抗GPC3抗体和使用方法
文献发布时间:2024-04-18 19:58:30
本申请要求2021年4月23日提交的国际专利申请号PCT/CN2021/089233的优先权。
技术领域
本披露涉及与GPC3结合的抗体和抗体衍生物及其使用方法。
背景技术
磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)是一种GPI连接的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖和细胞表面癌胚蛋白,在超过70%的肝细胞癌(HCC)活检中高度表达。GPC3阳性HCC患者的无病存活率显著低于GPC3阴性HCC患者。GPC3也以可溶性GPC3(sGPC3)的形式存在于HCC患者的外周血中,但不存在于健康成人的肝组织、脂肪肝的病理样品或肝硬化、肝炎或损伤的肝脏中,这表明GPC3是比甲胎蛋白(AFP)更可靠的肿瘤标记物。GPC3还在多种儿科癌症上表达,例如肝细胞癌、大多数儿科肝母细胞瘤、肾母细胞瘤、横纹肌样瘤、某些生殖细胞肿瘤亚型和少数横纹肌肉瘤。此外,GPC3基因突变导致辛普森变异综合征(Simpson-Golabi-BehmelSyndrome),这是一种X连锁过度生长疾病,易发展为表达GPC3的癌症,包括肝母细胞瘤和肾母细胞瘤。因此,本领域需要开发靶向GPC3用于癌症治疗的治疗分子和方法。
发明内容
本披露提供了以高亲和力特异性结合GPC3的分离的单克隆抗体和抗体衍生物,包括单特异性抗GPC3抗体和结合GPC3和一种或多种另外的靶标的多特异性抗体。在某些实施例中,本文披露的抗体或抗体衍生物包含与GPC3结合的单结构域抗体。本披露还提供了制备和使用本文披露的抗体和抗体衍生物以及包含这些抗体和抗体衍生物的药物组合物的方法,例如用于治疗疾病和障碍,例如癌症。本发明部分基于与GPC3结合的新型单结构域抗体的发现,该抗体可以靶向肿瘤细胞和/或增加针对肿瘤细胞的免疫应答,从而提供改进的抗肿瘤功效。
本披露提供了一种与GPC3结合的抗体,其包含与GPC3结合的单结构域抗体。
在某些实施例中,单结构域抗体以1x 10
在某些实施例中,该单结构域抗体与包含重链可变区的参考抗GPC3单结构域抗体交叉竞争结合GPC3,该重链可变区包含:包含SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列的重链可变区CDR1,包含SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的重链可变区CDR2,和包含SEQ ID NO:3中所示氨基酸序列的重链可变区CDR3,或包含SEQ ID NO:5中所示氨基酸序列的重链可变区CDR1,包含SEQ ID NO:6中所示氨基酸序列的重链可变区CDR2,和包含SEQ ID NO:7中所示氨基酸序列的重链可变区CDR3。
在某些实施例中,单结构域抗体包含重链可变区,该重链可变区包含:a)重链可变区CDR1,其包含SEQ ID NO:1和5中任一个的氨基酸序列,或该氨基酸序列的包含至多约3个氨基酸取代的变体;b)重链可变区CDR2,其包含SEQ ID NO:2和6中任一个的氨基酸序列,或该氨基酸序列的包含至多约3个氨基酸取代的变体;和c)重链可变区CDR3,其包含SEQ IDNO:3和7中任一个的氨基酸序列,或该氨基酸序列的包含至多约3个氨基酸取代的变体。
在某些实施例中,该单结构域抗体包含重链可变区,该重链可变区包含CDR1结构域、CDR2结构域和CDR3结构域,其中该CDR1结构域、该CDR2结构域和该CDR3结构域分别包含参考重链可变区中包含的CDR1结构域、CDR2结构域和CDR3结构域,该参考重链可变区包含选自由SEQ ID NO:4、8和12组成的组的氨基酸序列。在某些实施例中,该单结构域抗体包含含有SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列的重链可变区CDR1,含有SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的重链可变区CDR2,和含有SEQ ID NO:3中所示氨基酸序列的重链可变区CDR3。在某些实施例中,该单结构域抗体包含含有SEQ ID NO:5中所示氨基酸序列的重链可变区CDR1,含有SEQ ID NO:6中所示氨基酸序列的重链可变区CDR2,和含有SEQ ID NO:7中所示氨基酸序列的重链可变区CDR3。在某些实施例中,该单结构域抗体包含重链可变区,该重链可变区包含与选自由SEQ ID NO:4、8和12组成的组的氨基酸序列具有至少约90%序列同一性的氨基酸序列。在某些实施例中,该单结构域抗体包含重链可变区,该重链可变区包含SEQ ID NO:4中所示氨基酸序列。在某些实施例中,该单结构域抗体包含重链可变区,该重链可变区包含SEQ ID NO:8中所示氨基酸序列。在某些实施例中,该单结构域抗体包含重链可变区,该重链可变区包含SEQ ID NO:12中所示氨基酸序列。在某些实施例中,该单结构域抗体包含人源化框架。
在某些实施例中,该抗体包含Fc区。在某些实施例中,该Fc区包含人Fc区。在某些实施例中,该Fc区包含选自下组的Fc区,该组由以下组成:IgG、IgA、IgD、IgE和IgM的Fc区。在某些实施例中,该Fc区包含选自下组的Fc区,该组由以下组成:IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的Fc区。在某些实施例中,该Fc区包含IgG1 Fc区。在某些实施例中,该IgG1 Fc区包含一个或多个突变,该突变增强抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。
在某些实施例中,该IgG1 Fc区包含L235V、F243L、R292P和Y300L的突变,S239D、A330L和I332E的突变,或L235V、F243L、R292P、Y300L和P396L的突变。在某些实施例中,该IgG1 Fc区包含L235V、F243L、R292P和Y300L的突变。在某些实施例中,该IgG1 Fc区包含S239D、A330L和I332E的突变。在某些实施例中,该IgG1 Fc区包含L235V、F243L、R292P、Y300L和P396L的突变。
在某些实施例中,重链可变区通过接头与Fc区连接。在某些实施例中,接头是肽接头。在某些实施例中,肽接头包含约4至约30个氨基酸。在某些实施例中,肽接头包含选自由SEQ ID NO:16-50组成的组的氨基酸序列。
在某些实施例中,该抗体包含全长免疫球蛋白,单链Fv(scFv)片段,Fab片段,Fab'片段,F(ab’)2,Fv片段,二硫键稳定的Fv片段(dsFv),(dsFv)2,VHH,VHH-Fc融合物,Fv-Fc融合物,scFv-Fc融合物,scFv-Fv融合物,双抗体,三抗体,四抗体或任何它们的组合。
在某些实施例中,该抗体包含在多特异性抗体(例如双特异性抗体)中,其中所述多特异性抗体包含特异性结合第二抗原的第二抗体部分。在某些实施例中,第二抗原是肿瘤相关抗原。在某些实施例中,肿瘤相关抗原选自下组,该组由以下组成:Her-2,EGFR,PDL1,c-Met,B细胞成熟抗原(BCMA),碳酸酐酶IX(CA1X),癌胚抗原(CEA),CD5,CD7,CD10,CD19,CD20,CD22,CD30,CD33,CD34,CD38,CD41,CD44,CD49f,CD56,CD74,CD123,CD133,CD138,CD276(B7H3),上皮糖蛋白(EGP2),滋养层细胞表面抗原2(TROP-2),上皮糖蛋白-40(EGP-40),上皮细胞粘附分子(EpCAM),受体酪氨酸蛋白激酶erb-B2、3、4,叶酸结合蛋白(FBP),胎儿乙酰胆碱受体(AChR),叶酸受体-a,神经节苷脂G2(GD2),神经节苷脂G3(GD3),人端粒酶逆转录酶(hTERT),激酶插入结构域受体(KDR),LewisA(CA 1.9.9),Lewis Y(LeY),B7H3,L1细胞粘附分子(L1CAM),粘蛋白16(Muc-16),粘蛋白1(Muc-1),NG2D配体,癌胚抗原(h5T4),前列腺干细胞抗原(PSCA),前列腺特异性膜抗原(PSMA),肿瘤相关糖蛋白72(TAG-72),密封蛋白18.2(CLDN18.2),血管内皮生长因子R2(VEGF-R2),肾母细胞瘤蛋白(WT-1),1型酪氨酸蛋白激酶跨膜受体(ROR1)、PVR、PVRL2及其任何组合。在某些实施例中,第二抗原是免疫检查点调节剂。在某些实施例中,免疫检查点调节剂选自由以下组成的组:TIGIT、PD1、CTLA4、LAG-3、2B4、BTLA及其任何组合。在某些实施例中,第二抗原是免疫共刺激分子或T细胞受体/CD3复合物的亚基。在某些实施例中,该免疫共刺激分子选自由以下组成的组:CD28、ICOS、CD27、4-1BB、OX40和CD40及其任何组合。在某些实施例中,该T细胞受体/CD3复合物的亚基选自由以下组成的组:CD3γ、CD3δ、CD3ε及其任何组合。
本公开提供了包含与治疗剂或标记连接的本文公开的任何抗体的免疫缀合物。在某些实施例中,治疗剂是细胞毒素或放射性同位素。在某些实施例中,标记选自下组,该组由以下组成:放射性同位素、荧光染料和酶。
本公开提供了嵌合抗原受体(CAR),其包含含有本文公开的抗体的胞外抗原结合结构域。在某些实施例中,该抗体是VHH。
本公开提供了包含本文公开的CAR的免疫应答细胞。在某些实施例中,免疫应答细胞选自下组,该组由以下组成:T细胞、自然杀伤(NK)细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、调节性T细胞、自然杀伤T(NKT)细胞和髓样细胞。在某些实施例中,免疫应答细胞是T细胞。
本披露提供了一种药物组合物,其包含a)本文披露的任何抗体、本文披露的任何免疫缀合物或本文披露的任何免疫应答细胞,以及b)药学上可接受的载剂。
本披露还提供了编码本文披露的任何抗体的核酸、包含本文披露的任何核酸的载体以及包含本文披露的任何核酸或载体的宿主细胞。
本披露提供了一种制备本文披露的抗体的方法,该方法包括在本文披露的宿主细胞中表达抗体并从宿主细胞中分离该抗体。
本披露还提供了一种减轻受试者肿瘤负荷的方法。在某些实施例中,该方法包括向受试者施用有效量的本文披露的抗体、本文披露的免疫缀合物或本文披露的药物组合物。在某些实施例中,该方法减少肿瘤细胞的数量。在某些实施例中,该方法减小肿瘤大小。在某些实施例中,该方法根除受试者的肿瘤。在某些实施例中,肿瘤表现出高微卫星不稳定性(MSI)。在某些实施例中,肿瘤选自下组,该组由以下组成:间皮瘤、肺癌、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌、结肠癌、胸膜肿瘤、成胶质细胞瘤、食道癌、胃癌、滑膜肉瘤、胸腺癌、子宫内膜癌、胃肿瘤、胆管癌、头颈癌、血液癌及其组合。
本披露提供了治疗和/或预防癌症或延长癌症受试者存活期的方法。在某些实施例中,该方法包括向受试者施用有效量的本文披露的抗体、本文披露的免疫缀合物或本文披露的药物组合物。在某些实施例中,癌症表现出高微卫星不稳定性(MSI)。在某些实施例中,癌症选自下组,该组由以下组成:间皮瘤、肺癌、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌、结肠癌、胸膜肿瘤、成胶质细胞瘤、食道癌、胃癌、滑膜肉瘤、胸腺癌、子宫内膜癌、胃肿瘤、胆管癌、头颈癌、血液癌及其组合。
本披露还提供了本文披露的用作药物的任何抗体和/或药物组合物。本披露还提供了本文披露的用于治疗癌症的任何抗体和/或药物组合物。在某些实施例中,癌症表现出高微卫星不稳定性(MSI)。在某些实施例中,癌症选自下组,该组由以下组成:间皮瘤、肺癌、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌、结肠癌、胸膜肿瘤、成胶质细胞瘤、食道癌、胃癌、滑膜肉瘤、胸腺癌、子宫内膜癌、胃肿瘤、胆管癌、头颈癌、血液癌及其组合。
本披露提供了一种试剂盒,其包含本文披露的抗体、本文披露的免疫缀合物、本文披露的药物组合物、本文披露的核酸、本文披露的载体或本文披露的免疫应答细胞。在某些实施例中,试剂盒还包含用于治疗和/或预防赘生物的书面说明书。
附图说明
图1A和1B分别描绘了本文披露的GPC3分子和示例性抗GPC3 VHH抗体的示意图。图1A描绘了人GPC3分子的结构示意图,该分子由580个氨基酸和两个靠近C末端部分的硫酸乙酰肝素(HS)侧链组成。GPC3可以在Arg358和Cys359之间被弗林蛋白酶裂解,从而产生通过二硫键连接的40kDa的N末端亚基和30kDa的C末端亚基。图1B描绘了美洲驼衍生的VHH-Fc抗体结构(左图)和VHH结构模型示意图(右图)。
图2描绘了通过流式细胞术的两个顶部VHH-Fc克隆与HepG2肝癌细胞系的结合能力。HN3 VHH-Fc用作阳性对照。
图3A-3D描绘了通过ELISA测量的1B01 VHH-Fc、HN3 VHH-Fc和无岩藻糖基化(AF)1B01 VHH-Fc与人GPC3(3A)、食蟹猴GPC3(3B)、小鼠GPC3(3C)和人GPC3 C末端结构域(3D)的结合活性。
图4A和4B描绘了通过流式细胞术测量的抗GPC3抗体与HepG2(4A)和Hep3B肝癌细胞(4B)的全细胞结合。
图5描绘了使用人PBMC作为效应细胞和HeG2肝癌细胞作为靶细胞,通过细胞溶解百分比测量的抗GPC3抗体的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)活性。
图6描绘了在抗GPC3 VHH抗体或媒介物对照处理下的HepG2肝癌小鼠模型的肿瘤生长曲线。
具体实施方式
本披露提供了以高亲和力特异性结合GPC3的分离的单克隆抗体和抗体衍生物,包括单特异性抗GPC3抗体和结合GPC3和一种或多种另外的靶标的多特异性抗体。在某些实施例中,本文披露的抗体或抗体衍生物包含与GPC3结合的单结构域抗体。本披露还提供了制备和使用本文披露的抗体和抗体衍生物以及包含这些抗体和抗体衍生物的药物组合物的方法,例如用于治疗疾病和障碍,例如癌症。本发明部分基于与GPC3结合的新型单结构域抗体的发现,该抗体可以靶向肿瘤细胞和/或增加针对肿瘤细胞的免疫应答,从而提供改进的抗肿瘤功效。
为了清楚起见而不是作为限制,本披露的主题的具体实施方式分为以下小节:
1.定义;
2.抗体和抗体衍生物;
3.使用方法;
4.药物配制品;以及
5.制品。
1.定义
本文提及的术语“抗体”包括全长抗体及其任何抗原结合片段(即抗体片段)。“抗体”可以是独立的分子或抗体衍生物的一部分。示例性抗体衍生物包括但不限于多特异性抗体(例如双特异性抗体)、抗原识别受体(例如嵌合抗原受体)、包含另外的蛋白质或非蛋白质部分的抗体缀合物(例如抗体-药物缀合物或聚合物包被的抗体)和包含抗体的其他多功能分子。
“全长抗体”、“完整抗体”和“全抗体”是指与天然抗体结构相似或具有包含本文定义的Fc区的重链的抗体。在某些实施例中,全长抗体包含两条重链和两条轻链。在某些实施例中,轻链和重链的可变区负责抗原结合。重链和轻链的可变区可以分别称为“VH”和“VL”。两条链中的可变区通常包含三个高度可变的环,称为互补决定区(CDR)(包括LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3的轻链(LC)CDR,包括HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3的重链(HC)CDR)。本文披露的抗体和抗原结合片段的CDR边界可以通过公知的惯例来定义或鉴定,例如,下文所述的Kabat、Chothia、MacCallum、IMGT和AHo的惯例。重链或轻链的三个CDR被插入称为框架区(FR)的侧翼区段之间,它们比CDR更为保守,并形成了支持高变环的支架。重链和轻链的恒定区不参与抗原结合,但是表现出多种效应子功能。根据抗体重链恒定区的氨基酸序列将抗体分类。抗体的五种主要类别或同种型是IgA、IgD、IgE、IgG和IgM,分别以存在α、δ、ε、γ和μ重链为特征。几种主要抗体类别分为亚类,例如IgG1(γ1重链)、IgG2(γ2重链)、IgG3(γ3重链)、IgG4(γ4重链)、IgA1(α1重链)或IgA2(α2重链)。在某些实施例中,全长抗体是糖基化的。在某些实施例中,全长抗体包含与其Fc区连接的聚糖。在某些实施例中,全长抗体包含支链聚糖。
如本文所用,术语抗体的“抗原结合部分”、“抗体片段”和“抗体部分”是指保留与抗原特异性结合的能力的抗体的一个或多个片段。已表明,抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段来执行。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2、双抗体、线性抗体、单链抗体分子(例如scFv和scFv-Fc)、单结构域抗体、VHH、VHH-Fc、纳米抗体、结构域抗体、二价结构域抗体、或结合抗原的抗体的任何其他片段或其组合。“VHH”是指从骆驼科动物中分离的单结构域抗体。在某些实施例中,VHH包含骆驼科动物重链抗体的重链可变区。在某些实施例中,VHH的大小不超过约25kDa。在某些实施例中,VHH的大小不超过约20kDa。在某些实施例中,VHH的大小不超过约15kDa。
与参考抗体“交叉竞争结合的抗体”是指在竞争测定中阻断参考抗体与其抗原的结合达50%以上的抗体,相反,在竞争测定中参考抗体阻断抗体与其抗原的结合达50%以上。在Antibodies[抗体],Harlow和Lane(Cold Spring Harbor Press[冷泉港实验室出版社],Cold Spring Harbor,NY[纽约冷泉港])中描述了示例性竞争测定法。
“Fv”是最小抗体片段,其含有完整抗原识别位点和抗原结合位点。该片段由紧密非共价缔合的一个重链可变区和一个轻链可变区的二聚体组成。从这两个结构域的折叠中发出六个高变环(重链和轻链各自中的3个环),该高变环贡献用于抗原结合的氨基酸残基并赋予抗体与抗原结合特异性。然而,甚至单个可变结构域(或仅包含三个对抗原有特异性的CDR的半个Fv)可以识别并结合抗原,虽然有时以比完整结合位点更低的亲和力进行。
“单链Fv”(也缩写为“sFv”或“scFv”)是包含连接成单个多肽链的V
出于本文的目的,“受体人框架”或“人框架”是包含源自人免疫球蛋白框架或人共有框架的轻链可变结构域(VL)框架或重链可变结构域(VH)框架的氨基酸序列的框架。“源自”人免疫球蛋白框架或人共有框架的受体人框架可以包含其相同的氨基酸序列,或者可以包含氨基酸序列变化。在某些实施例中,氨基酸变化的数目是10个或更少、9个或更少、8个或更少、7个或更少、6个或更少、5个或更少、4个或更少、3个或更少、或2个或更少。在某些实施例中,VL受体人框架与VL人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列在序列方面是相同的。
“亲和力”是指分子(例如,抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如,抗原)之间非共价相互作用的总和的强度。除非另外指明,如本文所用,“结合亲和力”是指内部结合亲和力,其反映出结合对(例如,抗体与抗原)的成员之间1:1相互作用。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以由解离常数(KD)表示。亲和力可以通过本领域已知的常规方法(包括本文所述的那些)测量。下面描述了用于测量结合亲和力的特定说明性和示例性实施例。
“亲和力成熟的”抗体是指与不具有这种改变的亲本抗体相比,在一个或多个CDR或高变区(HVR)中具有一个或多个改变的抗体,该改变提供了抗体对抗原的改善的亲和力。
如本文所用,“GPC3”、“GPC3蛋白”或“GPC3多肽”是指来自任何脊椎动物来源(包括哺乳动物,例如灵长类动物(例如人和食蟹猴))的任何GPC3多肽、或其任何片段,并且可以任选地包含至多一个、至多两个、至多三个、至多四个、至多五个、至多六个、至多七个、至多八个、至多九个或至多十个氨基酸取代、添加和/或缺失。该术语包括全长、未加工的GPC3以及在细胞中加工产生的任何形式的GPC3。该术语还包括天然存在的GPC3变体,例如剪接变体或等位基因变体。在某些实施例中,GPC3多肽包含或具有与具有以下NCBI参考号的序列具有至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、至少约99%或至少约100%同源性或同一性的氨基酸序列:NP_001158089.1、NP_001158090.1、NP_001158091.1、NP_004475.1或XP_016884902.1(本文的同源性可使用标准软件如BLAST或FASTA确定)。在某些实施例中,GPC3多肽包含或具有作为SEQ ID NO:14的整体或连续部分的氨基酸序列。
术语“GPC3的ECD”是指GPC3的胞外结构域。在某些实施例中,ECD是N末端ECD。在某些实施例中,ECD是C末端ECD。在某些实施例中,示例性GPC3多肽的C末端ECD可包含SEQ IDNO:15中所示的氨基酸序列。
术语“抗GPC3抗体”和“结合GPC3的抗体”是指能够以足够的亲和力结合GPC3的抗体,使得该抗体可用作靶向GPC3的诊断剂和/或治疗剂。在一个实施例中,抗GPC3抗体与无关的、非GPC3蛋白的结合程度小于该抗体与GPC3结合的约10%,例如通过
术语“嵌合”抗体是指这样的抗体,其中重链和/或轻链的一部分源自特定来源或物种,而重链和/或轻链的其余部分源自不同来源或物种。在某些实施例中,本文披露的嵌合抗体包含骆驼科动物重链可变区和人Fc区。
如本文所用,术语“CDR”或“互补决定区”是指重链和/或轻链的可变区内的非连续抗原结合位点。这些特定区已经描述于:Kabat等人,J.Biol.Chem.[生物化学杂志]252:6609-6616(1977);Kabat等人,U.S.Dept.ofHealth and Human Services[美国卫生与公众服务部],“Sequences of proteins of immunological interest[具有免疫学意义的蛋白质序列]”(1991);Chothia等人,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]196:901-917(1987);Al-Lazikani B.等人,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志],273:927-948(1997);MacCallum等人,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]262:732-745(1996);Abhinandan和Martin,Mol.Immunol.[分子免疫学],45:3832-3839(2008);Lefranc M.P.等人,Dev.Comp.Immunol.[发育与比较免疫学],27:55-77(2003);以及Honegger和Plückthun,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志],309:657-670(2001),其中定义包括当彼此比较时氨基酸残基的重叠或子集。然而,应用任一定义来指代抗体或移植的抗体或其变体的CDR旨在落入如本文定义和使用的术语的范围内。涵盖如上述每篇参考文献定义的CDR的氨基酸残基列于下表1中作为比较。CDR预测算法和接口是本领域已知的,包括例如Abhinandan和Martin,Mol.Immunol.[分子免疫学],45:3832-3839(2008);Ehrenmann F.等人,Nucleic Acids Res.[核酸研究],38:D301-D307(2010);和Adolf-Bryfogle J.等人,Nucleic Acids Res.[核酸研究],43:D432-D438(2015)。在本段中引用的参考文献的内容通过引用以其整体并入本文,以用于本申请中并且可能包含在本文的一项或多项权利要求中。
表1:CDR定义
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表述“如Kabat中的可变结构域残基编号”或“如Kabat中的氨基酸位置编号”及其变体是指用于上文Kabat等人的抗体汇编的重链可变结构域或轻链可变结构域的编号系统。使用这个编号系统,实际直链氨基酸序列可以含有对应于可变结构域的FR或CDR的缩短或插入的更少的或另外的氨基酸。例如,重链可变结构域可以包含在H2的残基52之后的单个氨基酸插入(根据Kabat的残基52a)以及在重链FR残基82之后的插入残基(例如,根据Kabat的残基82a、82b和82c等)。可以通过在抗体序列与“标准”Kabat编号序列的同源性区域进行比对来确定给定抗体的残基的Kabat编号。
在某些实施例中,涵盖单结构域抗体(例如,本文披露的单结构域抗GPC3抗体)的CDR的氨基酸残基是根据上文Lefranc等人的IMGT命名法定义的。在某些实施例中,涵盖全长抗体的CDR的氨基酸残基是根据上文Kabat等人的Kabat命名法定义的。在某些实施例中,免疫球蛋白重链例如Fc区中的残基编号是如上文Kabat等人所述的EU索引的编号。“如Kabat所述的EU索引”是指人IgG1 EU抗体的残基编号。
“框架”或“FR”是指除了本文定义的CDR残基以外的那些可变结构域残基。
“人源化”抗体是指包含来自非人CDR/HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施例中,人源化抗体将包括基本上至少一个、并且典型地两个可变结构域的全部,其中HVR/CDR的全部或基本上全部对应于非人类抗体的那些,并且FR的全部或基本上全部对应于人类抗体的那些。人源化抗体可任选地包含源自人抗体的抗体恒定区的至少一部分。抗体(例如非人抗体)的“人源化形式”是指已经人源化的抗体。
“人抗体”是具有氨基酸序列的抗体,该氨基酸序列对应于由人产生的抗体的氨基酸序列和/或已经使用本文披露的任何用于制备人抗体的技术制备。人抗体的此定义特别排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。可以使用本领域已知的各种技术(包括噬菌体展示文库)产生人抗体。Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志],227:381(1991);Marks等人,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志],222:581(1991)。也可用于制备人单克隆抗体的是在Cole等人,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy[单克隆抗体和癌症疗法],Alan R.Liss,第77页(1985);Boerner等人,J.Immunol.[免疫学杂志],147(1):86-95(1991)中描述的方法。另请参见van Dijk和van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.[当代药理学观点],5:368-74(2001)。人抗体可以通过将抗原施用至已被修饰以响应抗原攻击而产生这种抗体但其内源基因座已失效的转基因动物(例如已免疫的xenomice)来制备(参见例如关于XENOMOUSE
将“关于本文鉴定的多肽和抗体序列的氨基酸序列同一性百分比(%)”或“同源性”定义为在比对序列(考虑任何保守取代作为序列同一性的一部分)后,候选序列中与所比较多肽中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。出于确定氨基酸序列同一性百分比的目的,可以用本领域技术中的多种方式来实现比对,例如使用公众可得的计算机软件,例如BLAST、BLAST-2、ALIGN、Megalign(DNASTAR)或MUSCLE软件。本领域技术人员可以确定用于测量比对的适当参数,包括需要在被比较序列的全长范围实现最大比对的任何算法。然而,出于本文的目的,使用序列比较计算机程序MUSCLE生成氨基酸序列同一性%值(Edgar,R.C.,Nucleic Acids Research[核酸研究]32(5):1792-1797,2004;Edgar,R.C.,BMCBioinformatics[BMC生物信息学]5(1):113,2004)。
“同源的”是指两个多肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性或序列同一性。当两个比较序列中两个的一个位置被相同的碱基或氨基酸单体亚基占据时,例如,如果两个DNA分子中的每一个的一个位置被腺嘌呤占据,则该分子在该位置是同源的。两个序列之间的同源性百分比是两个序列共享的匹配或同源位置数除以比较的位置数乘以100的函数。例如,如果两个序列中10个位置中的6个是匹配或同源的,那么两个序列是60%同源的。举例来说,DNA序列ATTGCC和TATGGC具有50%的同源性。通常,当两个序列比对以给出最大同源性时进行比较。
术语“恒定结构域”是指免疫球蛋白分子的一部分,其相对于免疫球蛋白的另一部分,即可变结构域,具有更保守的氨基酸序列,该氨基酸序列包含抗原结合位点。恒定结构域包含重链的C
任何哺乳动物物种的抗体(例如免疫球蛋白)的“轻链”都可以根据其恒定结构域的氨基酸序列指定为两种明显不同的类型之一,分别称为kappa(“κ”)和lambda(“λ”)。
“CH1结构域”(也称为“H1”结构域的“C1”)通常从约氨基酸118延伸至约氨基酸215(EU编号系统)。
“铰链区”通常定义为IgG中对应于人IgG1的Glu216至Pro230的区域(Burton,Molec.Immunol.[分子免疫学]22:161-206(1985))。其他IgG同种型的铰链区可以通过将第一个和最后一个形成重链间S-S键的半胱氨酸残基置于相同位置而与IgG1序列比对。
人IgG Fc区(也称为“C2”结构域)的“CH2结构域”通常从约氨基酸231延伸至约氨基酸340。CH2结构域是独特的,因为其不与另一个结构域紧密配对。而是,两个N连接的支链碳水化合物链插入完整天然IgG分子的两个CH2结构域之间。据推测,碳水化合物可以提供结构域-结构域配对的替代物并有助于稳定CH2结构域。Burton,Molec Immunol.22:161-206(1985)。
“CH3结构域”(也称为“C2”结构域)包含CH2结构域与Fc区的C末端之间的残基(即,从约氨基酸残基341到抗体序列的C末端),通常在IgG的氨基酸残基446或447处)。
本文中的术语“Fc区”或“片段可结晶区”用于定义免疫球蛋白重链的C末端区域,包括天然序列Fc区和变体Fc区。尽管免疫球蛋白重链的Fc区的边界可以变化,但是通常将人IgG重链的Fc区定义为从Cys226位置处的氨基酸残基或从Pro230延伸至其羧基末端。可以例如在抗体的生产或纯化期间或通过对编码抗体重链的核酸进行重组工程化来去除Fc区的C末端赖氨酸(根据EU编号系统的残基447)。因此,完整抗体的组合物可以包括去除了所有K447残基的抗体群体,没有去除K447残基的抗体群体以及具有带有和不带有K447残基的抗体混合物的抗体群体。用于本文所述抗体的合适天然序列Fc区包括人IgG1、IgG2(IgG2A、IgG2B)、IgG3和IgG4。
“Fc受体”或“FcR”描述结合抗体的Fc区的受体。优选的FcR是天然人FcR。此外,优选的FcR是结合IgG抗体(γ受体)并包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体的FcR,包括等位基因变体和这些受体的剪接形式,FcγRII受体包括FcγRIIA(“活化受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”),它们具有相似的氨基酸序列,主要区别在于其胞质结构域。活化受体FcγRIIA在其胞质结构域中含有基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制性受体FcγRIIB在其胞质结构域中包含基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)。(参见M.
如本文所用,术语“表位”是指抗体或抗体衍生物所结合的抗原上的特定原子或氨基酸基团。如果两个抗体或抗原结合部分对抗原具有竞争性结合,则它们可以结合抗原内的相同表位。
如本文所用,术语“特异性结合”、“特异性识别”和“对……有特异性”是指可测量和可再现的相互作用,例如靶标与抗体或抗体部分之间的结合,其决定了在异质分子(包括生物分子)群体存在时靶标的存在。例如,特异性识别靶标(可以是表位)的抗体或抗体部分是与该靶标结合的抗体或抗体部分,其亲和力、亲合力、就绪性和/或持续时间长于与其他靶标的结合。在一些实施例中,抗体与不相关靶标的结合程度小于例如通过放射免疫测定(RIA)测量的抗体与靶标的结合程度的约10%。在一些实施例中,特异性结合靶标的抗体的解离常数(K
“分离的”抗体(或构建体)是已经从其生产环境的组分(例如天然或重组)中鉴定、分离和/或回收的抗体。在某些实施例中,分离的多肽在其生产环境中没有或基本上没有与所有其他组分缔合。
编码本文所述的构建体、抗体或其抗原结合片段的“分离的”核酸分子是与在其生产环境中从通常与其相关联的至少一种污染物核酸分子中鉴定并分离的核酸分子。在某些实施例中,分离的核酸没有或基本没有与生产环境有关的所有组分缔合。编码本文所述的多肽和抗体的分离的核酸分子的形式不同于天然存在的形式或背景。因此,分离的核酸分子不同于编码天然存在于细胞中的本文所述的多肽和抗体的核酸。分离的核酸包括通常包含核酸分子的细胞中所含的该核酸分子,但是该核酸分子存在于染色体外或与其天然染色体位置不同的染色体位置。
术语“控制序列”是指在特定宿主生物体中表达可操作地连接的编码序列所必需的DNA序列。例如,适用于原核生物的控制序列包括启动子、任选的操纵子序列和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、聚腺苷酸化信号和增强子。
当核酸与另一核酸序列处于功能关系时,该核酸是“可操作地连接的”。例如,如果将前序列或分泌性前导序列的DNA表达为参与多肽分泌的前蛋白,则该前序列或分泌性前导序列的DNA可操作地连接至该多肽的DNA;如果启动子或增强子影响编码序列的转录,则该启动子或增强子可操作地连接至该序列;或者如果核糖体结合位点被定位成使得有助于翻译,则该核糖体结合位点可操作地连接至编码序列。通常,“可操作地连接”意指所连接的DNA序列是连续的,并且在分泌性前导序列的情形下是连续的并处于阅读框中。然而,增强子不必需是连续的。通过在方便的限制位点处连接来实现连接。如果不存在此类位点,则根据常规实践使用合成的寡核苷酸衔接子或接头。
如本文所用,术语“载体”是指能够繁殖与其连接的另一核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体,以及掺入已引入其的宿主细胞基因组中的载体。某些载体能够指导与其可操作连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。
如本文所用,术语“转染的”或“转化的”或“转导的”是指将外源核酸转移或引入宿主细胞的过程。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是已经用外源核酸转染、转化或转导的细胞,该细胞包括原代受试者细胞及其子代。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用,是指已引入外源核酸的细胞,包括此类细胞的子代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”,其包括原代转化细胞和从其衍生的子代,而与传代次数无关。子代的核酸含量可能与亲代细胞不完全相同,并且可能含有突变。具有与在原始转化细胞中筛选或选择的功能或生物学活性相同的功能或生物学活性的突变子代包括在本文中。
术语“受试者”、“个体”和“患者”在本文可互换使用,是指哺乳动物,包括但不限于人、牛、马、猫、犬、啮齿动物或灵长类动物。在一些实施例中,受试者是人。
药剂的“有效量”是指在必要的剂量和时间段内有效达到所需治疗或预防结果的量。该特定剂量可以根据以下各项中的一种或多种来改变:所选择的特定药剂、随后的给药方案(无论它是否与其他化合物组合)、施用时间、成像的组织、以及其中携带它的物理递送系统。
本申请的物质/分子、激动剂或拮抗剂的“治疗有效量”可以根据例如疾病状态、年龄、性别和个体体重以及该物质/分子、激动剂或拮抗剂在个体中引发希望的应答的能力等因素而变化。治疗有效量也是该物质/分子、激动剂或拮抗剂的任何毒性或有害作用均被治疗有益作用所抵消的量。治疗有效量可以一次或多次施用来递送。
“预防有效量”是指以剂量计并且持续所需的时间段以实现所希望的预防结果的有效的量。典型地,但非必需的,因为预防的剂量是在疾病之前或早期在受试者体内使用的,所以这种预防有效量将小于治疗有效量。
如本文所用,“治疗(treatment或treating)”是用于获得有益的或所希望的结果(包括临床结果)的方法。出于本申请的目的,有益的或所希望的临床结果包括但不限于以下中的一种或多种:缓解由疾病引起的一种或多种症状、减少疾病的程度、稳定疾病(例如,预防或延迟疾病的恶化)、预防或延迟疾病的传播(例如,转移)、预防或延迟疾病的重现、延迟或减缓疾病的进展,改善疾病状态、提供疾病的缓解(部分或全部)、减少治疗疾病所需的一种或多种其他药物的剂量、延迟疾病的进展、增加或改善生活质量、增加体重增长和/或延长存活。“治疗”还涵盖减少癌症的病理后果(像例如,肿瘤体积)。本申请的方法考虑了这些治疗方面中的任何一个或多个。“治疗”并不一定意味着所治疗的疾病将得到治愈。
应当理解,本文所述的本申请的实施例包括“由实施例组成”和/或“基本上由实施例组成”。
如本文所用,术语“约(about)”或“大约(approximately)”意指由本领域普通技术人员确定的特定值在可接受的误差范围之内,这将部分地取决于该值是怎样测定或确定的,即,受到测量系统的限制。在某些实施例中,“约”可以意指根据本领域的实践在3个或大于3个标准差之内。在某些实施例中,“约”可以表示给定值的至多20%(例如,至多10%、至多5%或至多1%)的范围。在某些实施例中,特别是对于生物学系统和方法,该术语可以意指在某一值的数量级内,例如在5倍内或在2倍内。
如本文所用,术语“调节”是指正向或负向变化。示例性调节包括约1%、约2%、约5%、约10%、约25%、约50%、约75%或约100%的变化。
如本文所用,术语“增加”是指正向地改变至少约5%。改变可以为约5%、约10%、约25%、约30%、约50%、约75%、约100%或更多。
如本文所用,术语“减少”是指负向地变化至少约5%。改变可以为约5%、约10%、约25%、约30%、约50%、约75%或甚至约100%。
本文使用的术语“约X-Y”具有与“约X至约Y”相同的含义。
当在本文和附带的权利要求中使用时,单数形式“一个/种(a)”、“或(or)”和“该(the)”包括复数指代物,除非上下文明确地指示其他的情况。
“效应子功能”是指归因于抗体的Fc区的那些生物学活性,其随抗体同种型不同而变化。抗体效应子功能的实例包括:C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)、Fc受体结合、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、吞噬作用、细胞表面受体(例如B细胞受体)的下调和B细胞活化。
“免疫缀合物”是指缀合至一个或多个异源分子(包括但不限于细胞毒性剂)的抗体。
术语“药物配制品”是指这样的制剂,其处于允许包含其中的活性成分的生物学活性有效的形式,并且不含对配制品所施用的受试者具有不可接受的毒性的其他组分。
如本文所用,“药学上可接受的载剂”是指药物配制品中除活性成分以外的对受试者无毒的成分。药学上可接受的载剂包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链的结构域,其参与抗体与抗原的结合。在某些实施例中,天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构,每个结构域包含四个保守框架区(FR)和三个CDR。(参见例如,Kindt等人KubyImmunology[库比免疫学],第61版,W.H.Freeman and Co.[W.H.弗里曼公司],第91页(2007).)单个VH或VL结构域可足以赋予抗原结合特异性。此外,可以使用VH或VL结构域从结合抗原的抗体中分离结合特定抗原的抗体,以分别筛选互补的VL或VH结构域的文库。参见例如,Portolano等人,J.Immunol.[免疫学杂志]150:880-887(1993);Clarkson等人,Nature[自然]352:624-628(1991)。
如本文所用,术语“抗原识别受体”是指能够响应于其与抗原的结合而活化免疫应答细胞(例如T细胞)的受体。抗原识别受体的非限制性实例包括天然和修饰的T细胞受体(“TCR”)和嵌合抗原受体(“CAR”)。
如本文所用,术语“嵌合抗原受体”或“CAR”是指包含胞外抗原结合结构域和跨膜结构域的分子,该胞外抗原结合结构域与能够活化或刺激免疫应答细胞的胞内信号传导结构域融合。在某些实施例中,CAR的胞外抗原结合结构域包含抗体或抗体片段,例如VHH或scFv。在某些实施例中,抗体(例如VHH或scFv)与跨膜结构域融合,该跨膜结构域与胞内信号传导结构域融合。在某些实施例中,选择对抗原具有高结合亲和力或亲合力的CAR。
“免疫应答细胞”是指在免疫应答中起作用的细胞或其祖先或子代。
2.抗体和抗体衍生物
本披露提供了分离的单克隆抗体和抗体衍生物,包括单特异性抗GPC3抗体和结合GPC3和一种或多种另外的靶标的多特异性抗体。在某些实施例中,本文披露的抗体或抗体衍生物包含与GPC3结合的单结构域抗体。在某些实施例中,本披露部分基于与GPC3结合的单结构域抗体的发现,该单结构域抗体可用于抗肿瘤治疗,其中抗体选择性地靶向肿瘤细胞和/或抑制由GPC3介导的信号通路,从而诱导针对肿瘤细胞的有益抗肿瘤作用。在某些实施例中,本文披露的单结构域抗体是拮抗剂抗体,其抑制GPC3功能。在某些实施例中,单结构域抗体可以增强针对表达GPC3蛋白的肿瘤细胞的抗肿瘤免疫应答。在某些实施例中,单结构域抗体包括骆驼科动物抗体或VHH抗体。在某些实施例中,单结构域抗体由于其尺寸小于IgG、Fab和/或scFv形式的传统抗体而具有改进的组织浸润能力。
在某些实施例中,本披露的抗体可以是或包含单克隆抗体(包括嵌合抗体、人源化抗体或人抗体)。在某些实施例中,本文披露的抗体包含人源化抗体。在某些实施例中,抗体包含受体人框架,例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在某些实施例中,本披露的抗体可以是抗体片段,例如Fv、Fab、Fab'、scFv、双抗体或F(ab')2片段。在某些实施例中,抗体是全长抗体,例如完整的IgG 1抗体、或本文定义的其他抗体类型或同种型。在某些实施例中,本披露的抗体或抗体衍生物可以单独或组合地掺入任何(如本申请中所述的(例如,本文详述的第2.1-2.12节))特征。
本披露的抗体和抗体衍生物可用于例如诊断或治疗赘生物或癌症。在某些实施例中,使用本披露的抗体可以抑制其生长的瘤形成和癌症包括通常对免疫疗法有响应的瘤形成和癌症。在某些实施例中,瘤形成和癌症包括乳腺癌(例如,乳腺细胞癌)、卵巢癌(例如,卵巢细胞癌)和肾细胞癌(RCC)。可以使用本披露的方法治疗的其他癌症的实例包括黑素瘤(例如,转移性恶性黑素瘤),前列腺癌,结肠癌,肺癌,骨癌,胰腺癌,皮肤癌,脑瘤,慢性或急性白血病(包括急性髓系白血病,慢性髓系白血病,急性淋巴母细胞白血病,慢性淋巴细胞白血病),淋巴瘤(例如霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤,淋巴细胞性淋巴瘤,原发性CNS淋巴瘤,T细胞淋巴瘤),鼻咽癌(nasopharangeal carcinoma),头或颈癌,皮肤癌或眼内恶性黑素瘤,子宫癌,直肠癌,肛门区域癌,胃肿瘤,睾丸癌,子宫癌,输卵管癌,子宫内膜癌,子宫颈癌,阴道癌,外阴癌,食道癌,小肠癌,内分泌系统癌,甲状腺癌,甲状旁腺癌,乳腺癌(cancer ofthe breast gland),软组织肉瘤,尿道癌,阴茎癌,儿童实体瘤,膀胱癌,肾癌或输尿管癌,乳腺骨盆癌(carcinoma ofthe breastpelvis),中枢神经系统(CNS)赘生物,肿瘤血管生成,脊柱肿瘤,脑干神经胶质瘤,垂体腺瘤,卡波西氏肉瘤,表皮样癌,鳞状细胞癌,环境诱导的癌症,包括由石棉诱导的癌症(例如间皮瘤)以及所述癌症的组合。
2.1示例性抗GPC3抗体
本披露提供了与GPC3蛋白结合的分离抗体。在某些实施例中,本披露的抗GPC3抗体与GPC3的ECD结合。在某些实施例中,抗GPC3抗体与GPC3的C末端ECD结合。在某些实施例中,C末端ECD包含SEQ ID NO:15中所示氨基酸序列。在某些实施例中,抗GPC3抗体与本文所述的抗GPC3抗体(例如1B01)结合相同表位。
在某些实施例中,本文披露的抗GPC3抗体可以作为基于GPC3的信号通路的拮抗剂。在某些实施例中,抗GPC3抗体可以阻断或减少依赖于GPC3蛋白的信号通路。在某些实施例中,抗GPC3抗体可使信号通路的活性降低至少约10%、约20%、约30%、约40%、约50%、约60%、约70%、约80%、约90%、约99%或约99.9%。在某些实施例中,使用抗GPC3抗体的治疗在受试者中表现出抗肿瘤功效,从而减少肿瘤生长和/或延长受试者的存活期。在某些实施例中,抗GPC3抗体增加免疫细胞(例如T细胞和/或NK细胞)对表达GPC3的肿瘤细胞的免疫应答和/或抗肿瘤作用。在某些实施例中,包含单结构域抗体(例如VHH)的抗GPC3抗体与全长抗体相比具有更小的分子尺寸,因为与全长抗体的Fab结构域相比,单域抗体的尺寸较小,这可促使与全长抗体相比例如在肿瘤部位更优的组织浸润。在某些实施例中,与使用全长抗GPC3抗体的治疗相比,使用抗GPC3抗体的治疗表现出更优的抗肿瘤功效。
在某些实施例中,抗GPC3抗体包含与GPC3结合的单结构域抗体。在某些实施例中,单结构域抗体包含VHH。在某些实施例中,单结构域抗体包含重链可变区(VH)。在某些实施例中,单结构域抗体连接至Fc区。在某些实施例中,单结构域抗体不连接至Fc区。
在某些实施例中,单结构域抗体以约1x 10
在某些实施例中,单结构域抗体与参考抗GPC3单结构域抗体交叉竞争结合GPC3,该单结构域抗体包含含有SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列的重链可变区CDR1,含有SEQ IDNO:2中所示氨基酸序列的重链可变区CDR2,和含有SEQ ID NO:3中所示氨基酸序列的重链可变区CDR3。在某些实施例中,单结构域抗体与参考抗GPC3单结构域抗体交叉竞争结合GPC3,该单结构域抗体包含含有SEQ ID NO:5中所示氨基酸序列的重链可变区CDR1,含有SEQ ID NO:6中所示氨基酸序列的重链可变区CDR2,和含有SEQ ID NO:7中所示氨基酸序列的重链可变区CDR3。
在某些实施例中,单结构域抗体包含重链可变区,该重链可变区包含:a)重链可变区CDR1,其包含SEQ ID NO:1和5中任一个的氨基酸序列,或该氨基酸序列的包含至多约3个氨基酸取代的变体;b)重链可变区CDR2,其包含SEQ ID NO:2和6中任一个的氨基酸序列,或该氨基酸序列的包含至多约3个氨基酸取代的变体;和c)重链可变区CDR3,其包含SEQ IDNO:3和7中任一个的氨基酸序列,或该氨基酸序列的包含至多约3个氨基酸取代的变体。
在某些实施例中,该单结构域抗体包含重链可变区,该重链可变区包含CDR1结构域、CDR2结构域和CDR3结构域,其中该CDR1结构域、该CDR2结构域和该CDR3结构域分别包含参考重链可变区中包含的CDR1结构域、CDR2结构域和CDR3结构域,该参考重链可变区包含选自由SEQ ID NO:4、8和12组成的组的氨基酸序列。
在某些实施例中,该单结构域抗体包含含有SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列的重链可变区CDR1,含有SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的重链可变区CDR2,和含有SEQ ID NO:3中所示氨基酸序列的重链可变区CDR3。在某些实施例中,该单结构域抗体包含含有SEQ IDNO:5中所示氨基酸序列的重链可变区CDR1,含有SEQ ID NO:6中所示氨基酸序列的重链可变区CDR2,和含有SEQ ID NO:7中所示氨基酸序列的重链可变区CDR3。
在某些实施例中,单结构域抗体包含重链可变区,该重链可变区包含与选自由SEQID NO:4、8和12组成的组的氨基酸序列具有至少约80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的氨基酸序列。在某些实施例中,单结构域抗体包含重链可变区,重链可变区包含选自由SEQ ID NO:4、8和12组成的组的氨基酸序列。
在某些实施例中,单结构域抗体包含重链可变区,该重链可变区包含SEQ ID NO:4中所示氨基酸序列。在某些实施例中,单结构域抗体包含重链可变区,该重链可变区包含SEQ ID NO:8中所示氨基酸序列。在某些实施例中,单结构域抗体包含重链可变区,该重链可变区包含SEQ ID NO:12中所示氨基酸序列。
在某些实施例中,重链可变区中包含的任何氨基酸序列可包含至多约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9或约10个氨基酸取代、缺失和/或添加。在某些实施例中,氨基酸取代是保守取代。
在某些实施例中,单结构域抗体包含人源化框架。在某些实施例中,人源化框架包含SEQ ID NO:12中所示重链可变区序列的框架序列。
在某些实施例中,抗GPC3抗体不包含Fc区。在某些实施例中,抗GPC3抗体还包含Fc区。在某些实施例中,Fc区包含人Fc区。在某些实施例中,Fc区包含选自下组的Fc区,该组由以下组成:IgG、IgA、IgD、IgE和IgM的Fc区。在某些实施例中,Fc区包含选自下组的Fc区,该组由以下组成:IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的Fc区。在某些实施例中,Fc区包含IgG1 Fc区。在某些实施例中,IgG1 Fc区包含一种或多种修饰抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的突变。在某些实施例中,IgG1 Fc区包含一种或多种降低抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的突变。在某些实施例中,IgG1 Fc区包含一种或多种增强抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的突变。在某些实施例中,IgG1 Fc区包含L235V、F243L、R292P、Y300L和P396L的突变。在某些实施例中,IgG1 Fc区包含S239D、A330L和I332E的突变。在某些实施例中,抗GPC3抗体包含SEQ ID NO:13中所示氨基酸序列。
在某些实施例中,重链可变区通过接头连接至Fc区。在某些实施例中,接头是肽接头。在某些实施例中,肽接头包含约4至约30个氨基酸。在某些实施例中,肽接头包含约4至约15个氨基酸。在某些实施例中,肽接头包含选自由SEQ ID NO:16-50组成的组的氨基酸序列。
在某些实施例中,抗GPC3抗体包含全长免疫球蛋白、单链Fv(scFv)片段、Fab片段、Fab'片段、F(ab’)2、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、VHH、Fv-Fc融合物、scFv-Fc融合物、VHH-Fv融合物、双抗体、三抗体、四抗体或其任何组合。
在某些实施例中,抗体包含在作为抗体衍生物的较大分子中。在某些实施例中,抗体衍生物是多特异性抗体,例如双特异性抗体,其中多特异性抗体包含特异性结合第二抗原的第二抗体部分。在某些实施例中,第二抗原是肿瘤相关抗原。在某些实施例中,肿瘤相关抗原选自下组,该组由以下组成:Her-2,EGFR,PD-L1,MSLN,c-Met,B细胞成熟抗原(BCMA),碳酸酐酶IX(CA1X),癌胚抗原(CEA),CD5,CD7,CD10,CD19,CD20,CD22,CD30,CD33,CD34,CD38,CD41,CD44,CD47,CD49f,CD56,CD74,CD123,CD133,CD138,CD276(B7H3),上皮糖蛋白(EGP2),滋养层细胞表面抗原2(TROP-2),上皮糖蛋白-40(EGP-40),上皮细胞粘附分子(EpCAM),受体酪氨酸蛋白激酶erb-B2、3、4,叶酸结合蛋白(FBP),胎儿乙酰胆碱受体(AChR),叶酸受体-a,神经节苷脂G2(GD2),神经节苷脂G3(GD3),人端粒酶逆转录酶(hTERT),激酶插入结构域受体(KDR),LewisA(CA 1.9.9),Lewis Y(LeY),L1细胞粘附分子(L1CAM),粘蛋白16(Muc-16),粘蛋白1(Muc-1),NG2D配体,肿瘤胚胎抗原(h5T4),前列腺干细胞抗原(PSCA),前列腺特异性膜抗原(PSMA),肿瘤相关糖蛋白72(TAG-72),密封蛋白18.2(CLDN18.2),血管内皮生长因子R2(VEGF-R2),肾母细胞瘤蛋白(WT-1),1型酪氨酸蛋白激酶跨膜受体(ROR1),PVR,PVRL2及其任何组合。在某些实施例中,第二抗原是免疫检查点调节剂。在某些实施例中,免疫检查点调节剂选自下组,该组由以下组成:TIGIT、PD1、CTLA4、LAG-3、2B4、BTLA及其任何组合。在某些实施例中,抗体衍生物或多特异性抗体与第二抗原的结合抑制免疫检查点调节剂。在某些实施例中,第二抗原是免疫共刺激分子或T细胞受体/CD3复合物的亚基。在某些实施例中,免疫共刺激分子选自下组,该组由以下组成:CD28、ICOS、CD27、4-1BB、OX40、CD40及其任何组合。在某些实施例中,抗体衍生物或多特异性抗体与第二抗原的结合活化免疫共刺激分子。在某些实施例中,T细胞受体/CD3复合物的亚基选自下组,该组由以下组成:CD3γ、CD3δ、CD3ε及其任何组合。在某些实施例中,抗体衍生物或多特异性抗体与第二抗原的结合活化T细胞受体/CD3复合物。
在某些实施例中,抗GPC3抗体经由接头与第二抗原结合部分连接。在某些实施例中,接头是肽接头。在某些实施例中,肽接头包含约4至约30个氨基酸。在某些实施例中,肽接头包含约4至约15个氨基酸。在某些实施例中,肽接头包含选自由SEQ ID NO:16-50组成的组的氨基酸序列。
在某些实施例中,抗GPC3抗体缀合至治疗剂或标记。在某些实施例中,标记选自下组,该组由以下组成:放射性同位素、荧光染料和酶。
2.2抗体亲和力
在某些实施例中,本文披露的抗体或抗体衍生物对其靶抗原具有高结合亲和力。在某些实施例中,抗体或抗体衍生物以约1x 10
在某些实施例中,抗体或抗体衍生物以约1x 10
抗体或抗体衍生物的KD可以通过本领域已知的方法确定。这类方法包括但不限于蛋白质印迹、ELISA-、RIA-、ECL-、IRMA-、EIA-、Octet-
在某些实施例中,可以使用
2.3抗体片段
在某些实施例中,本披露的抗体包含抗原结合片段或抗体片段。抗体片段包括但不限于Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2、VHH、Fv和scFv片段,以及文中描述的其他片段。有关某些抗体片段的综述,参见Hudson等人Nat.Med.[自然医学]9:129-134(2003)。关于scFv片段的综述,参见例如,Pluckthtin,The Pharmacology ofMonoclonal Antibodies[单克隆抗体的药理学],第113卷,Rosenburg和Moore编辑,(Springer-Verlag[施普林格出版社],纽约),第269-315页(1994);还参见WO 93/16185;以及美国专利号5,571,894和5,587,458。关于包含补救受体结合表位残基并具有增加的体内半衰期的Fab和F(ab)
在某些实施例中,本披露的抗体可以是双抗体。双抗体是具有两个可以是二价或双特异性的抗原结合位点的抗体片段。参见例如,EP 404,097;WO 1993/01161;Hudson等人,Nat.Med.[自然医学]9:129-134(2003);和Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]90:6444-6448(1993)。三抗体和四抗体还描述于Hudson等人,Nat.Med.[自然医学]9:129-134(2003)中。
在某些实施例中,本披露的抗体可包含单结构域抗体。单结构域抗体是包含抗体的全部或部分重链可变结构域或全部或部分轻链可变结构域的抗体片段。在某些实施例中,单结构域抗体是人单结构域抗体(马萨诸塞州沃尔瑟姆Domantis公司(Domantis,Inc.,Waltham,MA);参见例如,美国专利号6,248,516Bl)。在某些实施例中,单结构域抗体是骆驼科动物单结构域抗体。在某些实施例中,单结构域抗体是VHH。在某些实施例中,单结构域抗体是人源化的。
抗体片段可以通过多种技术制备,这些技术包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)的生产,如本文所述。
2.4嵌合抗体和人源化抗体
在某些实施例中,本披露的抗体是嵌合抗体。某些嵌合抗体描述于,例如,美国专利号4,816,567;和Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊],81:6851-6855(1984))。在某些实施例中,嵌合抗体包含非人可变区(例如,源自小鼠的可变区)和人恒定区。在某些实施例中,嵌合抗体是其中类别或亚类已经从亲本抗体的类别或亚类改变的“类别转换”抗体。嵌合抗体包括其抗原结合片段。
在某些实施例中,本披露的抗体可以是人源化抗体。通常,将非人抗体进行人源化以减少对人的免疫原性,同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。通常,人源化抗体包含一个或多个可变结构域,其中HVR,例如CDR,(或其部分)衍生自非人抗体,而一个或多个框架(FR)(或其任何部分)源自人抗体序列。人源化抗体还可以任选地包含人恒定区的至少一部分。在某些实施例中,人源化抗体中的某些FR残基被来自非人抗体(例如,源自HVR残基的抗体)的相应残基取代,例如以恢复或改善抗体特异性或亲和力。
人源化抗体及其制备方法描述于例如Almagro和Fransson,Front.Biosci.[生物科学前沿]13:1619-1633(2008)中,并在例如以下中进一步描述:Riechmann等人,Nature[自然]332:323-329(1988);Queen等人,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]86:10029-10033(1989);美国专利号5,821,337、7,527,791、6,982,321和7,087,409;Kashmiri等人,Methods[方法]36:25-34(2005)(描述了SDR(a-CDR)移植);Padlan,Mol.Immunol.[分子免疫学]28:489-498(1991)(描述“重修表面”);Dall’Acqua等人,Methods[方法]36:43-60(2005)(描述了“FR改组”);和Osbourn等人,Methods[方法]36:61-68(2005)和Klimka等人,Br.J.Cancer[英国癌症杂志],83:252-260(2000)(描述了FR改组的“指导选择”方法)。
可用于人源化的人框架区包括但不限于:使用“最佳拟合”方法选择的框架区(参见,例如,Sims等人J.Immunol.[免疫学杂志]151:2296(1993));源自轻链或重链可变区的特定亚组的人抗体的共有序列的框架区(参见,例如,Carter等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊],89:4285(1992);和Presta等人J.Immunol.[免疫学杂志],151:2623(1993));人类成熟的(体细胞突变的)构架区或人种系框架区(参见,例如Almagro和Fransson,Front.Biosci.[生物科学前沿]13:1619-1633(2008));以及来源于筛选FR文库的框架区(参见例如,Baca等人,J.Biol.Chem.[生物化学杂志]272:10678-10684(1997)和Rosok等人,J.Biol.Chem.[生物化学杂志]271:22611-22618(1996))。
2.5人抗体
在某些实施例中,本披露的抗体可以是人抗体(例如,人结构域抗体或人DAb)。人抗体可以使用本领域中已知的不同技术产生。人抗体一般在van Dijk和van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol[当代药理学观点].5:368-74(2001),Lonberg,Curr.Opin.Immunol.[当代免疫学观点]20:450-459(2008)和Chen,Mol.Immunol.[分子免疫学]47(4):912-21(2010)中描述。能够产生完全人单结构域抗体(或DAb)的转基因小鼠或大鼠是本领域已知的。参见例如,US20090307787A1、美国专利号8,754,287、US 20150289489A1、US20100122358A1和WO 2004049794。
可以通过向转基因动物施用免疫原来制备人抗体(例如人DAb),该转基因动物已被修饰以响应抗原攻击而产生完整的人抗体或具有人可变区的完整抗体。这样的动物通常含有全部或部分的人免疫球蛋白基因座,它们取代了内源性免疫球蛋白基因座,或者存在于染色体外或随机整合到动物的染色体中。在这种转基因小鼠中,内源性免疫球蛋白基因座通常已被灭活。对于从转基因动物中获得人抗体的方法的综述,参见Lonberg,Nat.Biotech.[自然生物技术]23:1117-1125(2005)。还参见例如描述XENOMOUSE
人抗体(例如人DAb)也可以通过基于杂交瘤的方法来制备。已经描述了用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠人异源骨髓瘤细胞系(参见,例如,Kozbor J.Immunol.[免疫学杂志],133:3001(1984);Brodeur等人,Monoclonal Antibody ProductionTechniques and Applications[单克隆抗体生产技术及应用],第51-63页(MarcelDekker,Inc.[马塞尔德克尔公司],纽约,1987);和Boerner等人,J.Immunol.[免疫学杂志],147:86(1991))。通过人B细胞杂交瘤技术产生的人抗体也描述于Li等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊],103:3557-3562(2006)中。另外的方法包括例如在美国专利号7,189,826(描述从杂交瘤细胞系生产单克隆人IgM抗体)和Ni,Xiandai Mianyixue,26(4):265-268(2006)(描述人-人杂交瘤)中描述的那些方法。人杂交瘤技术(Trioma技术)也描述于Vollmers和Brandlein,Histology and Histopathology[组织学和组织病理学],20(3):927-937(2005)以及Vollmers和Brandlein,Methods andFindings in Experimental and Clinical Pharmacology[实验和临床药理学的方法和发现],27(3):185-91(2005)中。
人抗体(例如人DAb)也可以通过分离选自人源噬菌体展示文库的Fv克隆可变结构域序列来产生。然后可以将此类可变结构域序列与所需的人恒定结构域结合。从抗体文库中选择人抗体的技术描述如下。
2.6文库衍生的抗体
可以通过在组合文库中筛选具有所需活性或多种活性的抗体来分离本披露的抗体。例如,本领域已知多种用于产生噬菌体展示文库并筛选此类文库中具有所需结合特性的抗体的方法。这类方法在例如Hoogenboom等人Methods in MolecularBiology[分子生物学方法]178:1-37(O’Brien等人编辑,Human Press[哈门那出版社],Totowa,NJ[新泽西州托托瓦],2001)中描述,并且在以下文献中进一步描述:例如,McCafferty等人,Nature[自然]348:552-554;Clackson等人,Nature[自然]352:624-628(1991);Marks等人,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]222:581-597(1992);Marks和Bradbury,Methods inMolecular Biology[分子生物学方法]248:161-175(Lo,编辑,Human Press[哈门那出版社],Totowa,NJ[新泽西州托托瓦],2003);Sidhu等人,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]338(2):299-310(2004);Lee等人,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]340(5):1073-1093(2004);Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]101(34):12467-12472(2004);和Lee等人,J.Immunol.[免疫学杂志]Methods[方法]284(1-2):119-132(2004)。已经描述了用于构建单结构域抗体文库的方法,例如,参见美国专利号7371849。
在某些噬菌体展示方法中,通过聚合酶链反应(PCR)分别克隆V
从人抗体文库分离的抗体或抗体片段在本文中被视为人抗体或人抗体片段。
2.7抗体变体
本披露还提供了披露的抗体的氨基酸序列变体。例如,可能需要改善该抗体的结合亲和力和/或其他生物特性。可以通过将适当的修饰引入编码抗体的核苷酸序列中或通过肽合成来制备抗体的氨基酸序列变体。这样的修饰包括但不限于抗体的氨基酸序列内的残基的缺失和/或插入和/或取代。可以进行缺失、插入和取代的任何组合以得到最终的构建体,条件是最终的(即经过修饰的)抗体具有所需的特性(例如抗原结合)。
2.7.1取代、插入和缺失变体
在某些实施例中,提供了具有一个或多个氨基酸取代的抗体变体。取代诱变的目的位点包括HVR(或CDR)和FR。保守取代示于表2中“优选取代”标题之下。表2中在“示例性取代”的标题下提供了更实质的变化,并且如下文参考氨基酸侧链类别进一步描述的。氨基酸取代可以引入目的抗体中,并针对所希望的活性(例如保留/改善的抗原结合、降低的免疫原性、或改善的ADCC或CDC)筛选产物。
表2.氨基酸取代
氨基酸可以根据常见的侧链特性进行分组:(1)疏水性:正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile;(2)中性亲水性:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln;(3)酸性:Asp、Glu;(4)碱性:His、Lys、Arg;(5)影响链取向的残基:Gly、Pro;和(6)芳香性:Trp、Tyr、Phe。在某些实施例中,非保守取代将需要将这些类别中的一个的成员交换为另一个类别。
在某些实施例中,取代变体的一种类型涉及取代亲本抗体(例如,人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。通常,选择用于进一步研究的所得变体将相对于亲本抗体在某些生物学特性(例如,增加的亲和力、降低的免疫原性)上具有修饰(例如,改善)和/或将基本上保留了亲本抗体的某些生物学特性。示例性取代变体是亲和力成熟的抗体,该抗体可以方便地生成,例如使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术(例如本文披露的那些)。简而言之,对一个或多个HVR(或CDR)残基进行突变,并且将变体抗体在噬菌体上展示并针对特定生物学活性(例如结合亲和力)进行筛选。
可以在HVR(或CDR)中进行改变(例如,取代),例如以改善抗体亲和力。这样的改变可以在HVR(或CDR)“热点”,即,由在体细胞成熟过程中以高频率发生突变的密码子编码的残基(参见例如,Chowdhury,Methods Mol.Biol.[分子生物学方法]207:179-196(2008)),和/或SDR(a-CDR)中进行,测试所得变体VH或VL的结合亲和力。通过构建和从二级文库中重新选择而进行的亲和力成熟已经描述于例如,Hoogenboom等人Methods in MolecularBiology[分子生物学方法]178:1-37(O’Brien等人编辑,Human Press[哈门那出版社],Totowa,NJ[新泽西州托托瓦],(2001))中。在亲和力成熟的某些实施例中,通过多种方法(例如,易错PCR,链改组,或寡核苷酸定向诱变)中的任一种,将多样性引入选择用于成熟的可变基因中。然后产生二级文库。然后筛选文库以鉴别具有所希望的亲和力的任何抗体变体。引入多样性的另一种方法涉及HVR(或CDR)定向方法,其中使若干HVR(或CDR)残基(例如一次4-6个残基)随机化。可例如使用丙氨酸扫描诱变或模型化来特异性地鉴别抗原结合中涉及的HVR(或CDR)残基。特别是CDR-H3和CDR-L3经常成为靶标。
在某些实施例中,取代、插入或缺失可在一个或多个HVR(或CDR)内发生,只要这样的改变基本上不降低抗体结合抗原的能力。例如,可以在HVR(或CDR)中进行基本上不降低结合亲和力的保守改变(例如,如本文提供的保守取代)。此类改变可能在HVR(或CDR)“热点”或CDR之外。在以上提供的变体VHH序列的某些实施例中,每个HVR(或CDR)是未改变的,或包含不超过一个、两个或三个氨基酸取代。
如Cunningham andWells(1989)Science,244:1081-1085所述,用于鉴定可以靶向诱变的抗体的残基或区域的有用方法称为“丙氨酸扫描诱变”。在这种方法中,鉴定目标残基的残基或残基组(例如,带电荷的残基,例如Arg、Asp、His、Lys和Glu),并用中性或带负电荷的氨基酸(例如,丙氨酸或聚丙氨酸)取代,以确定抗体与抗原的相互作用是否受到影响。可以在氨基酸位置引入另外的取代,证明对初始取代的功能敏感性。可替代地或另外地,抗原-抗体复合物的晶体结构用于鉴定抗体和抗原之间的接触点。这样的接触残基和邻近残基可以被靶向或消除作为取代候选。可以筛选变体以确定它们是否包含所需的属性。
氨基酸序列插入包括氨基末端和/或羧基末端融合,长度在一个残基至含有一百个或更多残基的多肽的范围内,以及单一或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N末端甲硫氨酰基残基的抗体。抗体分子的其他插入变体包括与抗体的N-或C-末端与增加抗体的血清半衰期的酶(例如,对于ADEPT)或多肽融合。
2.7.2糖基化变体
在某些实施例中,改变抗体以增加或减少构建体糖基化的程度。向抗体中添加或缺失糖基化位点可通过改变氨基酸序列以产生或去除一个或多个糖基化位点而方便地实现。
当抗体包含Fc区(例如,scFv-Fc)时,与其相连的碳水化合物可以发生改变。由哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含分支的双触角寡糖,其通常通过N-键连接至Fc区C
在某些实施例中,抗体具有碳水化合物结构,该碳水化合物结构缺少(直接或间接)附接至Fc区的岩藻糖。例如,此类抗体中的岩藻糖含量可以为1%至80%、1%至65%、5%至65%或20%至40%。岩藻糖的量是通过计算Asn297糖链中岩藻糖的平均量来确定的,相对于通过MALDI-TOF质谱测量的与Asn297附接的所有糖结构(例如,复合、杂合和高甘露糖结构)的总和,如WO 2008/077546中所述。Asn297是指位于Fc区中约297位的天冬酰胺残基(Fc区残基的EU编号);然而,由于抗体中的微小序列变化,Asn297也可位于位置297上游或下游约±3个氨基酸,即在位置294和300之间。这类岩藻糖基化变体可以具有改善的ADCC功能。参见例如,美国专利公开号US2003/0157108(Presta,L.);US2004/0093621(协和发酵工业株式会社(Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd))。与“去岩藻糖基化”或“岩藻糖缺陷型”抗体变体有关的出版物实例包括:US2003/0157108;WO 2000/61739;WO 2001/29246;US2003/0115614;US2002/0164328;US2004/0093621;US2004/0132140;US 2004/0110704;US2004/0110282;US2004/0109865;WO 2003/085119;WO 2003/084570;WO 2005/035586;WO 2005/035778;WO2005/053742;WO2002/031140;Okazaki等人J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]336:1239-1249(2004);Yamane-Ohnuki等人Biotech.Bioeng.[生物技术和生物工程]87:614(2004)。能够产生去岩藻糖基化抗体的细胞系的实例包括蛋白质岩藻糖基化作用缺陷型的Lec13 CHO细胞(Ripka等人Arch.Biochem.Biophys.[生物化学与生物物理学集刊]249:533-545(1986);美国专利申请号US2003/0157108 A1,Presta,L;和WO 2004/056312 A1,Adams等人),以及敲除细胞系,例如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因FUT8,敲除CHO细胞(参见例如,Yamane-Ohnuki等人Biotech.Bioeng.[生物技术和生物工程]87:614(2004);Kanda,Y.等人,Biotechnol.Bioeng.[生物技术和生物工程],94(4):680-688(2006);和WO 2003/085107)。
在某些实施例中,抗体具有二等分的寡糖,例如其中附着于抗体的Fc区的双触角寡糖被GlcNAc二等分。此类抗体变体可以具有减少的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能。此类抗体变体的实例描述于例如WO 2003/011878(Jean-Mairet等人);美国专利号6,602,684(Umana等人);和US2005/0123546(Umana等人)中。还提供了在寡糖上具有至少一个连接至Fc区的半乳糖残基的抗体变体。此类抗体变体可以具有改善的CDC功能。此类抗体变体描述于例如WO 1997/30087(Patel等人);WO 1998/58964(Raju,S.);和WO 1999/22764(Raju,S.)中。
2.7.3Fc区变体
在某些实施例中,本公开的抗体或抗体衍生物的Fc区可包含人Fc区序列(例如,人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区),该序列包含在一个或多个氨基酸位置处的氨基酸修饰(例如,取代)。在某些实施例中,可将一个或多个氨基酸修饰引入抗体部分的Fc区(例如scFv-Fc或VHH-Fc)内,从而生成Fc区变体。
在某些实施例中,具有一些(但非全部)效应子功能的Fc区,此类功能使该区域成为适合应用的理想候选物,在这些应用中,抗体在体内的半衰期很重要,但某些效应子功能(例如,补体和ADCC)是非必要或有害的。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定确认CDC和/或ADCC活性的降低/消耗。例如,可以进行Fc受体(FcR)结合测定确保抗体没有FcγR结合能力(因此可能缺乏ADCC活性),但可以保留FcRn结合能力。用于介导ADCC的原代细胞NK细胞仅表达FcγRIII,而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞上的FcR表达总结在Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.[免疫学综述年鉴]9:457-492(1991)的第464页的表2中。用于评估目的分子的ADCC活性的体外测定的非限制性实例描述于美国专利号5,500,362(参见例如Hellstrom,I.等人Proc.Nat’l Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]83:7059-7063(1986))和Hellstrom,I等人,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]82:1499-1502(1985);5,821,337(参见Bruggemann,M.等人,J.Exp.Med.[实验医学杂志],166:1351-1361(1987))。可替代地,可以采用非放射性测定方法(例如,参见用于流式细胞术的ACTI
具有降低的效应子功能的抗体包括(美国专利号6,737,056),具有Fc区残基238、265、269、270、297、327和329中的一个或多个的取代的抗体。此类Fc突变体包括具有氨基酸位置265、269、270、297和327中的两个或更多个的取代的Fc突变体,包括具有残基265和297被丙氨酸取代的所称“DANA”Fc突变体(美国专利号7,332,581)。
描述了与FcR结合提高或降低的某些抗体变体。(参见例如,美国专利号6,737,056;WO 2004/056312和Shields等人,J.Biol.Chem.[生物化学杂志]9(2):6591-6604(2001).)
在某些实施例中,Fc区包含根据残基的EU编号的一个或多个突变。在某些实施例中,Fc区是IgG1 Fc区。在某些实施例中,IgG1 Fc区包含L234A突变和/或L235A突变。在某些实施例中,Fc区是IgG2或IgG4 Fc区。在某些实施例中,Fc区是包含F234A和/或L235A突变的IgG4 Fc区。
在某些实施例中,Fc区是IgG1 Fc区。在某些实施例中,IgG1 Fc区包含一种或多种修饰抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的突变。在某些实施例中,IgG1Fc区包含一种或多种降低抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的突变。在某些实施例中,IgG1 Fc区包含一种或多种增强抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的突变。在某些实施例中,IgG1Fc区包含L235V、F243L、R292P、Y300L和P396L的突变。在某些实施例中,IgG1 Fc区包含S239D、A330L和I332E的突变。在某些实施例中,IgG1 Fc区包含L235V、F243L、R292P和Y300L的突变。在某些实施例中,IgG1 Fc区包含在Fc区的位置298、333和/或334处的取代。在某些实施例中,IgG1 Fc区包含S267E和L328F的突变。
在某些实施例中,Fc区包含IgG4 Fc区。在某些实施例中,IgG4 Fc区包含S228P突变。
在某些实施例中,Fc区内发生改变,导致C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)发生改变(即,提高或降低),例如,如美国专利号6,194,551、WO 99/51642和Idusogie等人J.Immunol.[免疫学杂志]164:4178-4184(2000)中所述。
在某些实施例中,抗体(例如,scFv-Fc或VHH-Fc)变体包含变体Fc区,该区域包含一个或多个改变半衰期和/或改变与新生儿Fc受体(FcRn)的结合的氨基酸取代。具有延长的半衰期和与新生儿Fc受体(FcRn)的改善的结合的抗体,其负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer等人,J.Immunol.[免疫学杂志]117:587(1976)和Kim等人,J.Immunol.[免疫学杂志]24:249(1994)),描述于US2005/0014934A1(Hinton等人)中。那些抗体包含具有一个或多个取代的Fc区,其中这些取代改变了Fc区与FcRn的结合。此类Fc变体包括在一个或多个Fc区残基上具有取代(例如Fc区残基434的取代)的那些变体(美国专利号7,371,826)。
还参见Duncan&Winter,Nature 322:738-40(1988);美国专利号5,648,260;美国专利号5,624,821;以及关于Fc区变体的其他实例的WO 94/29351。
2.7.4半胱氨酸工程化抗体变体
在某些实施例中,可能需要产生半胱氨酸工程化抗体部分,例如“thioMAb”,其中抗体的一个或多个残基被半胱氨酸残基取代。在某些实施例中,取代的残基出现在抗体的可及位点处。通过用半胱氨酸取代那些残基,反应性硫醇基团由此位于抗体的可及位点,并可用于将抗体与其他部分,例如药物部分或接头-药物部分缀合,以产生免疫缀合物,如本文进一步所述。在某些实施例中,以下任何一个或多个残基可以被半胱氨酸取代:重链的A118(EU编号);以及重链Fc区的S400(EU编号)。半胱氨酸工程化抗体部分可以如例如美国专利号7,521,541中所述产生。
2.8抗体衍生物
在某些实施例中,本文所述的抗体可以被进一步修饰为包含本领域已知且容易获得的其他蛋白质或非蛋白质部分的抗体衍生物。适用于抗体衍生的非蛋白质部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括但不限于聚乙二醇(PEG),乙二醇/丙二醇,羧甲基纤维素,葡聚糖,聚乙烯醇,聚乙烯吡咯烷酮,聚-1,3-二氧戊环,聚-1,3,6-三氧杂环己烷,乙烯/马来酸酐共聚物,聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)和右旋糖酐或聚(正乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇,丙二醇均聚物,环氧丙烷/环氧乙烷共聚物,聚氧乙烯化多元醇(例如甘油),聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛由于在水中的稳定性而在制造中可能具有优势。该聚合物可以具有任何分子量,并且可以是支链或非支链的。连接至抗体的聚合物的数量可以变化,并且如果连接的聚合物多于一种,则它们可以是相同或不同的分子。一般而言,用于衍生化的聚合物的数量和/或类型可以基于以下考虑因素来确定,这些因素包括但不限于待改善抗体的特定性质或功能,是否将抗体衍生物用于确定的诊断条件等。
在某些实施例中,抗体可以被进一步修饰为包含一种或多种生物活性蛋白、多肽或其片段的抗体衍生物。如本文可互换使用的,“生物活性的”或“具有生物学活性的”是指在体内显示出执行特定功能的生物学活性。例如,它可能意味着与特定生物分子(例如蛋白质、DNA等)结合,然后促进或抑制这种生物分子的活性。在某些实施例中,生物活性蛋白或其片段包括:作为活性药物物质施用给患者的蛋白和多肽;用于预防或治疗疾病或病症、以及用于诊断目的的蛋白和多肽(例如诊断测试或体外测定中使用的酶);以及为预防疾病而施用给患者的蛋白质和多肽(例如疫苗)。
2.9生产方法
可以使用本领域中任何可用的或已知的技术来产生本文公开的抗体和抗体衍生物。例如但不限于,可以使用重组方法和组合物产生抗体和抗体衍生物,例如,如美国专利号4,816,567中所述。产生抗体和抗体衍生物的详细程序在以下实例中描述。
本公开的主题还提供了编码本文公开的抗体或抗体衍生物的分离的核酸。例如,分离的核酸可以编码包含抗体的VL的氨基酸序列和/或包含抗体的VH的氨基酸序列,例如抗体的轻链和/或重链。
在某些实施例中,核酸可以存在于一种或多种载体(例如表达载体)中。如本文所用,术语“载体”是指能够转运与其连接的另一种核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”,其是指可以将另外的DNA区段连接到其中的环状双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体,其中可以将另外的DNA区段连接到病毒基因组中。某些载体能够在它们被引入至其中的宿主细胞中自主复制(例如,具有细菌复制起点的细菌载体以及附加型哺乳动物载体)。其他载体(例如,非附加型哺乳动物载体)在引入到宿主细胞后被整合到宿主细胞的基因组中,并且从而随着宿主基因组一起复制。此外,某些载体表达载体能够指导它们可操作地连接的基因的表达。一般而言,用于重组DNA技术中的表达载体常常为质粒(载体)形式。但是,所公开的主题旨在包括具有等效功能的其他形式的表达载体,例如病毒载体(例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
可以在单个多顺反子表达盒、单个载体的多个表达盒或多个载体中构建本文公开的抗体或抗体衍生物的不同部分。产生多顺反子表达盒的元件的实例包括但不限于多种病毒和非病毒内部核糖体进入位点(IRES,例如,FGF-l IRES,FGF-2IRES,VEGF IRES,IGF-IIIRES,NF-kB IRES,RUNX1 IRES,p53 IRES,甲型肝炎IRES,丙型肝炎IRES,瘟病毒IRES,口蹄疫病毒IRES,小核糖核酸病毒IRES,脊髓灰质炎病毒IRES和脑心肌炎病毒IRES)和可裂解的接头(例如2A肽,例如P2A、T2A、E2A和F2A肽)。逆转录病毒载体和合适的包装线的组合也是合适的,其中衣壳蛋白将具有感染人细胞的功能。已知多种产生两亲性病毒的细胞系,包括但不限于PA12(Miller,等人(1985)Mol.Cell.Biol.[分子细胞生物学杂志]5:431-437);PA317(Miller,等人(1986)Mol.Cell.Biol.[分子细胞生物学杂志]6:2895-2902);和CRIP(Danos,等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]85:6460-6464)。非两亲性颗粒也是合适的,例如用VSVG、RD114或GALV包膜和本领域中任何其他已知的假型颗粒。
在某些实施例中,可以将编码本公开的抗体或抗体衍生物的核酸和/或包含核酸的一种或多种载体引入宿主细胞中。在某些实施例中,可以通过本领域已知的任何方法将核酸引入细胞中,这些方法包括但不限于转染、电穿孔、显微注射、用含有核酸序列的病毒或噬菌体载体感染、细胞融合、染色体介导的基因转移、微细胞介导的基因转移、原生质球融合等。在某些实施例中,宿主细胞可以包括,例如,已经用以下载体转化的宿主细胞:该载体包含编码包含单结构域抗体和/或单结构域抗体的VH的氨基酸序列的核酸。在某些实施例中,宿主细胞可以包括例如已经用以下转化的宿主细胞:(1)载体,其包含编码包含该抗体的VL的氨基酸序列和包含该抗体的VH的氨基酸序列的核酸,或(2)第一载体,其包含编码该抗体的VL的氨基酸序列的核酸,和第二载体,其包含编码包含该抗体的VH的氨基酸序列的核酸。在某些实施例中,宿主细胞是真核的,例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴细胞(例如,YO、NSO、Sp20细胞)。
在某些实施例中,制备本文公开的抗体或抗体衍生物的方法可以包括在适合于抗体或抗体衍生物表达的条件下培养其中已经引入了编码抗体或抗体衍生物的核酸的宿主细胞,以及任选地从宿主细胞和/或宿主细胞培养基中回收抗体或抗体衍生物。在某些实施例中,通过色谱技术从宿主细胞回收抗体或抗体衍生物。
为了重组产生本公开的抗体或抗体衍生物,可以分离编码例如如上所述的抗体或抗体衍生物的核酸,并将其插入一个或多个载体中,用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。可以使用常规程序(例如,通过使用能够特异性结合编码抗体或抗体衍生物的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)容易地分离和测序这些核酸。用于克隆或表达编码抗体的载体的合适宿主细胞包括本文所述的原核或真核细胞。例如,可以在细菌中产生抗体或抗体衍生物,特别是在不需要糖基化和Fc效应子功能时。对于在细菌中表达抗体片段和多肽,参见例如,美国专利号5,648,237、5,789,199和5,840,523。(还参见Charlton,Methods inMolecular Biology[分子生物学方法],第248卷(B.K.C.Lo编辑,Humana Press[哈门那出版社],Totowa,NJ[新泽西州托托瓦],2003),第245-254页,描述了抗体片段在大肠杆菌中的表达)在表达后,抗体或抗体衍生物可以以可溶性级分从细菌细胞糊中分离并可进一步纯化。
除原核生物外,真核微生物(例如丝状真菌或酵母菌)也是适合抗体编码载体的克隆或表达宿主,包括其糖基化途径已被“人源化”的真菌和酵母菌株,从而产生具有部分或完全人糖基化模式的抗体或抗体衍生物。参见Gemgross,Nat.Biotech.[自然生物技术]22:1409-1414(2004)和Li等人,Nat.Biotech.[自然生物技术]24:210-215(2006)。用于表达糖基化抗体的合适宿主细胞也可以源自多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已经鉴定出许多杆状病毒株,它们可以与昆虫细胞结合使用,特别是用于转染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。在某些实施例中,植物细胞培养物可以用作宿主细胞。参见例如美国专利号5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978和6,417,429(描述了在转基因植物中生产抗体的PLANTIBODIES
在某些实施例中,脊椎动物细胞也可以用作宿主。例如但不限于,适于悬浮生长的哺乳动物细胞系可能是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的非限制性实例是由SY40(COS-7)转化的猴肾CV1系;人胚胎肾系(293或293细胞,如例如在Graham等人,J GenViral.[普通病毒学杂志]36:59(1977)中描述);幼仓鼠肾细胞(BHK);小鼠塞托利(sertoli)细胞(TM4细胞,例如在Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980)中描述);猴肾细胞(CV 1);非洲绿猴肾细胞(VERO-76);人宫颈癌细胞(HELA);犬肾细胞(MDCK;水牛鼠(buffalo rat)肝细胞(BRL 3A);人肺细胞(W138);人肝细胞(Hep 02);小鼠乳房肿瘤(MMT060562);TRI细胞,例如在Mather等人,Annals N.Y.Acad.Sci.[纽约科学院年鉴]383:44-68(1982)中描述;MRC 5细胞;和FS4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞,包括DHFK CHO细胞(Urlaub等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]77:42I6(1980));和骨髓瘤细胞系(例如YO、NSO和Sp2/0)。对于某些适合抗体或抗体衍生物产生的哺乳动物宿主细胞系的综述,参见例如,Yazaki和Wu,Methods in MolecularBiology[分子生物学方法],第248卷(B.K.C.Lo编辑,Humana Press[哈门那出版社],Totowa,NJ[新泽西州托托瓦]),第255-268页(2003)。
在某些实施例中,用于制备双特异性和/或多特异性抗体的技术包括但不限于重组表达具有相同特异性的两个免疫球蛋白重链轻链对,其中一条或两条重链或轻链融合至具有不同特异性的抗原结合部分(例如,单结构域抗体,例如VHH),具有不同特异性的两个免疫球蛋白重链轻链对的重组共表达(参见Milstei n和Cuello,Nature[自然]305:537(1983)),PCT专利申请号WO 93/08829和Traunecker等人,EMBO J[欧洲分子生物学学会杂志]10:3655(l991))和“杵臼结构”工程化(参见例如,美国专利号5,731,168)。双特异性抗体也可以通过工程化静电转向效应来制备,以制备抗体Fc-异二聚体分子(WO 2009/089004A 1);交联两个或更多个抗体或片段(参见例如,美国专利号4,676,980和Brennan等人,Science[科学],229:81(1985));使用亮氨酸拉链产生双特异性抗体(参见例如,Kostelny等人,J Immunol.[免疫学杂志],148(5):1547-1553(1992));使用“双抗体”技术制备双特异性抗体片段(参见例如,Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊],90:6444-6448(1993));和使用单链Fv(sFv)二聚体(参见例如,Gruber等人,J.Immunol.[免疫学杂志],152:5368(1994));以及制备三特异性抗体,例如Tutt等人JImmunol.[免疫学杂志]147:60(1991)中所述。
本公开的双特异性和多特异性分子也可以使用化学技术(参见例如,Kranz(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]78:5807)、“polydoma”技术(参见例如美国专利4,474,893)或重组DNA技术制备。还可以使用本领域已知的和本文所述的方法,通过缀合组成型结合特异性,例如第一表位和第二表位结合特异性,来制备当前公开的主题的双特异性和多特异性分子。例如,但不限于,双特异性和多特异性分子的每种结合特异性可以通过重组融合蛋白技术一起产生,或者可以分开产生,然后彼此缀合。当结合特异性是蛋白质或肽时,可以使用多种偶联剂或交联剂进行共价结合。交联剂的非限制性实例包括蛋白A、碳二亚胺、N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基-硫代乙酸酯(SATA)、N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)和磺基琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯(磺基-SMCC)(参见例如,Karpovsky(1984)J.Exp.Med.[实验医学杂志]160:1686;Liu(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]82:8648)。其他方法包括由Paulus(Behring Ins.Mitt.[贝林研究所公告](1985)第78期,118-132;Brennan(1985)Science[科学]229:81-83),Glennie(1987)J Immunol.[免疫学杂志]139:2367-2375)所述的那些。当结合特异性是抗体(例如,两种人源化抗体)时,它们可以通过两条重链的C末端铰链区的巯基键合来缀合。在某些实施例中,在缀合之前,铰链区可以被修饰为包含奇数个(例如一个)巯基残基。
在某些实施例中,双特异性抗体的两种结合特异性可在同一载体中编码并在同一宿主细胞中表达和组装。当双特异性和多特异性分子是MAb x Mab、MAb x Fab、Fab x F(ab’)2或配体x Fab融合蛋白时,该方法特别有用。在某些实施例中,本公开的双特异性抗体可以是单链分子,例如单链双特异性抗体,包含一个单链抗体和结合决定簇的单链双特异性分子或包含两个结合决定簇的单链双特异性分子。双特异性和多特异性分子也可以是单链分子或可以包含至少两个单链分子。制备双特异性分子和多特异性分子的方法描述于例如美国专利号5,260,203;美国专利号5,455,030;美国专利号4,881,175;美国专利号5,132,405;美国专利号5,091,513;美国专利号5,476,786;美国专利号5,013,653;美国专利号5,258,498;以及美国专利号5,482,858中。本文还包括具有三个或更多个功能性抗原结合位点(例如,表位结合位点)的工程化抗体,包括“章鱼抗体”(参见例如US2006/0025576A1)。
在某些实施例中,动物系统可以用于产生本公开的抗体或抗体衍生物。用于制备杂交瘤的一种动物系统是鼠系统。
在小鼠中杂交瘤的产生是建立非常完善的程序。用于分离用于融合的经免疫的脾细胞的免疫方案和技术在本领域中是已知的。融合配偶体(例如鼠骨髓瘤细胞)和融合程序也是已知的(参见例如Harlow和Lane(1988),Antibodies,ALaboratory Manual[抗体:实验室手册],Cold Spring Harbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社],Cold SpringHarborNewYork[纽约冷泉港])。
2.10测定
本文提供的本公开的抗体和抗体衍生物可以通过本领域已知的和本文提供的多种测定法对其物理/化学性质和/或生物学活性进行鉴定、筛选或表征。
在某些实施例中,可以通过已知方法(例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)或蛋白质印迹测定)来测试本公开的抗体或抗体衍生物的抗原结合活性。这些测定中的每一种通常通过采用特异性针对目的复合物的经标记的试剂(例如,抗体)来检测具有特别意义的蛋白-抗体复合物的存在。例如,可以使用例如识别并特异性结合抗体或抗体衍生物的酶联抗体或抗体片段来检测抗体或抗体衍生物。可替代地,可以使用多种其他免疫测定中的任何一种来检测抗体或抗体衍生物。例如,可以将该抗体或抗体衍生物进行放射性标记并且在放射免疫测定(RIA)中使用(参见例如,Weintraub,B.,Principles ofRadioimmunoassays,Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques,TheEndocrine Society[放射免疫测定原理,第七期放射性配体测定技术培训课程(内分泌学会)],1986年3月,其通过引用并入本文)。可以通过这样的手段,如使用盖革(Geiger)计数器或闪烁计数器或通过放射自显影来对放射性同位素进行检测。
在某些实施例中,竞争测定法可用于鉴定与本公开的抗体竞争结合GPC3的抗体或抗体衍生物。在某些实施例中,这样的竞争性抗体结合与本文公开的抗体结合的相同表位(例如,线性或构象表位)。Morris(1996)“Epitope Mapping Protocols[表位定位方案],”Methods in Molecular Biology[分子生物学方法]第66卷(Humana Press[哈门那出版社],Totowa,NJ[新泽西州托托瓦])中提供了定位抗体所结合的表位的详细示例性方法。
在竞争测定的非限制性实例中,可以在包含与GPC3结合的第一标记抗体或抗体衍生物和第二未标记抗体的溶液中孵育固定的GPC3,测试第二未标记抗体与第一抗体竞争结合GPC3的能力。第二抗体可以存在于杂交瘤上清液中。作为对照,将固定的GPC3在包含第一标记抗体但不包含第二未标记抗体的溶液中孵育。在允许第一抗体与GPC3结合的条件下孵育后,去除过量的未结合抗体,并测量与固定的GPC3相关的标记的量。如果在测试样品中相比于对照样品的与固定的GPC3相关的标记的量大大减少,则表明第二抗体正在与第一抗体竞争结合GPC3。参见Harlow和Lane(1988)Antibodies:A Laboratory Manual[抗体:实验室手册]第14章(Cold Spring Harbor Laboratory[冷泉港实验室],Cold Spring Harbor,NY[纽约冷泉港])。
本公开提供了用于鉴定具有生物学活性的抗GPC3抗体或其抗体衍生物的测定法。生物学活性可以包括例如活化免疫细胞或免疫活化报告基因(例如NFAT报告基因或NF-κB报告基因)。还提供了在体内和/或体外具有这种生物学活性的抗体。
2.11免疫缀合物
本公开的主题还提供了免疫缀合物,其包含与一种或多种检测探针和/或细胞毒性剂(例如化学治疗剂或药物、生长抑制剂、毒素(例如,蛋白毒素,细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素、或其片段))或放射性同位素缀合的本文公开的抗体或抗体衍生物。例如,所公开的主题的抗体或抗原结合部分可以功能性地连接(例如,通过化学偶联、遗传融合、非共价缔合或其他方式)至一个或多个其他结合分子(例如另一种抗体、抗体片段、肽或结合模拟物)。
在某些实施例中,免疫缀合物是抗体药物缀合物(ADC),其中抗体缀合至一种或多种药物,包括但不限于美登木素生物碱(参见美国专利号5,208,020、5,416,064和欧洲专利EP 0425235);奥瑞他汀(auristatin),例如单甲基奥瑞他汀药物部分DE和DF(MMAE和MMAF)(参见美国专利号5,635,483和5,780,588,以及7,498,298);尾海兔素(dolastatin);卡里奇霉素(calicheamicin)或其衍生物(参见美国专利号5,712,374、5,714,586、5,739,116、5,767,285、5,770,701、5,770,710、5,773,001和5,877,296;Hinman等人,Cancer Res.[癌症研究]53:3336-3342(1993);和Lode等人,Cancer Res.[癌症研究]58:2925-2928(1998));蒽环霉素,如道诺霉素(daunomycin)或阿霉素(doxorubicin)(参见Kratz等人,Current Med Chem.[现代药物化学]13:477-523(2006);Jeffrey等人,Bioorganic&Med.Chem.Letters[生物有机化学与医药化学通讯]16:358-362(2006);Torgov等人,Bioconj.Chem.[生物缀合物化学]16:717-721(2005);Nagy等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]97:829-834(2000);Dubowchik等人,Bioorg.&Med.Chem.Letters[生物有机化学与医药化学通讯]12:1529-1532(2002);King等人,J Med.Chem.[药物化学杂志]45:4336-4343(2002);和美国专利号6,630,579);甲氨蝶呤;长春地辛;紫杉烷,例如多西他赛、紫杉醇、拉罗他赛、替塞他赛和奥他赛;单端孢霉烯(trichothecene);和CC1065。
在某些实施例中,免疫缀合物包含与酶活性毒素或其片段缀合的本文所述的抗体,所述酶活性毒素或其片段包括但不限于白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒蛋白A链、α-帚曲毒蛋白、油桐蛋白、香石竹毒蛋白、美洲商陆(Phytolacaamericana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制剂、麻疯树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥阜草(sapaonaria officinalis)抑制剂、多花白树毒蛋白、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酿霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)和单端孢霉烯(tricothecenes)。
在某些实施例中,免疫缀合物包含与放射性原子缀合以形成放射性缀合物的本文所述的抗体。多种放射性同位素可用于生产放射性缀合物。非限制性实例包括At
可以使用多种双功能蛋白偶联剂(例如,N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二巯基)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯的双功能衍生物(如二甲基己二亚氨酸酯HCl)、活性酯(如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛类(如戊二醛)、双叠氮化合物(如双(对叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(如双-(对重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(如甲代亚苯基2,6-二异氰酸酯)、和双活性氟化合物(如1,5-二氟-2,4-二硝基苯))制备抗体和细胞毒性剂的缀合物。例如,可以如Vitetta等人,Science[科学]238:1098(1987)描述的制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳4-标记的l-异硫氰酸基苄基-3-甲基二亚乙基三胺-五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体缀合的示例性螯合剂。参见WO 94/11026。接头可以是促进细胞毒性药物在细胞中释放的“可裂解接头”。例如,可以使用酸不稳定接头、肽酶敏感接头、光不稳定接头、二甲基接头或含二硫化物的接头(Chari等人,CancerRes.[癌症研究]52:127-131(1992);美国专利号5,208,020)。
本文的免疫缀合物或ADC明确涵盖但不限于用交联剂制备的此类缀合物,包括但不限于市售BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC、和磺基-SMPB、和SVSB(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)(例如,来自美国伊利诺伊州罗克福德的皮尔斯生物技术公司(Pierce Biotechnology,Inc.,Rockford,IL.,U.S.A))。
2.12抗原识别受体
本公开的主题还提供了包含本文公开的抗体或抗体片段的抗原识别受体。抗原识别受体是能够响应于其与抗原的结合而活化、刺激或抑制免疫应答细胞(例如T细胞)的受体。抗原识别受体的非限制性实例包括天然和重组T细胞受体(“TCR”)、嵌合共刺激受体(CCR)、嵌合抗原受体(“CAR”)或抑制性CAR(iCAR)。抗原识别受体设计和使用方法是本领域熟知的,并且描述于文献中,例如国际公开WO 2018/027155、WO 2019/099483、WO 2019/157454、WO 2019/133969、WO 2019/099993、WO 2015/142314、WO 2018/027197和WO2014055668。
在某些实施例中,本公开的主题提供了包含本文公开的抗体或抗体片段的嵌合抗原受体(CAR)。CAR是工程化受体,其可以将目的特异性移植或赋予给免疫效应细胞。在某些实施例中,CAR可用于将单克隆抗体的特异性移植到T细胞上;通过载体促进其编码序列的转移。在某些实施例中,CAR是“第一代”CAR,其通常由与跨膜结构域融合的胞外抗原结合结构域(例如scFv或VHH)组成,该跨膜结构域与胞质/胞内信号传导结构域融合。“第一代”CAR可以提供从头抗原识别并通过它们在单个融合分子中的CD3z链信号传导结构域引起免疫应答细胞(例如CD4+和CD8+T细胞)的活化,而与HLA介导的抗原呈递无关。在某些实施例中,CAR是“第二代”CAR,其进一步包含从各种共刺激分子(例如,CD28、4-1BB、ICOS、0X40、CD27、CD40/My88和NKGD2)到CAR的胞质尾区的胞内信号传导结构域以向免疫应答细胞提供额外信号,由此“第二代”CAR包含同时提供共刺激(例如,CD28或4-1BB)和活化(CD3z)的那些。在某些实施例中,CAR是“第三代”CAR,其包含多个共刺激结构域(例如,CD28和4-1BB)和活化(CD3z)。在某些实施例中,CAR是第二代CAR。在某些实施例中,CAR包含与抗原结合的胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域,其中该胞内信号传导结构域包含共刺激信号传导结构域。在某些实施例中,CAR还包含在胞外抗原结合结构域和跨膜结构域之间的铰链/间隔区。在某些实施例中,胞外抗原结合结构域包含本文公开的抗体或抗体片段。在某些实施例中,抗体或抗体片段包含VHH或scFv。
在某些实施例中,本公开的主题提供了包含本文公开的抗体或抗体片段的重组TCR。天然TCR是包含二硫键连接的异二聚体蛋白的蛋白复合物,该异二聚体蛋白由表达为与CD3链分子的复合物的一部分的两条可变链组成。天然TCR存在于T细胞表面,并负责将抗原识别为与主要组织相容性复合物(MHC)分子结合的肽。在某些实施例中,天然TCR包含α链和β链(分别由TRA和TRB基因编码)。在某些实施例中,TCR包含γ链和δ链(分别由TRG和TRD基因编码)。α链、β链、γ链和δ链各自包含两个胞外结构域:可变(V)区和恒定(C)区。恒定区靠近细胞膜,随后是跨膜区和短的胞质尾区。可变区与肽/MHC复合物结合。每个可变区具有三个互补决定区(CDR)。在某些实施例中,TCR包含与CD3δ、CD3γ、CD3ε和CD3ζ的受体复合物。当TCR复合物与其抗原和MHC(肽/MHC)结合时,表达TCR复合物的T细胞被活化。
在某些实施例中,重组TCR是非天然存在的TCR。在某些实施例中,重组TCR包含重组α链和/或重组b链,其中重组α链和/或重组b链的部分或整个可变区被本文公开的抗体或抗体片段替代。在某些实施例中,抗体或抗体片段包含VHH、VH、VL或scFv。在某些实施例中,抗体或抗体片段包含VHH。在某些实施例中,重组TCR以MHC/HLA非依赖性方式结合目的抗原。在某些非限制性实施例中,抗原的结合能够活化包含重组TCR的免疫应答细胞。
本公开的主题提供了免疫应答细胞,其包含(a)本文公开的抗原识别受体(例如,CAR或TCR)。在某些实施例中,抗原识别受体能够活化免疫应答细胞。本公开主题的免疫应答细胞可以是淋巴谱系的细胞。包含B、T和自然杀伤(NK)细胞的淋巴谱系提供抗体的产生、细胞免疫系统的调节、血液中外来试剂的检测、宿主外来细胞的检测等。淋巴谱系的免疫应答细胞的非限制性实例包括T细胞、自然杀伤(NK)细胞、胚胎干细胞和多能干细胞(例如,可从中分化淋巴细胞的那些)。T细胞可以是在胸腺中成熟并主要负责细胞介导的免疫的淋巴细胞。T细胞参与适应性免疫系统。本公开主题的T细胞可以是任何类型的T细胞,包括但不限于辅助T细胞、细胞毒性T细胞、记忆T细胞(包括中央记忆T细胞、干细胞样记忆T细胞(stem-cell-like memory T cell/stem-like memory T cell))和两种类型的效应记忆T细胞:例如,TEM细胞和TEMRA细胞、调节性T细胞(也称为抑制T细胞)、自然杀伤T细胞、粘膜相关不变T细胞和gd T细胞。细胞毒性T细胞(CTL或杀伤T细胞)是能够诱导受感染的体细胞或肿瘤细胞死亡的T淋巴细胞子集。患者自身的T细胞可通过引入抗原识别受体(例如CAR或TCR)进行遗传修饰以靶向特定抗原。在某些实施例中,免疫应答细胞是T细胞。T细胞可以是CD4+T细胞或CD8+T细胞。在某些实施例中,T细胞是CD4+T细胞。在某些实施例中,T细胞是CD8+T细胞。自然杀伤(NK)细胞可以是作为细胞介导的免疫的一部分并在先天免疫应答期间起作用的淋巴细胞。NK细胞不需要预先活化以对靶细胞进行细胞毒性作用。本公开主题的人淋巴细胞的类型包括但不限于外周供体淋巴细胞,例如以下公开的那些:Sadelain,M.,等人2003NatRev Cancer[癌症自然评论]3:35-45(公开了经遗传修饰以表达CAR的外周供体淋巴细胞)、Morgan,R.A.,等人2006Science[科学]314:126-129(公开了经遗传修饰以表达包含a和b异二聚体的全长肿瘤抗原识别T细胞受体复合物的外周供体淋巴细胞)、Panelli,M.C.,等人2000J Immunol[免疫学杂志]164:495-504;Panelli,M.C.,等人2000JImmunol[免疫学杂志]164:4382-4392(公开了源自肿瘤活检中肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的淋巴细胞培养物)、和Dupont,J.,等人2005Cancer Res[癌症研究]65:5417-5427;Papanicolaou,G.A.,等人2003Blood[血液]102:2498-2505(公开了使用人工抗原呈递细胞(AAPC)或脉冲树突状细胞选择性体外扩增抗原特异性外周血白细胞)。在某些实施例中,免疫应答细胞(例如,T细胞)可以是自体的、非自体的(例如,同种异体的)、或体外衍生自工程化的祖细胞或干细胞。
3.使用方法
本公开的主题进一步提供了使用公开的抗体和抗体衍生物的方法。在某些实施例中,这些方法涉及本公开的抗体或抗体衍生物的治疗用途。在某些实施例中,这些方法涉及本公开的抗体或抗体衍生物的诊断用途。
3.1治疗方法
本公开提供了本文公开的抗体或抗体衍生物用于治疗疾病和障碍或用于增强免疫应答的方法和用途。在某些实施例中,可以将本文公开的抗体,抗体衍生物或包含该抗体、抗体衍生物的药物组合物施用于受试者(例如哺乳动物(例如人))以治疗疾病和障碍或增强免疫应答。在某些实施例中,这些疾病和障碍涉及免疫检查点抑制和/或异常的GPC3活性。在某些实施例中,可以通过本文公开的抗体或抗体衍生物治疗的疾病和障碍包括但不限于瘤形成(例如癌症)。
在某些实施例中,本公开提供了本文所述的抗体或抗体衍生物(或其片段),用于制造药物。在某些实施例中,本公开提供了本文所述的抗体或抗体衍生物(或其片段),用于制造用于治疗癌症的药物。在某些实施例中,本公开提供了本文所述的抗体或抗体衍生物(或其片段),用于治疗受试者的癌症。在某些实施例中,本公开提供了包含本文提供的抗体或抗体衍生物(或其片段)的药物组合物,用于治疗受试者的癌症。在某些实施例中,癌症可以是血液癌(例如白血病、淋巴瘤和骨髓瘤)、卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌、脑癌、结肠癌、肠癌、肝癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、胃肿瘤、成胶质细胞瘤、喉癌、黑素瘤、神经母细胞瘤、腺癌、神经胶质瘤、软组织肉瘤和多种癌(包括前列腺癌和小细胞肺癌)。合适的癌还包括肿瘤学领域中的任何已知癌,包括但不限于星形细胞瘤、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、少突神经胶质瘤、室管膜细胞瘤、成神经管细胞瘤、原始神经外胚层肿瘤(PNET)、软骨肉瘤、骨原性肉瘤、胰腺导管腺癌、小细胞和大细胞肺腺癌、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、鳞状细胞癌、支气管肺泡癌、上皮腺癌、和其肝转移瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、肝癌、胆管癌、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、基底细胞癌、汗腺瘤、乳头状癌、皮脂腺癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、肾母细胞瘤、睾丸瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、成神经细胞瘤、视网膜母细胞瘤、白血病、多发性骨髓瘤、华氏巨球蛋白血症(Waldenstrom’s macroglobulinemia)、乳腺肿瘤(如导管腺癌和小叶腺癌)、子宫颈鳞状上皮和腺癌、子宫上皮癌和卵巢上皮性癌、前列腺腺癌、膀胱移行性鳞状细胞癌、B和T细胞淋巴瘤(结节性和弥散性)、浆细胞瘤、急性和慢性白血病、恶性黑素瘤、软组织肉瘤和平滑肌肉瘤。
在某些实施例中,癌症可以是黑素瘤、NSCLC、头颈癌、尿路上皮癌、乳腺癌(例如,三阴性乳腺癌、TNBC)、胃癌、胆管癌、经典型霍奇金淋巴瘤(cHL)、非霍奇金淋巴瘤原发性纵隔B-细胞淋巴瘤(NHLPMBCL)、间皮瘤、卵巢癌、肺癌(例如,小细胞肺癌)、食管癌、鼻咽癌(NPC)、胆道癌、结肠直肠癌、宫颈癌或甲状腺癌。
在某些实施例中,待治疗的受试者是哺乳动物(例如,人,非人灵长类、大鼠、小鼠、牛、马、猪、绵羊、山羊、狗、猫等)。在某些实施例中,受试者是人。在某些实施例中,受试者疑似患有癌症或有患癌症的风险、或被诊断患有具有异常GPC3表达或活性的癌症或任何其他疾病。
表现出异常的GPC3活性的许多癌症或任何其他疾病的诊断方法以及这些疾病的临床描述是本领域已知的。此类方法包括但不限于例如免疫组织化学、PCR、荧光原位杂交(FISH)。关于异常GPC3活性或表达的诊断方法的其他细节描述于例如Gupta等人(2009)ModPathol[现代病理学].22(1):128-133;Lopez-Rios等人(2013)J Clin Pathol.[临床病理学杂志]66(5):381-385;Ellison等人(2013)J Clin Pathol[临床病理学杂志]66(2):79-89;以及Guha等人(2013)PLoS ONE[美国科学公共图书馆-综合]8(6):e67782中。
可以通过任何合适的途径施用,包括例如静脉内、肌内或皮下。在一些实施例中,本文提供的抗体或抗体衍生物(或其片段)和/或组合物与第二、第三或第四药剂(包括例如抗肿瘤药、生长抑制剂、细胞毒性剂或化学治疗剂)组合施用,以治疗涉及异常GPC3活性的疾病或障碍。这类药剂包括例如多西他赛、吉非替尼、FOLFIRI(伊立替康、5-氟尿嘧啶和亚叶酸)、伊立替康、顺铂、卡铂、紫杉醇、贝伐单抗(抗VEGF抗体)、FOLFOX-4、输注氟尿嘧啶、亚叶酸和奥沙利铂、阿法替尼、吉西他滨、卡培他滨、培美曲塞、替万替尼、依维莫司、CpG-ODN、雷帕霉素、来那度胺、维罗非尼、内皮抑素、拉帕替尼、PX-866、Imprime PGG和伊洛替尼。在一些实施例中,将抗体或抗体衍生物(或其片段)缀合至另外的药剂。
在某些实施例中,本文提供的抗体或抗体衍生物(或其片段)和/或组合物与一种或多种其他疗法(例如放射疗法、手术、化学疗法、和/或靶向疗法)组合施用。在某些实施例中,本文提供的抗体、抗体衍生物(或其片段)和/或组合物与放射疗法组合施用。在某些实施例中,本文提供的抗体、抗体衍生物(或其片段)和/或组合物与放射疗法的组合用于治疗本文公开的赘生物或癌症。
取决于待治疗的适应症和本领域技术人员熟悉的与给药相关的因素,本文提供的抗体或抗体衍生物将以在最小化毒性和副作用的同时有效治疗该适应症的剂量施用。对于癌症的治疗,典型的剂量可以是例如在0.001至1000μg的范围内;然而,低于或高于该示例性范围的剂量在本发明的范围内。日剂量可以是总体重的约0.1μg/kg至约100mg/kg,总体重的约0.1μg/kg至约100μg/kg或总体重的约1μg/kg至约100μg/kg。如上提到的,可以通过定期评估治疗的患者来监测治疗或预防功效。对于经若干天或更长时间的重复施用,取决于病症,重复进行治疗直至发生所希望的疾病症状抑制。然而,其他剂量方案可能是有用的并且在本发明的范围内。所希望的剂量可通过单次推注施用组合物、通过多次推注施用组合物、或通过连续输注施用组合物来递送。
包含本文公开的抗体或抗体衍生物的药物组合物可以每天一次、两次、三次或四次施用。组合物也可以以低于每日施用的频率进行施用,例如,每周六次、每周五次、每周四次、每周三次、每周两次、每周一次、每两周一次、每三周一次、每月一次、每两个月一次、每三个月一次或每六个月一次。组合物也可以例如在植入物中以缓释配制品施用,该植入物逐渐释放该组合物以在一段时间内使用,并且允许该组合物以较低频率施用,例如每月一次、每2-6个月一次、每年一次、或甚至单次施用。缓释装置(例如圆粒剂型(pellet)、纳米颗粒、微粒、纳米球、微球等)可以通过注射或手术植入各种位置进行施用。
可以通过例如但不限于肿瘤消退、肿瘤重量或尺寸缩小、进展时间、存活持续时间、无进展存活、总体反应率、应答持续时间、生活质量、蛋白质表达和/或活性来评估癌症治疗。可以采用确定疗法功效的方法,包括例如通过放射成像测量反应。
在某些实施例中,将治疗功效测量为肿瘤生长抑制百分比(%TGI),使用等式100-(T/C x 100)进行计算,其中T是治疗的肿瘤的平均相对肿瘤体积,并且C是未治疗的肿瘤的平均相对肿瘤体积。在某些实施例中,%TGI是约10%、约20%、约30%、约40%、约50%、约60%、约70%、约80%、约90%、约91%、约92%、约93%)、约94%)、约95%、或多于95%。
3.2诊断和成像方法
经标记的抗体或抗体衍生物可用于诊断目的,以检测、诊断或监测与GPC3的表达、异常表达和/或活性相关的疾病和/或障碍。例如,本文提供的抗体和抗体衍生物可以用于原位、体内、离体和体外诊断测定或成像测定。用于检测GPC3多肽表达的方法,包括(a)使用一种或多种抗体或抗体衍生物测定多肽在个体的细胞(例如组织)或体液中的表达,和(b)比较该基因表达水平和标准基因表达水平,其中与标准表达水平相比,测定的基因表达水平的增加或减少指示异常表达。
本文提供的另外的实施例包括在动物(例如哺乳动物,如人)中诊断与GPC3的表达或异常表达相关的疾病或障碍的方法。这些方法包含在哺乳动物中检测GPC3分子。在某些实施例中,诊断包括:(a)向哺乳动物施用有效量的经标记的抗体或抗体衍生物;(b)在施用后等待一段时间间隔,以允许经标记的抗体或抗体衍生物优先浓缩在受试者的表达GPC3分子的部位(并且将未结合的经标记的分子清除至背景水平);(c)确定背景水平;和(d)检测受试者中经标记的分子,使得检测到高于背景水平的经标记的分子指示受试者患有与GPC3表达或异常表达相关的特定疾病或障碍。背景水平可以通过不同方法确定,这些方法包括将所检测到的标记的分子的量与先前针对一个具体系统确定的标准值进行对比。
本文提供的抗体和抗体衍生物可以用于使用本领域技术人员已知的经典免疫组织学方法来测定生物样品中蛋白质水平(例如,参见Jalkanen,等人,J.Cell.Biol.[细胞生物学杂志]101:976-985(1985);Jalkanen,等人,J.Cell.Biol.[细胞生物学杂志]105:3087-3096(1987))。有用于检测蛋白质基因表达的其他基于抗体的方法包括免疫测定,例如酶联免疫吸附测定(ELISA)和放射免疫测定(RIA)。合适的抗体测定标记是本领域中已知的并且包括酶标记(例如葡萄糖氧化酶);放射性同位素,例如碘(
本领域已知的技术可以应用于本文提供的经标记的抗体(或其片段)。此类技术包括但不限于使用双功能缀合剂(参见例如,美国专利号5,756,065;5,714,631;5,696,239;5,652,361;5,505,931;5,489,425;5,435,990;5,428,139;5,342,604;5,274,119;4,994,560;和5,808,003)。
可替代地,或另外地,可以测量细胞中编码GPC3多肽的核酸或mRNA的水平,例如经由使用对应于编码GPC3的核酸或其互补序列的基于核酸的探针的荧光原位杂交;(FISH;参见1998年10月公布的WO 98/45479),DNA印迹法、RNA印迹法或聚合酶链反应(PCR)技术,例如实时定量PCR(RT-PCR)。还可以通过测量生物流体(例如血清)中的脱落抗原来研究GPC3过表达,例如使用基于抗体的测定(还参见,例如,1990年6月12日发布的美国专利号4,933,294;1991年4月18日发布的WO 91/05264;1995年3月28日发布的美国专利号5,401,638;和Sias等人,J.Immunol.[免疫学杂志]Methods[方法]132:73-80(1990))。除了上述测定之外,本领域技术人员可获得各种体内和离体测定。例如,可以将哺乳动物体内的细胞暴露于抗体,该抗体任选地用可检测标记(例如放射性同位素)进行标记,并且可以例如通过外部扫描放射性或者通过分析取自先前暴露于该抗体的哺乳动物的样品(例如,活体标本检查或其他生物样品)来评估抗体与细胞的结合。
4.药物配制品
本披露的主题还提供了包含本文披露的抗体或抗体衍生物以及药学上可接受的载剂的药物配制品。在某些实施例中,药物组合物可以包含本披露的主题的多种(例如,两种或更多种)抗体和/或抗体衍生物的组合。
在某些实施例中,所披露的药物配制品可以通过将具有所需纯度的抗体或抗体衍生物与一种或多种任选的药学上可接受的载剂组合来制备(Remington's PharmaceuticalSciences[雷明顿药物科学]第16版,Osol,A.编辑(1980)),呈冻干配制品或水溶液形式。例如但不限于,冻干抗体配制品在美国专利号6,267,958中描述。在某些实施例中,水性抗体配制品可以包括在美国专利号6,171,586和WO 2006/044908中描述的那些,后者的配制品包括组氨酸-乙酸盐缓冲液。在某些实施例中,抗体或抗体衍生物可以具有大于约80%,大于约90%,大于约91%,大于约92%,大于约93%,大于约94%,大于95%,大于约96%,大于约97%,大于约98%,大于约99%,大于约99.1%,大于约99.2%,大于约99.3%,大于约99.4%,大于约99.5%,大于约99.6%,大于约99.7%,大于约99.8%或大于约99.9%的纯度。
药学上可接受的载剂通常在所采用的剂量和浓度下对接受者无毒,并且包括但不限于:缓冲液(例如磷酸盐、柠檬酸盐、以及其他有机酸);包括抗坏血酸和甲硫氨酸的抗氧化剂;防腐剂(例如氯化十八烷基二甲基苄基铵;氯化六甲铵;氯化苄烷铵、氯化苯乙铵;苯酚、丁醇或苯甲醇;烷基对羟苯甲酸酯(例如甲基或丙基对羟苯甲酸酯);邻苯二酚;间苯二酚;环己醇;3-戊醇;以及间甲酚);低分子量(少于约10个残基)多肽;蛋白,例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白;亲水性聚合物,例如聚乙烯吡咯酮;氨基酸,例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸、或赖氨酸;单糖、二糖、以及其他碳水化合物,包括葡萄糖、甘露糖、或糊精;螯合剂,例如EDTA;糖,例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇;成盐的计数离子,例如钠;金属络合物(例如Zn-蛋白络合物);和/或非离子型表面活性剂,例如聚乙二醇(PEG)。本文中的示例性药学上可接受的载剂还包括间质药物分散剂,例如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP),例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白,例如rHuPH20(
载剂可以适合于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊柱或表皮施用(例如,通过注射或输注)。根据施用途径,可以将活性化合物(例如,抗GPC3抗体)包被在一种材料中,以保护该化合物免受酸和其他可使化合物失活的自然条件的影响。
本披露的药物组合物也可以组合治疗,即与其他药剂组合施用。在某些实施例中,本文所披露的药物组合物还可以包含多于一种活性成分,这对于所治疗的特定适应症是必需的,例如,具有互补活性且不会产生互相不利影响的那些。在某些实施例中,药物配制品可包含用于治疗由第一治疗剂治疗的相同疾病的第二活性成分。此类活性成分合适地以对于预期目的有效的量组合存在。例如但不限于,本披露的配制品还可以包含多于一种活性成分,这对于所治疗的特定适应症是必要的,优选地是具有互补活性且不会产生互相不利影响的那些。例如,可能期望进一步提供可用于治疗相同疾病的第二治疗剂。此类活性成分合适地以对于预期目的有效的量组合存在。
本披露的组合物可以通过本领域已知的多种方法施用。施用途径和/或方式取决于所需结果。这些活性化合物可以用保护该化合物以便避免快速释放的载剂来制备,例如控释配制品,包括植入物、经皮贴片以及微囊化递送系统。可以使用生物可降解、生物相容的聚合物,如乙烯醋酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯、以及聚乳酸。制备这类配制品的许多方法由例如Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems[缓释和控释药物递送系统],J.R.Robinson,编辑,Marcel Dekker,Inc.[马塞尔德克尔公司],纽约,1978描述。在某些实施例中,药物组合物是在美国食品和药物管理局(U.S.Food andDrug Administration)的优质生产规范(Good Manufacturing Practice(GMP))条件下生产的。
也可以制备含有本文披露的抗体或抗体衍生物的缓释制剂。缓释制剂的适合的实例包括含有抗体或抗体衍生物的固体疏水聚合物的半透性基质,该基质处于成型制品的形式(例如薄膜或微胶囊)。在某些实施例中,可以将活性成分包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中,例如分别在胶体药物递送系统中(例如,脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)或在粗乳液中的羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊。此类技术披露于Remington's Pharmaceutical Sciences[雷明顿药物科学]第16版,Osol,A.编辑(1980)。
为了通过某些施用途径施用本披露的抗体或抗体衍生物,可能有必要用防止其失活的材料包被该化合物或与该化合物共同施用。例如,可以在合适的载剂(例如脂质体)或稀释剂中将化合物施用给受试者。药学上可接受的稀释剂包括盐水和缓冲水溶液。脂质体包括水包油包水型CGF乳液以及常规脂质体(Strejan等人(1984)J Neuroimmunol.[神经免疫学杂志]7:27)。
药学上可接受的载剂包括无菌水溶液或分散液以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。使用此类介质和试剂用于药物活性的物质是本领域中已知的。
除非任何常规介质或药剂与活性化合物不相容,否则可考虑将其用于本披露的药物组合物中。还可以将补充性活性化合物掺入组合物中。
治疗组合物通常必须是无菌的、基本等渗的,并且在生产和储存条件下是稳定的。该组合物可以配制为一种溶液、微乳液、脂质体,或适合于高药物浓度的其他有序结构。该载剂可以是含有以下物质的溶剂或分散介质:例如,水、乙醇、多元醇(例如,甘油、丙二醇、和液体聚乙二醇等),以及其适合的混合物。恰当的流动性可以(例如)通过使用包衣(如卵磷脂)来维持,在分散体的情况下通过维持所需的颗粒大小来维持,以及通过使用表面活性剂来维持。在许多情况下,在组合物中包括等渗剂,例如糖、多元醇(如甘露糖醇、山梨糖醇)或氯化钠将为优选的。可以通过在该组合物中包括例如单硬脂酸盐以及明胶的一种延迟吸收的药剂来实现这些可注射组合物的延长的吸收。
无菌注射溶液可通过将所需量的一种或多种本文披露的抗体或抗体衍生物根据需要与合适的溶剂与上面列举的一种或多种成分的组合掺入,然后进行灭菌微滤(例如通过无菌滤膜过滤)来制备。通常,分散液通过将活性化合物掺入无菌媒介物中来制备,该无菌媒介物含有基础分散介质和来自以上列举的那些的其他所需成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下,优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干),该方法从其先前的无菌过滤溶液中产生活性成分和任何其他所希望的成分的粉末。
还可以用本领域已知的医学装置来施用治疗性组合物。例如,本发明的治疗组合物可以与无针皮下注射装置一起施用,例如在美国专利号5,399,163、5,383,851、5,312,335、5,064,413、4,941,880、4,790,824或4,596,556中披露的装置。可用于本披露的植入物和模块的实例包括:美国专利号4,487,603,其披露了一种用于以受控的速率分配药物的植入式微输液泵;美国专利号4,486,194,其披露了一种用于通过皮肤施用药物的治疗装置;美国专利号4,447,233,其披露了一种用于以精确的输注速率输送药物的药物输注泵;美国专利号4,447,224,其披露了一种用于连续药物输送的可变流量可植入输注设备;美国专利号4,439,196,其披露了一种具有多室隔室的渗透药物递送系统;以及美国专利号4,475,196,其披露了一种渗透药物输送系统。已知许多其他此类植入物、递送系统和模块。
对于治疗组合物,本披露的配制品包括适于口服、经鼻、局部(包括经颊和经舌下)、直肠、阴道和/或肠胃外施用的那些配制品。这些配制品可以方便地以单位剂量形式存在并且可以通过药学领域已知的任何方法制备。可以与载剂材料组合以产生单一剂型的抗体或抗体衍生物的量根据所治疗的受试者和特定的施用方式而变化。可以与载剂材料结合以产生单一剂型的抗体或抗体衍生物的量通常是产生治疗效果的组合物的量。通常,以百分数计,这个量的范围是从约0.01%至约99%的活性成分,从约0.1%至约70%,或从约1%至约30%。
用于局部或经皮施用本披露的组合物的剂型包括散剂、喷雾剂、软膏剂、糊剂、乳膏剂、洗剂、凝胶剂、溶液、贴剂和吸入剂。可以将活性化合物在无菌条件下与药学上可接受的载剂和可能需要的任何防腐剂、缓冲剂或推进剂混合。
短语“肠胃外施用”和“经肠胃外施用”是指除了肠施用和局部施用之外的、通常通过注射的施用模式,并且包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眼眶内、心内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外以及胸骨内注射和输注。
这些药物组合物还可以含有辅助剂,例如防腐剂、润湿剂、乳化剂、和分散剂。预防存在微生物可以通过上述灭菌程序,以及通过包含不同抗细菌和抗真菌剂,例如对羟苯甲酸酯(paraben)、氯代丁醇、苯酚山梨酸等来确保。可能还希望将等渗剂,例如糖、氯化钠等包括于这些组合物中。此外,通过包括延迟吸收的试剂,例如单硬脂酸铝和明胶可以引起可注射药物形式的延长吸收。
在某些实施例中,当将本披露的抗体或抗体衍生物作为药物施用给人和动物时,它们可以单独或与药学上可接受的载剂组合的作为药物组合物给予,该药物组合物包含例如约0.01%至约99.5%(或约0.1%至约90%)的抗体或抗体衍生物。
5.制品
当前披露的主题还提供一种制品,该制品包含可用于治疗、预防和/或诊断上述障碍的材料。
在某些实施例中,制品包括容器以及在容器上或与容器相关联的标签或包装插入物。合适的容器的非限制性实例包括瓶、小瓶、注射器、IV溶液袋等。容器可以由多种材料(例如玻璃或塑料)形成。容器可以容纳(本身或与另一种组合物组合)有效治疗、预防和/或诊断病症的组合物,并且可具有无菌进入口(例如,容器可以是静脉内溶液袋或具有可由皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。
在某些实施例中,组合物中的至少一种活性剂是本披露的抗体或抗体衍生物。标签或包装插入物可指示该组合物用于治疗所选病症。
在某些实施例中,该制品可以包括(a)第一容器,该第一容器中装有组合物,其中该组合物包含本披露的抗体或抗体衍生物;以及(b)第二容器,其中装有组合物,其中该组合物包含其他细胞毒性或治疗剂。在某些实施例中,制品可以进一步包含包装插入物,其指示组合物可以用于治疗特定病症。
可替代地或另外地,制品可以进一步包括另外的容器,例如第二或第三容器,其包括药学上可接受的缓冲剂,例如但不限于注射用抑菌水(BWFI),磷酸盐缓冲盐水,林格氏溶液和右旋糖溶液。该制品可以包括从商业和用户角度所希望的其他材料,包括其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针头和注射器。
序列表
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以下实例仅是对本披露的主题的说明,不应以任何方式视为限制。
实例
实例1.抗GPC3 VHH抗体的产生和筛选
用C末端聚组氨酸标签或Fc标签构建重组人GPC3胞外结构域(ECD)蛋白的抗原并在内部纯化。使用最终体积为2ml的1mg免疫原和CFA/IFA佐剂的混合物,使用GPC3 ECD-His对美洲驼进行免疫接种。血清滴度和GPC3特异性抗体的存在通过ELISA使用在免疫前和52天时间点从测试血液中获得的血清来确认。然后收集全血,并分离PBMC。然后从PBMC中分离总RNA,并使用SuperScript IV逆转录酶第一链cDNA合成试剂盒(赛默飞世尔公司(ThermoFisher)#18091050)从总RNA合成抗体V区的cDNA。使用标准方案通过PCR从cDNA扩增VH和VHH抗体基因的可变区,使用的是与V区段退火的正向引物和在IgG1、2和3的美洲驼抗体同种型的CH2区中退火的反向引物。然后通过凝胶提取分离来自IgG2和IgG3美洲驼抗体的VHH基因。进行二级巢式PCR以扩增凝胶纯化的VHH基因的V区段,并添加限制酶位点5'和3'以克隆到噬菌粒载体pADL-23c(抗体设计实验室)中。将连接的DNA转化到电感受态TG1(Lucigen)细胞中(60μLTG1细胞中1.2μg DNA)。重复转化10次,达到10
为了鉴定抗GPC3特异性VHH抗体,将转化的TG1细胞在辅助噬菌体存在下在2xYT培养基中培养并孵育过夜。通过离心收获细胞培养物上清液中的噬菌体,并如前所述使用溶液相淘选进行人GPC3抗原结合物的淘选(Hawkins等人,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志],226(1992),第889页;Vaughan等人,Nat.Biotechnol.[自然生物技术],14(1996),第309页)。在淘选之前,将GPC3-His用EZ-Link磺基-NHS-LC-生物素,No-Weigh形式(赛默飞世尔公司#A39258)进行生物素化。然后将生物素化的人GPC3包被到链霉亲和素偶联的Dynabeads(赛默飞世尔公司#11206D)中。在一轮淘选后,洗脱GPC3的结合物,其用于感染SS320细胞。挑选SS320细胞的菌落并在Y2T培养基中培养,并加入IPTG以分泌VHH抗体。使用重组人GPC3包被板通过ELISA测定筛选具有VHH抗体的上清液。挑选阳性人GPC3结合物进行测序。选择具有不同序列的克隆用于对重组人C末端GPC3和食蟹猴GPC3蛋白进行额外的ELISA筛选。C末端ECD的结合物优于N末端ECD,因为C末端ECD更好地附接在细胞膜上,而N末端ECD更有可能被裂解并从细胞表面去除(图1A)。
使用标准方法使用板结合的GPC3蛋白进行ELISA测定。简而言之,通过在室温下与1μg/mL重组人GPC3-Fc、GPC3 His、GPC3 C末端(LSBIO#LS-G13157-10)或食蟹猴GPC3-His(安迪生物科技公司(R&D Systems))在PBS中孵育过夜来包被96孔ELISA板(Costar高结合(CostarHigh Binding))。然后用洗涤缓冲液PBST(PBS,0.05%Tween-20)洗涤板四次,并在室温下用5%牛奶的PBS溶液封闭1小时。弃去封闭溶液后,加入细菌上清液并在室温(RT)下孵育30分钟。用PBST洗涤孔3次,然后在室温下与抗c-Myc辣根过氧化物酶(HRP)(杰克逊免疫研究公司(Jackson Immuno Research),1:10,000稀释度)孵育30分钟。对于噬菌体ELISA,在室温下加入在PBST中以1:1000稀释的抗M13 mAb辣根过氧化物酶(HRP)缀合物(Amersham Pharmacia公司),持续30分钟。洗涤5次后,向每个孔中加入50μl的3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液(1-Step
为了评估体外抗原结合,设计了VHH二价嵌合抗体。将人IgG1 Fc融合到每个VHH的C末端以形成美洲驼-人嵌合二价(VHH-Fc,图1B)。将所得构建体在Expi-CHO瞬态系统中表达并在内部纯化。简而言之,通过离心澄清细胞培养基,然后使用0.2um过滤器进行无菌过滤。使用蛋白质A亲和色谱(例如GE的Mabselect)纯化澄清的收获物。洗脱的蛋白质用1MTris pH 8.5中和至pH 5.5。参考抗GPC3 VHH抗体HN3由美国国立卫生研究院开发,并在国际公开号WO 2012145469A1中披露。HN3的二价VHH-Fc形式作为对照抗GPC3 VHH抗体在内部制造。
图2描绘了通过流式细胞术的两个顶部VHH-Fc克隆与HepG2肝癌细胞系的结合能力。HepG2肝癌细胞内源性表达GPC3。HN3 VHH-Fc用作阳性对照。克隆1B01显示对HepG2肝癌细胞系的最佳结合活性,因此被选择用于人源化和进一步表征。
实例2.人源化抗GPC3 VHH-Fc二价抗体的产生
VHH基因与III族的人类VH3家族高度同源,除了FR2中的几个关键氨基酸取代,即Val37→Phe/Tyr,Gly44→Glu,Leu45→Arg和Trp47→Gly(Kabat编号)。为了使1B01抗体人源化,除上述2个关键残基外,将框架1、2、3和4中的“非人”残基替换为最接近的人类VH序列。从公开披露的IgGblast、Abysis和IMGT数据库中对1B01可变区进行同源性搜索。结果,使用IGHV3-64*04。将人源化1B01 VHH-Fc构建体克隆到表达载体(来自EMD密理博公司(EMDMillipore)的AS-puro)中,并通过瞬时转染ExpiCHO产生抗体蛋白并通过蛋白A纯化。上述HN3类似物用作阳性对照。
1B01 VHH-Fc与各种形式的GPC3蛋白的结合能力如图3A-3D所示。首先,与HN3类似物相比,1B01 VHH-Fc及其非岩藻糖基化形式(AF)显示出与人GPC3蛋白更强的结合(图3A)。此外,1B01 VHH-Fc及其非岩藻糖基化形式(AF)均与食蟹猴GPC3蛋白结合,而HN3类似物未显示与食蟹猴GPC3蛋白的任何结合(图3B)。相比之下,HN3与小鼠GPC3蛋白结合,而1B01VHH-Fc及其非岩藻糖基化形式(AF)均未显示与小鼠GPC3蛋白的任何结合(图3C)。此外,1B01 VHH-Fc及其非岩藻糖基化形式(AF)显示出与GPC3的人C末端ECD的强结合,而HN3与GPC3的C末端ECD没有结合(图3D),表明1B01和HN3与GPC3的不同区域结合。该结果与先前的报告一致,显示HN3与GPC3的N末端和C末端结构域形成的构象表位结合(参见WO2012145469A1)。由于N末端结构域可以在某些生理条件下被裂解并从细胞表面去除,因此与需要N末端结构域进行抗原结合的抗体(如HN3)相比,不依赖N末端结构域进行抗原结合的抗体(如1B01)可以具有更好的肿瘤靶向能力。
实例3.抗GPC3抗体1B01的体外表征
为了评估抗GPC3抗体1B01的结合活性,通过流式细胞术测量抗体对HepG2和Hep3人肝癌细胞系(从ATCC购买)的浓度依赖性结合,每种细胞系都内源性表达GPC3。这些细胞在补充有10%FBS的Eagle最低基础培养基(EMEM)中以单层形式生长。用1x PBS(吉布科公司(Gibco))冲洗细胞两次,并与预热的(37℃)0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液孵育5-7分钟。当细胞分离时,通过加入4倍体积的含有10%FBS的完全生长培养基,并通过以1x 10个细胞/mL在FACS缓冲液(1%FBS/PBS)中移液轻轻重悬细胞来中和胰蛋白酶。加入稀释至适当浓度的抗GPC3抗体,并在冰上反应30分钟。纯化抗体进行3倍连续稀释(总共8次稀释),起始浓度为100nM。用FACS缓冲液洗涤细胞一次,并在冰上加入山羊抗人IgG Fc-Alexa 488(杰克逊免疫化学公司(Jackson Immunochemicals))用于检测,持续30分钟。孵育后,将细胞以1500rpm离心3分钟,并除去上清液。将细胞悬浮在100μL FACS缓冲液中并进行流式细胞术。使用CytoFlex(贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter))作为流式细胞仪。
如图4A和4B所示,抗GPC3抗体1B01 VHH-Fc和HN3 VHH-Fc均以剂量依赖性方式与HepG2和Hep3B肝癌细胞系结合。1B01显示出与HepG2细胞的更强结合,而1B01和HN3与HepG2细胞的结合相似。这种差异可能是由于亲合力,因为与Hep3B细胞相比,HepG2细胞表达更高水平的GPC3。
此外,还评估了1B01引发针对人肝癌细胞系的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的能力。简而言之,通过梯度离心从肝素化血液样品中分离人外周血单个核细胞(hPBMC)。靶细胞HepG2和Hep3B细胞用BATDA双(乙酰氧基甲基)2,2’:6’,2”-三吡啶-6,6”-二羧酸酯)DELFIA试剂(解离增强型镧系荧光免疫测定,珀金埃尔默公司(Perkin Elmer))在37℃下以1×10
如图5所示,与对照相比,1B01 VHH-Fc、其非岩藻糖基化形式(AF)和HN3VHH-Fc均显示出剂量依赖性肿瘤溶解,并且与HN3类似物相比,两种形式的1B01在较低浓度下均显示出更强的肿瘤溶解。
实例4.抗GPC3抗体1B01的体内抗肿瘤功效
使用异种移植小鼠模型测定1B01的体内抗肿瘤功效。在含有100μl PBS培养基和MATRIGEL(BD生物科学公司(BD Bioscience))(比率为1:1)的溶液中以5x10
如图6所示,在2.6mg/kg的相对低剂量下,与媒介物对照组相比,使用1B01处理导致肿瘤体积减小。肿瘤生长抑制(TGI)率为约30%。相比之下,与媒介物对照组相比,使用相同剂量的HN3处理没有显示出肿瘤体积减小。尽管1B01和HN3在高得多的剂量下都可以抑制肿瘤生长(数据未显示),但低剂量的结果表明,在治疗性抗体难以在肿瘤微环境中达到高浓度的实体瘤中,与HN3类似物相比,1B01可具有增强的抗肿瘤功效。
除了所描绘和要求保护的各种实施例之外,所披露的主题还针对具有本文所披露和要求保护的特征的其他组合的其他实施例。这样,本文所呈现的特定特征可以在所披露的主题的范围内以其他方式彼此组合,使得所披露的主题包括本文所披露的特征的任何合适的组合。出于展示和说明的目的已经提出了所披露主题的特定实施例的以上说明。以上说明并不旨在是穷尽的或将所披露主题限制于所披露的那些实施例。
对于本领域技术人员将显而易见的是,在不脱离所披露主题的精神或范围的情况下,可以对所披露主题的组成和方法进行多种修改和变化。因此,预期的是所披露主题包括在所附权利要求书及其等同物范围之内的修改和变化。
本文引用了多种出版物、专利和专利申请,其内容通过引用以其整体特此并入。
序列表
<110>上海复宏汉霖生物技术股份有限公司(SHANGHAI HENLIUS BIOTECH, INC.)
<120>抗GPC3抗体和使用方法
<130>212948
<150>PCT/CN2021/089233
<151>2021-04-23
<160>50
<170>SIPO序列表1.0
<210>1
<211>8
<212>PRT
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<220>
<221>结构域
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<220>
<221>结构域
<222>(1)..(8)
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Ile Ser Thr Gly Gly Lys Ser Thr
1 5
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<220>
<221>结构域
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Ala Lys Gly Gly Lys Ser Arg Ser Tyr Tyr Ser Glu
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<220>
<221>结构域
<222>(1)..(119)
<223>4F3美洲驼VHH
<400>4
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
202530
Ile Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Leu Glu Trp Val
354045
Ala Thr Ile Ser Thr Gly Gly Lys Ser Thr Ala Tyr Ala Asp Ser Val
505560
Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Ile Asn Thr Ala Tyr
65707580
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
859095
Ala Lys Gly Gly Lys Ser Arg Ser Tyr Tyr Ser Glu Arg Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
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<400>8
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Val Gly Leu Pro Phe Ser Asn Tyr
202530
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Glu Glu Arg Glu Phe Val
354045
Ser Ala Val Ser Ala Asn Gly Gly Asn Glu Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
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Leu Arg Met Leu Ser Leu Lys Leu Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
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Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Val Gly Leu Pro Phe Ser Asn Tyr
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Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Phe Val
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Ser Ala Val Ser Ala Asn Gly Gly Asn Glu Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
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Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
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<223>1B01 VHH Fc
<400>13
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Val Gly Leu Pro Phe Ser Asn Tyr
202530
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Phe Val
354045
Ser Ala Val Ser Ala Asn Gly Gly Asn Glu Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
505560
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
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Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
859095
Ala Thr Val Arg Arg Arg Gly Gly Thr Phe Thr Val Gly Ser Tyr Arg
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp
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Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
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Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
145 150 155 160
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
165 170 175
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
180 185 190
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
195 200 205
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
210 215 220
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
225 230 235 240
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
245 250 255
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
260 265 270
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
275 280 285
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
290 295 300
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
305 310 315 320
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
325 330 335
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
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Gly Lys
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<212>PRT
<213>人工序列
<220>
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<400>14
Met Ala Gly Thr Val Arg Thr Ala Cys Leu Val Val Ala Met Leu Leu
1 5 1015
Ser Leu Asp Phe Pro Gly Gln Ala Gln Pro Pro Pro Pro Pro Pro Asp
202530
Ala Thr Cys His Gln Val Arg Ser Phe Phe Gln Arg Leu Gln Pro Gly
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Leu Lys Trp Val Pro Glu Thr Pro Val Pro Gly Ser Asp Leu Gln Val
505560
Cys Leu Pro Lys Gly Pro Thr Cys Cys Ser Arg Lys Met Glu Glu Lys
65707580
Tyr Gln Leu Thr Ala Arg Leu Asn Met Glu Gln Leu Leu Gln Ser Ala
859095
Ser Met Glu Leu Lys Phe Leu Ile Ile Gln Asn Ala Ala Val Phe Gln
100 105 110
Glu Ala Phe Glu Ile Val Val Arg His Ala Lys Asn Tyr Thr Asn Ala
115 120 125
Met Phe Lys Asn Asn Tyr Pro Ser Leu Thr Pro Gln Ala Phe Glu Phe
130 135 140
Val Gly Glu Phe Phe Thr Asp Val Ser Leu Tyr Ile Leu Gly Ser Asp
145 150 155 160
Ile Asn Val Asp Asp Met Val Asn Glu Leu Phe Asp Ser Leu Phe Pro
165 170 175
Val Ile Tyr Thr Gln Leu Met Asn Pro Gly Leu Pro Asp Ser Ala Leu
180 185 190
Asp Ile Asn Glu Cys Leu Arg Gly Ala Arg Arg Asp Leu Lys Val Phe
195 200 205
Gly Asn Phe Pro Lys Leu Ile Met Thr Gln Val Ser Lys Ser Leu Gln
210 215 220
Val Thr Arg Ile Phe Leu Gln Ala Leu Asn Leu Gly Ile Glu Val Ile
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Asn Thr Thr Asp His Leu Lys Phe Ser Lys Asp Cys Gly Arg Met Leu
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Thr Arg Met Trp Tyr Cys Ser Tyr Cys Gln Gly Leu Met Met Val Lys
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Pro Cys Gly Gly Tyr Cys Asn Val Val Met Gln Gly Cys Met Ala Gly
275 280 285
Val Val Glu Ile Asp Lys Tyr Trp Arg Glu Tyr Ile Leu Ser Leu Glu
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Glu Leu Val Asn Gly Met Tyr Arg Ile Tyr Asp Met Glu Asn Val Leu
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Leu Gly Leu Phe Ser Thr Ile His Asp Ser Ile Gln Tyr Val Gln Lys
325 330 335
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Phe Lys Tyr Pro Ile Phe Phe Leu Cys Ile Gly Leu Asp Leu Gln Ile
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Gly Lys Leu Cys Ala His Ser Gln Gln Arg Gln Tyr Arg Ser Ala Tyr
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Tyr Pro Glu Asp Leu Phe Ile Asp Lys Lys Val Leu Lys Val Ala His
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Val Glu His Glu Glu Thr Leu Ser Ser Arg Arg Arg Glu Leu Ile Gln
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Lys Leu Lys Ser Phe Ile Ser Phe Tyr Ser Ala Leu Pro Gly Tyr Ile
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Gln Glu Leu Val Glu Arg Tyr Ser Gln Lys Ala Ala Arg Asn Gly Met
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Lys Asn Gln Phe Asn Leu His Glu Leu Lys Met Lys Gly Pro Glu Pro
465 470 475 480
Val Val Ser Gln Ile Ile Asp Lys Leu Lys His Ile Asn Gln Leu Leu
485 490 495
Arg Thr Met Ser Met Pro Lys Gly Arg Val Leu Asp Lys Asn Leu Asp
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515 520 525
Ile Gly Gly Ser Gly Asp Gly Met Ile Lys Val Lys Asn Gln Leu Arg
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Asn Leu Gly Asn Val His Ser Pro Leu Lys Leu Leu Thr Ser Met Ala
580 585 590
Ile Ser Val Val Cys Phe Phe Phe Leu Val His
595 600
<210>15
<211>196
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>结构域
<222>(1)..(196)
<223>人GPC3多肽的C末端ECD
<400>15
Ser Ala Tyr Tyr Pro Glu Asp Leu Phe Ile Asp Lys Lys Val Leu Lys
1 5 1015
Val Ala His Val Glu His Glu Glu Thr Leu Ser Ser Arg Arg Arg Glu
202530
Leu Ile Gln Lys Leu Lys Ser Phe Ile Ser Phe Tyr Ser Ala Leu Pro
354045
Gly Tyr Ile Cys Ser His Ser Pro Val Ala Glu Asn Asp Thr Leu Cys
505560
Trp Asn Gly Gln Glu Leu Val Glu Arg Tyr Ser Gln Lys Ala Ala Arg
65707580
Asn Gly Met Lys Asn Gln Phe Asn Leu His Glu Leu Lys Met Lys Gly
859095
Pro Glu Pro Val Val Ser Gln Ile Ile Asp Lys Leu Lys His Ile Asn
100 105 110
Gln Leu Leu Arg Thr Met Ser Met Pro Lys Gly Arg Val Leu Asp Lys
115 120 125
Asn Leu Asp Glu Glu Gly Phe Glu Ser Gly Asp Cys Gly Asp Asp Glu
130 135 140
Asp Glu Cys Ile Gly Gly Ser Gly Asp Gly Met Ile Lys Val Lys Asn
145 150 155 160
Gln Leu Arg Phe Leu Ala Glu Leu Ala Tyr Asp Leu Asp Val Asp Asp
165 170 175
Ala Pro Gly Asn Ser Gln Gln Ala Thr Pro Lys Asp Asn Glu Ile Ser
180 185 190
Thr Phe His Asn
195
<210>16
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>结构域
<222>(1)..(10)
<223>示例性接头16
<400>16
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210>17
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>结构域
<222>(1)..(12)
<223>示例性接头17
<400>17
Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
1 5 10
<210>18
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>结构域
<222>(1)..(15)
<223>示例性接头18
<400>18
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 1015
<210>19
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>结构域
<222>(1)..(5)
<223>示例性接头19
<400>19
Gly Gly Gly Ser Gly
1 5
<210>20
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>结构域
<222>(1)..(10)
<223>示例性接头20
<400>20
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10
<210>21
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>结构域
<222>(1)..(8)
<223>示例性接头21
<400>21
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly
1 5
<210>22
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>结构域
<222>(1)..(12)
<223>示例性接头22
<400>22
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10
<210>23
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>结构域
<222>(1)..(6)
<223>示例性接头23
<400>23
Gly Ser Gly Gly Ser Gly
1 5
<210>24
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>结构域
<222>(1)..(9)
<223>示例性接头24
<400>24
Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
1 5
<210>25
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>结构域
<222>(1)..(7)
<223>示例性接头25
<400>25
Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5
<210>26
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>结构域
<222>(1)..(12)
<223>示例性接头26
<400>26
Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
1 5 10
<210>27
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>结构域
<222>(1)..(18)
<223>示例性接头27
<400>27
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 1015
Gly Gly
<210>28
<211>25
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>结构域
<222>(1)..(25)
<223>示例性接头28
<400>28
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 1015
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
2025
<210>29
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>结构域
<222>(1)..(30)
<223>示例性接头29
<400>29
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 1015
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
202530
<210>30
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>结构域
<222>(1)..(20)
<223>示例性接头30
<400>30
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 1015
Gly Gly Gly Ser
20
<210>31
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>结构域
<222>(1)..(5)
<223>示例性接头31
<400>31
Pro Ala Pro Ala Pro
1 5
<210>32
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>结构域
<222>(1)..(15)
<223>示例性接头32
<400>32
Pro Ala Pro Ala Pro Pro Ala Pro Ala Pro Pro Ala Pro Ala Pro
1 5 1015
<210>33
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>结构域
<222>(1)..(7)
<223>示例性接头33
<400>33
Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
1 5
<210>34
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>结构域
<222>(1)..(7)
<223>示例性接头34
<400>34
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
1 5
<210>35
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>结构域
<222>(1)..(10)
<223>示例性接头35
<400>35
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ala Ser Thr Lys
1 5 10
<210>36
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>结构域
<222>(1)..(36)
<223>示例性接头36
<400>36
Ala Ser Thr Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10
<210>37
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>结构域
<222>(1)..(4)
<223>示例性接头37
<400>37
Ala Ser Thr Lys
1
<210>38
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>结构域
<222>(1)..(12)
<223>示例性接头38
<400>38
Ala Ser Thr Lys Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
1 5 10
<210>39
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>结构域
<222>(1)..(7)
<223>示例性接头39
<400>39
Ala Glu Ala Ala Ala Lys Ala
1 5
<210>40
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>结构域
<222>(1)..(12)
<223>示例性接头40
<400>40
Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala
1 5 10
<210>41
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>结构域
<222>(1)..(10)
<223>示例性接头41
<400>41
Gly Arg Pro Gly Ser Gly Arg Pro Gly Ser
1 5 10
<210>42
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>结构域
<222>(1)..(20)
<223>示例性接头42
<400>42
Gly Arg Pro Gly Ser Gly Arg Pro Gly Ser Gly Arg Pro Gly Ser Gly
1 5 1015
Arg Pro Gly Ser
20
<210>43
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>结构域
<222>(1)..(10)
<223>示例性接头43
<400>43
Gly Arg Gly Gly Ser Gly Arg Gly Gly Ser
1 5 10
<210>44
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>结构域
<222>(1)..(20)
<223>示例性接头44
<400>44
Gly Arg Gly Gly Ser Gly Arg Gly Gly Ser Gly Arg Gly Gly Ser Gly
1 5 1015
Arg Gly Gly Ser
20
<210>45
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>结构域
<222>(1)..(10)
<223>示例性接头45
<400>45
Gly Lys Pro Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser
1 5 10
<210>46
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>结构域
<222>(1)..(20)
<223>示例性接头46
<400>46
Gly Lys Pro Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly
1 5 1015
Lys Pro Gly Ser
20
<210>47
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>结构域
<222>(1)..(10)
<223>示例性接头47
<400>47
Gly Glu Pro Gly Ser Gly Glu Pro Gly Ser
1 5 10
<210>48
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>结构域
<222>(1)..(20)
<223>示例性接头48
<400>48
Gly Glu Gly Gly Ser Gly Glu Gly Gly Ser Gly Glu Gly Gly Ser Gly
1 5 1015
Glu Gly Gly Ser
20
<210>49
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>结构域
<222>(1)..(10)
<223>示例性接头49
<400>49
Gly Asp Pro Gly Ser Gly Asp Pro Gly Ser
1 5 10
<210>50
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>结构域
<222>(1)..(20)
<223>示例性接头50
<400>50
Gly Asp Pro Gly Ser Gly Asp Pro Gly Ser Gly Asp Pro Gly Ser Gly
1 5 1015
Asp Pro Gly Ser
20
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