一种马来酰亚胺基己酸-PEGn类似物的linker化合物的合成方法

技术领域

本发明主要涉及ADC药物技术领域，具体涉及一种马来酰亚胺基己酸-PEGn类似物的linker化合物的合成方法。

背景技术

ADC领域百花争鸣，新技术更新迭代如滚滚洪流带着生物医药开启飞奔模式，这是一个最好的时代。早在20世纪初，PaulEhrlich就首先提出了“魔法子弹”的概念，可第一个ADC药物Mylotarg(gemtuzumab ozogamicin)在将近百年后才获批上市，谁无暴风劲雨时，守得云开见月明，截至2022年7月全球共有14款ADC药物获批用于血液系统恶性肿瘤和实体瘤，此外，目前还有100多个ADC候选者处于临床试验的不同阶段。随着靶点和适应症的不断扩大，ADC正在引领癌症靶向治疗的新时代，有望改变未来靶向药物治疗格局。

ADC药物是采用特定的连接子将抗体和小分子细胞毒药物连接起来，其主要组成成分包括抗体、连接子(Linker)和小分子细胞毒药物(smallmolecular cytotoxic drug，SM)。抗体分子主要发挥靶向投递作用，小分子药物发挥效应。但有些抗体同时存在抗肿瘤的药效学作用，如Kadcyla中阿多曲妥珠单抗(ado-trastuzumab)和美坦新(maitansine)(美登素)存在协同作用。

由于ADC药物结构较为复杂，且不同ADC药物设计之间存在较大的差异。即使同一靶点的不同药物，由于识别位点、连接位点、连接子及所连接小分子的不同，其毒性的差异显而易见。因此，评价ADC药物毒性之前，先要了解该ADC药物的设计。理想的ADC药物设计需要考虑①抗体的选择：靶点清晰、肿瘤细胞高表达，正常组织低表达；支持药物加载、稳定、能向细胞内化；良好的PK特性；非特异性结合少；②连接位点：一般有赖氨酸或半胱氨酸残基，可改构进行定向偶联；③连接子：在循环中稳定，在细胞内能被释放(如在溶酶体内酶切释放，或抗体降解后释放)；④细胞毒药物：高度的药效学作用，无免疫原性，通过修饰能与连接子结合，机制清晰。

PROTAC linker将E3泛素连接酶配体与靶蛋白配体连接起来，其中linker的设计与选择对于PROTAC分子的成药性非常重要。Linker的类型、长度和连接位点会影响PROTAC的结构刚性、疏水性和溶解性等，从而影响三元复合物的形成及最终的降解活性。PEG是PROTAC开发中最常用的linker，据统计，在已报道的PROTAC分子中有54％使用了PEG作为linker[2]。PEG linker在PROTAC中的作用：1.PEG的引入可以增加PROTAC分子的水溶性，影响细胞渗透性，从而影响口服吸收。2.通过使用不同链长的PEG可轻松实现对linker长度系统性的改变，影响PROTAC分子的降解效率。3.使用各种双官能化的PEG linker，能够简单、快速地组装具有不同连接基团的分子，加速筛选得到有效的降解结构。

相较于传统的小分子抑制剂，PROTAC技术在活性、选择性、靶向“不可成药”蛋白、克服耐药性及用药途径等方面更有优势，近年来发展迅速，已成为新药研发中的一大利器。

我公司合成一类马来酰亚胺基己酸-PEGn类似物的linker化合物：马来酰亚胺基己酸-PEG3-乙酸-Lys(Boc)-OH，其中由苏州博瑞生物医药发明的CD44靶向多臂偶联物用到了linker，这种linker具有较好的水溶性，使用这种linker修饰可以提高偶联物的水溶性，从而提高载药量，减少药物副作用，提高偶联物的生物利用度；相对于未使用该linker修饰的偶联物，能够是使偶联物产生更强的作用，在人体或其他动物组织内更加富集；使用该马来酰亚胺基己酸-PEGn类似物的linker化合物的偶联物多用于治疗癌症的药物的应用，包括卵巢癌、乳腺癌、肺癌、子宫内膜癌、脑瘤、胃癌等。

目前公布的专利CN109771658A中用到了叠氮化钠大大增加实验危险性和产品毒性，且进行了柱层析纯化，很难实现规模化的生产。

发明内容

本发明的目的在于提供一种马来酰亚胺基己酸-PEGn类似物的linker化合物的合成方法，解决现有技术中马来酰亚胺基己酸-PEGn类似物的linker化合物生产危险性和产品毒性难以解决的技术问题。

本发明公开了一种马来酰亚胺基己酸-PEGn类似物的linker化合物的合成方法，

进一步的，所述S1中，Cbz-PEG

进一步的，所述第一缩合剂选自N,N'-二异丙基碳二亚胺、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳酰二亚胺盐酸盐、N,N'-二环己基碳二亚胺，2-琥珀酰亚胺基-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸酯中的任意一种；更优选为1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳酰二亚胺盐酸盐。

进一步的，所述S1中反应溶剂选自乙酸乙酯、二氯甲烷、四氢呋喃、甲苯、乙腈、DMF、二氯甲烷、氯仿中的任意一种或几种任意比例的混合物；更优选为乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷；进一步优选为二氯甲烷。

进一步的，所述第一缩合剂为1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳酰二亚胺盐酸盐时，所述Cbz-PEG

进一步的，所述S1中缩合反应的温度为-10～30℃，更优选为15℃。

进一步的，所述S1反应时间为4～10h，更优选为6h。

进一步的，所述S2中加入碱进行偶联，所述碱选自碳酸氢钠、碳酸氢钾、N,N-二异丙基乙胺、三乙胺、N-甲基吗啉，吡啶中的任意一种；更优选为N,N-二异丙基乙胺、三乙胺、吡啶，N-甲基吗啉；进一步优选为三乙胺。

进一步的，中间体1、H-Lys(Boc)-OH、碱的摩尔比为1：0.9～1.3：1～1.5，更优选为1：1.1：1.1。

进一步的，所述S2中使用的溶剂选自乙酸乙酯、二氯甲烷、四氢味喃、甲苯、乙腈、DMF、二氯甲烷、氯仿、甲醇、乙醇、水中的任意一种或几种任意比例的混合物；更优选为二氯甲烷、DMF、甲醇；进一步优选为DMF。

进一步的，所述S2中缩合反应的温度为0～40℃，更优选为20℃。

进一步的，所述S2反应时间为6～10h，更优选为8h。

进一步的，所述S4中使用第二缩合剂进行缩合，所述第二缩合剂选自N,N'-二异丙基碳二亚胺、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳酰二亚胺盐酸盐、N,N'-二环己基碳二亚胺，2-琥珀酰亚胺基-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸酯中的任意一种；更优选为1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳酰二亚胺盐酸盐。

进一步的，所述S4中采用的溶剂为乙酸乙酯、二氯甲烷、四氢味喃、甲苯、乙腈、DMF、二氯甲烷、氯仿、甲醇、乙醇、水中的任意一种或几种任意比例的混合物，更优选为二氯甲烷/甲醇、DMF/甲醇、四氢呋喃/甲醇；进一步优选为二氯甲烷/甲醇。

进一步的，所述S5中中间体3与中间体4加入碱进行偶联，所述碱选自碳酸氢钠、碳酸氢钾、N,N-二异丙基乙胺、三乙胺、N-甲基吗啉、吡啶；更优选为N,N-二异丙基乙胺、三乙胺、吡啶；进一步优选为三乙胺。

进一步的，所述中间体3、中间体4、碱摩尔比为1：0.8～1.0：1.5～2.5，更优选为1：0.9：2.0。

进一步的，所述S5中采用的有机溶剂为乙酸乙酯、二氯甲烷、四氢味喃、甲苯、乙腈、DMF、二氯甲烷、氯仿、甲醇、乙醇、水中的任意一种或几种任意比例的混合物；更优选为二氯甲烷、DMF、四氢呋喃，进一步优选为二氯甲烷。

进一步的，所述步骤S1-S5中，每个步骤还包括纯化目标化合物的步骤。

与现有技术相比，本发明具有的有益效果是：

1.本发明的合成方法工艺条件温和，不存在高温或超低温，大大降低了生产的危险性；

2.本发明在整在涉及到的缩合反应中未使用DCC，DIC；不会产生其副产物DCU，DIU等基因毒性杂质，采用EDC.HCL及产生的副产物EDCU，其亲水性较好，很容除去，大大提高了的安全性。

附图说明

图1为本发明中间体2的HPLC图；

图2为本发明中间体4的HPLC图；

图3为本发明马来酰亚胺-PEG类似物linker化合物的HPLC图；

图4为本发明马来酰亚胺-PEG类似物linker化合物的HNMR图；

附图5为马来酰亚胺-PEG类似物linker化合物粗品的HPLC图。

具体实施方式

为使本发明实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施方式，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。

实施例1

一种马来酰亚胺基己酸-PEGn类似物的linker化合物的合成方法，将原料10.00gCbz-NH-PEG3-乙酸(29.32mmol)加入250ml反应瓶中，加入50ml乙腈，在加入4.05gHOSu(35.19mmol)，控温15℃缓慢加入6.18gEDC.HCL(32.25mmol)，加毕，保温反应6h，TLC点板观察，反应完全；经加水淬灭，加入乙酸乙酯萃取，有机相经水洗涤，收集有机相，干燥，浓缩至干，得到中间体1 11.61g，收率92％；

将10g中间体1(25.4mmol)加入250ml反应瓶中，加入二氯甲烷30ml甲醇20ml，在加入6.87g H-Lys(Boc)-OH(26.01mmol)，控温20℃缓慢加入2.83g三乙胺(27.94mmol)，加毕，保温反应8h，TLC点板观察，反应完全；反应产物经加水淬灭，并用稀盐酸水溶液调节pH＝4～5，优选4N HCL，加入乙酸乙酯萃取，有机相经水洗涤，收集有机相，干燥，浓缩至干，加入乙酸乙酯降温结晶，抽滤得固体，烘干得中间体2 13.51g，收率93.5％，纯度98.86％；

将10g中间体2(17.57mmol)加入250ml反应瓶中，加入甲醇50ml，1g钯碳，加毕，室温反应，TLC点板观察，反应完全；反应产物经过滤，浓缩至干，得到中间体3 7.5g，收率98％；

将原料10g原料马来酰亚氨基己酸(47.39mmol)加入250ml反应瓶中，加入50ml二氯甲烷，20ml甲醇，再加入6g HOSu(52.13mmol)，控温15℃缓慢加入10g EDC.HCL(52.12mmol)，加毕，保温反应6h，TLC点板观察，反应完全；经过水洗干燥，过滤，浓缩，得到中间体4 14.2g,收率97％，纯度98.3％附图1；

将10g中间体3(22.99mmol)加入250ml反应瓶中，加入二氯甲烷50ml，在加入6.37g中间体4(20.69mmol)，控温20℃缓慢加入4.65g三乙胺(45.98mmol)，加毕，保温反应5h，TLC点板观察，反应完全；反应物经加水淬灭，并用稀盐酸水溶液调节pH＝4～5，优选4N HCL，加入乙酸乙酯萃取，有机相经水洗涤，收集有机相，干燥，浓缩至干，加入乙酸乙酯降温结晶，抽滤得固体，烘干得马来酰亚胺基己酸-PEG

实施例2

本实施例以中间体1、H-Lys(Boc)-OH为标准底物，在实施例1的基础上改变仅为步骤S2中使用的碱不同，结果如下表所示：

表1

其中“-”表示产率无效；由上表可知，当溶剂为二氯甲烷，使用三乙胺作反应用碱的收率和纯度均高于其他碱，故最优选为三乙胺。

实施例3

本实施例以马来酰亚氨基己酸、HOSU为标准底物，在实施例1的基础上改变仅为使用的第二缩合剂不同，结果如下表所示：

表2

其中“-”表示产率无效；由上表可知，当溶剂为二氯甲烷/甲醇，不能生成本发明的中间体4；使用DCC、DIC均有基因毒性，且使用EDCI产率及纯度均比较高，故最优选缩合剂为EDCI。

实施例4

本实施例以中间体3、中间体4为标准底物，在实施例1的基础上改变仅为步骤S5中使用的碱不同，结果如下表所示：

表3

其中“-”表示产率无效；由上表可知，当溶剂为二氯甲烷，使用三乙胺作反应用碱的收率和纯度均高于其他碱，故最优选为三乙胺。。

以上即为本实施例列举的实施方式，但本实施例不局限于上述可选的实施方式，本领域技术人员可根据上述方式相互任意组合得到其他多种实施方式，任何人在本实施例的启示下都可得出其他各种形式的实施方式。上述具体实施方式不应理解成对本实施例的保护范围的限制，本实施例的保护范围应当以权利要求书中界定的为准，并且说明书可以用于解释权利要求书。