一种降解木质素的菌株及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种降解木质素的菌株及其应用。

背景技术

我国是农业大国，也是秸秆资源最丰富的国家之一，农作物秸秆资源的科学开发利用，不但可以缓解农村饲料、肥料、燃料和工业原料的紧张状况，又是保护农村生态环境、促进农业可持续协调发展的迫切要求。

秸秆的主要组成成分为纤维素、半纤维素和木质素。木质素虽然占比不高但是对秸秆的保护作用很强，要提高对秸秆的降解速率必须重视首先解除木质素对纤维素和半纤维素的保护作用。

目前常用的木质素处理方法主要包括物理法、化学法、生物法或者是几种方法进行联合处理。虽然这些方法在一定程度上增加了对生物质资源的利用率，但是这些方法在操作过程中仍然有许多弊端。物理法有超声波法、微波辐射、γ射线辐射，主要是通过对木质素内部产生短暂的局部高温、高压和温度的急剧变化，破坏木质素的结构稳定性发生化学反应，但是该法效果不稳定且噪音对环境不利，难以工业化放大应用。化学法是通过一些强酸强碱等破坏木质素中的一些化学键来达到对木质素的降解，但是该法对环境不友好，此外还存在成本高，用完后试剂难以回收等问题存在。而生物法相较于以上两种方法就比较温和而且处理效果也比较好，然而其也存在处理时间长、分解效率较低等问题。

因此，开发有效的木质素降解菌分离方法，筛选降解效率高、发酵周期短的木质素降解菌具有重要意义。

发明内容

发明要解决的问题

生物法对菌种的培养条件要求严格，降解过程比较缓慢，所以现在对生物处理法的研究主要注重在寻找一种有高效降解能力的菌株。

用于解决问题的方案

本发明提供一种棒状杆菌，所述棒状杆菌为假单胞菌(Pseudomonas sp.)MZK-2-7，所述棒状杆菌的保藏号为CCTCC NO:M 20221892，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2022年12月07日，保藏地址为中国武汉，武汉大学。

保藏说明：

保藏号：CCTCC NO:M 20221892；

保藏单位代码：CCTCC-中国典型培养物保藏中心；

保藏日期：2022年12月07日；

保藏地址：中国武汉，武汉大学；

分类命名：Pseudomonas sp.；

保藏状态：存活。

优选地，所述棒状杆菌的16S rDNA基因序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明提供一种上述棒状杆菌的分离筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)取样收集；

(2)菌种分离；

(3)菌种筛选；

(4)菌种鉴定；

(5)菌株培养。

优选地，步骤(2)中木质素培养基的配方为：每升培养基中含有1-4g碱性木素、0.2-2g KH

优选地，步骤(3)中所述筛选是使用PDA-苯胺蓝平板显色进行筛选。

优选地，步骤(5)包括如下步骤：将棒状杆菌接种到培养基，30-60℃发酵培养。

本发明提供一种菌剂，包括上述棒状杆菌和/或所述棒状杆菌的发酵液。

本发明提供上述棒状杆菌在木质素降解中的应用。

本发明提供上述菌剂在木质素降解中的应用。

本发明提供一种利用上述棒状杆菌降解木质素的方法，包括以下步骤：将棒状杆菌接种到含有木质素的培养基，发酵培养。

本发明提供一种利用上述菌剂降解木质素的方法，包括以下步骤：将菌剂接种到含有木质素的培养基，发酵培养。

发明的效果

本发明扩充了木质素降解菌株的菌种库，有利于进一步提高细菌在木质素降解领域的深入应用。假单胞菌MZK-2-7可利用廉价培养基快速稳定生长，发酵周期短，木质素降解效率高。该菌可用于生物法降解秸秆，提高秸秆利用率，有很高的经济价值和生态价值。

附图说明

图1为本发明菌株假单胞菌MZK-2-7的菌落形态图。

图2为本发明菌株假单胞菌MZK-2-7的苯胺蓝平板显色图。

图3为本发明菌株假单胞菌MZK-2-7的16S鉴定电泳图。

图4为本发明菌株假单胞菌MZK-2-7的系统进化树。

图5为本发明菌株假单胞菌MZK-2-7的木质素降解效率。

图6为本发明菌株假单胞菌MZK-2-7的生长曲线。

具体实施方式

为使本发明的技术方案和有益效果能够更加明显易懂，下面通过列举具体实施例的方式进行详细说明。其中，附图不一定是按比例绘制的，局部特征可以被放大或缩小，以更加清楚的显示局部特征的细节；除非另有定义，本文所使用的技术和科学术语与本申请所属的技术领域中的技术和科学术语的含义相同。

本发明提供一种棒状杆菌，所述棒状杆菌为假单胞菌(Pseudomonas sp.)MZK-2-7，所述棒状杆菌的保藏号为CCTCC NO:M 20221892，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2022年12月07日，保藏地址为中国武汉，武汉大学。

在某些实施方式中，所述棒状杆菌的16S rDNA基因序列如SEQ ID NO.1所示。

SEQ ID NO.1

CCGTGGTACCGTCCTCCTTGCGGTTAGACTAGCTACTTCTGGAGCAACCCACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGTGACATTCTGATTCACGATTACTAGCGATTCCGACTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGGACTACGATCGGTTTTATGGGATTAGCTCCACCTCGCGGCTTGGCAACCCTTTGTACCGACCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCTGGCCGTAAGGGCCATGATGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTCCTTAGAGTGCCCACCCGAGGTGCTGGTAACTAAGGACAAGGGTTGCGCTCGTTACGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTGTCAGAGTTCCCGAAGGCACCAATCCATCTCTGGAAAGTTCTCTGCATGTCAAGGCCAGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCATTTGAGTTTTAACCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGTCGACTTATCGCGTTAGCTGCGCCACTAAGATCTCAAGGATCCCAACGGCTAGTCGACATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCACCTCAGTGTCAGTATCAGTCCAGGTGGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTTCCTATATCTACGCATTTCACCGCTACACAGGAAATTCCACCACCCTCTACCGTACTCTAGCTCAGTA

GTTTTGGATGCAATTCCCAGGTTGAGCCCGGGGCTTTCACATCCAACTTGCTGAACCACCTAC

GCGCGCTTTACGCCCAGTAATTCCGATTAACGCTTGCACCCTTCGTATTACCGCGGCTGCTGGC

ACGAAGTTAGCCGGTGCTTATTCTGTTGGTAACGTCAAAACAGCAAGGTATTAACTTACTGCCC

TTCCTCCCAACTTAAAGTGCTTTACAATCCGAAGACCTTCTTCACACACGCGGCATGGCTGGAT

CAGGCTTTCGCCCATTGTCCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGACCGTGTCT

CAGTTCCAGTGTGACTGATCATCCTCTCAGACCAGTTACGGATCGTCGCCTTGGTGGGCCATTA

CCCCACCAACTAGCTAATCCGACCTAGGCTCATCTGATAGCGTGAGGTCCGAAGATCCCCCACT

TTCTCCCGTAGGACGTATGCGGTATTAGCGTTCCTTTCGAAACGTTATCCCCCACTACCAGGCA

GATTCCTAGGCATTACTCACCCGTCCGCCGCTGAATCATGGAGCAAGCTCCACTCATCCGCTCG

ACTTGCATGTGTAG

本发明提供一种上述棒状杆菌的分离筛选方法，包括如下步骤：

(1)取样收集；

(2)菌种分离；

(3)菌种筛选；

(4)菌种鉴定；

(5)菌株培养。

在某些实施方式中，上述分离筛选方法还包括菌株保存。

在某些实施方式中，步骤(2)中木质素培养基的配方为：每升培养基中含有1-4g碱性木素、0.2-2g KH

在某些实施方式中，步骤(2)中木质素培养基的配方为：每升培养基中含有2g碱性木素、0.45g KH

在某些实施方式中，步骤(3)中所述筛选是使用PDA-苯胺蓝平板显色进行筛选。

在某些实施方式中，步骤(5)包括如下步骤：将棒状杆菌接种到培养基，30-60℃发酵培养。

在某些实施方式中，上述棒状杆菌的分离筛选方法，包括如下步骤：

(1)取样

从活牛瘤胃中取新鲜瘤胃液；

(2)菌种分离与筛选

使用木质素筛选平板筛选能够以碱性木素为唯一碳源生长的微生物，再用苯胺蓝平板进一步筛选能够产生透明圈的优势菌株；

(3)菌种鉴定

以27F/1492R为引物进行菌种鉴定，而后进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果正常的PCR产物进行sanger测序。对测序结果进行BLAST分析，并生成系统进化树；

(4)菌株保存

使用木质素筛选液体培养基摇菌，并用10-30％甘油保菌。

本发明提供一种菌剂，包括上述棒状杆菌和/或所述棒状杆菌的发酵液。

本发明提供上述棒状杆菌在木质素降解中的应用。

本发明提供上述菌剂在木质素降解中的应用。

本发明提供一种利用上述棒状杆菌降解木质素的方法，包括以下步骤：将棒状杆菌接种到含有木质素的培养基，发酵培养。

本发明提供一种利用上述菌剂降解木质素的方法，其特征在于，包括以下步骤：将菌剂接种到含有木质素的培养基，发酵培养。

实施例1

(1)取样

从黄山农场的牛身上取新鲜的瘤胃液，取样过程应严格执行无菌操作，避免污染。取得的样品装入无菌玻璃瓶，放置冰盒保存，并在6h内带回实验室进行处理。

(2)菌种分离

将新鲜的瘤胃液用1×盐溶液稀释至10

1×盐溶液的配方为：每升0.45g KH

木质素筛选平板配方为：每升2g碱性木素，每升0.45g KH

微量元素配方为：硼酸300mg/L，六水氯化钴190mg/L，四水氯化锰50mg/L，氯化锌42mg/L，六水氯化镍24mg/L，二水钼酸钠18mg/L，二水氯化铜2mg/L，七水硫酸亚铁1.1g/L。

B12溶液配方为：100mg B12每升。0.22μm过滤除菌，使用前加入。

(3)菌种筛选：PDA-苯胺蓝平板显色筛选

具有漆酶酶活的木质素降解菌可在PDA-苯胺蓝平板上形成透明圈，将已确定菌种的木质素降解菌接种于木质素筛选液体培养基，39℃，150rpm培养48h-72h。在PDA-苯胺蓝平板接种木质素降解菌，每种木质素降解菌进行三次平行实验，接种量为0.5μL，置于28℃培养箱培养。观察过夜培养的上述平板，测量其透明圈直径和菌落直径，计算二者的比值，以此代表菌株的降解活性。

PDA-苯胺蓝平板配方为：去皮土豆200g，水煮30min后滤清液加入葡萄糖10g，酵母粉2.5g，蛋白胨5g，磷酸二氢钾3g，七水硫酸镁1.5g，琼脂15g，定容至1L。再向其中加入0.3g/L苯胺蓝。

(4)菌种鉴定

挑取上述单克隆溶于10μL无菌水中，取2μL菌液为模板，分别以27F/1492R为引物进行PCR，剩下的8μL菌液加入2mL木质素筛选液体培养基中培养。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，选择电泳结果为单一条带且大小正确(27F/1492R：1500bp左右)的样品送测。将测序正常的样品进行序列比对。

引物信息：

PCR反应体系

PCR反应程序

电泳信息：1％的琼脂糖凝胶，120V电压，电泳时间30min。

使用NCBI对返回的序列信息进行BLAST分析，选择Fast Minimum Evolution方法构建系统进化树，相关参数设置为：最大序列差异＝0.75，序列标签为分类名称。

(5)菌株保存

筛选出的菌种用50mL木质素液体培养基摇菌，供后续测定木质素降解效率使用，待菌生长至对数期时，吸取三份750μL菌液加入三支250μL 50％的甘油中，而后置于-80℃冰箱保存。

实施例2

(1)碱性木素降解效率测定

木质素在320nm处有最大吸收峰，通过测定该处的吸光度值，可以计算木质素含量。

将已确定菌种的木质素降解菌甘油菌在木质素和LB液体培养基中摇菌。39℃，150rpm培养48h后测定蛋白浓度。分别按10ug/mL和50ug/mL的蛋白终浓度将假单胞菌MZK-2-7接种到碱性木素液体培养基中，将未接种菌液的碱性木素培养基作为空白对照。39℃，150rpm条件下培养实验组和对照组，每24小时取1mL培养物，12000g离心5min，上清测定木质素吸光度，沉淀用于蛋白浓度测定。将分光光度计预热30min以上，调节波长至320nm，蒸馏水调零。测定刚完成接种时的吸光值作为木质素含量起始值，并记作A0，连续测定培养物吸光值变化，将数据分别记为A1、A2、A3、A4，ΔA1＝A1-A0，ΔA2＝A2-A0，以此类推，可以计算出每天的木质素降解效率。

将实验组的降解效率减去对照组的降解效率，即得MZK-2-7对碱性木素的净降解效率，以该值为纵坐标，培养时间为横坐标，即得MZK-2-7木质素降解效率图(图5)。

(2)Bradford法测定菌体蛋白

取出Bradford染色液平衡至室温，将BSA样品取出，室温解冻。配制一系列BSA蛋白标准品，浓度分别为：0ug/mL、100ug/mL、200ug/mL、300ug/mL、400ug/mL。向假单胞菌MZK-2-7的菌体沉淀加入1mL1M NaOH，并于100℃金属浴加热15min，而后12000g离心10min。标准溶液和待测样品各取25μL加入1.5mL离心管中。各管加入1mL的Bradford工作液，迅速混匀。取样品管中900μL的液体用分光光度计测定A595下的吸光度值。以标准组测定的OD值为纵坐标，对应的蛋白浓度为横坐标，绘制标准曲线。将样品测量的OD值代入标准曲线，计算出样品的蛋白浓度。

用蛋白浓度表示菌株生长情况，以培养天数为横坐标，蛋白浓度为纵坐标绘图，即得MZK-2-7的生长曲线(图6)。

实施例3

1、秸秆降解效率测定

(1)活化菌株

取假单胞菌MZK-2-7斜面菌种一环接种于木质素筛选固体培养基，温度39℃、培养24～48h，得到活化的菌株；

(2)制备菌悬液

将活化的菌株接种于4mL木质素筛选液体培养基中，在温度39℃、200rpm的摇床上培养12～16h，得到过夜菌；取2mL过夜菌接种于100mL的木质素筛选液体培养基中，温度39℃、200rpm摇床上培养1～2天，得到菌悬液；

(3)处理秸秆

将秸秆在温度65℃条件下烘干，粉碎；过筛20目筛，再次温度65℃条件下烘干，得到秸秆粉料；

(4)秸秆降解培养基配制：

秸秆降解培养基配方如下：每升培养基中含有100g秸秆粉(20目)、1.35g KH

准备6个500ml锥形瓶，每个锥形瓶按照上述配方制备150ml发酵培养基，121℃高温灭菌90分钟，冷却至室温后，加入45μL无菌维生素B

(5)接种、培养：

取步骤(2)菌悬液按5％接种比加入(4)中3瓶上述含有秸秆降解培养基的锥形瓶内，剩余3瓶作为对照，上述6个锥形瓶在温度39℃、转速150rpm培养。在预定时间点终止反应，回收降解后的秸秆并置于65℃条件下烘干至恒重。用减重法对降解产物进行检测，降解一周，秸秆的减重率达到27.47％。

2、秸秆中木质素、纤维素、半纤维素含量测定

实验操作步骤、方法、结果评估：

(1)试样制备(参照NY/T 3492规定执行)

切短：将农作物秸秆简单切短，以便于后续烘干和粉碎。

烘干：将洁净的称量盘置于(45±3)℃电热鼓风干燥箱中，烘干3小时后取出，室温环境冷却(20-30℃，相对湿度小于50％，可在干燥器中冷却)。将切短的秸秆置于烘干后的称量盘中，置于(45±3)℃电热鼓风干燥箱中，烘干36小时后，取出冷却至室温。再置于(45±3)℃电热鼓风干燥箱中，烘干1小时后，取出冷却至室温，称量器质量(精确至0.1g)，重复此操作，直至连续称量的质量差不超过样品质量的1％，为便于烘干，样品铺放厚度以不超过10mm为宜。

粉碎与筛分：烘干样品采用切割式粉碎设备进行粉碎，采用850μm的实验筛进行筛分。若存在筛上物，则重复粉碎和筛分。直至全部通过850μm的试验筛。合并所有筛下物，充分混匀。粉碎过程中避免样品过热，粉碎设备应尽可能低速运转以减少粉尘损失。

缩分：将粉碎筛后样品采用堆锥四分法进行缩分，重复缩分过程直至获得分析所需的样品量(不少于50g)。

存储和标识：样品应保存再密封容器中，并应贴有带唯一性标识的样品种类等信息的标签

(2)抽提

水抽提：称取约3g试样(精确至0.1mg)于已称重的滤纸筒中，将滤纸筒放入索氏提取器的抽提筒内，连接至已干燥至恒重的接受瓶，由抽提器冷凝管上端加入190mL水，于电热套上加热，使水不断回流抽提(4次/h-5次/h)，一般抽提6-8h，抽提完成后，关闭加热套，将索氏提取器冷却至室温。

乙醇抽提；将水抽提后的抽屉筒连接至已经干燥至恒重的接收瓶，由抽提器冷凝管上端加入190mL乙醇，于电热套上加热，使乙醇不断回流抽提(6-10次/h)，一般抽提16-24h。抽提完成后，关闭加热套，将索氏提取器冷却至室温。将经两步抽提后的生物质试样(即不含抽提物试样)在45±3℃干燥箱中干燥至恒重，称量试样质量精确至0.1mg。

(3)两步酸法水解

坩埚恒重：将玻璃砂芯坩埚(G4)置于马弗炉中，在575±25℃下灼烧至恒重。将坩埚从马弗炉中取出后放入干燥器冷却，称量质量精确至0.1mg。

浓酸水解：称取300.0mg(精确至0.1mg)不含抽提物试样至耐压管，每个试样做2次以上平行实验。向耐压管中加入3.00mL 72％硫酸溶液后立即混合均匀。将耐压管放入30±3℃的水浴中，5-10min搅拌一次。恒温60min后取出，向耐压管中加入84.00mL水，拧紧盖子混匀。

糖回收率：配制计算回收率的糖标准溶液，包括D(+)葡萄糖，D(+)木糖，D(+)半乳糖，L(+)阿拉伯糖，L(+)甘露糖。糖回收标准溶液的浓度应该与检测试样的糖浓度接近。称量每种糖的质量精确至0.1mg，加入10.0mL水再加入348μL72％硫酸溶液，拧紧盖子混匀。用微孔过滤器过滤，分装至样品瓶中，冷冻储存。使用时解冻并摇匀。

稀酸水解：将装有试样和糖回收标准溶液的耐压试管放入高压蒸汽灭菌器中，121℃水解1小时。待水解产物冷却至室温，通过玻璃砂芯坩埚(G4)进行过滤，用锥形瓶收集滤液约50mL，转移至具塞容器0-4℃储藏。于6小时内进行酸溶木质素的测定。

(4)测定

酸溶木质素：使用上述过滤后的稀酸水解溶液，用紫外-可见光分光光度计在320nm测定液体试样的吸光值。用水坐紫外-可见光光度计空白，用水稀释至吸光度为0.7-1.0。记录稀释倍数，记录吸光值精确到0.001。

酸不溶木质素：用大于50mL的热水冲洗100mL具塞耐压试管中残留的酸不溶残渣，使残渣全部保留在玻璃芯坩埚中(G4)，并用真空过滤器抽干。在105±3℃烘干玻璃芯坩埚(G4)和酸不容残障至恒重，记录玻璃芯坩埚和酸不溶残渣质量，精确至0.1mg。将玻璃芯坩埚(G4)以及酸不溶残渣置于马弗炉中(575±25)℃灼烧至少3小时，直至所有有机物被灰化。升温速率控制在10℃/min，以防止试样燃烧以及强气流引起的试样机械损失。灰化后降温至105℃，取出放入干燥器冷却。称坩埚和灰分质量精确至0.1mg。

碳水化合物：色谱条件

标准曲线的绘制：参照下表中建议的浓度范围准备D-纤维二糖，D(+)葡萄糖，D(+)木糖的混合便准溶液，使用五点校正法。分别吸取10μL标准溶液注入高效液相色谱仪，在上述的色谱条件下测定标准溶液的响应值(峰面积)，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

糖标准溶液的建议质量浓度范围如下：

试样溶液测定：取10mL上述过滤后的稀酸水解溶液于50mL离心管中，缓慢加入碳酸钙1g将水解液中和至pH5-6。混合液5000g，10min离心，将上清液用0.22um微孔过滤后进行高效液相色谱分析。计算各种糖的含量。如试样中的纤维二糖含量高于3mg/mL说明水解作用不完全，在纤维二糖之前有峰存在，表明试样中糖发生了过度水解。

(5)结果计算

①酸溶木质素含量

试样中的酸溶木质素含量ASL，以质量百分数(％)表示，按下式计算。

式中：ASL---试样中酸溶木质素含量，单位为质量百分数(％)；

--滤液在320nm处的紫外-可见吸光值平均值；

V---滤液体积，取值为87mL；

N---滤液稀释倍数；

L---比色皿厚度，单位为厘米(cm)；

ε---酸溶木质素在320nm处吸收率，玉米秸秆取30L/(g.cm)，其他原料取25L/(g.cm)；

w

w

w

②酸不溶木质素含量

试样中的酸不溶木质素含量AIL，以质量百分数(％)表示，按下式计算

式中：AIL---试样中酸不溶木质素含量，单位为质量百分数(％)；

m

m

m

③木质素含量

试样中的总木质素含量Lig，以质量百分数(％)表示，按下式计算

Lig＝ASL+AIL

式中：Lig---试样中总木质素含量，单位为质量百分数(％)；

ASL---试样中酸溶木质素含量，单位为质量百分数(％)；

AIL---试样中酸不溶木质素含量，单位为质量百分数(％)。

④纤维素含量和半纤维素含量

按照如下公式计算糖回收率：

其中C

测定葡萄糖和木糖的质量Z

其中C

F：为脱水校正因子，木糖和阿拉伯糖用0.88，葡萄糖，半乳糖和甘露糖用0.9校正。

V：稀酸消化后的体积，87mL。

W

R

W

W

纤维素的含量：Cel＝Z葡萄糖

Z葡萄糖：试样中葡萄糖的含量，单位为质量百分数(％)。

半纤维素的含量：Hem＝Z木糖

Z木糖：为试样中木糖的含量，单位为质量百分数(％)

降解效率见表1，本发明菌株假单胞菌MZK-2-7短时间内高效降解秸秆中的木质素，而纤维素和半纤维素降解率低，效率高，特异性高。

表1本发明菌株假单胞菌MZK-2-7的秸秆降解效率

应当理解，以上实施例均为示例性的，不用于包含权利要求所包含的所有可能的实施方式。在不脱离本公开的范围的情况下，还可以在以上实施例的基础上做出各种变形和改变。同样的，也可以对以上实施例的各个技术特征进行任意组合，以形成可能没有被明确描述的本发明的另外的实施例。因此，上述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，不对本发明专利的保护范围进行限制。