一种纯化融合蛋白的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种有效提纯多功能融合蛋白，减少多聚体杂质的纯化工艺。

背景技术

多聚体是指抗体蛋白以二聚体或多聚体形式存在的聚集体。多聚体主要在细胞培养、蛋白纯化、制剂处方和药物储存的工艺过程中由于受培养工艺、纯化条件以及制剂存储过程中某些因素的影响，从而导致蛋白质部分分解折叠或者错误折叠，暴露的相关区域相互作用引发聚集，形成多聚体。

多聚体不仅可能会使得药物活性降低甚至失去生物活性，从而影响药效，更有可能使得受体发生过敏性免疫原反应，从而影响了受体的健康。因此，多聚体是抗体蛋白类药物在制备过程中需要监控和去除的杂质，药物中的多聚体含量被认为是产品的一个重要的质量指标。

在抗体融合蛋白药物生产的过程中，虽然我们可以通过改变操作条件，来控制多聚体的产生，但是我们没有办法达到产品中完全没有多聚体的控制效果。所以有效的多聚体的去除手段对于多聚体的控制就显得至关重要。

目前抗体融合蛋白类药物去除多聚体的纯化工艺，主要包括凝胶过滤层析、亲和层析、离子层析和疏水层析，其中亲和层析作为最主要的纯化方法，在洗脱过程中最常用的是线性洗脱法。一般的线性洗脱法的效果优于等度洗脱法。然而，线性洗脱法也存在一定的弊端，由于涉及到产品的分管收集，在生产过程中收集产品繁琐，可操作性不高。另外，在实际生产过程中，线性梯度的条件也不容易操作，导致不适合工业化生产。

发明内容

为了克服这一技术难题，本发明对抗体融合蛋白的纯化工艺进行了优化，在洗脱步骤中考察了不同的层析填料，不同的洗脱方式，不同的洗脱缓冲液对去除多聚体的影响，筛选出了合适的添加剂种类、添加剂浓度和最优的洗脱pH，最终开发出了最优的等度洗脱法，从而筛选出了合适的纯化工艺，使得在融合蛋白中去除多聚体的效果显著提高，且操作简单，适合工业化生产。

具体而言，本发明公开了一种纯化融合蛋白的方法，包括以下步骤：

步骤1，处理层析填料，上样；

步骤2，使用平衡缓冲液淋洗；

步骤3，使用洗脱缓冲液洗脱产品，并收集产品。

进一步地，所述洗脱缓冲液包含NaAc-HAc、Tris-盐酸、柠檬酸缓冲液或磷酸缓冲液中的一种或几种。

进一步地，所述洗脱缓冲液还包含添加剂。

进一步地，所述添加剂选自氨基酸、醇、糖、盐中的一种或多种。

进一步地，所述氨基酸为精氨酸、甘氨酸、组氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸中的一种或几种。

进一步地，所述盐选自NaCl和CaCl

进一步地，所述添加剂的浓度为10-200mM，优选为20-100mM，更优选为30-80mM，进一步优选为40mM、50mM、60mM或70mM。

进一步地，所述洗脱方法为等度洗脱法或线性洗脱法。

进一步地，所述洗脱方法为等度洗脱法。

进一步地，所述洗脱缓冲液包含洗脱缓冲液1和洗脱缓冲液2。

进一步地，所述洗脱缓冲液1的pH为3.0-5.0，优选为3.5-4.5，更优选为3.9-4.1，进一步优选为3.9、4.0或4.1。

进一步地，所述层析填料选自纳微Nanoab50HC、JSR A3、MabselectSuRe LX和博格隆AT Protein A Diamond中的一种或几种。

进一步地，步骤1为用3-5倍柱体积缓冲液A(10-30mM PB，120-160mM NaCl，pH为7.2-7.6)以流速1.0-1.4mL/min冲洗平衡层析柱，用培养基上清液以流速1.0-1.4mL/min进行上样，上样体积为40-44mL。

进一步地，步骤1为用4倍柱体积缓冲液A(20mM PB，140mM NaCl，pH7.4)以流速1.2mL/min冲洗平衡层析柱，用培养基上清液以流速1.2mL/min进行上样，上样体积为42mL。

进一步地，步骤2为先用1-3倍柱体积缓冲液A(10-30mM PB，120-160mM NaCl，pH为7.2-7.6)以流速1.0-1.4mL/min冲洗，然后用2-4倍柱体积缓冲液C(20-30mM NaAc-HAc，450-550mM NaCl，pH为4.8-5.2)以流速1.0-1.4mL/min冲洗，最后用2-4倍柱体积缓冲液D-2(40-60mM NaAc-HAc，pH为4.8-5.2)以流速1.0-1.4mL/min冲洗。

进一步地，步骤2为先用2倍柱体积缓冲液A(20mM PB，140mM NaCl，pH7.4)以流速1.2mL/min冲洗，然后用3倍柱体积缓冲液C(25mM NaAc-HAc，500mM NaCl，pH5.0)以流速1.2mL/min冲洗，最后用3倍柱体积缓冲液D-2(50mM NaAc-HAc，pH5.0)以流速1.2mL/min冲洗。

进一步地，步骤3使用等度洗脱法，即用4-6倍柱体积的缓冲液1以流速1.0-1.4mL/min洗脱，然后用2-4倍柱体积的缓冲液2以流速1.0-1.4mL/min洗脱。

进一步地，步骤3使用等度洗脱法，即用5倍柱体积的缓冲液1以流速1.2mL/min洗脱，然后用3倍柱体积的缓冲液2以流速1.2mL/min洗脱。

进一步地，所述融合蛋白包括第一重链、第二重链、第一轻链和第二轻链，所述第一重链的一部分和第一轻链的一部分、所述第二重链的一部分和第二轻链的一部分分别配对，且二者之一或全部形成PD-1抗原结合位点，所述第一重链还包含细胞因子IL-15片段以及免疫球蛋白Fc部分，所述第二重链还包含IL-15受体片段以及免疫球蛋白Fc部分，所述第一重链中的细胞因子IL-15片段与第二重链中的IL-15受体片段相互结合。

进一步地，所述第一重链中的IL-15片段和第二重链中的IL-15受体片段可以分别嵌合于所述链的Fc部分内部，也可以存在于Fc部分外部，优选位于所述相应重链的CH1和CH2功能区之间。

进一步地，所述融合蛋白的第一重链氨基酸序列选自SEQ ID NO:1；所述融合蛋白的第二重链氨基酸序列选自SEQ ID NO:3；所述融合蛋白的第一轻链和第二轻链的氨基酸序列选自SEQ ID NO:5。

术语

“氨基酸”以三字母或单字母代码命名，如下所示：丙氨酸(Ala，A)、精氨酸(Arg，R)、天冬酰胺(Asn，N)、天冬氨酸(Asp，D)、半胱氨酸(Cys，C)、谷氨酰胺(Gln，Q)、谷氨酸(Glu，E)、甘氨酸(Gly，G)、组氨酸(His，H)、异亮氨酸(Ile，I)、亮氨酸(Leu，L)、赖氨酸(Lys，K)、甲硫氨酸(Met，M)、苯丙氨酸(Phe，F)、脯氨酸(Pro，P)、丝氨酸(Ser，S)、苏氨酸(Thr，T)、色氨酸(Trp，W)、酪氨酸(Tyr，Y)和缬氨酸(Val，V)。

“缓冲液”是通过它的酸-碱共轭物组分的作用而抵抗pH的变化的缓冲溶液。

“洗脱缓冲液”用于从层析基质洗脱蛋白，即将目标蛋白从固相上洗脱下来。洗脱缓冲液的电导率和/或pH能使目标蛋白从层析填料上洗脱下来。

本发明中的洗脱缓冲液1包含NaAc-HAc和L-精氨酸，洗脱缓冲液2包含NaAc-HAc和L-精氨酸。

“线性洗脱”是指这样的方法，例如在某些实施例中，在整个洗脱过程中，洗脱缓冲液A和洗脱缓冲液B的总体积不变，洗脱缓冲液B的体积分数跟时间呈线性关系，即洗脱缓冲液B的体积随着时间的延长呈线性增加。

“等度洗脱”是指这样的方法，例如在某些实施例中，其中例如引起洗脱(即从层析填料中分离出结合的化合物)的缓冲液浓度立即上升或下降，即在单步骤中直接从起始值/水平到终值/水平。

“盐”是通过酸和碱的相互作用而形成的化合物。

有益效果

本发明提供了一种简单有效的纯化融合蛋白的方法，能够提高融合蛋白药物制备过程中去除多聚体的效率，解决了线性洗脱法中产品的分管收集繁琐、线性梯度条件控制难度大的问题，为融合蛋白药物纯化工艺提供了更加可靠的选择。

具体实施方式

以下结合具体的实施例详细说明本发明的内容，但这些实施例并非限制本发明的范围。本发明未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1抗体的制备

本发明融合蛋白的轻链和重链氨基酸序列信息选自公开的或自研PD-1靶点单抗序列信息，分析获得该序列的可变区和恒定区信息。将天然IL-15序列或IL-15变体序列插入一条重链的氨基酸序列中，并在另一条重链的相应位置插入IL-15受体序列，优选为IL-15RαSushi序列。根据需要，调整所述融合蛋白氨基酸序列的Fc为其他IgG类型，如IgG4等，并进一步在各重链中设计所需形式的氨基酸突变，由此得到目标融合蛋白的氨基酸序列，分别为：

第一重链的全长序列为SEQ ID NO:1，第二重链的全长序列为SEQ ID NO:3，第一轻链和第二轻链的全长序列为(二者相同)为SEQ ID NO:5。

将上述各目标氨基酸序列转化为核苷酸序列，分别为：

第一重链为SEQ ID NO:2，第二重链为SEQ ID NO:4，第一轻链和第二轻链(二者相同)为SEQ ID NO:6。

利用分子克隆技术，将融合蛋白片段插入PCDNA3.1载体中，构建成哺乳动物细胞表达质粒。在37℃、8％ CO

实施例2层析填料筛选

在实施例2中，探索了使用纳微Nano UniMab50HC，JSR A3，MabselectSuRe LX和博格隆AT Protein A Diamond几种不同的层析填料进行样品纯化，研究保留时间5min，20mg/mL载量时，不同层析填料的纯化效果。

层析条件：

样品来源：实施例1中的培养基上清液，表达量：3.23mg/mL

缓冲液A：20mM PB，140mM NaCl，pH7.4

缓冲液B：0.1M NaOH

缓冲液C：25mM NaAc-HAc，500mM NaCl，pH5.0

缓冲液D-1：25mM NaAc-HAc，pH5.0

缓冲液E-1：50mM NaAc-HAc，pH3.5

用2倍柱体积缓冲液B以流速1.2mL/min冲洗层析柱，用4倍柱体积缓冲液A以流速1.2mL/min冲洗平衡层析柱，用实施例1中的培养基上清液以流速1.2mL/min进行上样。

先用2倍柱体积缓冲液A以流速1.2mL/min冲洗，然后用3倍柱体积缓冲液C以流速1.2mL/min冲洗，最后用3倍柱体积缓冲液D以流速1.2mL/min冲洗。

用缓冲液E以流速1.2mL/min洗脱，收集洗脱峰。

结果发现，当使用纳微Nano UniMab50HC，JSR A3，MabselectSuRe LX和博格隆ATProtein A Diamond中的任一层析填料进行样品纯化时，其分离效果都不好。SEC纯度≥90％的产品为合格样品，计算合格样品的回收率，结果如表1所示。

表1不同层析填料的纯化结果

由结果可知，当使用一种洗脱液时，纳微Nano UniMab50HC，JSR A3，MabselectSuRe LX和博格隆AT Protein A Diamond中的任一层析填料进行样品纯化时，目标产品和多聚体的分离效果都不好，未得到SEC纯度≥90％的合格样品。

实施例3洗脱缓冲液的优化(线性洗脱法)

通过改变洗脱条件，来考察不同的洗脱条件对抗体纯化效果的影响。

层析条件：

样品来源：实施例1中的培养基上清液，表达量：3.23mg/mL

填料：AT ProteinA Diamond，6.15mL

缓冲液A：20mM PB，140mM NaCl，pH7.4

缓冲液B：0.1M NaOH

缓冲液C：25mM NaAc-HAc，500mM NaCl，pH5.0

缓冲液D-2：50mM NaAc-HAc，pH5.0

缓冲液E-2：50mM NaAc-HAc，pH3.2

缓冲液F：50mM NaAc-HAc，100mM NaCl，pH5.0

缓冲液G：50mM NaAc-HAc，100mM NaCl，pH3.2

缓冲液H：50mM NaAc-HAc，50mM L-精氨酸，pH5.0

缓冲液I：50mM NaAc-HAc，50mM L-精氨酸，pH3.2

用4倍柱体积缓冲液A以流速1.2mL/min冲洗平衡层析柱，用实施例1中的培养基上清液以流速1.2mL/min进行上样，上样体积为38mL。

先用2倍柱体积缓冲液A以流速1.2mL/min冲洗，然后用3倍柱体积缓冲液C以流速1.2mL/min冲洗，最后用3倍柱体积缓冲液D以流速1.2mL/min冲洗。

以流速1.2mL/min进行洗脱，收集洗脱峰。

采用表2中的方案线性洗脱，使洗脱缓冲液2的体积分数由0％线性升至100％。

表2使用不同洗脱缓冲液的线性洗脱

分管收集洗脱样品测定纯度，其中，方案1-3中每管收集1mL，计算纯度≥90％的产品的回收率。结果如表3所示。

表3使用不同洗脱缓冲液的线性洗脱的纯化结果

由结果可知，当洗脱缓冲液中添加NaCl或L-精氨酸时，目标产品的洗脱分离效果都比较好。

实施例4洗脱条件pH的优化(等度洗脱法)

通过改变洗脱条件pH，来考察不同的pH对抗体纯化效果的影响。

样品来源：实施例1中的培养基上清液，表达量：3.23mg/mL

填料：AT ProteinA Diamond，6.15mL

缓冲液A：20mM PB，140mM NaCl，pH7.4

缓冲液B：0.1M NaOH

缓冲液C：25mM NaAc-HAc，500mM NaCl，pH5.0

缓冲液D-2：50mM NaAc-HAc，pH5.0

用4倍柱体积缓冲液A以流速1.2mL/min冲洗平衡层析柱，用实施例1中的培养基上清液以流速1.2mL/min进行上样，上样体积为42mL。

先用2倍柱体积缓冲液A以流速1.2mL/min冲洗，然后用3倍柱体积缓冲液C以流速1.2mL/min冲洗，最后用3倍柱体积缓冲液D-2以流速1.2mL/min冲洗。

使用等度洗脱法，即用5倍柱体积的缓冲液1以流速1.2mL/min洗脱，然后用3倍柱体积的缓冲液2以流速1.2mL/min洗脱。其中，缓冲液1将合格产品从填料上洗脱，洗脱液2将多聚物等杂质从填料上洗脱。

收集洗脱样品测定纯度，计算样品的纯度和回收率，结果如表4所示。

表4不同pH洗脱缓冲液的纯化结果

由结果可知，当洗脱缓冲液1的pH值在3.9至4.1之间，不但目标产品的洗脱分离效果好，而且回收率高。

由方案4-6与方案1-3的结果对比可知，使用等度洗脱法的洗脱效果和回收率，显著优于线性洗脱法。

应当说明的是，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用于限制本发明的范围，凡在本发明的精神和原则之内所作出的任何修改、等同的替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。