽；其中所述抗原结合结构域特异性结合TGFβ。

在某些方面，本公开内容涉及包含信号肽、具有可变重链(VH)和可变轻(VL)区的抗原结合结构域、肽间隔物、跨膜结构域和胞内结构域的多肽；其中所述VH区包含SEQ IDNO:5(HCDR1)、SEQ ID NO:6(HCDR2)；和SEQ ID NO:7(HCDR3)，并且所述VL区包含SEQ IDNO:8(LCDR1)、SEQ ID NO:9(LCDR2)；和SEQ ID NO:10(LCDR3)。在一些实施例中，VH包含SEQID NO:1并且VL包含SEQ ID NO:2。

在某些方面，本公开内容涉及包含信号肽、具有可变重链(VH)和可变轻(VL)区的抗原结合结构域、肽间隔物、跨膜结构域和胞内结构域的多肽；其中所述VH区包含SEQ IDNO:11(HCDR1)、SEQ ID NO:12(HCDR2)；和SEQ ID NO:13(HCDR3)，并且所述VL区包含SEQ IDNO:14(LCDR1)、SEQ ID NO:15(LCDR2)；和SEQ ID NO:16(LCDR3)。在一些实施例中，VH包含SEQ ID NO:3并且VL包含SEQ ID NO:4。

在某些方面，本公开内容涉及包含信号肽、具有可变重链(VH)和可变轻(VL)区的抗原结合结构域、肽间隔物、跨膜结构域和胞内结构域的多肽；其中所述VH区包含SEQ IDNO:21(HCDR1)、SEQ ID NO:22(HCDR2)；和SEQ ID NO:23(HCDR3)，并且所述VL区包含SEQ IDNO:24(LCDR1)、SEQ ID NO:25(LCDR2)；和SEQ ID NO:26(LCDR3)。在一些实施例中，VH包含SEQ ID NO:19并且VL包含SEQ ID NO:20。

上文和本文所述的多肽是其为连续单链的多肽。

多核苷酸或多核苷酸区(或者多肽或多肽区)与另一个序列具有一定百分比(例如，60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％-或其中可衍生的任何范围)的“序列同一性”或“同源性”意指，当比对时，在比较这两个序列时该百分比的碱基(或氨基酸)是相同的。该比对和同源性或序列同一性百分比可使用本领域已知的软件程序来确定，例如Ausubel等人编辑(2007)Current Protocols in Molecular Biology中所述的那些。

本公开内容的多肽可具有区域、结构域、接头、间隔物等，其与本文所述的氨基酸序列的全部或一部分具有至少、至多、或正好80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的同一性(或其中可衍生的任何范围)。在某些实施例中，本公开内容自始至终描述的多肽是分离的，这意味着它未在细胞环境中发现。在一些情况下，它们是纯化的，这意味着它与具有不同氨基酸序列和/或化学式的多肽大部分(如果不是完全)分离。

在一些实施例中，VH和VL由肽接头分开。考虑肽接头可分开本公开内容的多肽中描述的任何结构域/区域。在一些实施例中，肽接头是仅由甘氨酸和丝氨酸残基组成的肽(甘氨酸-丝氨酸接头)。在一些实施例中，肽接头是至少、至多、或正好4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、100、125、150或200个氨基酸(或其中任何可衍生的范围)。在一些实施例中，肽接头是本领域已知的或本文描述的肽接头。

在一些实施例中，多肽具有结构S-X-PL-Y-PS-T-E或S-Y-PL-X-PS-T-E，其中S是信号肽，X是VH，PL是肽接头，Y是VL，PS是肽间隔物，T是跨膜结构域，并且E是胞内结构域。在一些实施例中，多肽具有以下结构：S-X-Y-PS-T-E或S-Y-X-PS-T-E，其中S、X、Y、PS、T和E如上定义。当提及本文的肽和多肽时，序列和结构书写并解释为从N末端到C末端进行，这是本领域的标准实践。

在一些实施例中，该多肽还包含共刺激区。在一些实施例中，共刺激区位于跨膜结构域和胞内结构域之间。在一些实施例中，该多肽包含至少、至多或正好1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个(或其中任何可衍生的范围)共刺激区。在一些实施例中，共刺激区是本领域已知或本文所述的。

在一些实施例中，跨膜结构域包含CD28的跨膜结构域。在一些实施例中，跨膜结构域是本领域已知或本文所述的跨膜结构域的全部或部分。

在一些实施例中，胞内结构域包含CD28或CD3-ζ信号传导结构域或两者。在一些实施例中，胞内结构域是本领域已知或本文所述的胞内结构域的全部或部分。在一些实施例中，胞内结构域是CD3-ζ信号传导结构域。在一些实施例中，胞内结构域包含本文所述的合适胞内结构域的一个或多个，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10个部分。

在一些实施例中，肽间隔物包含铰链区。在一些实施例中，铰链是IgG分子的铰链区。在一些实施例中，铰链是本领域已知或本文所述的铰链区。在一些实施例中，肽间隔物包含或还包含IgG分子的CH

在一些实施例中，多肽还包含检测肽。在一些实施例中，检测肽是SEQ ID NO:17、HA标签(SEQ ID NO:94)或cMyc标签(SEQ ID NO:95)的肽。在一些实施例中，检测肽侧接接头。在一些实施例中，接头(例如本文所述的肽接头)位于检测肽的氨基部分处。在一些实施例中，接头(例如本文所述的肽接头)位于检测肽的羧基部分处。在一些实施例中，接头位于检测肽的氨基和羧基部分处。在一些实施例中，检测肽位于VH和VL区的氨基部分处。在一些实施例中，检测肽位于信号肽和抗原结合结构域之间。

在一些实施例中，信号肽包含SEQ ID NO:18。在一些实施例中，信号肽是本领域已知或本文所述的信号肽。

在一些实施例中，多肽还包含癌症分子特异性抗原结合结构域。例如，多肽可以为双特异性嵌合抗原受体(CAR)，其中所述多肽包含关于TGF-β的抗原结合结构域和关于癌症分子或癌抗原的抗原结合结构域。抗原结合结构域可由肽间隔物/接头分开。在一些实施例中，癌症分子包含Her2。在一些实施例中，癌症分子包含CD19或CD20。在一些实施例中，癌症分子或癌抗原是本领域已知或本文所述的癌症分子或癌抗原。

在一些实施例中，抗原结合结构域特异性结合可溶性TGF-β。先前未知的是，与本公开内容相似的多肽可以结合可溶性抗原并且响应可溶性抗原转导信号。

本文所述的多肽可包括在SEQ ID NO:1-95的至少或至多3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、300、400、500、550、1000个或更多个邻接氨基酸、或其中可衍生的任何范围内的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100个或更多个变体氨基酸。

本公开内容的进一步方面涉及编码本文所述多肽的核酸。在一些方面，本公开内容涉及包含一种或多种本文所述的多肽的细胞。在一些实施例中，细胞还包含癌症特异性CAR。β在一些实施例中，癌症特异性CAR是与TGF-βCAR分开的多肽。在一些实施例中，癌症特异性CAR特异性结合Her2。在一些实施例中，癌症特异性CAR特异性结合CD19或CD20。在一些实施例中，癌症特异性CAR特异性结合本领域已知和/或本文所述的癌症分子或抗原。在一些实施例中，细胞是免疫细胞。在一些实施例中，细胞是祖细胞或干细胞。在一些实施例中，祖细胞或干细胞在体外分化成免疫细胞。在一些实施例中，细胞是T细胞。在一些实施例中，细胞是CD4+或CD8+T细胞。在一些实施例中，细胞是天然杀伤细胞。在一些实施例中，细胞是离体的。术语免疫细胞包括免疫系统的细胞，其参与捍卫机体抵抗传染病和外来物质。免疫细胞可包括例如嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、天然杀伤细胞、淋巴细胞如B细胞和T细胞、以及单核细胞。T细胞可包括例如CD4+、CD8+、T辅助细胞、细胞毒性T细胞、γδT细胞、调节性T细胞、抑制性T细胞和天然杀伤T细胞。在一个具体实施例中，T细胞是调节性T细胞。

本公开内容的进一步方面涉及用于刺激免疫应答的方法，其包括使本公开内容的细胞(即，包含本文所述的抗原结合多肽的细胞)与TGF-β接触。在一些实施例中，刺激免疫应答包括增加免疫刺激性细胞因子和/或分子的表达和/或分泌。在一些实施例中，细胞因子和/或分子是促炎细胞因子或分子。在一些实施例中，免疫刺激性细胞因子和/或分子是TNF-α、IFN-β、IFN-γ、IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-18和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子中的一种或多种。在一些实施例中，刺激免疫应答包括增加免疫细胞的增殖。在一些实施例中，免疫细胞是T细胞。在一些实施例中，TGF-β是需要免疫刺激的人受试者中产生的内源性TGF-β。在一些实施例中，人受试者患有癌症、纤维化或开放性伤口。在一些实施例中，人受试者患有B细胞恶性肿瘤。在一些实施例中，人受试者患有实体瘤。实体肿瘤是通常不包含囊肿或液体区域的异常组织肿块。实体瘤可以为良性的(不是癌症)、或恶性的(癌症)。不同类型的实体瘤因形成其的细胞类型而命名。实体瘤的例子是肉瘤、癌和淋巴瘤。在一些实施例中，该方法用于治疗患有适应症的个人，其中所述适应症的特征在于TGF-β的致病性表达水平。在一些实施例中，本文所述的细胞和多肽可用于治疗癌症、失调性伤口、纤维化、开放性伤口、实体瘤等……其中病况的病因至少部分基于TGF-β的表达。在一些实施例中，细胞(即包含抗原结合多肽的本公开内容的细胞)存在于需要免疫刺激的人受试者中。在一些实施例中，该方法还包括将本文所述的包含本公开内容的多肽或核酸的细胞施用于人受试者。

进一步的方法方面涉及用于检测溶液中的TGF-β的方法，其包括接触本公开内容的细胞并测量免疫刺激；其中免疫刺激的增加表示TGF-β的存在，并且免疫刺激的不增加表示不存在TGF-β。在一些实施例中，免疫刺激包括免疫刺激性细胞因子和/或分子的表达。在一些实施例中，免疫刺激性细胞因子和/或分子是TNF-α、IFN-β、IFN-γ、IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-18和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子中的一种或多种。在一些实施例中，免疫刺激包括免疫细胞增殖的增加。在一些实施例中，免疫细胞是T细胞。在一些实施例中，细胞是离体的。

如本文所述的表达或增殖的增加可以为基线表达水平如对照(非疾病、非TGF-β或非抗原结合多肽对照)的至少、至多或正好1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、50、100、200、300、500或1000倍增加。

本公开内容的进一步方面涉及用于制备本公开内容的多肽的方法，其包括在细胞中表达编码所述多肽的核苷酸。进一步方面涉及包含本文所述多肽的培养细胞、冷冻细胞、悬浮细胞或贴壁细胞。

本公开内容的方面涉及用于治疗疾病或病理状况的方法，其包括向患者施用本公开内容的细胞。在一些实施例中，患者是人患者。

在一些实施例中，细胞是T调节细胞(即包含本文所述的TGF-β结合多肽的调节性T细胞)。在一些实施例中，疾病是自身免疫疾病。在一些实施例中，自身免疫疾病是类风湿性关节炎。在一些实施例中，自身免疫疾病是本文描述的一种。

在方法方面的一些实施例中，该方法还包括向受试者施用TGF-β。

在一些方面，该方法包括或还包括体外扩增和/或诱导T细胞增殖，该方法包括使本公开内容的体外T细胞与包含TGF-β的组合物接触。在一些实施例中，T细胞是调节性细胞。在一些实施例中，T细胞是本文所述的T细胞。在一些实施例中，扩增的调节性T细胞包含小于10％的非调节性T细胞。在一些实施例中，扩增的调节性T细胞包含小于0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48或50％或其中可衍生的任何范围。

在一些实施例中，组合物包含1-50ng/mL的TGF-β。在一些实施例中，组合物包含至少、至多、或约0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100ng/mL的TGF-β(或其中可衍生的任何范围)。

在一些实施例中，组合物还包含IL-2。在一些实施例中，组合物包含20-400U/mL的IL-2。在一些实施例中，组合物包含至少、至多、或约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400、405、410、415、420、425、430、435、440、445、450、455、460、465、470、475、480、485、490、495、500、505、510、515、520、525、530、535、540、545、550、555、560、565、570、575、580、585、590、595、600U/mL的IL-2(或其中可衍生的任何范围)。

在一些实施例中，该方法还包括使细胞与饲养细胞接触。在一些实施例中，照射饲养细胞。饲养细胞或支持细胞可包括例如成纤维细胞、小鼠胚胎成纤维细胞、JK1细胞、SNL76/7细胞、人胎儿皮肤细胞、人成纤维细胞和人包皮成纤维细胞。

在一些实施例中，该方法排除使T细胞与饲养细胞接触。在某些情况下，排除的饲养细胞来自与T细胞不同的动物物种。

在本文描述的方法的一个实施例中，受试者是人受试者。术语“个体”、“受试者”、“宿主”和“患者”在本文中可互换使用，指哺乳动物，包括但不限于鼠(例如大鼠、小鼠)、兔类动物(例如兔)、非人类灵长类动物、人、犬科动物、猫科动物、有蹄类动物(例如马科动物、牛科动物、羊科动物、猪科动物、猫科动物)等。

在进一步描述本发明之前，应理解，本发明并不限于所描述的特定实施例，因为这些当然可变化。另外，也应理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施例的目的，并且不预期是限制性的，因为本发明的范围将仅受所附权利要求限制。

当提供值的范围时，应理解，除非上下文另有明确说明，否则在该范围的上限和下限以及在所述范围内的任何其它所述值或中间值之间的每个中间值到下限单位的十分之一，涵盖在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括在较小范围内，并且也涵盖在本发明内，遭受所述范围中的任何特别排除的限制。当所述范围包括一个或两个限制时，排除那些包括的限制中的任一或两个的范围也包括在本发明中。

根据下述详细描述，本发明的其它目的、特征和优点将变得显而易见。然而，应当理解，详细描述和具体实例虽然指示本发明的优选实施例，但仅以说明性方式给出，因为根据该详细描述，在本发明的精神和范围内的各种变化和修改对于本领域技术人员将变得明显。

附图说明

下述附图构成本说明书的一部分并且被包括以进一步证实本发明的某些方面。通过参考与本文呈现的具体实施例的详细描述结合的这些附图中的一个或多个，可更好地理解本发明。

图1显示了TGF-βscFv中和人TGF-β。向培养的HepG2细胞中加入所示量的TGF-β和抗-TGF-βscFv共30分钟。如通过蛋白质印迹检测到的，TGF-β的中和通过磷酸-SMAD2应答的丧失来指示。

图2显示了TGF-βCAR在细胞表面上表达。使用scFv#2产生TGF-βCAR。表面染色和流式细胞术显示TGF-βCAR存在于CD4+和CD8+T细胞的细胞表面上。受体的胞外结构域含有FLAG表位。EGFRt是截短的表皮生长因子受体，其是细胞转导的指示剂。

图3A-B证实了TGF-βCAR阻断CD8+(A)和CD4+(B)T细胞中的内源性TGF-β信号传导。T细胞中的TGF-βCAR表达经由SMAD途径阻断TGF-β信号传导。表达所示受体的T细胞与TGF-β一起温育30分钟，并且经由蛋白质印迹探测磷酸-SMAD2。无scFv指缺乏任何配体(抗原)结合的scFv结构域的CAR，EGFRt指与此处其它组分无关的截短的表皮生长因子受体。

图4A-C.(A)稳定表达TGF-βCAR和NFAT报道分子(由NFAT诱导型启动子表达的EGFP)的Jurkat细胞显示了响应增加的TGF-β浓度而增加的激活。(B,C)稳定表达TGF-βCAR的原代人CD4+T细胞响应TGF-β刺激而上调(B)CD69表达和(C)Th1细胞因子产生。在连同或不连同TGF-β温育一天后，通过表面染色监测CD69上调。通过应用蛋白质转运抑制剂布雷菲德菌素A，并且在连同或不连同TGF-β温育一天后执行细胞内染色，来检测细胞因子产生。“模拟”指示用无关构建体转导的T细胞。“无scFv”指示T细胞表达的CAR与TGF-βCAR相同，除了它缺乏scFv结构域并因此不能结合TGF-β之外。“DNR”是显性失活的TGF-β受体，其是缺乏细胞质信号传导结构域的截短的TGF-β受体链2。显示的值是一式三份的平均值，伴随指示±1标准差(s.t.d.)的误差条。*p<0.05；**p<0.005，***p<0.0005，*****p≤0.0005。

图5显示了显性失活的TGF-β受体不能触发细胞因子产生。虽然已报道显性失活的TGF-β受体也抑制TGF-β信号传导，但它不触发免疫刺激作用，例如TNF-α产生。Tβ短和Tβ长是两种不同的TGF-βCAR，Dom-Neg指显性失活的TGF-β受体，并且无scFv指缺乏任何配体结合scFv结构域的CAR。Tβ短指具有仅由IgG4铰链区组成的肽间隔物的TGF-βCAR多肽。长Tβ指具有包含IgG4铰链区和CH

图6证实了TGF-βCAR-T细胞响应TGF-β而增殖。

图7显示了鼠TGF-β/SMAD信号传导的抑制。将指示量的scFv和小鼠TGF-β1应用于NIH3T3成纤维细胞30分钟。使细胞裂解并探测SMAD2磷酸化。

图8.稳定表达TGF-βCAR和NFAT报道分子(由NFAT诱导型启动子表达的EGFP)的Jurkat细胞显示响应鼠TGF-β1的输入增加而激活增加，表示改造为识别人TGF-β的TGF-βCAR也与鼠TGF-β交叉反应。

图9.与显性失活的TGF-β受体相比，TGF-βCAR更有效地呈递至细胞表面。

图10.TGF-βCAR功能可通过共刺激结构域选择来调节。

图11.TGF-β跨越来自不同供体的细胞以剂量依赖性方式持续触发TNF-α产生。

图12.TGF-βCAR的肽间隔物长度调节触发阈值。

图13.CAR信号传导需要配体介导的CAR二聚化，但不要求配体或CAR本身作为二聚体预先存在。对携带所示CAR的Jurkat细胞系执行CD69表面染色。GFP CAR#1和GFP CAR#3两者均主要作为同二聚体存在，并且两种CAR结合EGFP上的不同表位并可同时结合单体EGFP分子。GFP CAR#1和GFP CAR#2与EGFP上的相同表位结合，但CAR#2作为单体而不是同二聚体存在。

图14.可溶性二聚体抗原分子可通过将受体连接到不同细胞上来触发信号传导。

图15.TGF-βCAR可以以细胞间接触依赖性和非依赖性方式两者被触发。

图16.TGF-βCAR-T细胞可在不存在细胞间接触的情况下被激活。

具体实施方式

本文所述的多肽、细胞和方法可用于在TGF-β的存在下中和TGF-β并且特异性触发T细胞激活。

I.定义

本公开内容的肽涉及包含CAR或嵌合抗原受体的肽。CAR是经改造的受体，其将任意特异性移植到免疫效应细胞上。通常，这些受体用于将单克隆抗体的特异性移植到T细胞上。受体被称为嵌合体，因为它们由来自不同来源的部分组成。

当提及基因产物时，术语“蛋白质”、“多肽”和“肽”在本文中可互换使用。

“同源性”、“同一性”或“相似性”是指两个肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性。可通过比较每个序列中为了比较目的可比对的位置来确定同一性。当比较序列中的位置被相同的碱基或氨基酸占据时，那么分子在该位置共享序列同一性。序列之间的同一性程度是由序列共有的匹配或同源位置的数目的函数。“无关的”或“非同源的”序列与本公开内容的序列之一共享小于40％的同一性、或小于25％的同一性。

如本文使用的术语“氨基部分”、“N末端”、“氨基末端”等等用于指多肽区域的次序。此外，当某物对于区域为N-末端时，它不一定位于整个多肽的末端(或端)处，而是仅位于该区域或结构域的末端。类似地，如本文中使用的术语“羧基部分”、“C末端”、“羧基末端”等等用于指多肽区域的次序，并且当某物对于区域为是C末端时，它不一定位于整个多肽的末端(或端)处，而是仅位于该区域或结构域的末端处。

术语“多核苷酸”、“核酸”和“寡核苷酸”可互换使用，并且指任何长度的核苷酸的聚合形式，无论是脱氧核糖核苷酸还是核糖核苷酸或其类似物。多核苷酸可具有任何三维结构并且可执行已知或未知的任何功能。下述是多核苷酸的非限制性例子：基因或基因片段(例如探针、引物、EST或SAGE标签)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、dsRNA、siRNA、miRNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可包含经修饰的核苷酸，例如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，则可在多核苷酸组装之前或之后赋予对核苷酸结构的修饰。核苷酸序列可被非核苷酸组分中断。聚合后可进一步修饰多核苷酸，例如通过与标记组分缀合。该术语也指双链和单链分子两者。除非另有说明或要求，否则本发明的多核苷酸的任何实施例涵盖双链形式和已知或预测构成双链形式的两种互补单链形式中的每一种。

术语“受试者”、“个体”或“患者”在本文中可互换使用，并且指脊椎动物，例如灵长类动物、哺乳动物或优选人。哺乳动物包括但不限于马科动物、犬科动物、牛科动物、羊科动物、鼠科动物、大鼠、猿猴、人、农场动物、运动动物和宠物。

当用于培养基、细胞外基质或培养条件时，术语“无异种(XF)”或“无动物成分(ACF)”或“无动物”指基本上不含异源动物来源组分的培养基、细胞外基质或培养条件。为了培养人类细胞，非人动物例如小鼠的任何蛋白质将是异种组分。在某些方面，无异种基质可基本上不含任何非人动物来源的组分，因此排除小鼠饲养细胞或Matrigel

如本文使用的，当细胞具有小于10％的元件时，细胞“基本上(subst antially)不含”这些试剂或元件，例如血清、信号传导抑制剂、动物组分或饲养细胞、外源遗传元件或载体元件，并且当它们具有小于1％的元件时，“基本上(essentially)不含”某些试剂或元件。然而，更期望的是细胞群体，其中总细胞群体的小于0.5％或小于0.1％包含外源遗传元件或载体元件。

当培养物、基质或培养基分别具有这些试剂的水平低于使用本领域普通技术人员已知的常规检测方法可检测的水平，或者这些试剂没有外在地添加到培养物、基质或培养基中时，培养基、基质或培养基“基本上不含”这些试剂或元件，如血清、信号传导抑制剂、动物组分或饲养细胞。无血清培养基可基本上不含血清。

“编码”特定蛋白质的“基因”、“多核苷酸”、“编码区”、“序列”、“区段”、“片段”或“转基因”是这样的核酸分子，当置于适当的调节序列的控制下时，所述核酸分子在体外或体内被转录且任选还被翻译成基因产物，例如多肽。编码区可以cDNA、基因组DNA或RNA形式存在。当以DNA形式存在时，核酸分子可以为单链(即有义链)或双链的。编码区的边界由在5'(氨基)末端处的起始密码子和在3'(羧基)末端处的翻译终止密码子来确定。基因可包括但不限于来自原核或真核mRNA的cDNA、来自原核或真核DNA的基因组DNA序列、以及合成的DNA序列。转录终止序列通常位于基因序列的3'末端。

术语“细胞”在本文中以其在本领域中最广泛的含义使用，并且指其是多细胞生物的组织结构单元的活体，被将其与外部隔离的膜结构包围，具有自我复制的能力，并且具有遗传信息和用于表达它的机制。本文使用的细胞可以为天然存在的细胞或人工修饰的细胞(例如融合细胞、遗传修饰的细胞等)。

如本文使用的，术语“干细胞”指能够自我复制和具有多能性或多潜能性的细胞。通常，干细胞可再生受伤组织。本文的干细胞可以为但不限于胚胎干(ES)细胞、诱导的多能干细胞或组织干细胞(也称为组织特异性干细胞或体干细胞)。

“胚胎干(ES)细胞”是源自早期胚胎的多能干细胞。ES细胞最初于1981年建立，其自1989年以后也应用于灭活小鼠的生产。在1998年，建立了人ES细胞，目前所述人ES细胞已可用于再生医学。

与ES细胞不同，组织干细胞具有有限的分化潜能。组织干细胞存在于组织中的特定位置，并具有未分化的细胞内结构。因此，组织干细胞的多能性通常较低。组织干细胞具有较高的细胞核/细胞质比率，并且具有少量细胞内细胞器。大多数组织干细胞具有低多能性、长细胞周期和超过个体寿命的增殖能力。基于细胞来源的部位，例如真皮系统、消化系统、骨髓系统、神经系统等等，将组织干细胞分类。真皮系统中的组织干细胞包括表皮干细胞、毛囊干细胞等等。消化系统中的组织干细胞包括胰腺(普通)干细胞、肝干细胞等等。骨髓系统中的组织干细胞包括造血干细胞、间充质干细胞等等。神经系统中的组织干细胞包括神经干细胞、视网膜干细胞等等。

“诱导的多能干细胞”通常缩写为iPS细胞或iPSC，指通过引入称为重编程因子的某些因子，由非多能细胞(通常为成年体细胞)或终末分化的细胞(例如成纤维细胞、造血细胞、肌细胞、神经元、表皮细胞等等)人工制备的一类多能干细胞。

“多能性”指具有分化成构成一个或多个组织或器官、或者特别是下述三种胚层中的任一种的所有细胞的潜力的干细胞：内胚层(胃粘膜、胃肠道、肺)、中胚层(肌肉、骨骼、血液、泌尿生殖器)或外胚层(表皮组织和神经系统)。本文使用的“多能干细胞”指可分化成源自三种胚层中的任一种的细胞的细胞，例如全能细胞的直接后代或诱导的多能细胞。

如本文使用的，术语“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”等等指获得所需药理学效应和/或生理学效应。就完全或部分预防疾病或其症状而言，该效应可以为预防性的，和/或就疾病和/或归因于该疾病的不良反应的部分或完全治愈而言，可以为治疗性的。如本文使用的，“治疗”涵盖对哺乳动物例如人中的疾病的任何治疗，并且包括：(a)预防疾病在可能易患疾病但尚未被诊断为患有其的受试者中发生；(b)抑制疾病，即阻止其发展；和(c)缓解疾病，即促使疾病消退。

在一些实施例中，该方法可用于减少实体瘤的大小和/或细胞数目。在一些实施例中，本公开内容的方法可用于抑制受试者中的肿瘤例如实体瘤的生长。

术语“抗原”指促使免疫系统产生针对其的抗体或响应其的T细胞的任何物质。在一些实施例中，抗原是长度为5-50个氨基酸或者至少、至多、或者正好5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、250或300个氨基酸或其中任何可衍生的范围的肽。

术语“抗体”包括单克隆抗体、多克隆抗体、二聚体、多聚体、多特异性抗体和抗体片段，其可以为人、小鼠、人源化、嵌合的或源自另一个物种。“单克隆抗体”是从针对特定抗原位点的基本上同质的抗体群体获得的抗体。

“抗体或其功能片段意指与特定抗原或表位特异性结合或免疫反应的免疫球蛋白分子，并且包括多克隆抗体和单克隆抗体两者。术语抗体包括遗传改造或其它修饰形式的免疫球蛋白，例如胞内抗体、肽体、嵌合抗体、全人抗体、人源化抗体和异源缀合抗体(例如双特异性抗体、双抗体、三抗体和四抗体)。术语功能性抗体片段包括抗体的抗原结合片段，包括例如Fab'、F(ab')

单链可变片段(scFv)的使用是特别有利的。scFv是重组分子，其中编码抗原结合结构域的轻链和重链免疫球蛋白链的可变区被改造成单一多肽。一般地，V

“治疗有效量”或“有效量”指当向哺乳动物或其它受试者施用用于治疗疾病时，足以实现此类疾病治疗的试剂的量或两种试剂的组合量。“治疗有效量”将根据待治疗的受试者的试剂，疾病及其严重程度和年龄、体重等而变化。

如本文说明书中使用的，“一个”或“一种”可意指一个或多个。如本文权利要求中使用的，当与单词“包含”一起使用时，单语“一个”或“一种”可意指一个/种或超过一个/种。

在权利要求中术语“或”的使用用于意指“和/或，”除非明确指出仅指替代方案或替代方案是相互排斥的，尽管本公开内容支持仅指替代方案以及“和/或”的定义。如本文使用的，“另一个/种”可意指至少第二个/种或更多个/种。

在本专利申请自始至终，术语“约”用于指示值包括设备、用于确定该值的方法的误差的固有变化或者存在于研究受试者之间的变化。

II.多肽

A.信号肽

“信号肽”指的是指导蛋白质在细胞内的转运和定位的肽序列，例如导向某个细胞器(如内质网)和/或细胞表面。信号肽指导新生蛋白质进入内质网内。如果受体要被糖基化并锚定在细胞膜中，则这是必需的。一般地，使用天然地附着在氨基末端最大组分上的信号肽(例如在具有定向轻链-接头-重链的scFv中，使用轻链的天然信号)。在一些实施例中，信号肽是SEQ ID NO:18。

在一些实施例中，信号肽在通过内质网(ER)后被切割，即是可切割的信号肽。在一些实施例中，限制性位点位于信号肽的羧基末端处，以促进切割。

B.抗原结合结构域

抗原结合结构域是基于TGF-β抗体的单链可变片段(scFv)。“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的V

本公开内容的多肽的抗原结合结构域的可变区可通过使VH和/或VLCDR1、CDR2和/或CDR3区内的氨基酸残基突变进行修饰，以改善抗体的一种或多种结合性质(例如，亲和力)。术语“CDR”指基于分别由B细胞和T细胞生成的免疫球蛋白(抗体)和T细胞受体中的部分可变链的互补决定区，其中这些分子结合其特异性抗原。因为在CDR中发现与免疫球蛋白和T细胞受体相关的大部分序列变异，所以这些区域有时称为高变区。可通过定点诱变或PCR介导的诱变来引入突变，并且可在适当的体外或体内测定中评估对抗体结合或其它感兴趣的功能性质的作用。优选引入保守修饰并且通常改变CDR区内不超过一、二、三、四或五个残基。突变可以为氨基酸取代、添加或缺失。

例如通过将一个或多个构架残基“回复突变”为相应的种系序列，可对抗体进行构架修饰以降低免疫原性。

还考虑通过将抗原结合结构域与结合相同抗原(多价)或不同抗原(多特异性)的VH和VL区对进行多聚化，抗原结合结构域可以为多特异性或多价的。

如本文使用的，术语“亲和力”指两种试剂的可逆结合的平衡常数，并且表示为解离常数(Kd)。亲和力可以是比抗体对无关氨基酸序列的亲和力大至少1倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍、至少100倍或至少1000倍或更多(或其中任何可衍生的范围)。如本文使用的，术语“亲合力”指在稀释后两种或更多种试剂的复合物对解离的抗性。术语“免疫反应性”和“优先结合”在本文中关于抗体和/或抗原结合片段可互换使用。

术语“结合”指由于例如共价、静电、疏水和离子和/或氢键相互作用(包括诸如盐桥和水桥的相互作用)而引起的在两个分子之间的直接结合。

C.肽间隔物

间隔区连接抗原结合结构域与跨膜结构域。它应该是足够柔性的，以允许抗原结合结构域在不同方向上定向，以促进抗原识别。最简单的形式是来自IgG的铰链区。替代方案包括免疫球蛋白的CH

如本文使用的，术语“铰链”指对侧翼多肽区提供结构柔性和间隔的柔性多肽连接子区(本文也称为“铰链区”或“间隔物”)，并且可由天然或合成多肽组成。源自免疫球蛋白(例如IgGl)的“铰链”一般定义为从人IgGl的Glu216延伸到Pro230(Burton(1985)Molec.Immunol.,22:161-206)。通过将形成重链间二硫(S-S)键的第一个和最后一个半胱氨酸残基置于相同的位置，可将其它IgG同种型的铰链区与IgGl序列进行比对。铰链区可以为天然存在的或非天然存在的，包括但不限于改变的铰链区，如美国专利号5,677,425中所述。铰链区可包括源自与CH

肽间隔物可具有至少、至多、或正好4、5、6、7、8、9、10、15、16、17、18、19、20、20、25、30、35、40、45、50、75、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、260、270、280、290、300、325、350或400个氨基酸(或其中任何可衍生的范围)。在一些实施例中，肽间隔物由来自免疫球蛋白的铰链区组成或包含来自免疫球蛋白的铰链区。免疫球蛋白铰链区氨基酸序列是本领域已知的；参见例如Tan等人(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:162；和Huck等人(1986)Nucl.Acids Res。

肽间隔物的长度可对TGF-β的响应和/或扩增性质具有影响。在一些实施例中，例如小于50、45、40、30、35、30、25、20、15或10个氨基酸的较短间隔物可具有降低有效激活应答反应所需的TGF-β浓度的优点。在一些实施例中，较长的间隔物(例如至少50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、260、270、280或290个氨基酸的间隔物)可具有在体内或体外增加扩增的优点。

作为非限制性例子，免疫球蛋白铰链区可包括下述氨基酸序列之一：DKTHT(SEQID NO:27)；CPPC(SEQ ID NO:28)；CPEPKSCDTPPPCPR(SEQ ID NO:29)；ELKTPLGDTTHT(SEQID NO:30)；KSCDKTHTCP(SEQ ID NO:31)；KCCVDCP(SEQ ID NO:32)；KYGPPCP(SEQ IDNO:33)；EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO:34)(人IgGl铰链)；ERKCCVECPPCP(SEQ ID NO:35)(人IgG2铰链)；ELKTPLGDTTHTCPRCP(SEQ ID NO:36)(人IgG3铰链)；SPNMVPHAHHAQ(SEQ ID NO:37)；ESKYGPPCPPCP(SEQ ID NO:98)或ESKYGPPCPSCP(SEQ ID NO:99)(基于人IgG4铰链)等等。在一些实施例中，铰链是SEQ ID NO:98或SEQ ID NO:99。在一些实施例中，铰链是SEQID NO:99。

铰链区可包含人IgGl、IgG2、IgG3或IgG4铰链区的氨基酸序列。与野生型(天然存在的)铰链区相比，铰链区可包括一个或多个氨基酸取代和/或插入和/或缺失。例如，人IgGl铰链的His229可被Tyr取代，使得铰链区包含序列EPKSCDKTYTCPPCP(SEQ ID NO:38)。

铰链区可包含源自人CD8的氨基酸序列；例如铰链区可包含氨基酸序列：TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD(SEQ ID NO:39)或其变体。

D.跨膜结构域

跨膜结构域是跨越膜的疏水性α螺旋。一般地，使用来自胞内结构域的最膜近侧组分的跨膜结构域。不同的跨膜结构域导致不同的受体稳定性。

跨膜结构域介于肽间隔物和胞内结构域之间。在一些实施例中，跨膜结构域介于肽间隔物和共刺激区之间。在一些实施例中，接头位于跨膜结构域和共刺激区或胞内结构域之间。

提供将多肽插入真核(例如哺乳动物)细胞的细胞膜内的任何跨膜结构域都适合于使用。作为一个非限制性例子，可使用跨膜序列IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC(SEQ ID NO:48)。在一些实施例中，跨膜结构域是CD8β来源的：LGLLVAGVLVLLVSLGVAIHLCC(SEQ ID NO:49)；CD4来源的：ALIVLGGVAGLLLFIGLGIFFCVRC(SEQ ID NO:50)；CD3ζ来源的：LCYLLDGILFIYGVILTALFLRV(SEQ ID NO:51)；CD28来源的：WVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV(SEQ ID NO:52)；CD134(OX40)来源的：VAAILGLGLVLGLLGPLAILLALYLL(SEQ ID NO:53)；或CD7来源的：ALPAALAVISFLLGLGLGVACVLA(SEQ ID NO:54)。

E.胞内结构域

在抗原识别后，受体簇和信号通过胞内结构域和/或共刺激结构域传递到细胞。在一些实施例中，本文所述的共刺激结构域是胞内结构域的一部分。最常用的胞内结构域组分是CD3-ζ，其含有3个ITAM。这在抗原结合后向T细胞传递激活信号。CD3-ζ可能不提供完全胜任的激活信号，并且需要额外的共刺激信号传导。例如，嵌合CD28和OX40可与CD3-ζ一起使用以传递增殖/存活信号，或者所有三者可一起使用。

适用于本公开内容的多肽中的其它胞内结构域包括任何所需信号传导结构域，其响应于通过抗原与抗原结合结构域结合的激活而提供不同且可检测的信号(例如，通过细胞增加的一种或多种细胞因子的产生；靶基因转录的变化；蛋白质活性的变化；细胞行为的变化，例如细胞死亡；细胞增殖；细胞分化；细胞存活；细胞信号传导应答的调节等)。在一些实施例中，胞内结构域包括至少一个(例如一个、两个、三个、四个、五个、六个等)如本文所述的ITAM基序。在一些实施例中，胞内结构域包括DAP10/CD28型信号传导链。

适用于本公开内容的多肽的胞内结构域包括含有基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)的细胞内信号传导多肽。ITAM基序是YX

合适的胞内结构域可以为源自含ITAM基序的多肽的含ITAM基序的部分。例如，合适的胞内结构域可以为来自任何含ITAM基序蛋白质的含ITAM基序的结构域。因此，合适的胞内结构域无需含有它源自其的完整蛋白质的完整序列。合适的含ITAM基序多肽的例子包括但不限于：DAP12；FCER1G(FcεI受体Iγ链)；CD3D(CD3δ)；CD3E(CD3ε)；CD3G(CD3γ)；CD3Z(CD3ζ)；和CD79A(抗原受体复合物相关蛋白α链)。

在一些情况下，胞内结构域源自DAP12(也称为TYROBP；TYRO蛋白酪氨酸激酶结合蛋白；KARAP；PLOSL；DN AX-激活蛋白12；KAR相关蛋白；TYRO蛋白酪氨酸激酶结合蛋白；杀伤激活受体相关蛋白；杀伤激活受体相关蛋白等)。例如，合适的胞内结构域多肽可包含与以下具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或100％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列：MGGLEPCSRLLLLPLLLAVSGLRPVQAQAQSDCSCSTVSPGVLAGIVMGDLVLTVLIALAVYFLGRLVPRGRGAAEAATRKORITETESPYOELOGORSDVYSDLNTQRPYYK(SEQ ID NO:66)；MGGLEPCSRLLLLPLLLAVSGLRPVQAQAQSDCSCSTVSPGVLAGIVMGDLVLTVLIALAVYFLGRLVPRGRGAAEATRKORITETESPYOELOGORSDVYSDLNTQRPYYK(SEQ ID NO:67)；MGGLEPCSRLLLLPLLLAVSDCSCSTVSPGVLAGIVMGDLVLTVLIALAVYFLGRLVPRGRGAAEAATRKORITETESPYOELOGORSDVYSDLNTQRPYYK(SEQ ID NO:68)；或MGGLEPCSRLLLLPLLLAVSDCSCSTVSPGVLAGIVMGDLVLTVLIALAVYFLGRLVPRGRGAAEATRKORITETESPYOELOGORSDVYSDLNTQRPYYK(SEQ ID NO:69)。

在一些实施例中，合适的胞内结构域多肽可包含全长DAP12氨基酸序列的含ITAM基序的部分。因此，合适的胞内结构域多肽可包含与ESPYOELOGORSDVYSDLNTO(SEQ ID NO:70)具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或100％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施例中，胞内结构域源自FCER1G(也称为FCRG；Fcε受体Iγ链；Fc受体γ链；fc-εRl-γ；fcRγ；fceRIγ；高亲和力免疫球蛋白ε受体亚基γ；免疫球蛋白E受体，高亲和力，γ链等)。例如，合适的胞内结构域多肽可包含与MIPAVVLLLLLLVEQAAALGEPQLCYILDAILFLYGIVLTLLYCRLKIQVRKAAITSYEKSDGVYTGLSTRNQETYETLKHEKPPQ(SEQ ID NO:71)具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或100％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施例中，合适的胞内结构域多肽可包含全长FCER1G氨基酸序列的含ITAM基序的部分。因此，合适的胞内结构域多肽可包含与DGVYTGLSTRNOETYETLKHE(SEQ ID NO:72)具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或100％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施例中，胞内结构域源自T细胞表面糖蛋白CD3δ链(也称为CD3D；CD3-DELTA；T3D；CD3抗原，δ亚基；CD3δ；CD3d抗原，δ多肽(TiT3复合物)；OKT3，δ链；T细胞受体T3δ链；T细胞表面糖蛋白CD3δ链；等)。例如，合适的胞内结构域多肽可包含与下述氨基酸(2种同种型)中任一的约100个氨基酸至110个氨基酸(aa)、约110个aa至约115个aa、约115个aa至约120个aa、约120个aa至约130个aa、约130个aa至约140个aa、约140个aa至约150个aa、或约150个aa至约170个aa的连续段具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或100％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列：MEHSTFLSGLVLATLLSQVSPFKIPIEELEDRVFVNCNTSITWVEGTVGTLLSDITRLDLGKRILDPRGIYRCNGTDIYKDKESTVQVHYRMCQSCVELDPATVAGIIVTDVIATLLLALGVFCFAGHETGRLSGAADTOALLRNDOVYOPLRDRDDAOYSHLGGNWARNK(SEQ ID NO:73)或MEHSTFLSGLVLATLLSQVSPFKIPIEELEDRVFVNCNTSITWVEGTVGTLLSDITRLDLGKRILDPRGIYRCNGTDIYKDKESTVOVHYRTADTOALLRNDOVYOPLRDRDDAQYSHLGGNWARNK(SEQ ID NO:74)。

在一些实施例中，合适的胞内结构域多肽可包含全长CD3δ氨基酸序列的含ITAM基序的部分。因此，合适的胞内结构域多肽可包含与DOVYOPLRDRDDAOYSHLGGN(SEQ ID NO:75)具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或100％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施例中，胞内结构域源自T细胞表面糖蛋白CD3ε链(也称为CD3e、T细胞表面抗原T3/Leu-4ε链、T细胞表面糖蛋白CD3ε链、AI504783、CD3、CD3epsilon、T3e等)。例如，合适的胞内结构域多肽可包含与下述氨基酸的约100个氨基酸至110个氨基酸(aa)、约110个aa至约115个aa、约115个aa至约120个aa、约120个aa至约130个aa、约130个aa至约140个aa、约140个aa至约150个aa、或约150个aa至约205个aa的连续段具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或100％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列：MQSGTHWRVLGLCLLSVGVWGQDGNEEMGGITQTPYKVSISGTTVILTCPQYPGSEILWQHNDKNIGGDEDDKNIGSDEDHLSLKEFSELEQSGYYVCYPRGSKPEDANFYLYLRARVCENCMEMDVMSVATIVIVDICITGGLLLLVYYWSKNRKAKAKPVTRGAGAGGRQRGQNKERPPPVPNPDYEPIRKGQRDLYSGLNQRRI(SEQ ID NO:76)。

在一些实施例中，合适的胞内结构域多肽可包含全长CD3ε氨基酸序列的含ITAM基序的部分。因此，合适的胞内结构域多肽可包含与NPDYEPIRKGQRDLYSGLNQR(SEQ ID NO:77)具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或100％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施例中，胞内结构域源自T细胞表面糖蛋白CD3γ链(也称为CD3G，T细胞受体T3γ链，CD3-GAMMA，T3G，γ多肽(TiT3复合物)等)。例如，合适的胞内结构域多肽可包含与下述氨基酸的约100个氨基酸至110个氨基酸(aa)、约110个aa至约115个aa、约115个aa至约120个aa、约120个aa至约130个aa、约130个aa至约140个aa、约140个aa至约150个aa、或约150个aa至约180个aa的连续段具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或100％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列：MEQGKGLAVLILAIILLQGTLAQSIKGNHLVKVYDYQEDGSVLLTCDAEAKNITWFKDGKMIGFLTEDKKKWNLGSNAKDPRGMYQCKGSQNKSKPLQVYYRMCQNCIELNAATISGFLFAEIVSIFVLAVGVYFIAGODGVROSRASDKOTLLPNDOLYOPLKDREDDQYSHLQGNQLRRN(SEQ ID NO:78)。

在一些实施例中，合适的胞内结构域多肽可包含全长CD3γ氨基酸序列的含ITAM基序的部分。因此，合适的胞内结构域多肽可包含与DOLYOPLKDREDDOYSHLOGN(SEQ ID NO:79)具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或100％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施例中，胞内结构域源自T细胞表面糖蛋白CD3ζ链(也称为CD3Z、T细胞受体T3ζ链、CD247、CD3-ZETA、CD3H、CD3Q、T3Z、TCRZ等)。例如，合适的细胞内信号传导结构域多肽可包含与下述氨基酸(2种同种型)中任一的约100个氨基酸至110个氨基酸(aa)、约110个aa至约115个aa、约115个aa至约120个aa、约120个aa至约130个aa、约130个aa至约140个aa、约140个aa至约150个aa、或约150个aa至约160个aa的连续段具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或100％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列：MKWKALFTAAILQAQLPITEAQSFGLLDPKLCYLLDGILFIYGVILTALFLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELOKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYOGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:80)或MKWKALFTAAILQAQLPITEAQSFGLLDPKLCYLLDGILFIYGVILTALFLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELOKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYOGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:81)。

在一些实施例中，合适的胞内结构域多肽可包含全长CD3ζ氨基酸序列的含ITAM基序的部分。因此，合适的胞内结构域多肽可包含与下述氨基酸序列中的任一种具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或100％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列：RVKFSRSADAPAYOQGONOLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPOEGLYNELOKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYOGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:82)；NOLYNELNLGRREEYDVLDKR(SEQ ID NO:83)；EGLYNELQKDKMAEAYSEIGMK(SEQ ID NO:84)；或DGLYOGLSTATKDTYDALHMO(SEQ ID NO:85)。

在一些实施例中，胞内结构域源自CD79A(也称为B细胞抗原受体复合物相关蛋白α链；CD79a抗原(免疫球蛋白相关α)；MB-1膜糖蛋白；ig-α；膜结合免疫球蛋白相关蛋白；表面IgM相关蛋白；等)。例如，合适的胞内结构域多肽可包含与下述氨基酸(2种同种型)中任一的约100个氨基酸至110个氨基酸(aa)、约110个aa至约115个aa、约115个aa至约120个aa、约120个aa至约130个aa、约130个aa至约150个aa、约150个aa至约200个aa、或约200个aa至约220个aa的连续段具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或100％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列：MPGGPGVLQALPATIFLLFLLSAVYLGPGCQALWMHKVPASLMVSLGEDAHFQCPHNSSNNANVTWWRVLHGNYTWPPEFLGPGEDPNGTLIIQNVNKSHGGIYVCRVQEGNESYQQSCGTYLRVRQPPPRPFLDMGEGTKNRIITAEGIILLFCAVVPGTLLLFRKRWONEKLGLDAGDEYEDENLYEGLNLDDCSMYEDISRGLOGTYQDVGSLNIGDVQLEKP(SEQ ID NO:86)；或MPGGPGVLQALPATIFLLFLLSAVYLGPGCQALWMHKVPASLMVSLGEDAHFQCPHNSSNNANVTWWRVLHGNYTWPPEFLGPGEDPNEPPPRPFLDMGEGTKNRIITAEGIILLFCAVVPGTLLLFRKRWQNEKLGLDAGDEYEDENLYEGLNLDDCSMYEDISRGLQGTYQDVGSLNIGDVQLEKP(SEQ ID NO:87)。

在一些实施例中，合适的胞内结构域多肽可包含全长CD79A氨基酸序列的含ITAM基序的部分。因此，合适的胞内结构域多肽可包含与下述氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或100％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列：ENLYEGLNLDDCSMYEDISRG(SEQ ID NO:88)。

在一些实施例中，合适的胞内结构域可包含DAP10/CD28型信号传导链。DAP10信号传导链的例子是氨基酸序列：RPRRSPAQDGKVYINMPGRG(SEQ ID NO:89)。在一些实施例中，合适的胞内结构域包含与氨基酸序列RPRRSPAQDGKVYINMPGRG(SEQ ID NO:90)的全长具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

CD28信号传导链的例子是氨基酸序列FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(SEQ ID NO:91)。在一些实施例中，合适的胞内结构域包含与氨基酸序列FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(SEQ ID NO:92)的全长具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

适用于本公开内容的多肽中的其他胞内结构域包括ZAP70多肽，例如包含与下述氨基酸序列的约300个氨基酸至约400个氨基酸、约400个氨基酸至约500个氨基酸、或约500个氨基酸至619个氨基酸的连续段具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列：MPDPAAHLPFFYGSIS RAEAEEHLKLAGMADGLFLLRQCLRSLGGYVLSLVHDVRFHHFPIERQLNGTYAIAGGKAHCGPAELCEFYSRDPDGLPCNLRKPCNRPSGLEPQPGVFDCLRDAMVRDYVRQTWKLEGEALEQAIISQAPQVEKLIATTAHERMPWYHSSLTREEAERKLYSGAQTDGKFLLRPRKEQGTYALSLIYGKTVYHYLISQDKAGKYCIPEGTKFDTLWQLVEYLKLKADGLIYCLKEACPNSSASNASGAAAPTLPAHPSTLTHPQRRIDTLNSDGYTPEPARITSPDKPRPMPMDTSVYESPYSDPEELKDKKLFLKRDNLLIADIELGCGNFGSVRQGVYRMRKKQIDVAIKVLKQGTEKADTEEMMREAQIMHQLDNPYIVRLIGVCQAEALMLVMEMAGGGPLHKFLVGKREEIPVSNVAELLHQVSMGMKYLEEKNFVHRDLAARNVLLVNRHYAKISDFGLSKALGADDSYYTARSAGKWPLKWYAPECINFRKFSSRSDVWSYGVTMWEALSYGQKPYKKMKGPEVMAFIEQGKRMECPPECPPELYALMSDCWIYKWEDRPDFLTVEQRMRACYYSLASKVEGPPGSTQKAEAACA(SEQ ID NO:93)。

F.检测肽

合适的检测肽包括血凝素(HA；例如YPYDVPDYA(SEQ ID NO:94)；FLAG(例如DYKDDDDK(SEQ ID NO:17)；c-myc(例如EQKLISEEDL；SEQ ID NO:95)等等。其它合适的检测肽是本领域已知的。

G.肽接头

在一些实施例中，本公开内容的多肽包括肽接头(有时称为接头)。肽接头可分开本文所述的任何肽结构域/区域。例如，接头可在信号肽和抗原结合结构域之间、抗原结合结构域的VH和VL之间、抗原结合结构域和肽间隔物之间、肽间隔物和跨膜结构域之间、侧接共刺激区或在共刺激区的N-或C-区上、和/或在跨膜结构域和胞内结构域之间。肽接头可具有各种氨基酸序列中的任一种。结构域和区域可通过一般具有柔性性质的肽接头连接，尽管不排除其它化学连接。接头可以为长度约6至约40个氨基酸、或长度约6至约25个氨基酸的肽。这些接头可通过使用合成的编码接头的寡核苷酸来偶联蛋白质而产生。

可使用具有一定柔性程度的肽接头。肽接头实际上可具有任何氨基酸序列，应记住合适的肽接头将具有导致一般柔性肽的序列。使用小氨基酸如甘氨酸和丙氨酸可用于产生柔性肽。此类序列的产生对于本领域技术人员是常规的。

合适的接头可容易地选择并且可具有任何合适的不同长度，例如1个氨基酸(例如Gly)至20个氨基酸、2个氨基酸至15个氨基酸、3个氨基酸至12个氨基酸，包括4个氨基酸至10个氨基酸、5个氨基酸至9个氨基酸、6个氨基酸至8个氨基酸、或7个氨基酸至8个氨基酸，并且可以为1、2、3、4、5、6或7个氨基酸。

示例性的柔性接头包括甘氨酸聚合物(G)

H.共刺激区

合适的共刺激区的非限制性例子包括但不限于来自4-lBB(CD137)、CD28、ICOS、OX-40、BTLA、CD27、CD30、GITR和HVEM的多肽。

共刺激区可具有至少、至多、或正好20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200或300个氨基酸或其中可衍生的任何范围的长度。在一些实施例中，共刺激区源自跨膜蛋白4-1BB(也称为TNFRSF9；CD137；4-1BB；CDwl37；ILA等)的细胞内部分。例如，合适的共刺激区可包含与KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(SEQ ID NO:55)具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或100％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施例中，共刺激区源自跨膜蛋白CD28(也称为Tp44)的细胞内部分。例如，合适的共刺激区可包含与FWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(SEQ ID NO:56)具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或100％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施例中，共刺激区源自跨膜蛋白ICOS(也称为AILIM、CD278和CVID1)的细胞内部分。例如，合适的共刺激区可包含与TKKKYSSSVHDPNGEYMFMRAVNTAKKSRLTDVTL(SEQID NO:57)具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或100％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施例中，共刺激区源自跨膜蛋白OX-40(也称为TNFRSF4、RP5-902P8.3、ACT35、CD134、OX40、TXGP1L)的细胞内部分。例如，合适的共刺激区可包含与RRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI(SEQ ID NO:58)具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或100％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施例中，共刺激区源自跨膜蛋白BTLA(也称为BTLA1和CD272)的细胞内部分。例如，合适的共刺激区可包含与CCLRRHQGKQNELSDTAGREINLVDAHLKSEQTEASTRQNSQVLLSETGIYDNDPDLCFRMQEGSEVYSNPCLEENKPGIVYASLNHSVIGPNSRLARNVKEAPTEYASICVRS(SEQ IDNO:59)具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或100％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施例中，共刺激区源自跨膜蛋白CD27(也称为S152、T14、TNFRSF7和Tp55)的细胞内部分。例如，合适的共刺激区可包含与HQRRKYRSNKGESPVEPAEPCRYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSP(SEQ ID NO:60)具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或100％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施例中，共刺激区源自跨膜蛋白CD30(也称为TNFRSF8、D1S166E和Ki-1)的细胞内部分。例如，合适的共刺激区可包含与RRACRKRIRQKLHLCYPVQTSQPKLELVDSRPRRSSTQLRSGASVTEPVAEERGLMSQPLMETCHSVGAAYLESLPLQDASPAGGPSSPRDLPEPRVSTEHTNNKIEKIYIMKADTVIVGTVKAELPEGRGLAGPAEPELEEELEADHTPHYPEQETEPPLGSCSDVMLSVEEEGKEDPLPTAASGK(SEQ ID NO:61)具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或100％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施例中，共刺激区源自跨膜蛋白GITR(也称为TNFRSF18、RP5-902P8.2、AITR、CD357和GITR-D)的细胞内部分。例如，合适的共刺激区可包含与HIWQLRSQCMWPRETQLLLEVPPSTEDARSCQFPEEERGERSAEEKGRLGDLWV(SEQ ID NO:62)具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或100％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施例中，共刺激区源自跨膜蛋白HVEM(也称为TNFRSF14、RP3-395M20.6、ATAR、CD270、HVEA、HVEM、LIGHTR和TR2)的细胞内部分。例如，合适的共刺激区可包含与CVKRRKPRGDVVKVIVSVQRKRQEAEGEATVIEALQAPPDVTTVAVEETIPSFTGRSPNH(SEQ ID NO:63)具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或100％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

I.另外的修饰

另外，本公开内容的多肽可进行化学修饰。例如，通过修饰多肽序列内的一个或多个糖基化位点以增加多肽对于抗原的亲和力(美国专利号5,714,350和6,350,861)，可改变多肽的糖基化。

通过在其中一个或多个PEG基团变得附着到多肽的条件下，使多肽与聚乙二醇(PEG)或PEG的反应性酯或醛衍生物反应，本发明的多肽可被聚乙二醇化，以增加生物半衰期。多肽聚乙二醇化可通过与反应性PEG分子(或类似的反应性水溶性聚合物)的酰化反应或烷基化反应进行。如本文使用的，术语“聚乙二醇”预期涵盖已用于衍生其它蛋白质的任何形式的PEG，例如单(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-马来酰亚胺。用于使蛋白质聚乙二醇化的方法是本领域已知的，并且可应用于本发明的多肽(EP 0 154 316和EP 0 401 384)。

另外，可通过将多肽与血清蛋白例如人血清白蛋白缀合或融合来化学修饰多肽，以增加所得到的分子的半衰期。这种方法例如在EP 0322094和EP 0 486 525中得到描述。

本公开内容的多肽可与诊断剂或治疗剂缀合并用于诊断，例如用于监测疾病的发展或进展并确定给定治疗方案的功效。多肽还可与治疗剂缀合，以提供与多肽的免疫刺激作用组合的治疗。诊断剂的例子包括酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料、放射性材料、使用各种正电子发射断层摄影术的正电子发射金属和非放射性顺磁性金属离子。可检测物质可与多肽直接偶联或缀合，或者使用本领域已知的技术通过接头间接偶联或缀合。合适的酶的例子包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶。合适的辅基复合物的例子包括链霉抗生物素蛋白/生物素和抗生物素蛋白/生物素。合适的荧光材料的例子包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、若丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白。发光材料的例子包括鲁米诺。生物发光材料的例子包括萤光素酶、萤光素和水母发光蛋白。合适的放射性材料的例子包括125I、131I、铟-111、镥-171、铋-212、铋-213、砹-211、铜-62、铜-64、铜-67、钇-90、碘-125、碘-131、磷-32、磷-33、钪-47、银-111、镓-67、镨-142、钐-153、铽-161、镝-166、钬-166、铼-186、钍-188、铼-189、铅-212、镭-223、锕-225、铁-59、硒-75、砷-77、锶-89、钼-99、铑-1105、钯-109、镨-143、钷-149、铒-169、铱-194、金-198、金-199和铅-211。螯合剂可通过助剂(amities)(Meares等人，1984Anal.Biochem.142:68-78)；氨基酸残基的巯基(Koya ma 1994Chem.Abstr.120:217262t)和碳水化合物基团(Rodwell等人1986PNAS USA 83:2632-2636；Quadri等人1993Nucl.Med.Biol.20:559-570)附着。

多肽还可与治疗剂缀合，以提供与多肽的免疫刺激作用组合的治疗。

其它合适的缀合分子包括核糖核酸酶(RNA酶)、DNA酶I、反义核酸、抑制性RNA分子如siRNA分子、免疫刺激性核酸、适体、核酶、三链体形成分子和外部指导序列。适体是长度范围为15-50个碱基的小核酸，其折叠成限定的二级结构和三级结构，如尾环或G-四重体，并且可结合小分子如ATP(美国专利号5,631,146)和茶碱(美国专利号5,580,737)，以及大分子如逆转录酶(美国专利号5,786,462)和凝血酶(美国专利号5,543,293)。核酶是能够催化分子内或分子间化学反应的核酸分子。核酶通常通过识别和结合靶底物伴并随后切割来切割核酸底物。三链体形成功能性核酸分子可通过形成三链体与双链或单链核酸相互作用，其中DNA的三条链形成依赖于Watson-Crick和Hoogsteen碱基配对的复合物。三联体分子可以高亲和力和特异性结合靶区域。

功能性核酸分子可充当靶分子所具有的特定活性的效应子、抑制剂、调节剂和刺激剂，或者功能性核酸分子可具有不依赖于任何其它分子的从头活性。

J.癌症特异性嵌合抗原受体

在一些实施例中，细胞可还包含癌症特异性嵌合抗原受体(CAR)。在CAR背景下的术语“癌症特异性”指对于癌症特异性分子如癌症特异性抗原具有抗原结合特异性的CAR。在一些实施例中，癌症特异性CAR在具有TGF-βCAR的细胞中。在一些实施例中，癌症特异性CAR和TGF-βCAR在分开的多肽上。在一些实施例中，CAR是对癌症特异性分子和TGF-β具有抗原结合的双特异性CAR。例如，双特异性CAR可具有信号肽、癌症分子特异性scFv、任选的肽接头/间隔物、随后为TGF-βscFv、随后为间隔物(spaer)、跨膜结构域和共刺激结构域。在一些实施例中，双特异性CAR包含本文所述的一种或多种另外的肽区段。

在一些实施例中，本公开内容的多肽可包含CD20 scFv。示例性的CD20 scFv包含下述：DIVLTQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVNYMDWYQKKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSFNPPTFGGGTKLEIKGSTSGGGSGGGSGGGGSSEVQLQQSGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHVWKQTPGQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSADYYCARSNYYGSSYWFFDVWGAGTTVTVSS(SEQ ID NO:100)。

在一些实施例中，本公开内容的多肽可包含CD19 scFv。示例性的CD19 scFv包含下述：DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO:101)。

其它癌症特异性分子(除CD19和CD20之外)可包括CAIX、CD33、CD44v7/8、CEA、EGP-2、EGP-40、erb-B2、erb-B3、erb-B4、FBP、胎儿乙酰胆碱受体、GD2、GD3、Her2/neu、IL-13R-a2、KDR、k-轻链、LeY、L1细胞粘附分子、MAGE-A1、间皮素、MUC1、NKG2D配体、癌胚抗原(h5T4)、PSCA、PSMA、由mAb IgE靶向的TAA、TAG-72和VEGF-R2。在一些实施例中，癌症特异性分子包含Her2。

III.细胞

某些实施例涉及包含本公开内容的多肽或核酸的细胞。在一些实施例中，细胞是免疫细胞或T细胞。“T细胞”包括表达CD3的所有类型的免疫细胞，包括T辅助细胞(CD4

合适的哺乳动物细胞包括原代细胞和永生化细胞系。合适的哺乳动物细胞系包括人细胞系、非人灵长类动物细胞系、啮齿类动物(例如小鼠、大鼠)细胞系等等。合适的哺乳动物细胞系包括但不限于HeLa细胞(例如美国典型培养物保藏中心(ATCC)编号CCL-2)、CHO细胞(例如ATCC编号CRL9618、CCL61、CRL9096)、人胚肾(HEK)293细胞(例如ATCC编号CRL-1573)、Vero细胞、NIH 3T3细胞(例如ATCC编号CRL-1658)、Huh-7细胞、BHK细胞(例如ATCC编号CCL10)、PC12细胞(ATCC编号CRL1721)、COS细胞、COS-7细胞(ATCC编号CRL1651)、RATI细胞、小鼠L细胞(ATCC编号CCLI.3)、HLHepG2细胞、Hut-78、Jurkat、HL-60、NK细胞系(例如NKL、NK92和YTS)等等。

在一些情况下，细胞不是永生化细胞系，而是从个体获得的细胞(例如，原代细胞)。例如，在某些情况下，细胞是从个体获得的免疫细胞。作为例子，细胞是从个体获得的T淋巴细胞。作为另一个例子，细胞是从个体获得的细胞毒性细胞。作为另一个例子，细胞是从个体获得的干细胞或祖细胞。

IV.方法

本公开内容的方面涉及用于刺激免疫应答的方法。免疫应答刺激可在体外、体内或离体完成。在一些实施例中，该方法涉及在TGF-β的存在下能够刺激免疫应答的细胞。该方法一般涉及用表达载体或RNA(例如体外转录的RNA)遗传修饰哺乳动物细胞，所述表达载体包含编码本公开内容的多肽的核苷酸序列，或直接将所述多肽转移至细胞。细胞可以为免疫细胞(例如T淋巴细胞或NK细胞)、干细胞、祖细胞等。在一些实施例中，细胞是本文描述的细胞。

在一些实施例中，遗传修饰是离体进行的。例如，从个体获得T淋巴细胞、干细胞或NK细胞(或本文所述的细胞)；并且从个体获得的细胞被遗传修饰，以表达本公开内容的多肽。在一些情况下，遗传修饰的细胞被离体激活(即，TGF-β与细胞离体接触)。在其它情况下，将遗传修饰的细胞引入个体(例如，从其获得细胞的个体)内；并且遗传修饰的细胞在体内被激活(即，通过内源产生的TGF-β)。

在一些实施例中，该方法还包括施用另外的治疗剂，例如双特异性T细胞衔接器(BITE)。这样的治疗剂可以肽形式施用于患者或者在本公开内容的细胞中表达，例如那些包含TGF-βCAR的细胞。BITE可对于本领域已知和/或本文所述的癌抗原/癌症分子具有抗原特异性，并且还可对T细胞分子如CD3具有抗原特异性。

在一些实施例中，该方法涉及施用本文所述的细胞或肽以治疗癌症或施用于患有癌症的个人。在一些实施例中、癌症是肾上腺癌、肛门癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、儿童或成人中的脑/CNS肿瘤、乳腺癌、宫颈癌、结肠/直肠癌、子宫内膜癌、食道癌、尤因家族肿瘤、眼癌、胆囊癌、胃肠道类癌瘤、胃肠道间质瘤(GIST)、妊娠滋养细胞疾病、霍奇金病、卡波西肉瘤、肾癌、喉和下咽癌、白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性髓样白血病、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓样白血病、慢性骨髓单核细胞白血病、肝癌、肺癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肺类癌瘤、淋巴瘤、恶性间皮瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、鼻腔和副鼻窦癌、鼻咽癌、成神经细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、口腔或口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、阴茎癌、垂体瘤、前列腺癌、成视网膜细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、皮肤癌、肉瘤、基底皮肤癌、鳞状细胞皮肤癌、黑素瘤、梅克尔细胞皮肤癌、小肠癌、胃癌、睾丸癌、胸腺癌、甲状腺癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌、沃尔登斯特伦巨球蛋白血症或肾母细胞瘤。

实施例可用于治疗或改善许多免疫介导的、炎症或自身免疫炎性疾病，例如变态反应、哮喘、糖尿病(例如1型糖尿病)、移植排斥等。这些疾病或病症的例子还包括但不限于关节炎(类风湿性关节炎如急性关节炎、慢性类风湿性关节炎、痛风或痛风性关节炎、急性痛风性关节炎、急性免疫性关节炎、慢性炎性关节炎、退行性关节炎、II型胶原诱发性关节炎、感染性关节炎、莱姆关节炎、增生性关节炎、牛皮癣关节炎、斯蒂尔病、脊椎关节炎和全身性幼年型类风湿性关节炎、骨关节炎、慢性进行性关节炎(arthritis chronicaprogrediente)、变形性关节炎、慢性原发性多关节炎(polyarthritis chronicaprimaria)、反应性关节炎和强直性脊柱炎)、炎性过度增殖性皮肤病、牛皮癣(如斑块状牛皮癣、点状牛皮癣、脓疱性牛皮癣和指甲牛皮癣)、特应性包括特应性疾病(如花粉热和乔布综合征)、皮炎(包括接触性皮炎、慢性接触性皮炎、剥脱性皮炎、过敏性皮炎、过敏性接触性皮炎、疱疹样皮炎、钱币状皮炎、脂溢性皮炎、非特异性皮炎、原发性刺激性接触性皮炎和特应性皮炎)、x连锁高IgM综合征、变应性眼内炎性疾病、荨麻疹(如慢性变应性荨麻疹和慢性特发性荨麻疹，包括慢性自身免疫性荨麻疹)、肌炎、多肌炎/皮肌炎、幼年型皮肌炎、中毒性表皮坏死松解症、硬皮病(包括系统性硬皮病)、硬化症如系统性硬化症、多发性硬化症(MS)如脊柱视觉MS、原发进展型MS(PPMS)和复发缓解型MS(RRMS)、进行性系统性硬化症、动脉粥样硬化、动脉硬化、播散性硬化症(sclerosis disseminata)、共济失调性硬化症、视神经脊髓炎(NMO)、炎性肠病(IBD)(例如克罗恩病、自身免疫介导的胃肠疾病、结肠炎如溃疡性结肠炎(ulcerative colitis)、溃疡性结肠炎(colitis ulcerosa)、显微镜下结肠炎、胶原性结肠炎、息肉状结肠炎、坏死性小肠结肠炎和透壁性结肠炎、以及自身免疫性炎性肠病)、肠炎症、坏疽性脓皮病、结节性红斑、原发性硬化性胆管炎、呼吸窘迫综合征包括成人或急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、脑膜炎、葡萄膜全部或部分发炎、虹膜炎、脉络膜炎、自身免疫性血液病症、类风湿性脊柱炎、类风湿性滑膜炎、遗传性血管性水肿、如脑膜炎中的颅神经损伤、妊娠疱疹、妊娠性类天疱疮、阴囊瘙痒、自身免疫性卵巢早衰、由于自身免疫状况的突发性听力丧失、IgE-介导的疾病如过敏反应和变应性和特应性鼻炎、脑炎如Rasmussen's enc眼炎和边缘叶和/或脑干脑炎、葡萄膜炎(如前葡萄膜炎、急性前葡萄膜炎、肉芽肿性葡萄膜炎、非肉芽肿性葡萄膜炎、晶状体抗原性葡萄膜炎、后葡萄膜炎或自身免疫性葡萄膜炎)、伴有和不伴有肾病综合征的肾小球肾炎(GN)(如慢性或急性肾小球肾炎如原发性GN、免疫介导的GN、膜性GN(膜性肾病)、特发性膜性GN或特发性膜性肾病、膜或膜增生性GN(MPGN)包括I型和II型、以及快速进展性GN)、增生性肾炎、自身免疫性多腺体内分泌衰竭、龟头炎包括浆细胞性局限性龟头炎、龟头包皮炎、离心性环状红斑、持久性色素异常性红斑、多形红斑、环状肉芽肿、光泽苔癣、硬化萎缩性苔藓、慢性单纯性苔藓、小棘苔癣、扁平苔癣、板层状鱼鳞病、表皮松解性角化过度症、恶化前角化症、坏疽性脓皮病、变应性状况和应答、变态反应、湿疹(包括变应性或特应性湿疹、干性湿疹、汗疱性湿疹和小泡样掌跖湿疹、哮喘(如细支气管哮喘、支气管哮喘和自身免疫性哮喘)、涉及T细胞浸润和慢性炎症应答的状况、在怀孕期间针对外来抗原如胎儿A-B-O血型的免疫反应、慢性肺部炎性疾病、自身免疫性心肌炎、白细胞粘附缺陷、狼疮(包括狼疮肾炎、狼疮性脑炎、小儿狼疮、非肾脏性狼疮、肾外狼疮、盘状狼疮和盘状红斑狼疮、脱发性狼疮、系统性红斑狼疮(SLE)如皮肤SLE或亚急性皮肤SLE、新生儿狼疮综合征(NLE)和播散性红斑狼疮)、幼年发作型(I型)糖尿病包括小儿胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)和成人发作型糖尿病(II型糖尿病)和自身免疫性糖尿病。还考虑了与由细胞因子和T淋巴细胞介导的急性和迟发性超敏反应相关的免疫应答、肉状瘤病、肉芽肿病(包括淋巴瘤样肉芽肿病、韦格纳氏肉芽肿病)、粒细胞缺乏症、血管炎病(包括血管炎、大血管血管炎(包括风湿性多肌痛和巨细胞(高安氏)动脉炎)、中血管血管炎(包括川崎氏病和结节性多动脉炎/结节性多动脉炎)、显微镜下多动脉炎、免疫血管炎、CNS血管炎、皮肤血管炎、超敏性血管炎、坏死性血管炎如系统性坏死性血管炎和ANCA相关血管炎如丘-施二氏血管炎或综合征(CSS)和ANCA相关小血管血管炎)、颞动脉炎、再生障碍性贫血、自身免疫性再生障碍性贫血、库姆斯阳性贫血、戴-布二氏贫血、溶血性贫血或免疫性溶血性贫血包括自身免疫性溶血性贫血(AIHA)、阿狄森氏病、自身免疫性中性粒细胞减少症、全血细胞减少症、白细胞减少症、涉及白细胞血细胞渗出的疾病、CNS炎性病症、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、多器官损伤综合征(如继发于败血症、创伤或出血的那些)、抗原-抗体复合物介导的疾病、抗肾小球基底膜疾病、抗磷脂抗体综合征、变应性神经炎、白塞氏病/综合征、淋巴结增生症、古德帕斯彻氏综合征、雷诺氏综合征、干燥综合征、史蒂文斯-约翰逊综合征、类天疱疮如大疱性类天疱疮和皮肤类天疱疮、天疱疮(包括寻常型天疱疮、落叶型天疱疮、天疱疮粘膜类天疱疮和红斑型天疱疮)、自身免疫性多内分泌腺疾病、莱特氏病或综合征、热损伤、先兆子痫、免疫复合物病症如免疫复合物肾炎、抗体介导的肾炎、多发性神经病、慢性神经病如IgM多发性神经病或IgM介导的神经病、自身免疫或免疫介导的血小板减少症如特发性血小板减少性紫癜(ITP)包括慢性或急性ITP、巩膜炎如特发性角膜巩膜炎、巩膜外层炎、睾丸和卵巢的自身免疫病包括自身免疫性睾丸炎和卵巢炎、原发性甲状腺功能减退症、甲状旁腺功能减退、自身免疫性内分泌疾病包括甲状腺炎如自身免疫性甲状腺炎、桥本氏病、慢性甲状腺炎(桥本氏甲状腺炎)、或亚急性甲状腺炎、自身免疫性甲状腺病、特发性甲状腺功能减退症、格雷夫斯氏病、多腺体综合征例如自身免疫性多腺体综合征(或多腺体内分泌病综合征)、副肿瘤综合征包括神经副肿瘤综合征如兰伯特-伊顿肌无力综合征或伊顿-兰伯特综合征、僵人(stiff-man)或僵人(stiff-person)综合征、脑脊髓炎(如变应性脑脊髓炎或过敏性脑脊髓炎和实验性变应性脑脊髓炎(EAE)、实验性自身免疫性脑脊髓炎)、重症肌无力如胸腺瘤相关重症肌无力、小脑变性、神经性肌强直、斜视性眼阵挛或斜视性眼阵挛-肌阵挛综合征(OMS)和感觉神经病变、多灶性运动神经病变、席汉氏综合征、自身免疫性肝炎、慢性肝炎、类狼疮性肝炎、巨细胞肝炎、慢性活动性肝炎或自身免疫慢性活动性肝炎、淋巴样间质性肺炎(LIP)、闭塞性细支气管炎(非移植)相对于NSIP、格-巴二氏综合征、伯格氏病(IgA肾病)、特发性IgA肾病、线性IgA皮肤病、急性发热性嗜中性皮肤病、角质层下脓疱皮肤病、暂时性棘层松解性皮肤病、硬化如原发性胆汁性肝硬化和肺硬变、自身免疫性肠病综合征、乳糜泻或乳糜泻病、口炎性腹泻(麸质肠病)、顽固性口炎性腹泻、特发性口炎性腹泻、冷球蛋白血症、肌萎缩性侧索硬化症(ALS；Lou Gehrig's病)、冠状动脉疾病、自身免疫性耳病如自身免疫性内耳病(AIED)、自身免疫性听力丧失、多软骨炎如难治性或复发性或复发型多软骨炎、肺泡蛋白沉积症、科干氏综合征/非梅毒性间质性角膜炎、贝尔氏麻痹、Sweet's病/综合征、自身免疫性红斑痤疮、带状疱疹相关性疼痛、淀粉样变性、非癌性淋巴细胞增多症、原发性淋巴细胞增多症包括单克隆B细胞淋巴细胞增多症(如良性单克隆丙种球蛋白病和意义未明的单克隆丙种球蛋白病、MGUS)、周围神经病变、副肿瘤综合征、通道病变(如癫痫、偏头痛、心律失常、肌肉病症、耳聋、失明、周期性瘫痪和CNS的通道病变)、孤独症、炎症性肌病、局灶性或节段性或局灶节段性肾小球硬化症(FSGS)、内分泌性眼病变、葡萄膜视网膜炎、脉络膜视网膜炎、自身免疫性肝病症、纤维肌痛、多发性内分泌衰竭、施密特氏综合征、肾上腺炎、胃萎缩、早老性痴呆、脱髓鞘疾病如自身免疫性脱髓鞘疾病和慢性炎性脱髓鞘性多神经病、心肌梗塞后综合征、斑秃、全秃、CREST综合征(钙质沉着、雷诺氏现象、食道运动功能障碍、指端硬化)和毛细血管扩张)、男性和女性自身免疫性不育症如由于抗精子抗体、混合性结缔组织病、恰加斯氏病、风湿热、复发性流产、农民肺、多形红斑、心脏切开后综合征、库欣综合征、养鸟人肺、变应性肉芽肿性血管炎、良性淋巴细胞性血管炎、Alport’s综合征、肺泡炎如变应性肺泡炎和纤维化肺泡炎、间质性肺病、输血反应、麻风病、疟疾、寄生虫病如利什曼病、锥虫病、血吸虫病、蛔虫病、曲霉菌病、Sampter's综合征、卡普兰综合征、登革热、心内膜炎、心内膜心肌纤维化、弥漫性间质性肺纤维化、间质性肺纤维化、肺纤维化、特发性肺纤维化、囊性纤维化、眼内炎、持久性隆起性红斑、胎儿成红细胞增多症、嗜酸细胞性筋膜炎、舒曼氏综合征、费尔蒂氏综合征、丝虫病、睫状体炎(如慢性睫状体炎、异时性睫状体炎、虹膜睫状体炎(急性或慢性)或福斯氏睫状体炎)、过敏性紫癜、人类免疫缺陷病毒(HIV)感染、SCID、获得性免疫缺陷综合征(AIDS)、埃可病毒感染、败血症、内毒素血症、胰腺炎、甲状腺毒症(thyroxicosis)、细小病毒感染、风疹病毒感染、疫苗接种后综合征、先天性风疹感染、EB病毒感染、腮腺炎、埃文氏综合征、自身免疫性性腺衰竭、西登哈姆氏舞蹈病、链球菌感染后肾炎、血栓闭塞性脉管炎(thromboangitis ubiterans)、甲状腺毒症、脊髓痨、脉络膜炎、巨细胞多肌痛、慢性超敏性肺炎、干燥性角结膜炎、流行性角结膜炎、特发性肾病综合征、微小病变肾病、良性家族性和局部缺血-再灌注损伤、移植器官再灌注、视网膜自身免疫、关节炎症、支气管炎、慢性阻塞性气道/肺部疾病、矽肺、口疮、口疮性口炎、动脉硬化性病症、无精子产生症(asperniogenese)、自身免疫性溶血、伯克氏病、冷球蛋白血症、Dupuytren's挛缩、晶状体过敏性眼内炎、过敏性肠炎、麻风结节性红斑、特发性面瘫、慢性疲劳综合征、风湿性热病、Hamman-Rich's病、感觉神经性听力丧失、阵发性血红蛋白尿、性腺功能减退症、局限性回肠炎、白细胞减少症、感染性单核细胞增多症、横贯性脊髓炎、原发性特发性粘液水肿、肾病、交感性眼炎、肉芽肿性睾丸炎、胰腺炎、急性多发性神经根炎(polyradiculitis acuta)、坏疽性脓皮病、Quervain's甲状腺炎、获得性脾萎缩、非恶性胸腺瘤、白癜风、中毒性休克综合征、食物中毒、涉及T细胞浸润的状况、白细胞粘附缺陷、与由细胞因子和T淋巴细胞介导的急性和迟发性超敏反应相关的免疫应答、涉及白细胞血细胞渗出的疾病、多发性器官损伤综合征、抗原-抗体复合物介导的疾病、抗肾小球基底膜疾病、过敏性神经炎、自身免疫性多内分泌腺疾病、卵巢炎、原发性粘液水肿、自身免疫性萎缩性胃炎、交感性眼炎、风湿性疾病、混合结缔组织病、肾病综合征、胰岛炎、多内分泌腺衰竭、I型自身免疫性多内分泌腺综合征、成人发作型特发性甲状旁腺功能减退症(AOIH)、心肌病如扩张型心肌病、获得性大疱性表皮松解症(EBA)、血色病、心肌炎、肾病综合征、原发性硬化性胆管炎、化脓性或非脓性窦炎、获得性或慢性窦炎、筛窦、额叶、上颌或蝶窦炎、嗜酸性粒细胞相关病症如嗜酸性粒细胞增多症、肺浸润嗜酸性粒细胞增多症、嗜酸性粒细胞增多症-肌痛综合征、吕弗勒氏综合征、慢性嗜酸性粒细胞性肺炎、热带肺嗜酸性粒细胞增多症、支气管肺曲霉病、曲霉肿或包含嗜酸性粒细胞的肉芽肿、过敏症、血清反应阴性脊柱关节炎、多内分泌腺自身免疫疾病、硬化性胆管炎、巩膜、巩膜外层、慢性皮肤粘膜念珠菌病、布鲁顿氏综合征、婴儿期短暂性低丙种球蛋白血症、维-奥二氏综合征、共济失调毛细血管扩张综合征、血管扩张、与胶原疾病相关的自身免疫性病症、风湿病、神经系统疾病、淋巴结炎、血压反应降低、血管功能障碍、组织损伤、心血管缺血、痛觉过敏、肾缺血、脑缺血和伴随血管形成的疾病、过敏性超敏反应病症、肾小球肾炎、再灌注损伤、缺血再灌注病症、心肌或其它组织的再灌注损伤、淋巴瘤性气管支气管炎、炎症性皮肤病、具有急性炎症组分的皮肤病、多器官衰竭、大疱性疾病、肾皮质坏死、急性化脓性脑膜炎或其它中枢神经系统炎性病症、眼和眶炎性病症、粒细胞输注相关综合征、细胞因子诱发性毒性、发作性睡病、急性严重炎症、慢性难治性炎症、肾盂炎、动脉内膜增生、消化性溃疡、瓣膜炎、移植物抗宿主病、接触性过敏、哮喘气道高反应和子宫内膜异位症。

V.药物组合物

本公开内容包括用于调节有此需要的受试者中的免疫应答的方法。本公开内容包括可以为药物组合物形式的细胞，所述药物组合物可用于诱导或修饰免疫应答。

根据本公开内容的组合物的施用通常经由任何常见途径进行。这包括但不限于肠胃外、原位、皮内、皮下、肌内、腹膜内、鼻内或静脉内注射。

通常，本发明的组合物以与剂量配方相容的方式施用，并且其量将为治疗有效和免疫修饰的量。要施用的数量取决于要治疗的受试者。需要施用的活性成分的精确量取决于从业者的判断。

应用的方式可广泛地变化。用于施用包含细胞组分的药物组合物的任何常规方法都是适用的。药物组合物的剂量将取决于施用途径，并且将根据受试者的大小和健康而变化。

在许多情况下，期望具有至多约或至少约3、4、5、6、7、8、9、10或更多次的多次施用。施用范围可以为2天至12周间隔，更通常为一至两周间隔。施用过程随后可以进行关于同种异体反应性免疫应答和T细胞活性的测定。

短语“药学可接受的”或“药理学可接受的”指当施用于动物或人时，不产生不利反应、过敏反应或其它不良反应的分子实体和组合物。如本文使用的，“药学可接受的载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等等。此类介质和试剂用于药物活性物质的用途是本领域众所周知的。除非任何常规介质或试剂与活性成分不相容，否则考虑其在免疫原性和治疗性组合物中的使用。本公开内容的药物组合物是药学可接受的组合物。

本公开内容的组合物可配制用于肠胃外施用，例如配制用于经由静脉内、肌内、皮下或甚至腹膜内途径注射。通常，这样的组合物可以制备为注射剂，或液体溶液或悬浮液；也可以制备为适用于在注射前加入液体时制备溶液或悬浮液的固体形式；并且，制备物也可以被乳化。

适合于注射使用的药物形式包括无菌水溶液或分散体；包括芝麻油、花生油或水性丙二醇的制剂。它在制造和贮存条件下也应该是稳定的，并且必须防止微生物如细菌和真菌的污染作用。

通过将需要量的活性成分(即本公开内容的细胞)以需要的量掺入具有上文列举的各种其它成分的适当溶剂中(如果需要)，随后过滤灭菌，来制备无菌注射溶液。一般地，通过将各种灭菌的活性成分掺入无菌媒介物内来制备分散体，所述无菌媒介物含有基本分散介质和来自上文列举的那些的所需其它成分。

基于预期目标确定组合物的有效量。术语“单位剂量”或“剂量”指适用于受试者的物理离散单位，每个单位含有计算为产生与其施用(即适当途径和方案)相关的本文讨论的所需应答的预定数量的组合物。根据治疗次数和单位剂量两者，要施用的量取决于所需的结果和/或保护。组合物的精确量还取决于从业者的判断，并且对于每个个体是独特的。影响剂量的因素包括受试者的身体和临床状态，施用途径，预期的治疗目标(症状缓解与治愈)，以及特定组合物的效力、稳定性和毒性。在配制时，溶液将以与剂量配方相容的方式施用并且以治疗或预防有效的量施用。该制剂易于以各种剂型施用，例如上述可注射溶液的类型。

VI.序列

本公开内容的抗原结合结构域包括下述VH(可变重链)和VL(可变轻链)区域：

scFv#1VH：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYAFTNYLIEWVRQAPGKGLEWVGVINPGSGGSNYNEKFKGRATISADNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSGGFYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPS(SEQ ID NO:1)

scFv#1VL：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVLYSSNQKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCHQYLSSDTFGQGTKVEIKRTVA(SEQ ID NO:2)

scFv#2VH：QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSSNVISWVRQAPGQGLEWMGGVIPIVDIANYAQRFKGRVTITADESTSTTYMELSSLRSEDTAVYYCALPRAFVLDAMDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:3)

scFv#2VL：ETVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSLGSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRAPGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYADSPITFGQGTRLEIK(SEQ ID NO:4)

scFv#3VH：EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKELEWVAVISYDGSIKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARTGEYSGYDTDPQYSWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:19)

scFv#3VL：EIVLTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQGIGDDLGWYQQKPGKAPILLIYGTSTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLQPEDFATYYCLQDSNYPLTFGGGTRLEIK(SEQ ID NO:20)

scFv#1的VH和VL区的相应CDR是下述氨基酸序列：scFv#1HCDR1：GYAFTNYLIE(SEQID NO:5)；scFv#1HCDR2：VINPGSGGSNYNEKFKG(SEQ ID NO:6)；scFv#1HCDR3：SGGFYFDY(SEQID NO:7)；scFv#1LCDR1：RASQSVLYSSNQKNYLA(SEQ ID NO:8)；scFv#1LCDR2：WASTRES(SEQID NO:9)；scFv#1LCDR3：HQYLSSDT(SEQ ID NO:10)。

scFv#2的VH和VL区的相应CDR是下述氨基酸序列：scFv#2HCDR1：SNVIS(SEQ IDNO:11)；scFv#2HCDR2：GVIPIVDIANYAQRFKG(SEQ ID NO:12)；scFv#2HCDR3：PRAFVLDAMDY(SEQ ID NO:13)；scFv#2LCDR1：RASQSLGSSYLA(SEQ ID NO:14)；scFv#2LCDR2：GASSRAP(SEQID NO:15)；和scFv#2LCDR3：QQYADSPIT(SEQ ID NO:16)

scFv#3的VH和VL区的相应CDR是下述氨基酸序列：scFv#3HCDR1：SYGMH(SEQ IDNO:21)；scFv#3HCDR2：VISYDGSIKYYADSVKG(SEQ ID NO:22)；scFv#3HCDR3：TGEYSGYDTDPQYS(SEQ ID NO:23)；scFv#3LCDR1：RSSQGIGDDLG(SEQ ID NO:24)；scFv#3LCDR2：GTSTLQS(SEQID NO:25)；和scFv#3LCDR3：LQDSNYPLT(SEQ ID NO:26)。

本公开内容的检测肽可包括例如HA：YPYDVPDYA(SEQ ID NO:94)；FLAG：DYKDDDDK(SEQ ID NO:17)；和c-myc：EQKLISEEDL；SEQ ID NO:95)。

示例性的信号肽包括：METDTLLLWVLLLWVPGSTG(SEQ ID NO:18)。其它示例性的信号肽包括：MLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDT(SEQ ID NO:94)或MGTSLLCWMALCLLGADHADG(SEQ IDNO:95)。

示例性的肽间隔物铰链区包括：DKTHT(SEQ ID NO:27)、CPPC(SEQ ID NO:28)、CPEPKSCDTPPPCPR(SEQ ID NO:29)、ELKTPLGDTTHT(SEQ ID NO:30)、KSCDKTHTCP(SEQ IDNO:31)、KCCVDCP(SEQ ID NO:32)、KYGPPCP(SEQ ID NO:33)、EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO:34；人IgGl铰链)，ERKCCVECPPCP(SEQ ID NO:35；人IgG2铰链)，ELKTPLGDTTHTCPRCP(SEQ IDNO:36；人IgG3铰链)，SPNMVPHAHHAQ(SEQ ID NO:37)；ESKYGPPCPPCP(SEQ ID NO:98)、ESKYGPPCPSCP(SEQ ID NO:99)(基于人IgG4铰链)，EPKSCDKTYTCPPCP(SEQ ID NO:38)和TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD(SEQ ID NO:39)。

示例性的肽接头包括例如(GSGGS)n(SEQ ID NO:40)；(GGGS)

示例性的跨膜结构域包括IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC(SEQ ID NO:48)，CD8β来源的：LGLLVAGVLVLLVSLGVAIHLCC(SEQ ID NO:49)，CD4来源的：ALIVLGGVAGLLLFIGLGIFFCVRC(SEQ ID NO:50)，CD3ζ来源的：LCYLLDGILFIYGVILTALFLRV(SEQ ID NO:51)，CD28来源的：WVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV(SEQ ID NO:52)，CD134(OX40)来源的：VAAILGLGLVLGLLGPLAILLALYLL(SEQ ID NO:53)，以及CD7来源的：ALPAALAVISFLLGLGLGVACVLA(SEQ ID NO:54)。

示例性的共刺激区包括：KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(SEQID NO:55)、FWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(SEQ ID NO:56)、TKKKYSSSVHDPNGEYMFMRAVNTAKKSRLTDVTL(SEQ ID NO:57)、RRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI(SEQ ID NO:58)、CCLRRHQGKQNELSDTAGREINLVDAHLKSEQTEASTRQNSQVLLSETGIYDNDPDLCFRMQEGSEVYSNPCLEENKPGIVYASLNHSVIGPNSRLARNVKEAPTEYASICVRS(SEQ ID NO:59)、HQRRKYRSNKGESPVEPAEPCRYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSP(SEQ ID NO:60)、RRACRKRIRQKLHLCYPVQTSQPKLELVDSRPRRSSTQLRSGASVTEPVAEERGLMSQPLMETCHSVGAAYLESLPLQDASPAGGPSSPRDLPEPRVSTEHTNNKIEKIYIMKADTVIVGTVKAELPEGRGLAGPAEPELEEELEADHTPHYPEQETEPPLGSCSDVMLSVEEEGKEDPLPTAASGK(SEQ ID NO:61)、HIWQLRSQCMWPRETQLLLEVPPSTEDARSCQFPEEERGERSAEEKGRLGDLWV(SEQ ID NO:62)、以及CVKRRKPRGDVVKVIVSVQRKRQEAEGEATVIEALQAPPDVTTVAVEETIPSFTGRSPNH(SEQ ID NO:63)。

在一些实施例中，胞内结构域包含ITAM基序。ITAM基序是YX

示例性胞内结构域包括来自以下的多肽：MGGLEPCSRLLLLPLLLAVSGLRPVQAQAQSDCSCSTVSPGVLAGIVMGDLVLTVLIALAVYFLGRLVPRGRGAAEAATRKORITETESPYOELOGORSDVYSDLNTQRPYYK(SEQ ID NO:66),MGGLEPCSRLLLLPLLLAVSGLRPVQAQAQSDCSCSTVSPGVLAGIVMGDLVLTVLIALAVYFLGRLVPRGRGAAEATRKORITETESPYOELOGORSDVYSDLNTQRPYYK(SEQ ID NO:67)；MGGLEPCSRLLLLPLLLAVSDCSCSTVSPGVLAGIVMGDLVLTVLIALAVYFLGRLVPRGRGAAEAATRKORITETESPYOELOGORSDVYSDLNTQRPYYK(SEQ ID NO:68)；MGGLEPCSRLLLLPLLLAVSDCSCSTVSPGVLAGIVMGDLVLTVLIALAVYFLGRLVPRGRGAAEATRKORITETESPYOELOGORSDVYSDLNTQRPYYK(SEQ ID NO:69)；ESPYOELOGORSDVYSDLNTO(SEQ IDNO:70)；MIPAVVLLLLLLVEQAAALGEPQLCYILDAILFLYGIVLTLLYCRLKIQVRKAAITSYEKSDGVYTGLSTRNQETYETLKHEKPPQ(SEQ IDNO:71)；DGVYTGLSTRNOETYETLKHE(SEQ ID NO:72)；MEHSTFLSGLVLATLLSQVSPFKIPIEELEDRVFVNCNTSITWVEGTVGTLLSDITRLDLGKRILDPRGIYRCNGTDIYKDKESTVQVHYRMCQSCVELDPATVAGIIVTDVIATLLLALGVFCFAGHETGRLSGAADTOALLRNDOVYOPLRDRDDAOYSHLGGNWAR NK(SEQ ID NO:73)；MEHSTFLSGLVLATLLSQVSPFKIPIEELEDRVFVNCNTSITWVEGTVGTLLSDITRLDLGKRILDPRGIYRCNGTDIYKDKESTVOVHYRTADTOALLRNDOVYOPLRDRDDAQYSHLGGNWARNK(SEQ ID NO:74)；DOVYOPLRDRDDAOYSHLGGN(SEQ ID NO:75)；MQSGTHWRVLGLCLLSVGVWGQDGNEEMGGITQTPYKVSISGTTVILTCPQYPGSEILWQHNDKNIGGDEDDKNIGSDEDHLSLKEFSELEQSGYYVCYPRGSKPEDANFYLYLRARVCENCMEMDVMSVATIVIVDICITGGLLLLVYYWSKNRKAKAKPVTRGAGAGGRQRGQNKERPPPVPNPDYEPIRKGQRDLYSGLNQRRI(SEQ ID NO:76)；NPDYEPIRKGQRDLYSGLNQR(SEQ ID NO:77)；MEQGKGLAVLILAIILLQGTLAQSIKGNHLVKVYDYQEDGSVLLTCDAEAKNITWFKDGKMIGFLTEDKKKWNLGSNAKDPRGMYQCKGSQNKSKPLQVYYRMCQNCIELNAATISGFLFAEIVSIFVLAVGVYFIAGODGVROSRASDKOTLLPNDOLYOPLKDREDDQYSHLQGNQLRRN(SEQ ID NO:78)；DOLYOPLKDREDDOYSHLOGN(SEQ ID NO:79)；MKWKALFTAAILQAQLPITEAQSFGLLDPKLCYLLDGILFIYGVILTALFLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELOKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYOGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:80)；MKWKALFTAAILQAQLPITEAQSFGLLDPKLCYLLDGILFIYGVILTALFLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELOKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYOGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:81)；RVKFSRSADAPAYOQGONOLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPOEGLYNELOKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYOGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:82)；NOLYNELNLGRREEYDVLDKR(SEQ ID NO:83)；EGLYNELQKDKMAEAYSEIGMK(SEQ ID NO:84)；DGLYOGLSTATKDTYDALHMO(SEQ ID NO:85)；MPGGPGVLQALPATIFLLFLLSAVYLGPGCQALWMHKVPASLMVSLGEDAHFQCPHNSSNNANVTWWRVLHGNYTWPPEFLGPGEDPNGTLIIQNVNKSHGGIYVCRVQEGNESYQQSCGTYLRVRQPPPRPFLDMGEGTKNRIITAEGIILLFCAVVPGTLLLFRKRWONEKLGLDAGDEYEDENLYEGLNLDDCSMYEDISRGLOGTYQDVGSLNIGDVQLEKP(SEQID NO:86)；MPGGPGVLQALPATIFLLFLLSAVYLGPGCQALWMHKVPASLMVSLGEDAHFQCPHNSSNNANVTWWRVLHGNYTWPPEFLGPGEDPNEPPPRPFLDMGEGTKNRIITAEGIILLFCAVVPGTLLLFRKRWQNEKLGLDAGDEYEDENLYEGLNLDDCSMYE DISRGLQGTYQDVGSLNIGDVQLEKP(SEQ ID NO:87)；ENLYEGLNLDDCSMYEDISRG(SEQ ID NO:88)；RPRRSPAQDGKVYINMPGRG(SEQ ID NO:89)；RPRRSPAQDGKVYINMPGRG(SEQ ID NO:90)；FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(SEQ ID NO:91)；FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(SEQ ID NO:92)；和MPDPAAHLPFFYGSIS RAEAEEHLKLAGMADGLFLLRQCLRSLGGYVLSLVHDVRFHHFPIERQLNGTYAIAGGKAHCGPAELCEFYSRDPDGLPCNLRKPCNRPSGLEPQPGVFDCLRDAMVRDYVRQTWKLEGEALEQAIISQAPQVEKLIATTAHERMPWYHSSLTREEAERKLYSGAQTDGKFLLRPRKEQGTYALSLIYGKTVYHYLISQDKAGKYCIPEGTKFDTLWQLVEYLKLKADGLIYCLKEACPNSSASNASGAAAPTLPAHPSTLTHPQRRIDTLNSDGYTPEPARITSPDKPRPMPMDTSVYESPYSDPEELKDKKLFLKRDNLLIADIELGCGNFGSVRQGVYRMRKKQIDVAIKVLKQGTEKADTEEMMREAQIMHQLDNPYIVRLIGVCQAEALMLVMEMAGGGPLHKFLVGKREEIPVSNVAELLHQVSMGMKYLEEKNFVHRDLAARNVLLVNRHYAKISDFGLSKALGADDSYYTARSAGKWPLKWYAPECINFRKFSSRSDVWSYGVTMWEALSYGQKPYKKMKGPEVMAFIEQGKRMECPPECPPELYALMSDCWIYKWEDRPDFLTVEQRMRACYYSLASKVEGPPGSTQKAEAACA(SEQ ID NO:93)或其一部分。

VII.实例

包括下述实例以证实本发明的实施例。本领域技术人员应该了解，在下述实例中公开的技术代表由发明人发现的在本发明的实践中发挥良好作用的技术，并且因此可视为构成用于其实践的优选模式。然而，根据本公开内容，本领域技术人员应该了解，可在所公开的具体实施例中做出许多改变，并且仍然获得相似或类似的结果，而不背离本发明的精神和范围。

实例1

本公开内容描述了中和人和小鼠TGF-β的单链可变片段(scFv)，以及响应人和小鼠TGF-β的嵌合抗原受体(CAR)。哺乳动物中的TGF-β保守性水平提示所述scFv和CAR可用于结合大多数哺乳动物TGF-β。通过用(G4S)3接头连接重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)构建两种scFv，使得最终取向是N-末端—VH—(G

可用来自鼠κ轻链的前导(即信号)肽给每个scFv加上标签，使得scFv被分泌并且可直接从培养生产细胞的培养基中收集。scFv也可在N末端(在前导肽之后但在VH序列之前)处用标记物加上标签，所述标记物如DYKDDDDK(SEQ ID NO:17)表位、HA标签或侧接GGS接头的cMyc标签。每个scFv可直接施用以中和人或小鼠TGF-β。scFv#1和#2优于scFv#3(图1和7)。此外，每个scFv可用于构建响应TGF-β的CAR。CAR是由胞外抗原结合结构域、胞外间隔物、跨膜结构域、共刺激信号传导区(其数目取决于特定CAR设计而变化)和CD3-ζ信号传导结构域/胞内结构域组成的融合蛋白。可使用上述scFv作为胞外抗原结合结构域构建TGF-βCAR。免疫细胞包括T细胞和天然杀伤(NK)细胞可通过各种方法进行改造，以表达TGF-βCAR，所述方法包括病毒转导、DNA核转染和RNA核转染。与TGF-βCAR结合的TGF-β可激活人类T细胞，从而将TGF-β信号传导从免疫抑制性应答重定向到免疫刺激性应答。TGF-βCAR还可用作辅助受体来抵消免疫抑制，并加强所有过继性T细胞治疗中的T细胞介导的应答，无论是基于肿瘤浸润性淋巴细胞、T细胞受体改造还是其它CAR。

如图2中所示，TGF-βCAR在原代人T细胞的表面上有效表达。使用scFv#2产生TGF-βCAR。表面染色和流式细胞术显示TGF-βCAR存在于原代人CD4+和CD8+T细胞的表面上。受体的胞外结构域含有N末端FLAG表位。EGFRt是截短的表皮生长因子受体，其是细胞转导的指示剂。进一步发现TGF-βCAR比显性失活的TGF-β受体更有效地呈递至细胞表面(图9)。已报道包含缺失细胞内信号传导结构域的截短的TGF-β受体链II的显性失活TGF-β受体(DNR)抑制TGF-β信号传导并改善T细胞效应子功能。然而，DNR无法在细胞表面上有效表达，而TGF-βCAR则能。图9中所示的数据来自用慢病毒转导原代人CD4+T细胞，所述慢病毒编码加上FLAG标签的TGF-βCAR或加上FLAG标签的DNR。经由T2A切割肽将每个受体标记至截短的表皮生长因子受体(EGFRt)，使得转导的细胞可通过EGFRt染色鉴定，而受体表面表达可通过FLAG染色鉴定。图9的结果指示TGF-βCAR在T细胞表面上比DNR更有效地表达。

图3显示了TGF-βCAR阻断内源性TGF-β信号传导。原代人T细胞中的TGF-βCAR表达经由SMAD途径阻断TGF-β信号传导。表达所示受体的T细胞与指示浓度的TGF-β一起温育30分钟，并且经由蛋白质印迹探测磷酸-SMAD2。EGFRt指表达截短的表皮生长因子受体并用作“无CAR”对照的T细胞；无scFv指T细胞表达的CAR缺乏任何配体结合scFv结构域，但在其它方面与TGF-βCAR长相同。TGF-βCAR后面的“长”和“短”标记指其胞外肽间隔物的长度。如图6中所示，TGF-βCAR-T细胞响应TGF-β而增殖。表达TGF-βCAR的T细胞将TGF-β从生长抑制性细胞因子转换为生长促进性细胞因子。

还发现TGF-βCAR激活T细胞并触发细胞因子产生(图4)。如图4中所示，TGF-βCAR-T细胞上调CD69激活标记物的表达，并且产生响应于TGF-β暴露的免疫刺激性细胞因子IFN-γ和TNF-α。在连同或不连同TGF-β的24小时温育后，通过表面染色监测CD69上调。通过应用蛋白质转运抑制剂布雷菲德菌素A，并且在连同或不连同TGF-β的24小时温育后执行细胞内染色，来检测细胞因子产生。“无scFv”指缺乏任何配体结合scFv结构域的CAR。

与TGF-βCAR不同，显性失活的TGF-β受体无法触发细胞因子产生。虽然已报道显性失活的TGF-β受体也抑制TGF-β信号传导，但它不引发免疫刺激作用，例如TNF-α产生(图5)。“Tβ短”和“Tβ长”是两种不同的TGF-βCAR，“Dom-Neg”指显性失活的TGF-β受体，并且“无scFv”指缺乏任何配体结合scFv结构域的CAR。

进一步发现TGF-βCAR功能可通过共刺激域选择来调节。如图10中所示，在CD28和4-1BB共刺激结构域之间的转换改变了响应TGF-β的细胞因子生产水平。此外，发现TGF-β在来自不同供体的具有TGF-βCAR的细胞中以剂量依赖性方式持续触发TNF-α产生，提示CAR的性能足够稳健以用于临床应用(图11)。

进一步发现TGF-βCAR间隔物长度调节触发阈值。增加细胞外间隔物长度增加了CAR触发的TGF-β阈值(图12)。这提示可通过改变配体结合结构域和细胞内信号传导结构域之间的偶联，来定制CAR对应用需求的响应性。“短间隔物”包含人IgG4的铰链部分；“长间隔物”包含IgG4铰链-CH2-CH3。

接下来，发现可溶性配体介导的CAR二聚化触发CAR信号传导。图13中显示的是携带所示CAR的Jurkat细胞系。GFP CAR#1和GFP CAR#3两者均以同二聚体形式存在，并且两种CAR结合EGFP上的不同表位并可同时结合单个EGFP分子。GFP CAR#1和GFP CAR#2与EGFP上的相同表位结合，但CAR#2作为单体而不是同二聚体存在。结果指示CAR信号传导可通过配体介导的CAR二聚化来促进，但不要求配体或CAR本身作为二聚体预先存在(图13)。可溶性配体通过可触发CAR信号传导的一种可能机制是通过将受体连接在两个不同的细胞上，从而形成免疫突触。该机制与表达单一类型的GFP CAR的Jurkat细胞可被二聚体而不是单体EGFP激活的观察一致。这也与两种Jurkat细胞系的混合物(各自表达不同的GFP CAR)可被二聚体和单体EGFP激活的观察一致。在这种情况下，由于两种Jurkat细胞系上的CAR与同一EGFP分子上的两个不同表位结合，单体EGFP也可触发细胞间连接(图14)。

发现可以细胞间接触依赖性和非依赖性方式两者触发TGF-βCAR。尽管细胞间接触是可溶性配体如EGFP和TGF-β可通过其触发CAR信号传导的一种可能机制，但CAR-T细胞激活也可在不存在细胞间接触的情况下由可溶性配体触发。在图15中，将稳定表达TGF-βCAR和由NFAT启动子表达的EGFP报道分子的Jurkat细胞以各种细胞密度接种，并且连同或不连同5ng/mL TGF-β一起温育。即使在其中细胞主要作为单细胞分离物存在的非常低的细胞密度下，在TGF-β的存在下观察到明确的EGFP信号。此外，对于细胞密度的10倍范围(从500到5000个细胞/cm^2)，不存在EGFP输出随细胞密度而增加(图15)。这些结果指示可溶性TGF-β可不依赖于细胞间接触而触发T细胞激活。然而，EGFP输出显著增加超过阈值细胞密度，证实了在更高细胞密度水平下细胞间接触的贡献。为了进一步测试这点，表达TGF-βCAR的原代人CD4+T细胞用钙指示剂Fluo-4-AM标记，并且通过荧光显微镜检查成像。在不存在细胞间接触的情况下，在TGF-β添加后观察到的Fluo-4-AM信号证实了TGF-βCAR-T细胞可在没有细胞间连接的情况下被可溶性配体激活(图16)。

TGF-βCAR解决了免疫细胞抵抗TGF-β作为肿瘤微环境中免疫抑制的驱动因素的作用的需要。尽管CAR-T细胞疗法已产生了针对B细胞恶性肿瘤的显著临床结果，但其针对实体瘤的功效明显受限。已知实体瘤通过过度产生TGF-β和其它细胞因子来生成高度免疫抑制性微环境，最终导致T细胞失活。TGF-βCAR赋予T细胞不仅通过减少经由内源性TGF-β途径的信号传导来抵抗免疫抑制的能力，还在TGF-β的存在下特异性触发T细胞激活。T细胞激活刺激免疫细胞产生免疫刺激性细胞因子并增殖，因此将TGF-β从免疫抑制信号转变为激励抗肿瘤免疫应答的激活刺激。

实例2：改造多-功能调节性T-细胞疗法用于自身免疫疾病

本实例描述了可用于改造嵌合抗原受体(CAR)-表达的调节性T细胞(Treg)的方法，所述Treg可被肿瘤生长因子β(TGF-β)激活，以选择性地离体扩增，在体内维持稳健的抑制功能，并分泌抗-白细胞介素6受体α(IL--6Rα)单-链可变片段(scFv)，以有效减少类风湿关节炎(RA)小鼠模型中的炎症。考虑其它自身免疫疾病，例如本领域已知和/或本文所述的那些，也可通过本实例和公开内容中描述的方法治疗。

使用表达嵌合抗原受体(CAR)的常规T细胞(Tconv)的过继性T-细胞疗法已证实针对难治性癌症，特别是B-细胞恶性肿瘤的显著临床功效。然而，CAR-T细胞疗法在治疗自身免疫疾病中的应用仍处于初期阶段。

Treg通过多重机制抑制Tconv功能，所述机制之一是TGF-β的分泌，所述TGF-β是抑制效应性T-细胞和天然杀伤细胞功能两者的有效免疫抑制细胞因子。本发明人已开发了在TGF-β的存在下特异性激活Tconv的TGF-βCAR(图4)，并且已证实TGF-βCAR-T细胞响应可溶性形式和固定形式这两者的TGF-β。尽管TGF-β通常是高度免疫抑制剂的事实(图4)，但表达TGF-βCAR的人CD4+和CD8+Tconv触发稳健的NFAT信号传导，并且在TGF-β的存在下产生Th2细胞因子。

考虑出于下述原因，TGF-βCAR将独特地适合于Treg疗法：1)已知TGF-β促进Treg分化，因此TGF-β-介导的CAR-表达T细胞的扩增呈现了选择性扩增Treg同时防止污染性Tconv长出的方法。我们已观察到TGF-β驱动表达TGF-βCAR-的Tconv的稳健增殖，但仅在受照射的饲养细胞的存在下。在不存在饲养细胞的情况下，TGF-βCAR--Tconv的增殖被TGF-β的存在特异性地抑制，并且与未经修饰的Tconv或表达非--TGFβCAR的Tconv相比，针对TGF-βCAR--Tconv的抑制显著更强。本发明人的实验结果提示，作为天然同二聚体存在的TGF-β可引起表达均TGF-βCAR的两种T细胞之间的缀合。这种细胞间-缀合可导致Tconv中的自相残杀性毒性。这种毒性可超过通过来源于CAR信号传导的增殖应答补偿的，而是仅由受照射的饲养细胞支持。与Tconv不同，Treg不显示出粒酶-介导的细胞毒性，并且它们不被内源性TGF-β信号传导抑制。因此，预期在不存在饲养-细胞支持的情况下，在TGF-β-驱动的离体扩增方案中，TGF-βCAR-表达的Treg可选择性地扩增超过污染性Tconv，从而解决治疗性Treg生产中的主要障碍。2)激活的Treg天然产生TGF-β，因此提供了TGF-βCAR-Treg在体外和体内自-维持激活的机制。已显示抗原-特异性Treg在免疫抑制中比多克隆Treg更有效。另一方面，还已显示一旦激活，Treg就可以以抗原-非特异性方式发挥抑制功能。此外，预先-激活的多克隆Treg已证实抑制小鼠中的胶原-诱发性关节炎。总之，这些结果提示，抗原-特异性Treg可更有效，因为它们比非抗原-特异性Treg更可能被激活，并且针对靶细胞的特异性-尽管可能是有利的-但对于治疗功能不是必需的。天然抗原-特异性Treg难以分离并扩增到用于治疗应用的足够大的数量。尽管转基因T-细胞受体(TCR)的引入提供了有吸引力的替代方案，但每种疾病都需要其自身特异性TCR以及合适的抗原靶的可用性，其中后者已被认为是T-细胞疗法发展中的主要瓶颈。因为TGF-β产生是与TCR特异性无关的Treg的天然输出，所以TGF-βCAR呈现了允许自-维持Treg激活的可推广策略，所述自维持Treg激活可支持针对广泛多样疾病靶的Treg-介导的抑制，而无需疾病-特异性受体。

本实例提供了用于针对自身免疫疾病的基于细胞-的免疫疗法的新型方法学和特异性Treg产物，其中RA作为初始研究的疾病模型。总体目标是建立生成具有持续治疗功能的治疗性Treg的可推广方法，并且证实经改造的Treg在小鼠中的胶原-诱发性关节炎模型中的效用。

A.开发TGF-β-介导的离体扩增方案用于稳健的Treg繁殖

可使用RosetteSep CD4+T-细胞富集试剂盒，随后为基于磁珠-的CD127–和CD25+细胞富集，从健康供体血液样品中分离原代人Treg。分离的细胞可用CD3/CD28 Dynabeads激活，并且在慢病毒转导之前，在补充有300U/ml IL-2的完全培养基(RPMI+10％热-灭活的胎牛血清)中培养2天。编码具有截短的表皮生长因子受体(EGFRt)的TGF-βCAR标记(经由T2A切割肽)的慢病毒载体已经通过转导到原代人Tconv中被构建且验证。CAR-表达细胞可通过基于磁珠-的EGFRt+细胞分选来分离。这种分选方案避免了与CAR的直接抗体结合的需要，并且降低了非生产性T-细胞激活的可能性。分选的CAR-Treg可在各种培养条件下在96-孔板中扩增：(a)仅300U/ml IL-2，(b)仅在浓度梯度(1-20ng/ml)下的TGF-β，(c)IL-2(50-300U/ml)和TGF-β(1-20ng/ml)的梯度，和(d)以1:7T-细胞:TM-LCL比率的IL-2和TGF-β浓度的梯度加上受照射的饲养细胞(TM-LCL)。活细胞计数可通过流式细胞术经过3-周时期来定量。Foxp3表达水平可通过细胞内染色在整个细胞-制备过程中进行定量，从新鲜分离的CD4+/CD25+/CD127–细胞开始。已构建了除了缺乏TGF-β-结合scFv结构域之外与TGF-βCAR相同的“无scFv-”CAR，并且可被包括作为阴性对照。

通过本实例中描述的研究，可确定下述内容：(1)TGF-βCAR表达是否赋予Treg响应TGF-β添加而特异性增殖的能力，并且(2)鉴定IL-2、TGF-β和/或饲养细胞用于以高效率(由大-扩增倍数限定)和高纯度(由污染性Tconv的最低限度存在限定)的离体Treg扩增的最佳组合。本发明人已开发了具有不同结构特性的多种TGF-βCAR，并且已观察到这些CAR响应TGF-β的不同信号传导阈值。可评估两种不同的TGF-βCAR，一种具有短的(12-个氨基酸)细胞外间隔物和另一种具有长的(229-个氨基酸)细胞外间隔物，以确定用于Treg应用的最佳构建体。

B.优化TGF-βCAR-Treg在体外和体内的抑制功能

可进一步调查稳定表达TGF-βCAR的Treg的抑制功能。如上所述，将Treg分离、转导并分选。可评估长-间隔物和短-间隔物TGF-βCAR。作为阴性对照，可转导CD4+T细胞的一部分(在富集CD127–/CD25+表型之前)且进行分选，以提供与经改造的Treg相比的TGF-βCAR-Tconv比较。作为第二阴性对照，用上述无scFv-CAR转导的Treg可包括在研究中。分选的CAR-Treg可在补充有300U/ml IL-2的完全培养基中扩增，因为已报道这种IL-2浓度在体外支持Treg存活和增殖，并且是已公布的研究中报道的那些中的中间浓度。扩增程序可更新至确定为支持最佳Treg扩增的条件。Tconv在补充有50U/ml IL-2和1ng/ml IL-15的完全培养基中扩增。

可在与靶Tconv的共-培养物中评估TGF-βCAR-Treg的抑制功能。靶Tconv是慢病毒转导以表达CD19 CAR的CD4+T细胞。为了测定Treg功能，在可溶性TGF-β的存在或不存在下，TGF-βCAR-Treg可与CFSE-标记的CD19 CAR-Tconv和CD19+Raji淋巴瘤细胞一起共-温育。CD19 CAR-Tconv的增殖可通过CFSE稀释以及通过流式细胞术的活细胞计数来评估。可执行基于CFSE-的增殖测定来代替更广泛使用的3H-胸苷掺入测定，以便在这种共-培养背景下清楚地区分Treg与Tconv增殖。CFSE-标记的细胞可通过从早期时间点开始的流式细胞术准确地定量，而CFSE稀释峰揭示经过7-天时期的细胞-分裂动力学。作为阴性对照，TGF-βCAR-Tconv或无scFv-的CAR-Treg可替代共-温育样品中的TGF-βCAR-Treg。预期无scFv-的CAR-Treg将显示一定的抑制功能，但TGF-βCAR-Treg将显示增强的抑制，由于TGF-β产生和后续的通过TGF-βCAR的自分泌Treg激活。此外，预期外源性TGF-β的添加将进一步强化TGF-βCAR-Treg的抑制功能，导致最低限度的CD19 CAR-Tconv扩增，尽管存在CD19+靶细胞。

在体外验证TGF-βCAR-Treg的抑制剂功能后，可评估经改造的Treg在体内执行抑制剂功能的能力。对于动物研究，通过基于磁珠-的细胞分选，从DBA/1小鼠的淋巴结和脾中分离出小鼠CD4+/CD25+Treg。分选的细胞可通过鼠CD3/CD28免疫磁珠激活，并且转导，扩增并分选以用于TGF-βCAR表达，如先前对于人Treg所述的。虽然TGF-βCAR由靶向人TGF-β的scFv构建，但本发明人已证实该受体用于高效地与鼠TGF-β交叉-反应(图8)。为了触发胶原-诱发性关节炎(CIA)，DBA/1小鼠可在尾的基部处用100-μl乳液注射，所述乳液含有以1:1的比率与溶解于具有0.1M乙酸的PBS中的2mg/ml鸡II型胶原混合的完全弗氏佐剂。可在CIA免疫前一天或CIA免疫后两周经由尾-静脉注射施用一百万Treg，以便评估Treg在疾病进展的不同阶段的表现。就其预防或改善关节炎的能力，可将TGF-βCAR-Treg与无scFv-的CAR-Treg和“无-Treg”对照(即在CIA免疫后无Treg施用)进行比较。基于以下的如先前描述的4-点量表，可评价小鼠的爪中的临床关节炎：Kelchtermans,H.等人(Arthritis ResTher 7,R402-415(2005))。对于每种测试条件可包括十只动物(总共40只动物)。在α＝0.05的双-侧t--检验中，n＝10的样本量将提供检测关节炎评分中的1.5个标准差的差异的92％能力。基于可用文献，预计无scFv-的CAR-Treg在CIA模型中实现关节炎症状的显著抑制。然而，预计TGF-βCAR的添加导致增强的Treg功能性，导致更有效的CIA抑制。还有待观察的是，长-间隔物还是短-间隔物CAR将在CIA模型中显示出优良的体内功能性。

***

根据本公开内容，本文公开和请求保护的所有方法都可无需过度实验而制备且执行。虽然本发明的组合物和方法已根据优选实施例进行描述，但对于本领域技术人员显而易见的是，可对本文所述的方法以及所述方法的步骤或步骤顺序应用变化，而不背离本发明的概念、精神和范围。更具体而言，显而易见化学和生理学相关的某些试剂可代替本文所述的试剂，同时获得相同或相似的结果。对于本领域技术人员显而易见的所有这些类似的替代和修改视为在如由所附权利要求限定的本发明的精神、范围和概念内。所有参考文献、引用的文献文章、专利出版物和与任何所述GenBank登录号相关的序列都特别以引用的方式整体并入本文用于所有目的。

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