一种谷子温敏叶色SiWSL1基因及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种谷子温敏叶色SiWSL1基因及其应用。

背景技术

叶片是作物进行光合作用的主要器官，叶片颜色与光合作用及产量密切相关，提高作物的光合效能可以大幅提高作物的产量。将水稻、小麦等C

叶色突变体也称为叶绿素突变体，它直接或间接影响叶绿素的合成和降解，改变叶绿素含量。叶绿素突变受核基因和质体基因两类不同遗传体系控制，其中核基因多数受单隐性核基因控制，少数受两对核基因控制。目前，在拟南芥中，已鉴定出叶绿素合成过程中的相关基因，在水稻、玉米、大麦、小麦等多种作物中获得了叶色突变体。其中，在水稻上已鉴定到160多个叶色突变体，根据表型将其归为白化、黄化、温敏变色、亮绿、常绿、条斑条纹、转绿和紫色8类，已利用这些突变体克隆了30多个调控基因，主要集中在编码叶绿素合成与降解途径中酶的基因。

随着相关领域研究平台的不断完善，以谷子和青狗尾草为研究模式的C

发明内容

本发明的目的是提供一种谷子温敏叶色SiWSL1基因及其应用。

第一方面，本发明首先保护蛋白质，是如下(A1)或(A2)或(A3)或(A4)：

(A1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(A2)由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(A3)在序列2或序列4所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；

(A4)将序列2或序列4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。

所述蛋白质来源于谷子，命名为SiWSL1蛋白。

上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述蛋白质中，蛋白标签(protein-tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。

第二方面，本发明保护编码上述蛋白质的核酸分子(命名为SiWSL1基因)。

所述核酸分子为如下(B1)-(B6)中任一所述的DNA分子：

(B1)编码区如序列表中序列1所示的DNA分子；

(B2)序列表中序列1所示的DNA分子；

(B3)编码区如序列表中序列3所示的DNA分子；

(B4)序列表中序列3所示的DNA分子；

(B5)在严格条件下与(B1)-(B4)中任一所述限定的DNA序列杂交且编码Siwsl1蛋白的DNA分子；

(B6)与(B1)-(B4)中任一所述限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码SiWSL1蛋白的DNA分子。

上述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min。

第三方面，本发明保护与SiWSL1蛋白或SiWSL1基因相关的生物材料；所述生物材料为如下(1)-(8)中的任一种

(1)含有上述基因的表达盒；

(2)含有上述基因或(1)所述表达盒的重组表达载体；

(3)含有上述基因或(1)所述表达盒或(2)所述重组表达载体的转基因细胞系或重组菌；

(4)能够降低上述蛋白质的活性和/或表达量的核酸分子；

(5)能够抑制上述基因表达的核酸分子；

(6)含有(4)或(5)所述核酸分子的表达盒；

(7)含有(4)或(5)所述核酸分子或(6)所述表达盒的载体；

(8)含有(4)或(5)所述核酸分子或(6)所述表达盒或(7)所述载体的转基因细胞系或重组菌。

第四方面，本发明保护上述SiWSL1蛋白或SiWSL1基因或上述生物材料在调控植物叶色表型中的应用。所述调控具体为：改变植物叶色表型。在本发明的实施例中，通过互补SiWSL1基因，使具有白色条纹叶片的突变体wsl1恢复为绿色叶片。

降低目的植物中序列2所述蛋白质的活性和/或表达量的物质在使植物绿色表型变为白色条纹表型中的应用也是本发明保护的范围；

或，抑制目的植物中序列1所述核酸分子的表达的物质在使植物绿色表型变为白色条纹表型中的应用也是本发明保护的范围；

或使植物中序列2所示的蛋白突变为序列4所述的蛋白的物质在使植物的绿色表型变为白色条纹表型中的应用也是本发明保护的范围。

上述序列2所示的蛋白质或其编码核酸分子在恢复白色条纹表型植物变为绿色叶片表型植物中的应用也是本发明保护的范围。

第五方面，本发明保护培育转基因植物的方法，为方法A或方法B。

所述方法A包括如下步骤：降低目的植物中SiWSL1蛋白的活性和/或含量，得到转基因植物；所述转基因植物表现为白色条纹叶色表型。

所述方法B包括如下步骤：对目的植物中SiWSL1蛋白进行基因编辑，得到具有白色条纹叶色表型的转基因植物。

第六方面，本发明保护培育转基因植物的方法，为方法C或方法D。

所述方法C包括如下步骤：抑制目的植物中SiWSL1基因的表达，得到转基因植物；所述转基因植物表现为白色条纹叶色表型；

所述方法D包括如下步骤：对目的植物中SiWSL1基因进行基因编辑，得到具有白色条纹叶色表型的转基因植物。

所述基因编辑为将敲除载体pBWA(V)HU-ylCas9-WSL1转入野生型愈伤组织中，得到具有白色条纹叶色表型的转基因植物。

第七方面，本发明还保护上述SiWSL1蛋白或SiWSL1基因或生物材料或方法在研究植物叶绿体发育和光合作用机制或植物育种中的应用。

上述任一所述植物为如下(D1)或(D2)或(D3)：

(D1)双子叶植物或单子叶植物；

(D2)禾本科植物；

(D3)谷子。

所述谷子具体可为谷子品种长农35号。

本发明以谷子品种长农35号温敏叶色突变体wsl1为主要研究材料，对该突变体进行鉴定、农艺性状和遗传方式分析，同时对其叶绿素含量、细胞形态学、叶绿体的超微结构以及光合特性等进行初步研究，并以“wsl1×品资39号”杂交F2分离群体为定位群体，分别采用重测序BSA-seq策略精细定位突变基因SiWSL1，对该基因进行突变得到具有白色条纹叶色表型的转基因植物。

附图说明

图1为野生型长农35号和突变体wsl1苗期叶色及幼穗田间表型。A、B和C：野生型和wsl1苗期第3、4和5片叶表型；D和E：抽穗期野生型和wsl1幼穗表型。

图2为不同温度条件下突变体wsl1与野生型(长农35号)叶色和幼穗表型差异。A-D：20℃条件下植株表型；F-I：25℃条件下植株表型；K-N：30℃条件下植株表型；A、F和K：野生型苗期表型；B、G和L：wsl1苗期表型；C、H和M：野生型苗期第2片叶表型；D、I和N：wsl1苗期第2片叶表型；E：8月下旬-9月上旬(平均温度为17.5℃)野生型(左)和wsl1(右)幼穗表型；J：长治8月上旬(平均温度为22.8℃)野生型(左)和wsl1(右)幼穗表型；O：长治7月中旬(平均温度为25.9℃)野生型(左)和wsl1(右)幼穗表型。

图3为SiWSL1基因的精细定位与候选基因图位克隆。

图4为WSL1蛋白序列分析。

图5为WSL1表达模式分析。A：WSL1在野生型各组织器官中的表达：B：培养箱L30/D28、L25/D23和L20/D18条件下，WSL1在野生型和突变体苗期叶片的表达分析。

图6为WSL1和突变后wsl1蛋白的亚细胞定位。GFP：目标蛋白WSL1和wsl1的荧光通道；Chl：叶绿体荧光通道；Bright Field：明场；Merge：GFP、Chl和明场叠加图。

图7为SiWSL1的转基因互补与CRISPR-Cas9验证。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

谷子品种长农35号，记载在如下文献中：郭二虎,范惠萍,王秀清,et al.优质高产谷子新品种长农35号的选育[J].中国农学通报,2008(08):198-201.；该品种为山西农业大学谷子研究所选育并于2005年通过国家审定的谷子品种，现为全国谷子品种区域适应性联合鉴定对照品种。公众可以从山西农业科学院谷子研究所获得。

实施例1、谷子白条纹叶白穗突变体wsl1的鉴定

一、谷子白条纹叶色突变体wsl1的表型鉴定和农艺性状分析

从谷子品种长农35号中获得了一个自发突变体，该突变体为白条纹叶色，命名为长农35号突变体wsl1并递交国家种质资源库保存(库编号：00029710)。于谷子适宜播种期在山西农业大学谷子研究所试验田同时种植突变体wsl1与野生型，各选取10株于苗期、抽穗期、成熟期进行调查，调查的农艺性状包括：抽穗期、株高、穗下节长、第一节间粗、第二节间粗、第三节间粗、穗长、穗粗、穗重、穗粒重、千粒重及结实率等。

结果如图1和表1所示。

结果显示，突变体叶片及幼穗颜色表型：3叶期前叶片条白，4-5叶期从新叶叶端开始沿叶脉逐渐转绿，至成株期完全变绿，幼穗内外颖表现为白色，穗轴和小枝梗表现为绿色，成熟后颖壳转黄(图1)。在其它农艺性状方面，突变体wsl1与野生型相比，抽穗期极显著延长，株高极显著增高，千粒重显著提高，穗下节极显著增长，穗粗、穗重、穗粒重及结实率均极显著下降(表1)，但在穗长、第一节间粗、第二节间粗和第三节间粗等性状上没有明显差异。

表1为长农35号和wsl1的农艺性状及产量性状比较

二、长农35号和wsl1的农艺性状及产量性状比较

根据突变体wsl1随环境温度变化的表型情况，在土壤、水分和光照一致条件下，设置20℃、25℃和30℃这3个温度，分别在人工气候培养箱种植突变体wsl1与野生型，观察其在苗期的叶色变化和生长状况；分别于4月份、5月份和6月份不同环境温度下在田间播种野生型和突变体，相应抽穗期分别在7月中旬、8月上旬和8月下旬至9月上旬，观察突变体在抽穗初期穗部内外颖的颜色。

结果如图2所示。结果显示，在不同温度环境条件下，突变体wsl1表型不同。20℃时，突变体表现白色条纹表型；25℃时，突变体叶片表现为白条纹状；而在30℃条件下，突变体叶片跟野生型在各时期均没有明显差别(绿叶片)，因此该材料属于低温敏感型突变体，同时，突变体穗部内外颖颜色出表现出相应的温度敏感性，在8月下旬至9月上旬温度较低条件下，突变体穗部内外颖为白色。

实施例2、谷子白条纹叶色突变体wsl1的精细定位

一、谷子白条纹叶色突变体wsl1的遗传分析

通过与wsl1遗传背景相对一致的野生型长农35号构建“wsl1×长农35号”、“长农35号×wsl1”正反交F

遗传分析结果表明：在突变体wsl1与野生型正反交组合中，以及突变体wsl1与09K65、品资39号等杂交组合中，所有F

表2为不同F

注：χ

二、SiWSL1基因的精细定位与候选基因图位克隆

在试验田种植“wsl1×品资39号”杂交自交F

表3为开发的12个InDel标记和2个CAPS标记信息

注：其中加粗字体标出的的为CAPS标记。

采用Phytozome Setaria italica v2.2(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#！info？alias＝Org_Sitalica)数据库对目标区段进行检索，发现该区间共存在4个开放阅读框(ORF)。功能注释表明，ORF1(Seita.9G185600)编码一个三角状五肽(pentatricopeptide repeat，PPR)蛋白，ORF2(Seita.9G185700)和ORF3(Seita.9G185800)均为功能未知的表达蛋白，ORF4(Seita.9G185900)编码一个低聚糖基转移酶γ亚基。

分别从突变体和野生型中克隆了4个ORFs的基因组序列，对其进行序列比对后发现，除ORF1序列有差异外，ORF2、ORF3和ORF4序列均无差异。同时，表达分析表明，在突变体和野生型间，ORF1表达差异显著。同时，表达分析表明，在突变体和野生型间，ORF1表达差异显著。初步认为ORF1(Seita.9G185600)为控制白条纹叶色突变性状的候选基因。

三、SiWSL1生物信息学分析

利用NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)分析SiWSL1蛋白保守结构域，利用网站Chloro P(http://www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/)和Target P(http://www.cbs.dtu.dk/services/Target P/)对SiWSL1蛋白及突变后蛋白亚细胞定位进行预测。

SiWSL1开放阅读框全长2253bp，不含内含子。基因组序列比对发现，在突变体中，Siwsl1的ATG上下游有189bp缺失(含ATG)，导致基因翻译起始位点(起始密码子)改变，(见图4)，蛋白预测发现突变蛋白N-端缺失68个氨基酸。利用网站Chloro P(http://www.cbs.dtu.dk/services/Chloro P/)和Target P(http://www.cbs.dtu.dk/services/Target P/)对SiWSL1蛋白及突变后蛋白进行预测发现：SiWSL1蛋白N端存在着叶绿体转运肽(CTP)，而突变后蛋白不存在信号肽(-)或存在信号肽的概率很小(0.121)，推测189bp缺失与该基因叶绿体转运肽有无存在直接关系。

野生型SiWSL1基因的cDNA序列如序列表的序列1所示，编码区为序列1第249-2501位，其编码的蛋白质如序列表的序列2所示。突变SiWSL1基因的cDNA序列如序列表的序列3所示，编码区为序列3第264-2312位，其编码的蛋白质如序列表的序列4所示。

突变SiWSL1基因的cDNA与野生型SiWSL1基因的cDNA相比，缺少了189bp。

突变SiWSL1蛋白与野生型SiWSL1蛋白相比，缺少了68个氨基酸残基。

四、SiWSL1的表达模式分析

1、提取野生型谷子品种长农35号幼叶(3叶、4叶和6叶)、拔节期叶片(10叶)孕叶、旗叶、幼茎、孕茎、幼穗、抽穗和根等各个组织的总RNA，并但转录为cDNA，采用RT-PCR检测SiWSL1表达情况，采用引物SiWSL1F和引物SiWSL1R组成的引物对检测SiWSL1表达情况，采用引物ACTIN-7和引物ACTIN-7R组成的引物对检测内参基因ACTIN-7。

SiWSL1F：5'-CTCATTGTTGCTCTATGCTCAC-3'；

SiWSL1R：5'-GGAGAAAGTCCCTTCACAGTTA-3'；

ACTIN-7F：5'TGATCTCACTGACAGTCTGATG 3'；

ACTIN-7R：5'ATGTCTCTTACAATTTCCCGC 3'。

结果如图5A所示，结果显示，SiWSL1在野生型幼叶(3叶、4叶和6叶)、拔节期叶片(10叶)孕叶、旗叶、幼茎、孕茎、幼穗、抽穗和根等各个组织中都有表达，是一个组成性表达的基因，在幼叶中表达量最高，而在根中的表达量最低。

2、对培养箱L30/D28(30℃光照14h，28℃黑暗10h)、L25/D23(25℃光照14h，23℃黑暗10h)和L20/D18(20℃光照14h，18℃黑暗10h)条件下野生型和突变体wsl1在苗期(1叶1心)叶片样品采用RT-PCR检测SiWSL1表达情况，所用引物同上。

结果如图5B所示，每组柱形图，左侧为野生型WT，右侧为突变体wsl1，结果显示，L30/D28条件下，SiWSL1基因的表达较低，随着温度降低，该基因表达量在增加，在L20/D18条件下，野生型和突变体中SiWSL1基因的表达均明显升高，表明该基因编码的蛋白低温下在幼叶中高表达。

五、SiWSL1蛋白的亚细胞定位

为了了解WSL1蛋白的亚细胞定位情况，首先在网站Chloro P(http://www.cbs.dtu.dk/services/Chloro P/)和Target P(http://www.cbs.dtu.dk/services/Target P/)对SiWSL1蛋白进行预测，发现N端的存在着叶绿体转运肽(CTP)，但其突变体存在信号肽的概率很小或者不存在。

1、构建重组表达载体载体pBWA(V)HS-WSL1(WT)-GFP

提取野生型谷子品种长农35号的总RNA，并反转录为cDNA，以cDNA为模板，采用引物SiWSL1-YF和引物SiWSL1-YR组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。将PCR扩增产物通过BpiⅠ酶切连接到载体pBWA(V)HS–GFP(武汉伯远生物)上，得到重组表达载体pBWA(V)HS-WSL1(WT)-GFP(已经测序验证)。

SiWSL1-YF:5’-cagtGAAGACaacaacatggcctgcgcgtcgtacct-3’；

SiWSL1-YR:5’-cagtGAAGACaatacatctgtaagtccattgagggt-3’。

2、构建重组表达载体载体pBWA(V)HS-wsl1(mutant)–GFP

提取突变体wsl1的总RNA，并反转录为cDNA，以cDNA为模板，采用引物Swsl1-YF和引物Swsl1-YR组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。将PCR扩增产物通过BpiⅠ酶切连接到载体pBWA(V)HS–GFP(武汉伯远生物)上，得到重组表达载体pBWA(V)HS-wsl1(mutant)–GFP(已经测序验证)。

Siwsl1-YF:5’-cagtGAAGACaacaacatgctgaactcggcgctcgc-3’；

Siwsl1-YR:5’-cagtGAAGACaatacatctgtaagtccattgagggt-3’。

3、分别将步骤1和步骤2得到的重组表达载体转化水稻品种9311原生质体中，28℃暗培养24-48h，激光共聚焦显微镜观察。

结果如图6所示。结果显示，WSL1(野生型)定位于叶绿体中，和叶绿素自发荧光(用于叶绿体Marker)共定位，但是wsl1(突变型)定位于细胞核中并没有和叶绿素自发荧光共定位，该结果与上述生物信息学对于WSL1蛋白和突变后蛋白的预测结果是一致的，突变蛋白N-端缺失68个氨基酸影响了该蛋白的亚细胞定位。

实施例3、SiWSL1基因功能验证

一、转基因互补试验

1、互补载体pBWA(V)HU-WSL1的构建

以野生型谷子品种长农35号的基因组DNA为模板，采用引物CSL1(+)和引物CSL1(-)组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物(该PCR产物具有序列1第249-2501位的核苷酸)。

将PCR扩增产物AarI酶切连接至pBWA(V)HU载体(武汉伯远生物)上，得到互补载体pBWA(V)HU-WSL1(已经测序验证)。

CSL1(+):5’-cagtCACCTGCaaaacaacatggcctgcgcgtcgtacct-3’；

CSL1(-):5’-cagtCACCTGCaaaatacatcatctgtaagtccattgag-3’。

2、将步骤1得到的互补载体pBWA(V)HU-WSL1首先转化到农杆菌感受态EHA105中，取该菌液用农杆菌侵染谷子成熟胚的方法进行遗传转化(Yang ZR,Zhang HS,Li XK,et al(2020)Amini foxtail millet with an Arabidopsis-like life cycle as a C

3、24个T0阳性株系收获种子后，种植T1代互补株系进行表型观察，以野生型(谷子品种长农35号)和突变体(wsl1)为对照。

结果如图7所示，野生型为绿色叶片，wsl1为白条纹表型，互补为T1代互补株系，可以看出，互补株系苗期表型恢复了野生型的表型，共有5个互补株系。

同时这5个株系经PCR验证后均为阳性(引物为CSL1(+)和引物CSL1(-)，得到615bp扩增产物的为阳性)，经过测序，以上结果表明wsl1突变体白条纹的表型是由于SiWSL1基因中189bp的缺失造成的。

二、CRISPR-Cas9敲除实验

1、构建敲除载体pBWA(V)HU-ylCas9-WSL1

在SiWSL1基因起始密码子附近选择3个靶标，分别为靶标1(ATG下游118bp，cccctccgcgtgtacgccgcctc)，靶标2(ATG下游18bp，cctagcctcctactcccgcgcct)，靶标3(靠近ATG的5‘UTR区，ccaaatgcttgcggtattgccac)。以此构建中间载体WSL1--Y1，WSL1--B1和WSL1--A1，中间载体的引物合成如下：

WSL1--Y1引物：

WSL1--Y1(+):cagtGGTCTCaggcagaggcggcgtacacgcggag

WSL1--Y1(-):cagtGGTCTCaaaacctccgcgtgtacgccgcctc

WSL1—Y2引物：WSL1--Y2(+):cagtGGTCTCaggcaaggcgcgggagtaggaggct

WSL1--Y2(-):cagtGGTCTCaaaacagcctcctactcccgcgcct

WSL1—Y3引物：

WSL1--Y3(+):cagtGGTCTCaggcagtggcaataccgcaagcatt

WSL1--Y3(-):cagtGGTCTCaaaacaatgcttgcggtattgccac

具体如下：

首先将引物WSL1--Y1引物变性、退火，得到WSL1--Y1的gRNA片段，使用ECO31I酶切后连接到经过同样酶切的空载体pBWA(V)HU上，得到pBWD(V)HU-ylCas9-WSL1--Y1质粒；

然后分别将引物WSL1—Y2引物和WSL1—Y3引物分别变性、退火，得到WSL1—Y2的gRNA片段和WSL1—Y3的gRNA片段，分别得到WSL1—Y2和WSL1—Y3质粒，用ECO31I分别对其酶切，并利用T4连接酶进行连接，得到WSL1—Y2+Y3双靶标质粒。

使用LguI酶切连接构建双靶标载体WSL1—Y2+Y3，然后将测序正确的双靶标质粒再与pBWD(LB)-WSL1—Y1质粒使用酶切(LguI)连接构建三靶标载体pBWD(V)HU-WSL1--Y1+Y2+Y3，简称pBWA(V)HU-ylCas9-WSL1(菌检条带大小：1700bp左右，Pbw2-:gcgattaagttgggtaacgccaggg，yl-F1:accggtaaggcgcgccgtagt)，经测序后得到三靶标载体质粒pBWA(V)HU-ylCas9-WSL1。

三靶标载体质粒pBWA(V)HU-ylCas9-WSL1是将序列表的序列5所示的DNA分子替代pBWA(V)HU-ylCas9载体(武汉伯远生物)的Tnos和RNAi骨架位点间的片段，得到敲除载体pBWA(V)HU-ylCas9-WSL1(已经测序验证)。

pBWA(V)HU-ylCas9载体的插入序列的序列5所示的DNA分子中，第382-401位为WSL1--Y1的gRNA片段、第874-893位为WSL1—Y2的gRNA片段和第1366-1385位为WSL1—Y3的gRNA片段。

2、基因编辑阳性株系的制备

将步骤1得到敲除载体pBWA(V)HU-ylCas9-WSL1通过农杆菌介导转化法侵染野生型成熟种子诱导的胚愈伤组织中，通过愈伤抗性(潮霉素)筛选后分化成苗后，获得了9个基因编辑阳性植株，即为T0代基因编辑阳性植株。具体方法参照Yang ZR,Zhang HS,Li XK,etal(2020)A mini foxtail millet with an Arabidopsis-like life cycle as a C

3、基因编辑阳性株系的分子鉴定

提取T0代基因编辑阳性株系叶片的基因组DNA作为模板，用MRI1121-F:(cas9yl-F3+:)AGAACCTCTCCGATGCTATCC(载体的5456-5478的21bp位置处)MRI1121-R:(cas9yl-R3-:)AGCAAGAGGACCAACGTAG(载体的5925-5943的19bp位置处)进行PCR扩增。

扩增产物包含430bp产物为基因编辑成功的阳性植株，得到9个T0代基因编辑成功的阳性植株。

将送去测序，发现该基因编辑成功的阳性植株中的SiWSL1基因均发生移码突变，不能编码SiWSL1蛋白。

4、基因编辑阳性株系的表型观察

取T0代基因编辑阳性株系收获种子后，种植得到T1代基因编辑阳性株系(编辑-1)。

在人工气候室播种后待幼苗长至2叶1心时观察观察表型，结果如图7所示，可以看出，T1代基因编辑阳性株系(编辑-1)苗期表型出现突变表型，白色条纹叶表型。

以上结果表明通过基因编辑方式对该基因N端进行突变，会使野生型出现突变表型。

综合上述结果，SiWSL1就是本发明的目的基因。

SEQUENCE LISTING

<110>山西省农业科学院谷子研究所

<120>一种谷子温敏叶色SiWSL1基因及其应用

<160>5

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>2501

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<400>1

gccttcgttg gctcgttgca gtcacggtgc cacactggat gcttcctctt tcccttcccc60

tgttcgccag ctgcggcgag ccttgagttg agctcctctg cctcaatata cccgctttct 120

tctcagctcc gaccaacaat ccccttgctg cattctcccc agcggcgagc cttcgcttcg 180

cctgggcacc gccggcctcc gacctcgccc gctcgaggcg cgcaccaaat gcttgcggta 240

ttgccacaat ggcctgcgcg tcgtacctag cctcctactc ccgcgcctcg ccagcgccgg 300

cagcgtgccc gtgccatgtc cggccgcccg cgccgcgaac gcggcggcgt cgaccccgcc 360

ccgcgcccct ccgcgtgtac gccgcctccg accaccaaga gcggctcctc accgccctgc 420

gcgagcaggc ggaccccgag gcggcgctcc ggatgctgaa ctcggcgctc gcgcgggagg 480

acttcgcccc gagctccgac gtctacgagg agatcatccg gaagctcggg tccgccggcg 540

cgttcgacct gatgaagggg cttgtcgggg agatgcggcg ggaagggcac gaggtcaagg 600

ttggcatcgt gcagtcgttc gtggagagct acgcgcggct gcgccggttc gacgatgctg 660

tcgacctggt tctgaaccag ctcgacttgt tcggcgttca ggcggacacg gtcgtttaca 720

accacctcct caatgttctt gtggagggga gcaagatgaa gctactggag tcggtctaca 780

acgagatggc tagtcggggg atccgacctg atgttgtgac attcaatacc ctgatcaagg 840

ggctgtgccg ggcacatcag gtcaggactg cggtcttgat gctggaggag atgtcgagcc 900

atagtgtggc gcctgatgag accacattca ccaccttgat gcaaggcttt gttgaggagg 960

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gcatt 1385