一种悬钩子降糖降脂活性成分的分离方法及应用

技术领域

本发明属于植物活性组分分离技术领域，具体涉及一种悬钩子降糖降脂活性成分的分离方法及应用。

背景技术

悬钩子(Rubus corchorifolius Linn.f.)，又名三月泡、四月泡、山抛子、刺葫芦、山莓、馒头菠、高脚菠、龙船泡、牛奶泡、树莓、泡儿刺，广泛分布在我国除内蒙古、新疆、西藏以外的其他各省、市、自治区，在海拔300～1500m的向阳山坡、溪边、山谷、荒地和灌木丛中生长。悬钩子系蔷薇科Rosaceae，蔷薇亚科悬钩子属(Rubus，也称树莓属)，山莓根、茎、叶、果实均可入药，根性味微苦、辛、平，具有祛风除湿、活血化淤、解毒敛疮的功效，主治风湿腰痛、痢疾、遗精、毒蛇咬伤、闭经痛经、湿疹、小儿疳积等症。全株：补肝健胃、祛风止痛。

另外，悬钩子中含有的丰富活性物质，仍有许多未被分离、鉴定，若能对悬钩子中新的化学成分及其药理作用进行更加深入、细微的研究与活性机制探讨，则有望开发出更多可治疗疾病且安全有效的天然植物来源药物。

发明内容

本发明的目的在于提供一种悬钩子降糖降脂活性成分的分离方法，分离得到的悬钩子活性成分在降糖降脂产品中的应用，拓宽了悬钩子的应用范围，并且为高血糖、高血脂患者提供了新的选择。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

降糖降脂化合物，其结构式选自如下之一：

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本发明还提供前述降糖降脂化合物Fr2-3-2的制备方法，包括以下内容：

(1)将悬钩子醇提物与聚酰胺混合；

(2)将(1)中的混合样品进样至串联的小型中压色谱柱与MCI中压色谱柱中，分离得到五个组分Fr1、Fr2、Fr3、Fr4、Fr5；

其中，MCI中压色谱的色谱条件为：流动相A为色谱纯水，流动相B为甲醇，梯度洗脱条件为：0～90min，0～100％B；90～130min，100％B；流速为28mL/min，检测波长为210nm；

(3)将组分Fr2经液相制备色谱制备得到组分Fr2-1、Fr2-2、Fr2-3、Fr2-4、Fr2-5、Fr2-6、Fr2-7；

其中，制备条件为：采用C18色谱柱，流动相A为0.1％甲酸水，流动相B为甲醇，梯度洗脱条件为0～60min，15％～42％B；流速：19mL/min，检测波长为210nm；

(4)将组分Fr2-3经液相制备色谱分离得到Fr2-3-1、Fr2-3-2；

其中，色谱条件为：采用C18色谱柱，流动相A为0.1％甲酸水，流动相B为甲醇，梯度洗脱条件为0～80min，12％B，流速：19mL/min，检测波长为210nm。

在本发明的一个优选实施方式中，C18色谱柱为ACE Excel 5C18 Amide色谱柱，规格为20×250mm,5μm。

在本发明的一个实施例中，所述悬钩子醇提物是由悬钩子茎叶经乙醇提取后经过滤、浓缩得到。

在本发明中，所述乙醇的体积分数为80～99％，进一步选自90～95％，例如可以选自80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％等体积浓度的乙醇。

本发明所述的提取，可以选自但不限于加热提取、渗滤提取、超声提取、微波提取、浸渍提取、超临界提取等等。

在提取以后，还包括其他的常规制备步骤，例如过滤、浓缩、离心、干燥、蒸发等等。

在本发明的一个优选实施例中，所述悬钩子醇提物与聚酰胺混合后，需经干燥、研磨、过筛处理。

进一步地，(2)中C18色谱柱为Kromasil C18 AQ反相色谱柱，规格为4.6×250mm，5μm；进一步地，(3)中C18色谱柱为Megres C18，规格为20×250mm，10μm；

进一步地，五个组分Fr1、Fr2、Fr3、Fr4、Fr5的保留时间分别为：Fr1:20～30min，Fr2:44～58min，Fr3:66～88min，Fr4:93～110min，Fr5:116～127min；

进一步地，组分Fr2-1、Fr2-2、Fr2-3、Fr2-4、Fr2-5、Fr2-6、Fr2-7的保留时间分别为：Fr2-1:15～19min，Fr2-2:19～21min，Fr2-3:21～23min，Fr2-4:23～25min，Fr2-5：25～27min，Fr2-6:35～37min，Fr2-7:45～48min；

进一步地，Fr2-3-1、Fr2-3-2保留时间分别为：Fr2-3-1:57～60min,Fr2-3-2:62～67min。具体参见附图。

本发明首次从悬钩子的醇提物中分离得到了化合物Fr2-3-2，除此之外，本发明实际还提供了所述降糖降脂化合物Fr2-6-1的制备方法，还包括以下内容：

将前述方法制备得到的组分Fr2-6，经液相制备色谱分离得到Fr2-6-1；

其中，色谱条件为：采用C18色谱柱，流动相A为0.1％甲酸水，流动相B为甲醇，梯度洗脱条件为0～35min，28％B，流速：1mL/min，检测波长为210nm；

进一步地，Fr2-6-1保留时间为:26～28min。具体参见附图。

本发明除了首次从悬钩子醇提物中分离得到2个新的化合物Fr2-3-2、Fr2-6-1外，还分离得到了另一种新的降糖降脂化合物Fr2-7-1，具体地，包括以下内容：将前述方法制备得到的Fr2-7，经液相制备色谱分离得到Fr2-7-1；

其中，色谱条件为：采用C18色谱柱，流动相A为0.1％甲酸水，流动相B为甲醇，梯度洗脱条件为0～35min，36％B，流速：1mL/min，检测波长为210nm；

进一步地，Fr2-7-1保留时间为:25～28min。具体参见附图。

说明书和权利要求书中的近似用语用来修饰数量，表示本发明并不限定于该具体数量，还包括与该数量接近的可接受的而不会导致相关基本功能的改变的修正的部分。在本申请说明书和权利要求书中，范围限定可以组合和/或互换，如果没有另外说明这些范围包括其间所含有的所有子范围。

本发明提供了所述的化合物Fr2-3-2、Fr2-6-1、Fr2-7-1中的一种或多种，在制备降糖降脂产品中的应用。

本发明还提供一种前述化合物Fr2-3-2、Fr2-6-1、Fr2-7-1中的一种或多种，在制备抑制脂肪细胞3T3-L1分化的体内或体外用产品中的应用；

脂肪细胞是终末分化细胞，本身不能通过分裂增殖，主要是由前脂肪细胞(3T3-L1)在多种激素的作用下细胞内与脂肪生成相关的基因表达，细胞的形态也发生一定的变化，并最终形成成熟的脂肪细胞，细胞内可见明显的脂肪累积，细胞变大变圆。

脂肪合成与代谢的主要器官为肝脏，高脂饮食导致饮食中的热量增加，导致肝脏组织中TC、TG的生物合成增加，而减少了肝脏组织中TG和TC的降解，从而导致TG、TC在肝脏中不断积累形成脂肪肝。本研究结果显示，3T3-L1前脂肪细胞中TC和TG含量明显高于正常组，施用本发明悬钩子提取物中的活性成分后，TC和TG含量低于对照组。

进一步地，是在制备提高脂肪细胞中TC、TG含量的产品中的应用。

过氧化物酶增殖物激活受体(PPAR)是一类由配体激活的核转录因子，主要分布于脂肪、骨骼肌、心脏和肝脏中，可分为α、β、γ三种类型。其中PPARγ为脂肪组织中高水平表达的转录因子，具有多种生物学效应，在脂肪分化，脂肪代谢中起重要作用。

脂肪酸结合蛋白(Fatty acid binding proteins，FABPs)是一系列脂质伴侣蛋白，其蛋白中央空腔可以结合长链脂肪酸及其它一些疏水性配体。脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白(FABP4)是细胞内FABPs家族成员之一。早期研究发现，FABP4的基本功能包括以非共价方式和可逆性结合饱和及不饱和长链脂肪酸，促进脂肪酸的代谢和转运；FABP4能够可逆性结合饱和及不饱和长链脂肪酸，促进脂肪酸代谢和转运；脂肪细胞分化过程中FABP4的表达及活性显著增强，是脂肪细胞分化的标志物之一。C/EBPβ、SREBP-1c在脂肪细胞分化程序中也起着重要的作用。

进一步地，是在制备提高脂肪细胞中PPARγ、C/EBPα、SREBP-1c和FABP4表达水平的产品中的应用。

本发明还提供一种前述的Fr2-6-1在制备降糖降脂产品中的应用；

进一步地，是在制备抑制脂肪细胞3T3-L1分化的产品中的应用；

进一步地，是在制备提高脂肪细胞中TC、TG含量的产品中的应用。

进一步地，是在制备提高脂肪细胞中PPARγ、C/EBPα、SREBP-1c和FABP4表达水平的产品中的应用。

本发明还提供一种前述的Fr2-7-1在制备降糖降脂产品中的应用；

进一步地，是在制备抑制脂肪细胞3T3-L1分化的产品中的应用；

进一步地，是在制备提高脂肪细胞中TC、TG含量的产品中的应用；

进一步地，是在制备提高脂肪细胞中PPARγ、C/EBPα、SREBP-1c和FABP4表达水平的产品中的应用。

本发明中所述产品，包括但不限于药物、保健品、食品等。

进一步地，所述产品还可以包括药学上可接受的辅料。

在本发明的又一方面，本发明提供一种药物组合物，包括采用前述分离方法得到的活性成分。

本发明的有益效果在于：

(1)本发明提供了一种悬钩子降脂降糖活性成分的分离方法，本发明首次从紫色悬钩子提取物中分离得到了三个新的单体化合物Fr2-3-2、Fr2-6-1和Fr2-7-1；本发明基于建立的3T3-L1脂肪细胞IR模型和分离制备出的新的单体化合物，考察紫色悬钩子化合物对3T3-L1前脂肪细胞分化的影响，结果表明，提取得到的新化合物能够有效改善TNFα诱导引起的3T3-L1脂肪细胞产生的胰岛素抵抗，增强细胞对胰岛素的敏感性，初步探讨了紫色悬钩子单体化合物的降糖作用与机制，为进一步对紫色悬钩子植物治疗糖尿病的开发利用提供了更多的科学依据。

(2)本发明方法效率高，重现性好，可大规模的制备悬钩子中的单体化合物，填补了紫色悬钩子茎叶化学成分研究的空白，为后续紫色悬钩子的质量标准、化学成分以及生物活性研究提供了参考，为紫色悬钩子的发展提供了理论依据。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1为悬钩子MCI中压柱分离色谱图；

图2为Fr2制备对比色谱图；

图3为Fr2-3制备对比色谱图；

图4为Fr2-6制备对比色谱图；

图5为Fr2-7制备对比色谱图；

图6为化合物Fr2-3-2的质谱图；

图7为化合物Fr2-3-2的

图8为化合物Fr2-3-2的

图9为化合物Fr2-6-1的质谱图；

图10为化合物Fr2-6-1的

图11为化合物Fr2-6-1的

图12为化合物Fr2-6-1的HSQC谱图；

图13为化合物Fr2-6-1的HMBC谱图；

图14为化合物Fr2-7-1的质谱图；

图15为化合物Fr2-7-1的

图16为化合物Fr2-7-1的

图17为化合物Fr2-7-1的HSQC谱图；

图18为化合物Fr2-7-1的HMBC谱图；

图19为化合物Fr2-7-1的COSY谱图；

图20为化合物Fr2-7-1的NOSY谱图；

图21为化合物Fr2-7-1的DEPT谱图；

图22为化合物Fr2-7-1的紫外图；

图23为化合物Fr2-7-1的红外图；

图24为紫色悬钩子化合物对3T3-L1前脂肪细胞活力的影响，

图25为紫色悬钩子化合物对3T3-L1前脂肪细胞中TC、TG含量的影响，

图26紫色悬钩子化合物对3T3-L1前脂肪细胞转录因子mRNA表达水平的影响，

图24中，X-1、X-2、X-3分别表示Fr2-3-2、Fr2-6-1、Fr2-7-1；图25、图26中，1、2、3分别表示Fr2-3-2、Fr2-6-1、Fr2-7-1。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

应当明确的是，下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1悬钩子活性成分的提取、分离

1.组分的制备

(1)样品溶液的配置

将采集的悬钩子的茎叶晾干后(1.0kg)用95％乙醇对干燥茎叶进行提取，将提取液过滤、浓缩、干燥，最终得到提取物为183.5g。经计算，提取率约为18.3％。取提取物43.0g加入甲醇溶解，然后将提取物溶液与150g聚酰胺混合拌样，将其放入烘箱中烘至干燥。将干燥后的混合样品放入研钵中研碎后过筛，放置干燥处备用。

(2)将悬钩子提取物与聚酰胺混合样品装入到小型中压色谱柱中(49×100mm)中，将小型中压色谱柱(30mm×120mm，所用的小型中压色谱柱为空柱管，无填料，购自北京宝赛希望生物科技有限公司)与MCI中压色谱柱(49×460mm)串联，采用干法上样的方式对样品进行前处理，最终收集得到五个组分，按顺序命名为Fr1、Fr2、Fr3、Fr4、Fr5，保留时间分别为：Fr1:20～30min，Fr2:44～58min,Fr3:66～88min，Fr4:93～110min,Fr5:116～127min。

其中，MCI中压色谱前处理色谱条件：流动相A为色谱纯水，流动相B为甲醇，梯度洗脱条件为：0～90min，0～100％B,90～130min，100％B流速为28mL/min，检测波长为210nm；

将收集得到的样品浓缩干燥后称重，Fr1：29.13g、Fr2：15.52g、Fr3：7.77g、Fr4：3.91g、Fr5：4.28g。样品分离色谱图如图1所示。

(3)将Fr2(1.1g)溶于7mL水溶液中，经液相色谱分离得到7个组分，将得到的7个组分进行浓缩干燥，经称重Fr2-1为242.64mg、Fr2-2为19.22mg、Fr2-3为18.97mg、Fr2-4为14.48mg、Fr2-5为37.38mg、Fr2-6为13.68mg、Fr2-7为13.27mg；保留时间分别为：Fr2-1:15～19min，Fr2-2:19～21min，Fr2-3:21～23min，Fr2-4:23～25min，Fr2-5：25～27min，Fr2-6:35～37min，Fr2-7:45～48min。

Fr2制备色谱图如图2。

Fr2制备色谱条件：色谱柱为Megres C18(20×250mm,10μm)，流动相A为0.1％甲酸水，流动相B为甲醇，梯度洗脱条件为0-60min，15％-42％B，流速：19mL/min，检测波长为210nm。

2.化合物的制备

(1)Fr2-3-1、Fr2-3-2化合物的分离

将Fr2-3(18.97mg)溶于2mL甲醇溶液中，利用ACE Excel 5C18 Amide制备色谱柱对Fr2-3中的化学成分进行分离纯化。Fr2-3分析与制备色谱图如图3。最终从Fr2-3中分离得到2个组分，将得到的组分进行浓缩干燥，经称重Fr2-3-1为4.77mg、Fr2-3-2为2.75mg，保留时间分别为：Fr2-3-1:57～60min,Fr2-3-2:62～67min。

Fr2-3制备色谱条件：色谱柱为ACE Excel 5C18 Amide(20×250mm,5μm)，流动相A为0.1％甲酸水，流动相B为甲醇，梯度洗脱条件为0-80min，12％B，流速：19mL/min，检测波长为210nm。

(2)Fr2-6-1化合物的分离

将Fr2-6(13.68mg)溶于2mL甲醇溶液中，利用ACE Excel 5C18 Amide制备色谱柱对Fr2-6中的化学成分进行分离纯化。Fr2-6分析与制备色谱图如图4。最终从Fr2-6中分离得到的组分，将得到的组分进行浓缩干燥，经称重Fr2-6-1为8.36mg，Fr2-6-1保留时间为：26～28min。

Fr2-6制备色谱条件：色谱柱为ACE Excel5 C18 Amide(20×250mm,5μm)，流动相A为0.1％甲酸水，流动相B为甲醇，梯度洗脱条件为0-35min，28％B，流速：19mL/min，检测波长为210nm。

(3)Fr2-7-1化合物的分离

将Fr2-7(13.27mg)溶于2mL甲醇溶液中，利用ACE Excel 5C18 Amide制备色谱柱对Fr2-7中的化学成分进行分离纯化。Fr2-7分析与制备色谱图如图5。最终从Fr2-7中分离得到的组分，将得到的组分进行浓缩干燥，经称重Fr2-7-1为6.44mg，Fr2-7-1保留时间为:25～28min。

Fr2-7制备色谱条件：色谱柱为ACE Excel 5C18 Amide(20×250mm,5μm)，流动相A为0.1％甲酸水，流动相B为甲醇，梯度洗脱条件为0-35min，36％B，流速：19mL/min，检测波长为210nm。

3.化合物纯度验证

Fr2经制备型高效液相色谱分离纯化，得到Fr2-3-1、Fr2-3-2、Fr2-6-1、Fr2-7-1共4个组分。然后利用分析型高效液相对3个组分进行纯度检验，色谱条件为：色谱柱为ACEExcel 5C18 Amide分析色谱柱，流动相A为0.1％甲酸水，流动相B为甲醇，梯度洗脱条件为0-60min，15-75％B，流速：1mL/min，检测波长为210nm。最终从Fr2中分离得到4个新单体化合物且具有较高的纯度。

4.化合物结构鉴定

经鉴定化合物发现Fr2-3-2、Fr2-6-1和Fr2-7-1为新化合物。将分离得到的新化合物通过ESI-MS、

化合物Fr2-3-2(2.75mg)：黄色粉末；ESI-MS m/z：545.08[M-H]

化合物Fr2-6-1为(8.36mg)：白色粉末；ESI-MS m/z：311.05[M-H]-，分子式C

化合物Fr2-7-1(6.44mg)：黄色粉末；[α]2D 5-24.0°(

下面通过试验例证明本发明新化合物的有益效果：

试验例1

本实验基于建立的3T3-L1脂肪细胞IR模型和分离制备出的单体化合物，考察紫色悬钩子化合物对3T3-L1前脂肪细胞分化的影响，并探讨了改善IR作用的机制。

1.紫色悬钩子化合物对3T3-L1前脂肪细胞活力的影响

通过MTT法检测3个紫色悬钩子化合物对3T3-L1前脂肪细胞活力的影响。在本实验中，对各个单体化合物分别设了0，1，10，20、50和100μmol/L 6个浓度梯度，每个浓度6个重复，处理3T3-L1前脂肪细胞24h后，利用酶标仪在490nm处进行测定。结果由图25所示，3个紫色悬钩子化合物对细胞的存活率没有明显的毒性作用，并且化合物处理细胞后相对存活率并无明显下降，对细胞的存活率影响较小。在高浓度下1、2和3三个化合物对细胞活力有明显的促进作用(P＜0.05)。根据实验结果，选用20μmol/L作为后续有关3T3-L1前脂肪细胞的活性实验，处理浓度。

2.紫色悬钩子化合物对3T3-L1前脂肪细胞中TC、TG含量的影响

3T3-L1前脂肪细胞通过使用不同的诱导液，8天后分化为成熟脂肪细胞后，对细胞中TC、TG的含量进行定量，分析紫色悬钩子单体化合物对3T3-L1前脂肪细胞脂质积累的影响。本实验中分别设置对照组(未分化组，undiff)，模型组(分化组，diff)和化合物处理组，diff组进行诱导分化，undiff组使用正常培养基培养培养8天；diff组和化合物组在诱导过程中加入相应的药物干预，诱导8天后进行TC和TG含量测定。结果如图25所示，与diff组相比，undiff组细胞中TC和TG的含量都极低(P＜0.05)；给予紫色悬钩子单体化合物处理后，细胞中的TC和TG含量，都有不同程度的升高和降低。与diff组相比，三个化合物都能够显著升高细胞中TC和TG的含量(P＜0.05)。

3.紫色悬钩子单体化合物对3T3-L1脂肪细胞转录因子mRNA表达的影响

在脂肪细胞分化过程中，PPARγ、C/EBPα、SREBP-1c和FABP4等转录因子参与保持成熟脂肪细胞形态和功能。本实验中检测了紫色悬钩子化合物对3T3-L1脂肪细胞转录因子mRNA表达水平的影响。如图26所示，undiff组细胞使用正常培养基培养，没有诱导分化过程，细胞内转录因子PPARγ、C/EBPα、SREBP-1c和FABP4的mRNA表达水平非常低。与undiff组相比，diff组细胞经过诱导分化后成为成熟的脂肪细胞，分化完成后，细胞中的转录因子PPARγ、C/EBPα、SREBP-1c和FABP4的mRNA表达水平显著增加(P＜0.05)。3个紫色悬钩子化合物对细胞进行处理后，与diff组相比，1、3都能够不同程度升高PPARγ、C/EBPα、SREBP-1c和FABP4 mRNA基因的表达，其中3作用最显著(P＜0.05)；2都能够不同程度降低PPARγ、C/EBPα、SREBP-1c和FABP4 mRNA基因的表达，实验结果与TC、TG含量测定结果一致。

脂肪因子的表达会随着3T3-L1前脂肪细胞分化的过程而发生变化，在本实验中发现，紫色悬钩子化合物Fr2-3-2、Fr2-6-1和Fr2-7-1能够有效改善TNFα诱导引起的3T3-L1脂肪细胞产生的胰岛素抵抗，增强细胞对胰岛素的敏感性，初步探讨了紫色悬钩子单体化合物的降糖作用与机制，为进一步对紫色悬钩子植物治疗糖尿病的开发利用提供了更多的科学依据。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。