一种使用花瓣分泌表皮细胞油面积预测玫瑰精油含量的方法

技术领域

本发明涉及一种使用花瓣分泌表皮细胞油面积预测玫瑰精油含量的方法，属于植物资源评价技术领域。

背景技术

玫瑰（

植物的表皮细胞是生长在植物表面的第一层细胞，它们具有保护植物的功能，其中一部分细胞可以分泌精油等次生代谢物， 称为表皮分泌细胞，其与精油的关系研究对于深入了解精油的成分合成机制具有重要的意义。表皮分泌细胞分泌精油的过程受到多种因素的影响，包括植物的基因、生长环境、气候等因素。例如，松节油是由松树松节上的特化细胞分泌出来的。薄荷精油是由下表皮细胞合成，并在上表皮细胞中储存，再由薄荷叶片、茎和花序的表皮分泌细胞分泌出主要挥发性成分（薄荷醇等），因此薄荷精油的产生与薄荷叶片的表皮分泌细胞密切相关。薰衣草花瓣表皮分泌细胞含有大量合成和调节精油成分的细胞器和内含物，其细胞数量与精油含量呈正相关。香蕉的精油主要由挥发性化合物和类黄酮等物质组成，主要分布在香蕉的果皮和果肉中的油细胞内，其油细胞的数量和大小与香蕉的品种和生长环境密切相关。玫瑰花瓣表皮分泌细胞是植物挥发油合成的主要场所，表皮分泌细胞的数量、形态大小、分布部位和细胞器组成都可能对精油的成分和含量产生影响。

不同玫瑰品种，其精油含量存在明显差异，精油含量的多少常使用提取方法进行提取，包括水蒸气蒸馏法、溶剂提取法、压榨法和超声波提取法等。然而，玫瑰精油的出油率较低，常需要采摘大量的玫瑰鲜花作为原料，因而精油提取法不适用于新培育或者个体数量较少的玫瑰品种精油含量的判定。本发明通过不同品种玫瑰花瓣表皮分泌细胞油面积与玫瑰精油含量之间的关系，建立一种使用玫瑰花瓣分泌表皮细胞油面积预测玫瑰精油含量的方法，为快速筛选高精油含量的玫瑰种质提供技术手段，为玫瑰高出油率的种质资源的快速早期选择奠定基础。

发明内容

本发明的目的是为了针对上述现有技术中存在的问题，通过玫瑰花瓣分泌表皮细胞油面积与玫瑰精油含量的相关关系，建立一种快速筛选高精油含量的玫瑰种质的技术方法，能够用于玫瑰高出油率的种质资源的快速早期选择，具体为使用花瓣分泌表皮细胞油面积预测玫瑰精油含量的方法。

为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：一种使用花瓣分泌表皮细胞油面积预测玫瑰精油含量的方法，其特征是，包括以下步骤：

（1）花瓣包埋；选择盛花期玫瑰花朵，选取由外向内的第三轮玫瑰花瓣，将玫瑰花瓣中部切成长宽为1mm×1mm的组织小块，得到花瓣样品，立即将花瓣样品放入盛有4%多聚甲醛溶液（0.1 mol/ L，pH7.2 PBS配制）的小离心管中，抽真空直至花瓣样品下沉，置于室温下1h，吸去多聚甲醛固定液，加入2.5%的戊二醛固定液（0.1 mol/ L，Ph 7.2 PBS配制），置于室温下2 h，弃戊二醛固定液，用0.1M PBS清洗3-4次，每次停留15-20 min，弃0.1 MPBS，再加入1 %锇酸（0.2 mol/ L，pH7.2 PBS配制）后固定3-4 h，弃锇酸固定液，0.1M PBS清洗3-4次，每次停留15-20 min，吸去缓冲液，系列乙醇逐级脱水；100%丙酮和树脂过渡，Spurr树脂浸透、包埋、聚合；得到花瓣包埋块；

（2）半薄切片的制备；将经步骤（1）制得的花瓣包埋块用超薄切片机切成厚度为1mm的半薄切片，将载玻片放置于多功能热台上并滴上蒸馏水再将半薄切片放置载玻片上，待半薄切片水分蒸发消失；

（3）染色与定位；先用甲苯胺蓝将经步骤（2）获得的半薄切片染色，然后通过电镜观察找到上表皮分泌细胞，并去掉其他组织部分；

（4）超薄切片的制备与观察；将步骤（3）中已经染色定位好的玫瑰花瓣的花瓣包埋块用超薄切片机切成厚度为50 nm的超薄切片，然后再用醋酸双氧铀、硝酸铅双重染色后用透射电镜观察并拍照；

（5）计算表皮分泌细胞内油面积；采用AutoCAD软件勾选经步骤（4）拍照获得的表皮分泌细胞中黑色油面积区域，并计算花瓣表皮分泌细胞内的油面积；

（6）预测玫瑰精油含量；根据油面积与出油量的关系，即y=0.0018x+0.0829，使用上述经步骤（5）计算的油面积大小换算玫瑰品种的出油量。

本发明方法先进科学，通过对19种玫瑰分泌细胞内油面积和出油率相关性分析发现，玫瑰的出油量（y，ul/g）和细胞内油面积(x，mm

在方法上，选择盛花期花朵，选取由外向内的第三轮花瓣，从花瓣中部切片，切成长宽为1mm×1mm的组织小块。将制得的花瓣包埋块用超薄切片机切成厚度为1 mm的半薄切片。用甲苯胺蓝将获得的花瓣半薄切片染色，然后通过电镜观察找到上表皮分泌细胞，并去掉其他组织部分。将已经染色定位好的玫瑰花瓣的包埋块用超薄切片机切成厚度为50 nm的超薄切片，然后再用醋酸双氧铀、硝酸铅双重染色。计算表皮分泌细胞内油面积时，需选择多个分泌细胞样本，减少计算结果的偏差。

本发明主要通过花瓣的固定与包埋，制定花瓣的半薄切片，染色后制备超薄切片，然后通过透射电镜观察对表皮分泌细胞观察并拍照，基于图片计算表皮分泌细胞内油面积，最后根据油面积与出油量的关系换算玫瑰品种的出油量。本发明技术方案提供的通过花瓣表皮分泌细胞内油面积大小及其与出油量的关系判定玫瑰品种的出油量，能够在仅有少量玫瑰植株甚至仅有单株的条件下用于玫瑰高出油率的种质资源的快速选择。

附图说明

图1是丰花玫瑰花瓣上表皮分泌细胞横切图及油滴在细胞中的分布；

图2是玫瑰不同品种分泌细胞内油面积与出油量；

图3是油面积与出油量的线性拟合。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。

一种使用花瓣分泌表皮细胞油面积预测玫瑰精油含量的方法，包括以下步骤：

（1）花瓣包埋；选择盛花期玫瑰花朵，选取由外向内的第三轮玫瑰花瓣，从玫瑰花瓣中部切片，切成长宽为1mm×1mm的组织小块，得到花瓣样品，立即将花瓣样品放入盛有4%多聚甲醛溶液（0.1 mol/ L，pH7.2 PBS配制）的小离心管中，抽真空直至花瓣样品下沉，置于室温下1h，吸去多聚甲醛固定液，加入2.5%的戊二醛固定液（0.1 mol/ L，Ph 7.2 PBS配制），置于室温下2 h，弃戊二醛固定液，用0.1M PBS清洗3-4次，每次停留15-20 min，弃0.1M PBS，再加入1 %锇酸（0.2 mol/ L，pH7.2 PBS配制）后固定3-4 h，弃锇酸固定液，0.1MPBS清洗3-4次，每次停留15-20 min，吸去缓冲液，系列乙醇逐级脱水；100%丙酮和树脂过渡，Spurr树脂浸透、包埋、聚合；得到花瓣包埋块；

（2）半薄切片的制备；将经步骤（1）制得的花瓣包埋块用超薄切片机切成厚度为1mm的半薄切片，将载玻片放置于多功能热台上并滴上蒸馏水再将半薄切片放置载玻片上，待半薄切片水分蒸发消失；

（3）染色与定位；先用甲苯胺蓝将经步骤（2）获得的半薄切片染色，然后通过电镜观察找到上表皮分泌细胞，并去掉其他组织部分；

（4）超薄切片的制备与观察；将步骤（3）中已经染色定位好的玫瑰花瓣的花瓣包埋块用超薄切片机切成厚度为50 nm的超薄切片，然后再用醋酸双氧铀、硝酸铅双重染色后用透射电镜观察并拍照；

（5）计算表皮分泌细胞内油面积；采用AutoCAD软件勾选经步骤（4）拍照获得的表皮分泌细胞中黑色油面积区域，并计算花瓣表皮分泌细胞内的油面积；

（6）预测玫瑰精油含量；根据油面积与出油量的关系，即y=0.0018x+0.0829，使用上述经步骤（5）计算的油面积大小换算玫瑰品种的出油量。

实施例

玫瑰花瓣上表皮分泌细胞形状大多近圆形或者椭圆形。在盛花期，上表皮分泌细胞内的物质连同细胞器被酶解，被中央大液泡挤压到细胞壁内侧，细胞壁变厚有部分细胞壁向外凸起呈乳突状，细胞壁外有一层灰色物质，这些物质为分泌细胞内的挥发性油，细胞内的嗜锇油贴于细胞壁分布。观察发现丰花玫瑰细胞内含有较多的嗜锇油，细胞内油面积125.4573 μm

实施例

19种玫瑰的细胞内油面积较高的玫瑰品种有平阴重瓣白玫瑰、香水玫瑰、丰花玫瑰、平阴重瓣红玫瑰等10个玫瑰品种（图2），细胞内油面积分别为184.3911 μm

实施例

19种玫瑰分泌细胞内油面积（柱状图）和出油率（折线图）相关性分析发现（图2），玫瑰的出油率和细胞内油面积显著正相关（图3），例如平阴重瓣白玫瑰、香水玫瑰、平阴重瓣红玫瑰、杂交单瓣红玫瑰、丰花玫瑰的出油率和细胞内油面积都较高，出油量分别是0.4162 μL/g、0.3947 μL/g、0.3387 μL/g、0.3564 μL/g、0.2356 μL/g，油面积184.3911 μm2、171.2615 μm2、128.4041 μm2、106.6340 μm2。