一株粘膜乳杆菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物领域，具体涉及一株粘膜乳杆菌及其应用。

背景技术

人体的皮肤具备排泄、感觉、分泌、代谢、屏障、吸收、免疫、体温调节等多种功能，屏障是其最基础的功能。一旦皮肤屏障功能受损，而各类皮肤病的发生风险会明显增高，做好皮肤屏障功能修复治疗是减少皮肤病发生的重要措施。研究发现，皮肤屏障结构以及功能上的异常联系着不同皮肤病的病理特点，做好皮肤屏障修复治疗是预防细菌入侵的重要方法，也有助于减轻皮肤炎症，减少皮肤病的复发。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一株粘膜乳杆菌及其应用，所述菌株为粘膜乳杆菌XWL，具有更好的自由基清除效果和屏障修复作用。

本发明还提出一种含有上述菌株的产品。

本发明还提出上述菌株或含有上述菌株的产品的应用。

在本发明的一个方面，提出了一株菌株，所述菌株为粘膜乳杆菌(Lactobacillusmucosae)XWL，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2022551，保藏日期为2022年05月03日。

在本发明的一些实施方式中，所述粘膜乳杆菌XWL分离自泡菜。

在本发明的一些实施方式中，所述菌株具有如SEQ ID NO：1所示的16S rDNA序列。

在本发明的第二方面，提出了一种产品，包括(1)～(6)中至少的一种：

(1)上述菌株；

(2)含有上述菌株的菌剂；

(3)含有上述菌株的活菌液；

(4)含有上述菌株的死菌液；

(5)含有上述菌株的代谢产物；

(6)含有上述菌株的溶胞物。

在本发明的一些实施方式中，所述溶胞物为由上述菌株经均质破壁后进行固液分离，收集液相，再将液相进行过滤制备得到。

在本发明的一些实施方式中，还包括对所述菌株进行表面活性剂胁迫改良的步骤。

在本发明的一些实施方式中，所述胁迫改良是通过SLS(月桂醇硫酸酯钠)进行胁迫改良。

在本发明的一些实施方式中，所述胁迫改良使用的SLS的浓度为0.5mM-2mM。

在本发明的一些实施方式中，所述均质的条件为800～1200bar高压均质2～5个循环。

在本发明的一些实施方式中，所述固液分离采用离心。

在本发明的一些实施方式中，所述离心的转速为7000～10000rpm。

在本发明的一些实施方式中，所述离心的时间为8～12min。

在本发明的一些实施方式中，所述过滤采用滤膜，所述滤膜的孔径为0.20～0.50μm。

在本发明的一些实施方式中，所述产品为药品、化妆品、医疗器械或食品。

在本发明的一些实施方式中，所述药品还包括药用载体和/或药用辅料。

在本发明的一些实施方式中，所述药用载体包括稀释剂、赋形剂、填充剂、黏合剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂、甜味剂和香味剂中的至少一种。

在本发明的一些实施方式中，所述赋形剂包括水。

在本发明的一些实施方式中，所述填充剂包括淀粉和蔗糖中的至少一种。

在本发明的一些实施方式中，所述黏合剂包括纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮中的至少一种。

在本发明的一些实施方式中，所述湿润剂包括甘油。

在本发明的一些实施方式中，所述崩解剂包括琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠中的至少一种。

在本发明的一些实施方式中，所述吸收促进剂包括季铵化合物。

在本发明的一些实施方式中，所述表面活性剂包括十六烷醇。

在本发明的一些实施方式中，所述吸附载体包括高岭土和皂黏土中的至少一种。

在本发明的一些实施方式中，所述润滑剂包括滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁和聚乙二醇中的至少一种。

在本发明的一些实施方式中，所述医疗器械为凝胶。

在本发明的一些实施方式中，所述食品为使用含有上述菌株的发酵剂生产得到的乳制品、豆制品或果蔬制品；或所述食品为含有上述菌株的饮料或零食。

在本发明的一些实施方式中，所述产品的形式为粉剂、膏剂、凝胶、滴剂、栓剂、锭剂、颗粒、胶囊剂、喷雾、片、丸和溶液中的一种。

在本发明的第三方面，提出了上述粘膜乳杆菌菌株或上述产品的应用，所述应用为在制备保湿修复产品中的应用。

在本发明的一些实施方式中，所述保湿修复主要包括降低细胞ROS生成量和/或清除自由基。

在本发明的一些实施方式中，所述应用为在制备抗衰老产品中的应用。

在本发明的一些实施方式中，所述应用为在制备防治SLS损伤的产品中的应用。

在本发明的一些实施方式中，所述抗衰老的产品或保湿修复产品中，上述粘膜乳杆菌菌株或上述产品的浓度为1wt％-60wt％。

在本发明的第四方面，提出了一种保湿修复和抗衰老的组合物，所述组合物的制备原料包括：上述粘膜乳杆菌菌株或上述产品、螯合剂、防腐剂、保湿剂和精氨酸。

在本发明的一些实施方式中，所述螯合剂包括EDTA 2Na。

在本发明的一些实施方式中，所述防腐剂包括对羟基苯乙酮。

在本发明的一些实施方式中，所述保湿剂包括甘油、丁二醇、透明质酸钠和水解透明质酸钠。

在本发明的一些实施方式中，所述皮肤修复组合物包括以下质量百分比的制备原料：上述粘膜乳杆菌菌株或上述产品8％～12％、螯合剂0.005％～0.02％、防腐剂0.3％～0.8％、保湿剂1％～12％和精氨酸0.1％～0.3％。

在本发明的一些实施方式中，所述皮肤修复组合物包括以下质量百分比的制备原料：上述粘膜乳杆菌菌株或上述产品8％～12％、EDTA 2Na0.005％～0.02％、对羟基苯乙酮0.3％～0.8％、甘油1％～4％、丁二醇1％～5％、透明质酸钠0.01％～0.08％、水解透明质酸钠0.01％～0.05％和精氨酸0.1％～0.3％。

根据本发明的一些实施方式，至少具有以下有益效果：本发明提供了一株粘膜乳杆菌XWL，同时还将粘膜乳杆菌XWL进行了SLS胁迫改良，发现粘膜乳杆菌XWL和SLS胁迫改良后的粘膜乳杆菌XWL具有安全、可靠、效果好等优点，可以用于皮肤保湿、自由基清除、降低细胞ROS生成和屏障修复，同时可以定向修复受SLS损伤的细胞，使其作用在化妆品中更具有针对性和实用意义。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：

图1为本发明实施例1中的XWL菌株菌落形态图；

图2为本发明实施例1中的XWL菌株革兰氏染色后的镜检结果图；

图3为本发明测试例中的改良前后益生菌对HaCaT细胞活力的影响结果图；

图4为本发明测试例中的改良前后粘膜乳杆菌的ROS清除效果的测定结果图；

图5为本发明测试例中的改良前后植物乳杆菌的ROS清除效果的测定结果图。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。

下述实施例中涉及的培养基及其制备方法如下：

益生菌培养基(g/L)：称取蛋白胨10.0g、酵母粉5g、葡萄糖20.0g、磷酸氢二钾2.0g、乙酸钠5.0g、柠檬酸氢二铵2.0g、七水硫酸镁0.58g、硫酸锰0.25g，加入1L去离子水，搅拌溶解后将pH调节pH6.5～6.8，121℃高压灭菌20min，即得。

益生菌固体培养基：称取蛋白胨10.0g、酵母粉5g、葡萄糖20.0g、磷酸氢二钾2.0g、乙酸钠5.0g、柠檬酸氢二铵2.0g、七水硫酸镁0.58g、硫酸锰0.25g，加入1L去离子水，搅拌溶解后将pH调节pH6.5～6.8，再加入琼脂粉20.0g，121℃高压灭菌20min，将培养基冷却至50至60℃后倒入培养皿，每个培养皿约倾倒15-20mL的培养基，冷却凝固后置于4℃冰箱备用。

下述实施例中涉及的微生物的来源和培养方法如下：

植物乳杆菌BNCC336421(植物乳杆菌1)、棒状乳杆菌BNCC138616(棒状乳杆菌)、瑞士乳杆菌BNCC187926(瑞士乳杆菌)、植物乳杆菌BNCC194165(植物乳杆菌2)、卷曲乳杆菌BNCC135057(卷曲乳杆菌)、植物乳杆菌BNCC187897(植物乳杆菌3)、戊糖乳杆菌BNCC337069、短乳杆菌BNCC337373、清酒乳杆菌BNCC185970、干酪乳杆菌BNCC134415、植物乳杆菌BNCC193173(植物乳杆菌4)、发酵乳杆菌BNCC138617、鼠李糖乳杆菌BNCC133145和嗜酸乳杆菌BNCC336636均购自北纳生物公司。

实施例1 XWL菌株的获得

1、XWL菌株的分离

XWL菌株分离自泡菜。具体分离方法如下：将泡菜培养液置于ESwab运输保存液(Copan公司)中，充分震荡混匀，得到混合溶液，将混合溶液加入无菌PBS溶液进行连续十倍梯度稀释，取不同浓度稀释液分别涂布于益生菌固体培养基上，置于37℃培养箱中厌氧培养48h。待培养基上长出明显菌落后，将不同的菌落转接培养后，挑取生长菌落形态呈白色圆边、边缘整齐、表面有光泽等乳酸菌典型特征的菌株，逐一于益生菌固体培养基平板上进行划线培养分离。通过筛选得到具有较强的自由基清除和屏障修复作用的粘膜乳杆菌，将其命名为XWL。同时保藏菌液，标记对应菌株号，于-80℃冰箱冻存。

2、XWL菌株的鉴定

(1)培养特性、镜检及形态学特征

将分离得到的XWL菌株划线于益生菌固体培养基上厌氧培养，如图1所示，菌落表现为直径大小约2-3mm，为灰白色圆形菌落，不透明、中间突起，且菌落边缘整齐、大小形态稳定。对该菌涂片进行革兰氏染色，如图2所示，该菌呈革兰氏阳性，无鞭毛，为短杆状，可连成长链状，无芽胞。

(2)16s rDNA基因序列鉴定

通过细菌基因组DNA快速抽提试剂盒提取粘膜乳杆菌XWL的DNA，并对其进行测序。

将测序得到的结果，于NCBI数据库上对得到的细菌序列进行Blast序列分析，最后确定XWL为粘膜乳杆菌，同源性分值为98.88％。

经过上述鉴定结果，确定XWL菌株名称为粘膜乳杆菌，其分类命名为粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)，该菌株已于2022年5月3日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址:中国.武汉.武汉大学)，保藏编号为CCTCC NO：M 2022551。

粘膜乳杆菌XWL的16s rDNA的序列如下所示：

GGTTACCCCACCGACTTTGGGTGTTACAAACTCTCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGCAGGCGAGTTGCAGCCTGCAATCCGAACTGAGAACGGCTTTAAGAGATTTGCTTGCCCTCGCGAGTTCGCGACTCGTTGTACCGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATCTGACGTCGTCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTCACTAGAGTGCCCAACTTAATGCTGGCAACTAATAACAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCATTGCGTTCCCGAAGGAAACGCCCTATCTCTAGGATTGGCGCAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTAGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAACCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTCCGGCACTGAAGGGCGGAAACCCTCCAACACCTAGCACTCATCGTTTACGGCATGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTACCCATGCTTTCGAGCCTCAGCGTCAGTTGCAGACCAGACAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCTTCCATATATCTACGCATTCCACCGCTACACATGGAGTTCCACTGCCCTCTTCTGCACTCAAGTTATCCAGTTTCCGATGCACTTCTCCGGTTAAGCCGAAGGCTTTCACATCAGACTTAGAAAACCGCCTGCACTCTCTTTACGCCCAATAAATCCGG(SEQ IDNO:1)。

实施例2具有高自由基清除效果益生菌的筛选

1、菌种活化

将实施例1中得到的粘膜乳杆菌XWL和购自北纳生物公司的植物乳杆菌BNCC336421(植物乳杆菌1)、棒状乳杆菌BNCC138616(棒状乳杆菌)、瑞士乳杆菌BNCC187926(瑞士乳杆菌)、植物乳杆菌BNCC194165(植物乳杆菌2)、卷曲乳杆菌BNCC135057(卷曲乳杆菌)、植物乳杆菌BNCC187897(植物乳杆菌3)、戊糖乳杆菌BNCC337069、短乳杆菌BNCC337373、清酒乳杆菌BNCC185970、干酪乳杆菌BNCC134415、植物乳杆菌BNCC193173(植物乳杆菌4)、发酵乳杆菌BNCC138617、鼠李糖乳杆菌BNCC133145、嗜酸乳杆菌BNCC336636的菌种冻存管中取样，分别均匀涂布于益生菌固体培养基平板上，放在培养箱中，37℃培养24h，长出单菌落后，分别挑取单菌落继续接种在固体平板上培养2h从而使菌株活化。

2、种子培养基的制备

分别挑取单菌落接种在装有100mL液体益生菌培养基的锥形瓶中，在培养箱37℃条件下，静置培养12h，检测OD

3、扩大培养

将培养好的益生菌种子液按照体积比10％的比例分别加入不同含有新鲜无菌锥形瓶中加入装有300ml培养基的500ml摇瓶中，静置培养12h，至OD

4、菌体溶胞物的获得

将步骤(3)中获得的菌株，分别于8000rpm离心10min，去除上清液，将菌体沉淀用无菌的生理盐水洗涤，再次离心去除液相，采用生理盐水洗涤两遍后，用100mL生理盐水重悬菌体沉淀，得到OD

5、自由基清除效果的测定

(1)DPPH的清除率的测定

称取DPPH6.0mg并溶解于10mL无水甲醇中，将其稀释5倍后得到浓度为0.3mmol/L的DPPH溶液。分别移取稀释10倍的含有不同菌体的溶胞物的溶液(分别为含有植物乳杆菌1、棒状乳杆菌、瑞士乳杆菌、植物乳杆菌2、卷曲乳杆菌、植物乳杆菌3、戊糖乳杆菌、短乳杆菌、清酒乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌4、发酵乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌、粘膜乳杆菌XWL的溶胞物的溶液)100μL于96孔板中，于517nm处测得不同菌体溶胞物的吸光度A

DPPH的清除率计算公式如下：DPPH清除率/％＝[1-(As-Ab)/(Ac-Acb)]×100％。

(2)ABTS

ABTS

移取50μL稀释20倍的含不同菌体的溶胞物的溶液(分别为含有植物乳杆菌1、棒状乳杆菌、瑞士乳杆菌、植物乳杆菌2、卷曲乳杆菌、植物乳杆菌3、戊糖乳杆菌、短乳杆菌、清酒乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌4、发酵乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌、粘膜乳杆菌XWL的溶胞物的溶液)于96孔板中，然后加入150μL ABTS

表1

结果如表1所示，从表中可以看出，植物乳杆菌2溶胞物、鼠李糖乳杆菌溶胞物及粘膜乳杆菌XWL溶胞物的DPPH自由基和ABTS

实施例3 XWL菌株的胁迫改良

为了进一步加强菌株对于细胞的修复作用，并且降低在细胞中的毒性，对实施例2中筛选得到的自由基清除效果最好的3种菌，以SLS存活率和细胞毒性为指标，进行进一步筛选和改良。

胁迫改良的方法：分别将培养好的三株益生菌(分别为植物乳杆菌2、鼠李糖乳杆菌及粘膜乳杆菌XWL)的种子液，于37℃恒温培养箱中，按照体积比10％的比例，分别接种至300mL含有不同浓度(0.5mM、1mM、1.5mM、2mM)的SLS的新鲜无菌培养基的500mL摇瓶以及等量不含SLS的新鲜无菌培养基中继续静置培养12h，测其存活率。

表2益生菌在不同浓度SLS中的存活率

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存活率a％＝培养基含不同浓度SLS时菌株的OD

存活率结果如表2所示，从表中可以看出，粘膜乳杆菌XWL和植物乳杆菌存活率高，抗胁迫能力强，当SLS为1mM时细胞存活率适中，故选用该浓度为胁迫浓度。

根据上述胁迫改良的方法分别得到植物乳杆菌2、鼠李糖乳杆菌及粘膜乳杆菌XWL胁迫改良后的菌株。

将胁迫改良后的菌株(植物乳杆菌2、鼠李糖乳杆菌及粘膜乳杆菌XWL)和胁迫改良前的培养好的菌株，分别于8000rpm离心10min，去除上清液，将菌体沉淀用无菌生理盐水洗涤，离心去除上清，洗涤两遍后用100mL生理盐水重悬菌体沉淀，得到OD

实施例4

本实施例制备了一种保湿修复的产品，含有的实施例3制备得到的10％粘膜乳杆菌XWL溶胞物，配方如表3所示：

表3保湿修复益生菌试验用配方

实施例5

本实施例制备了一种保湿修复的产品，与实施例4中的益生菌试剂的配方的区别仅在于，益生菌溶胞物为实施例3制备得到的10％的胁迫改良后的粘膜乳杆菌XWL溶胞物。

对比例1

本对比例制备了一种保湿修复的产品，与实施例4中的益生菌试剂的配方的区别仅在于，益生菌溶胞物为实施例2制备得到的10％的植物乳杆菌2的溶胞物。

测试例

1、细胞毒性测试

本测试例选用人永生化表皮细胞(HaCaT细胞)作为模型细胞，测定益生菌溶胞物对皮肤细胞的活力作用，考察益生菌溶胞物对细胞的毒性的影响。

将HaCaT细胞按照1.0×10

细胞活力按照以下公示计算：

细胞活力(％)＝As/Ac×100％，其中As为测试样品的吸光度，Ac为未加样品的吸光度。

改良前后益生菌对细胞活力的影响的结果如图3所示，从图中可以看出，未经胁迫处理的粘膜乳杆菌(D-)在浓度40％(v/v％)以下表现出80％以上的细胞活力，经胁迫处理后的粘膜乳杆菌(D+)在浓度60％(v/v％)以下表现出80％以上的细胞活力，说明SLS胁迫可以降低益生菌溶胞物对细胞的毒性。

2、ROS清除效果的测定

将HaCaT细胞以10

测试结果如图4和图5所示，从图中可以看出，粘膜乳杆菌整体清除ROS效果优于植物乳杆菌，且经过胁迫后的菌株(用“+”表示)清除效果也明显增强，进一步说明SLS的胁迫对菌株起到了改良作用。

3、皮肤屏障修复和保湿测试

挑选适量皮肤状态相近的志愿者(5男+5女，n＝10)，连续三天使用3％浓度的SLS刺激前臂屈侧相同位置。三天后，在前臂屈侧刺激位置分别涂抹实施例4、实施例5和对比例1制备得到的产品，对比例1制备得到的产品为对照组，每天均匀涂抹2次，各组涂抹的量相等，分别在用药第0天、3天和第7天，用TawameterTM Hex测定经表皮水分流失率，Corneometer CM825测定皮肤角质层水分含量从而评价益生菌的保湿修复效果。

表4保湿修复益生菌改良前后人体修复功效

b％＝平均值±标准差*100％**p<0.01vs.SLS损伤后，

结果如表4所示，从表中可以看出，改良前后菌株相比于对照组都有良好的减少经表皮水分流失率和增加皮肤角质层水分含量的效果，且改良后效果显著优于改良前。这是由于当粘膜乳杆菌XWL进行SLS胁迫改良时，会分泌一些益生物质来修复自身受到SLS的损伤，最终存活下来的部分均具有良好的耐SLS胁迫能力。因此，当该菌溶胞物作用于受到SLS损伤的皮肤后，改良后的菌中的益生物质也可以针对性缓解SLS对皮肤的损伤，这些益生物质也通过代谢组学分析进一步明确，结果发现，改良后的菌株会分泌更多的肉碱、十六酰胺、鞘氨醇等具有抗氧化、保湿修复功能的成分，从而使皮肤含水量和经皮失水流失率恢复正常状态。

化妆品行业经历了100年的发展，已经到达了4.0时代，生物技术与传统化妆品工业的结合成为了新的趋势，而以益生菌为代表的生物发酵类原料成为了这一趋势下的热点。益生菌作为常用的食品添加剂普遍添加在酸奶和一些保健食品中，被消费者广为熟知，因此将其作为原料添加进护肤品会更天然获得消费者的信任，具有很大的推广前景。

近年来，益生菌被广泛运用在化妆品领域。虽然不能直接使用活菌，但进一步开发以益生菌为功效宣称的化妆品一般可以使用灭活细菌的溶胞物与发酵代谢产物。益生菌的溶胞物中主要含有代谢产物、细胞间脂质、细胞壁组分和多糖成分等成分，通过这些小分子物质起到护肤功效。目前，市场上应用的抗氧化修复类化妆品原料存在着种类单一、缺乏针对性等问题。而益生菌作为自然界广泛存在的物质，其潜在护肤功效相较于人工合成原料更加突出且多元化，还可以通过定向改良制备更有针对性的原料。但目前为止，很少有研究报道粘膜乳杆菌在化妆品中的应用，以及可减少长期使用淋洗类(含表面活性剂高)产品而造成的皮肤屏障受损相关益生菌源的化妆品原料。

同时，月桂醇硫酸酯钠(Sodium Lauryl Sulfate，简称SLS)是一种常见的阴离子表面活性剂，被广泛地应用于化妆品、洗涤剂等日常用品中。在《已使用化妆品原料目录2021版》中，淋洗类产品最高历史使用量为87.131％、驻留类产品最高历史使用量为2.5％。介于上述，本发明提供了一种经表面活性剂胁迫改良得到优良菌种，并达到其发酵液可具有修复皮肤屏障功能。

综上所述，本发明方案的粘膜乳杆菌XWL和对粘膜乳杆菌XWL进行SLS胁迫得到的改良后的粘膜乳杆菌，均具有良好的自由基清除和屏障修复效果，可以有效用于制备具有抗氧化、修复功效的化妆品。同时本粘膜乳杆菌XWL进行SLS胁迫得到的改良后的粘膜乳杆菌，相较未经改良的粘膜乳杆菌具有更高抗氧化活性和修复效果，可以定向修复受SLS损伤的细胞，使其作用在化妆品中更具有针对性和实用意义。

上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。