一种神经细胞的制备方法

技术领域

本发明涉及神经细胞制备技术领域，尤其涉及一种神经细胞的制备方法。

背景技术

神经细胞(neural cell)是脑组织的主要细胞成分，可通过体外培养获得。体外培养的神经细胞具有以下优点：(1)能够实现快速体外扩增，满足移植所需的细胞数量；(2)可作为“治疗性基因”的载体，对损伤或病变部位施行基因治疗，以实现外源性治疗基因的准确定位，高效表达；(3)用于移植与宿主发生的排斥反应较小，有利于移植神经细胞长期成活并与宿主细胞更好的融合。

干细胞是一种具有自我更新能力和多种分化潜能的细胞，是一种独特的生物资源。应用明确的定向诱导剂可以诱导干细胞分化成为多种类型的功能细胞，进而进行细胞移植治疗或者相关药物的筛选。干细胞分化为神经细胞可用于神经系统疾病的机制研究、细胞移植治疗和神经系统治疗药物的筛选等，具有潜在的社会和经济价值。

现有技术中公开了某些干细胞的神经诱导方法，例如中国专利CN109136187A公开了一种人颅骨间充质干细胞诱导分化神经细胞的方法，该方法采用多种细胞因子作为诱导剂，但实际生产中，由于细胞因子有一定的剂量相关毒性、免疫原性弱、半衰期短且较为昂贵等缺点，限制了相关神经细胞制备方法的应用；再如CN107326013A公开了定向诱导hiPSC分化后的神经细胞体系、诱导方法及应用，但是其中包括将hiPSC与骨髓基质细胞HS5共培养的步骤，容易收到污染。

并且上述方法中的干细胞定向诱导能力均较差、干细胞的神经定向分化的程度也较低。

发明内容

本发明的目的在于提供一种神经细胞的制备方法，以解决现有技术中干细胞的神经诱导方法存在的定向诱导能力较差、分化程度较低、且容易受到污染的问题。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种神经细胞的制备方法，包括以下步骤：

S1、将干细胞与诱导剂混合，初步培养1~5d，得到细胞混合物；

S2、将细胞混合物、牛磺酸和丙氨酰-L谷氨酰胺混合，诱导培养2~8d，得到神经细胞；

所述诱导剂中包括终体积浓度为1.5~2.5%的脑脊液；

所述诱导剂中包括B-27添加剂。

优选的，所述牛磺酸的终浓度为10~20mM。

优选的，所述丙氨酰-L谷氨酰胺的终浓度为100~200mM。

优选的，所述神经细胞为神经元和/或星型胶质细胞。

优选的，所述初步培养采用间充质干细胞无血清基础培养基作为基础培养基。

优选的，所述诱导培养采用Neurobasal-A培养基作为基础培养基。

优选的，所述干细胞为宫内膜干细胞。

优选的，所述宫内膜干细胞为第2~5代的子代宫内膜干细胞。

优选的，所述干细胞的接种密度为5×10

优选的，所述S1~S2采用的培养参数独立的为：温度36~38℃、CO

本发明的技术效果和优点：

本发明通过特定的分级诱导方式，诱导过程中结合脑脊液、B-27添加剂、牛磺酸和丙氨酰-L谷氨酰胺作为添加剂，能够提高干细胞的诱导分化能力，成功诱导得到神经细胞，诱导率较高。本发明的制备方法不需要其他细胞来辅助分化，所获取的神经细胞不会受到其他细胞来源的“污染”，更符合临床应用所需。

附图说明

图1为NSE阳性细胞的免疫染色结果图，其中褐色细胞为NSE阳性表达的细胞；

图2为GFAP阳性细胞的免疫染色结果图，其中褐色细胞为GFAP阳性表达的细胞。

具体实施方式

本发明提供了一种神经细胞的制备方法，包括以下步骤：

S1、将干细胞与诱导剂混合，初步培养1~5d，得到细胞混合物；

S2、将细胞混合物、牛磺酸和丙氨酰-L谷氨酰胺混合，诱导培养2~8d，得到神经细胞。

在本发明中，所述干细胞优选为宫内膜干细胞，所述宫内膜干细胞优选为第2~5代的子代宫内膜干细胞，所述干细胞的接种密度优选为5×10

本发明中，通过特定浓度的B-27和脑脊液复配使用，能为干细胞的诱导分裂生长全方位补充营养成分，使得干细胞能在体外快速分化增殖，克服了干细胞体外培养不定向分化导致不能满足后期诱导分化为特定细胞的缺点，在本发明提供的浓度范围中能够发挥最佳效果。

在本发明中，将细胞混合物、牛磺酸和丙氨酰-L谷氨酰胺混合，诱导培养2~8d，得到神经细胞，所述牛磺酸的终浓度为10~20mM，优选为13~17mM，所述诱导培养优选采用Neurobasal-A培养基作为基础培养基，所述丙氨酰-L谷氨酰胺的终浓度为100~200mM，优选为130~170mM；所述S2采用的培养参数优选为：温度36~38℃、CO

本发明中的步骤S2为干细胞的进一步增殖和分化提供了所需的氨基酸和功能诱导途径，进一步提升了干细胞的定向诱导效果，能够得到更多的神经细胞。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例中用到的试剂购买来源：

①脑脊液于无菌条件下取自神经外科脑室-腹腔分流术中或无菌条件下腰椎穿刺术中，脑积水清亮脑脊液6例(外伤后交通性脑积水患者，伤后一至三个月左右采集，脑脊液细胞数正常，蛋白<0.5g/L，患者均知晓并自愿参与实验)，标本量约5-10mL/例，立即分装置于无菌小瓶中，封口后置于4℃冰箱不超过24小时，或-20℃冰箱不超过一周；

②L-丙氨酰-L谷氨酰：购买于湖北泓肽生物科技有限公司，CNA号：39537-23-0；

③B-27（母液浓度为50×）：购买于博奥派克生物，货号：60705ES10；

④牛磺酸：购买于MCE公司（全称MedChemExpress），货号：107-35-7；

⑤MSC NutriStem® XF Medium（含MSC NutriStem® XF Supplement）：购买于BI公司，MSC NutriStem® XF Medium的货号：05-200-1B；MSC NutriStem® XF Supplement的货号：05-201-1-06；

⑥Neurobasal®-A培养基：购买于Gibco公司，货号：10888-022；

⑦宫内膜干细胞分离和扩增培养：

A：使用体积分数75%乙醇擦拭采集管外壁；

B：吸取7mL样本密度分离液，加入15mL离心管中，然后沿管壁缓慢加入7mL经血样本（含收集液），置于水平转子离心机中，4℃、1800rpm离心25min；

C：离心完毕后，取中间白膜层转入新的50mL离心管中，加入生理盐水重悬，所抽取白膜层与生理盐水体积比例为1:2，1500rpm离心5min；洗涤2次；

D：将白膜层离心后的沉淀加入MenSCs原代完全培养基，吹打均匀，均匀接种至T75培养瓶中，每瓶12mL；

E：将细胞培养瓶水平置于37℃、含体积分数5%CO

F：培养48h后，全量换液，吸去旧培养基，去除未贴壁组织及细胞，添加新鲜MenSCs原代完全培养基，每3天观察并换液；

G：待细胞融合度达到80~90%，即可进行消化传代，去除上清，用生理盐水清洗细胞2遍，加入0.125mg/mL的胰酶，消化2min；细胞变圆皱缩即可终止消化，收集细胞，1500rpm离心5min；弃上清，添加新鲜MenSCs原代完全培养基，每3天观察并换液；

H：重复传代操作，直至获取P2-P5细胞。

实施例1

诱导培养基①：MSC NutriStem® XF Medium添加MSC NutriStem® XFSupplement（配套的完全培养基）作为基础培养基；添加脑脊液，终浓度为2%；添加浓度为50×的B-27，终浓度为2×。

诱导培养基②：Neurobasal®-A培养基作为基础培养基；添加L-丙氨酰-L谷氨酰胺，终浓度为150mM；添加牛磺酸，终浓度为15mM。

将P2代宫内膜干细胞用诱导培养基①重悬，调整密度为1×10

实施例2

诱导培养基①：MSC NutriStem® XF Medium添加MSC NutriStem® XFSupplement（配套的完全培养基）作为基础培养基；添加脑脊液，终浓度为1%；添加浓度为50×的B-27，终浓度为2×。

诱导培养基②：Neurobasal®-A培养基作为基础培养基；添加L-丙氨酰-L谷氨酰胺，终浓度为100mM；添加牛磺酸，终浓度为10mM。

将P2代宫内膜干细胞用诱导培养基①重悬，调整密度为5×10

实施例3

诱导培养基①：MSC NutriStem® XF Medium添加MSC NutriStem® XFSupplement（配套的完全培养基）作为基础培养基；添加脑脊液，终浓度为3%；添加浓度为50×的B-27，终浓度为2×。

诱导培养基②：Neurobasal®-A培养基作为基础培养基；添加L-丙氨酰-L谷氨酰胺，终浓度为200mM；添加牛磺酸，终浓度为20mM。

将P2代宫内膜干细胞用诱导培养基①重悬，调整密度为5×10

对比例1

配置培养基：DMEM基础培养基+10%FBS+20ng/mL碱性成纤维因子（bFGF）和20ng/mL表皮生长因子（EGF），在37℃、5%CO

实验例1

将实施例1和对比例1中含有分化细胞的盖玻片取出，用SP组织化学染色试剂盒分别检测NSE、GFAP是否在分化细胞中表达；免疫细胞化学染色阳性为棕褐色，阴性对照不着色，NSE阳性表达的细胞代表神经元，GFAP阳性表达细胞代表星型胶质细胞（由于少突胶质细胞因在分化产物中所占比例很少，未进行免疫染色）。苏木精复染核呈蓝色的细胞代表总细胞数，结果如图1~2所示。

倒置相差显微镜下随机选择五个独立高倍视野计数阳性细胞及总细胞数，计算各系细胞比例并求其平均数，至少独立实验四次。残留在神经球中的神经干细胞因聚合密集，难以计数，排除在外，结果如表1所示：

表1 分化率计算结果

*表示P<0.05，与实施例相比，显著性差异。

从上表可知，通过本发明培养出来的细胞，其NSE和GFAP阳性细胞的分化率为36.6%、68.1%；明显高于对比例的24.84%、59.03%；均具有显著性差异，说明了本发明提供的制备方法具有更高更精准的神经细胞诱导能力。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。