一种抗炎和抗新生血管的双功能融合蛋白及其应用

技术领域

本发明属于纳米生物医学技术领域，具体涉及一种抗炎和抗新生血管的双功能融合蛋白及其应用。

背景技术

功能蛋白在生物领域的应用吸引了研究者广泛的关注。基于蛋白质自身生物降解性和生物相容性，借助基因工程技术，实现对蛋白质的定向改造，进而赋予功能蛋白新的生物学功能。同时，采用的融合蛋白构建策略简单、方便、高效、表达量高及易于纯化。除上述优势，RhuA蛋白为多价结构，融合的功能肽具备多价效应，在生物医学领域具有潜在的应用前景。

新生血管性眼病是诸多与新生血管相关的眼病的统称，致盲率极高。其中包括眼底新生血管(脉络膜新生血管和视网膜新生血管)、角膜新生血管以及新生血管性青光眼。眼底新生血管易发生眼底局部组织出血和渗漏，导致视力损害。角膜新生血管破坏角膜局部微环境，改变角膜透明度，影响视力。新生血管性青光眼更是属于难治性青光眼，出现新生血管往往是病程的晚期，除了视力损害还伴有严重眼痛。

目前临床方案主要依靠抗血管内皮生成因子(Vascular Endothelial GrowthFactor，VEGF)的单克隆抗体或融合蛋白来治疗眼部新生血管。但是该类药物仍存在极大的改进空间。首先，现有的抗VEGF药物大多数治疗频率为每月一次，治疗较为频繁。其次，单一的抗VGEF治疗不能很好的缓解因新生血管渗漏而导致的炎性因子高表达，联合抗炎的治疗方案效果更佳。第三，广谱的抗VEGF在抑制新生血管的同时损伤正常血管功能。最后，单克隆抗体或融合蛋白价格昂贵。

因此，亟待开发高效多价、双功能、价格亲民的抗VEGF治疗策略。这既能提高治疗效率，减轻患者经济负担，又能降低社会致盲率，缓解医疗体系压力。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种抗炎和抗新生血管的双功能融合蛋白及其应用。具体的，本发明公开了一种抗炎和抗新生血管的双功能RhuA(L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶)蛋白及其在新生血管性眼病中的应用，包括脉络膜新生血管性眼病、视网膜新生血管性眼病、角膜新生血管、新生血管性青光眼等。并通过不同给药途径针对不同疾病进行治疗，例如，以眼内注药的形式治疗脉络膜新生血管、视网膜新生血管和新生血管性青光眼；以滴眼液的形式治疗角膜新生血管。

本发明基于RhuA蛋白研发一种新型抗VEGF策略，从而突破现有技术中的不足。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种抗炎和抗新生血管的双功能融合蛋白，所述双功能融合蛋白包括自组装单体和分别插入在自组装单体的氨基末端和羧基末端的功能结构域；

插入在自组装单体氨基末端的功能结构域为具有抗新生血管功能的多肽；

插入在自组装单体羧基末端的功能结构域为具有靶向血管和抗炎效果的多肽；

所述自组装单体为天然RhuA单体氨基酸序列，所述自组装单体自组装形成融合蛋白。

本发明将RhuA蛋白改造为双功能融合蛋白，通过其多价效应大幅提高治疗效果。

优选地，所述具有抗新生血管功能的多肽选自：APJ受体(一种A类G蛋白偶联受体)拮抗剂MM54、神经毡蛋白-1结合肽LPPR、驱动蛋白衍生的血管生成抑制多肽KAI或血管生成抑制肽HRH中任意一种。

优选地，所述具有靶向血管和抗炎效果的多肽选自：半胱氨酸蛋白酶-1抑制多肽Ac-YVAD-CHO、pm26TGF-β1肽或血管细胞粘附分子-1靶向肽VHP中任意一种。

优选地，所述双功能融合蛋白包括天然RhuA单体氨基酸序列和分别插入在天然RhuA单体氨基酸序列的氨基末端和羧基末端的功能结构域；插入在自组装单体氨基末端的功能结构域为血管生成抑制肽HRH；插入在自组装单体羧基末端的功能结构域为血管细胞粘附分子-1靶向肽VHP。

天然的RhuA蛋白是C

本发明在天然RhuA单体氨基酸序列的氨基末端插入HRH序列，羧基末端插入VHP序列，双功能RhuA蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明对RhuA蛋白进行理性设计，通过在氨基末端和羧基末端进行功能化肽修饰，实现了双功能RhuA蛋白的构建。本发明的改造方法步骤简单、条件温和，获得的融合蛋白明显提高功能肽的效果，这种以RhuA作为载体的双功能蛋白在眼部新生血管疾病中具有重大临床意义。

优选地，所述天然RhuA单体氨基酸序列如SEQ ID No.5所示。

优选地，所述血管生成抑制肽HRH的序列如SEQ ID No.3所示。

优选地，所述血管细胞粘附分子-1靶向肽VHP的序列如SEQ ID No.4所示。

优选地，所述双功能融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

第二方面，本发明提供一种核酸分子，所述核酸分子编码第一方面所述的抗炎和抗新生血管的双功能融合蛋白。

第三方面，本发明提供一种表达载体，所述表达载体插入有第二方面所述的核酸分子，并且所述表达载体能够在转染宿主细胞后，使被转染的宿主细胞表达第一方面所述的抗炎和抗新生血管的双功能融合蛋白。

第四方面，本发明提供一种重组细胞，所述重组细胞含有第三方面所述的表达载体，或者，所述重组细胞的基因组中整合有第二方面所述的核酸分子。

优选地，所述重组细胞包括大肠杆菌。

第五方面，本发明提供第一方面所述的抗炎和抗新生血管的双功能融合蛋白的制备方法，所述制备方法包括：

构建第三方面所述的表达载体；将所述表达载体转入宿主细胞并进行表达，获得氨基末端带有His-tag的目的蛋白，采用烟草蚀刻病毒蛋白酶酶切带有His-tag的目的蛋白，获得所述抗炎和抗新生血管的双功能融合蛋白。

本发明中，所述的氨基末端带有His-tag的目的蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示：

第六方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物的有效成分包括第一方面所述的抗炎和抗新生血管的双功能融合蛋白。

优选地，所述抗炎和抗新生血管的双功能融合蛋白采用眼内注射和滴眼液的方式给药。

优选地，所述抗炎和抗新生血管的双功能融合蛋白眼内注射的方式选自：玻璃体腔注药、视网膜下注药或脉络膜上腔注药中任一项。

第七方面，本发明提供第一方面所述的抗炎和抗新生血管的双功能融合蛋白在制备治疗新生血管性眼病的药物中应用。

优选地，所述新生血管性眼病的类型包括眼底新生血管、角膜新生血管和新生血管性青光眼。

优选地，所述眼底新生血管包括脉络膜新生血管和视网膜新生血管，和/或与脉络膜新生血管和视网膜新生血管相关的黄斑水肿。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

本发明将RhuA蛋白改造为双功能融合蛋白，通过其多价效应大幅提高单肽HRH的治疗效果，并利用VHP肽靶向血管，显著提高抗VEGF药物对新生血管性黄斑变性选择性治疗，从而改善治疗效果。本发明采用的方法新颖、步骤简单、条件温和，因而具有广阔的应用前景。

附图说明

图1是本发明实施例2所获双功能融合蛋白的SDS-PAGE图。

图2是本发明实施例2所获双功能融合蛋白的透射电子显微镜图。

图3是本发明实施例2所获双功能融合蛋白的质谱图。

图4是本发明实施例4融合蛋白治疗激光诱导脉络新生血管的无赤光眼底照相图，FFA图。

具体实施方式

发明详述

本发明的实施例中研发了一种双功能融合蛋白，是由天然RhuA单体氨基酸序列在氨基末端插入如SEQ ID No.3所示的HRH序列，在羧基末端插入如SEQ ID No.4所示的VHP序列形成。

进一步地，所述双功能融合蛋白的氨基酸如SEQ ID No.2所示。

本发明还提供了携带有双功能融合蛋白的编码基因的重组表达载体。

本发明实施例还提供了转化/转染有所述重组表达载体的宿主菌。

进一步地，所述宿主菌包括大肠杆菌。

本发明实施例还提供了构建所述双功能融合蛋白的方法，所述方法包括：

(1)以天然RhuA目的基因序列为模板，构建氨基末端带有His-tag标签的融合蛋白重组表达载体，其序列如SEQ ID No.1所示；

(2)将所述重组载体转入宿主细胞进行表达，获得氨基末端带有His-tag标签的融合蛋白；

(3)在缓冲溶液中用TEV酶切His-tag标签，获得所述双功能融合蛋白。

优选地，本发明中所述表达载体是经过酶切的PET32a质粒与经过酶切的目的序列经酶联而成。

优选地，所述双功能融合蛋白的制备方法包括：

(1)构建带His-tag的融合蛋白：将天然RhuA单体氨基酸序列氨基末端插入His-tag标签和HRH序列，羧基末端插入VHP序列，构建重组表达载体，在大肠杆菌中实现表达，获得带His-tag的融合蛋白；

(2)融合蛋白的制备：将表达结束后获得的带His-tag的融合蛋白用裂解缓冲液重悬，并置于冰上进行超声破碎，离心取上清液，之后进行过滤除杂、酶切、纯化处理。

优选地，所述纯化处理包括亲和层析柱纯化、透析纯化或硫酸铵纯化等，但不限于此。

优选地，所述双功能融合蛋白的制备方法还包括：通过化学修饰方式将荧光物质连接在所述双功能融合蛋白上。

作为本发明的优选技术方案，所述制备方法具体包括：

(1)构建带His-tag的融合蛋白

以CaCl

(2)融合蛋白的制备

将步骤(1)所得带His-tag的融合蛋白与TEV酶置于三(羟甲基)氨基甲烷、氯化钠、甘油、β-巯基乙醇缓冲液中于4℃酶切12-20小时，依次进行过滤除杂、亲和层析柱纯化、透析纯化，获得融合蛋白。通过SDS-PAGE进行定性分析，最后通过聚乙二醇20000(PEG 20000)透析浓缩、超滤离心管浓缩，利用酶联免疫检测仪测定浓度，再通过针头过滤器再次除杂获得高浓度的双功能融合蛋白。

更加具体地，上述双功能融合蛋白的制备方法，主要包括如下三个步骤：

步骤E1：在天然的RhuA单体氨基酸序列的氨基末端插入His-tag和HRH序列(SEQID No.3所示)，羧基末端插入VHP序列(SEQ ID No.4所示)，之后将突变后基因序列连接到载体中，转化、表达、分离纯化，获得带His-tag标签的目的蛋白(氨基酸序列为SEQ ID No.1所示)。

具体地，本步骤将在天然RhuA单体氨基酸序列氨基末端插入HRH肽和His-tag标签，羧基末端插入VHP肽，以此RhuA突变体序列为基准，并在熟知突变体氨基酸序列和天然RhuA单体的cDNA全基因序列前提下，方便于本领域普通技术人员获取和实现重组载体构建。随后将重组载体转入表达E.coli(DE3)感受态细胞，挑菌、培养及表达重组蛋白，其后经过离心、破碎、硫酸铵、亲和层析柱纯化以及过滤除杂，获得带His-tag标签融合蛋白。

步骤E2：His-tag标签融合蛋白酶切：将步骤E1所得带His-tag标签蛋白与TEV酶置于三(羟甲基)氨基甲烷、氯化钠、甘油、β-巯基乙醇缓冲液中，4℃酶切12-20小时，依次进行过滤除杂、亲和层析柱纯化、透析纯化，获得目的融合蛋白。

步骤E3：制备双功能融合蛋白：将步骤E2所得融合蛋白通过SDS-PAGE进行定性分析，最后通过PEG 20000透析浓缩、超滤离心管浓缩，利用酶联免疫检测仪测定浓度，再通过针头过滤器再次除杂，获得高浓度的双功能融合蛋白。

上述步骤中所涉及的试剂浓度，如RhuA融合蛋白、TEV酶以及纯化步骤中所用具体试剂浓度，均为本领域普通技术人员在上述制备方法的精神下，根据具体情况进行选择，均在本发明的保护范围之内。

本发明实施例还提供了所述双功能融合蛋白在新生血管性黄斑变性中的用途。

在一些实施例中，所述具体方法包括：激光诱导脉络膜新生血管动物模型构建、玻璃体腔注射蛋白、小鼠眼底荧光血管造影(FFA)、光学相干断层扫描(OCT)及脉络膜铺片。

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

以下具体实施例中所提及双功能融合和蛋白表示将RhuA衣壳蛋白单体氨基酸序列氨基末端插入HRH序列，羧基末端插入VHP序列形成的突变体，即为改造后的单体，所提及的重组表达载体PET32a-RhuA-HRH-VHP表示将RhuA-HRH-VHP的编码基因连接到质粒载体PET32a后所形成。下述具体实施例中所提及单位“mM”表示“mmol/L”(毫摩尔每升)。

实施例1带His-tag的融合蛋白表达质粒的构建、原核表达以及分离纯化

A1：根据野生型RhuA单体的cDNA核苷酸序列，通过分子生物学手段转入PET32a载体中，成功构建重组载体PET32a-RhuA-HRH-VHP。

A2：经DNA测序测定转入载体中突变体基因序列完全正确，后将重组载体PET32a-RhuA-HRH-VHP用CaCl

A3：带His-tag的RhuA-HRH-VHP(融合蛋白)纯化；将步骤A2所得上清液缓慢加入1.7M固体硫酸铵纯化，4℃静置30分钟，12000rpm离心收集沉淀。将沉淀用溶解缓冲液(10mM三(羟甲基)氨基甲烷，pH 7.5)重悬，低温下透析2-3次过夜。4℃下，12000rpm离心15分钟，取上清经0.22μm针头过滤器过滤除杂。将His Trap HP 5mL预装柱装入AKTA Prime plusFPLC系统中，先用上样缓冲液(20mM三(羟甲基)氨基甲烷，pH 7.5)平衡，后用系统上样，采用梯度洗脱，洗脱梯度为20mM、50mM、200mM、500mM咪唑，洗脱流速为5mL/min，在冰上分别收集洗脱峰。用SDS-PAGE检测目的蛋白，将500mM咪唑洗脱峰蛋白4℃透析2-3次(10mM三(羟甲基)氨基甲烷，pH 7.5)。

本实施例所得蛋白His-tag-RhuA-HRH-VHP即为突变后带His-tag的融合蛋白，氨基酸序列氨基末端插入His-tag和HRH，羧基末端插入VHP，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

实施例2融合蛋白标签酶切及分离纯化

将TEV酶缓慢加入带His-tag的融合蛋白中混合，置于酶切缓冲液(三(羟甲基)氨基甲烷、氯化钠、甘油、β-巯基乙醇，pH 7.4)，于4℃酶切12-20小时。溶液经0.22μm针头过滤器过滤除杂，同时将His Trap HP 5mL预装柱装入AKTA Prime plus FPLC系统中，先用上样缓冲液(20mM三(羟甲基)氨基甲烷，pH7.5)平衡，后系统上样，采用梯度洗脱，洗脱梯度为200mM、500mM咪唑，洗脱流速为5mL/min，在冰上分别收集洗脱峰。用SDS-PAGE检测目的蛋白，将500mM咪唑洗脱峰蛋白4℃透析2-3次(10mM三(羟甲基)氨基甲烷，pH7.5)，所获双功能融合蛋白SDS-PAGE图如图1所示，泳道M是蛋白分子量标准，泳道1是未诱导蛋白条带，泳道2是IPTG诱导后蛋白条带，泳道3是目标蛋白Rhua-HRH-VHP条带。从图1中可以看出通过纯化手段获得符合理论值的RhuA-HRH-VHP蛋白条带。

所获双功能融合蛋白的透射电子显微镜图如图2所示，从图2中可以看出RhuA-HRH-VHP蛋白结构组装正确。

对所得双功能融合蛋白进行质谱检测，所获双功能融合蛋白的质谱图如图3所示，从图3中可以看出RhuA-HRH-VHP分子量符合理论值。

实施例3双功能融合蛋白制备

将实施例2所得融合蛋白通过SDS-PAGE进行定性分析，通过PEG 20000透析浓缩、超滤离心管浓缩，利用酶联免疫检测仪测定浓度，再通过针头过滤器再次除杂获得高浓度的双功能融合蛋白。

实施例4双功能融合蛋白治疗脉络膜新生血管

(1)激光诱导脉络膜新生血管动物模型构建：进行激光操作前，予小鼠复方托吡卡胺滴眼液(美多丽)点眼，待瞳孔扩大。预配制终浓度为1.0％的戊巴比妥钠麻药溶剂，按0.2mL/10g体重的标准对小鼠进行腹腔注射，以达到全身麻醉的效果。药物起效时间为3-5分钟，药效维持时间约30分钟，在麻醉期间行激光诱导脉络膜损伤操作。532nm Nd：YAG激光参数：能量240mA，光斑大小50μm，光凝时长50ms每只小鼠均选择右眼进行操作，每眼激光爆破三次，激光斑置于视盘周围约3个视乳头直径范围内，避开血管，爆破后脉络膜玻璃膜(Bruch膜)前出现气泡表示爆破成功。

(2)玻璃体腔特异性注射蛋白方法：激光损伤造后使用33G显微注射器(WorldPrecision Instruments Inc.Florida，USA)将1μL的蛋白小鼠玻璃体腔注射。

(3)小鼠眼底荧光血管造影方法。小鼠激光诱导CNV造模后一周，进行研究荧光造影检测，以评估CNV面积和渗漏评分。行荧光造影操作前，予小鼠复方托吡卡胺滴眼液(美多丽)点眼，待瞳孔扩大。按0.2mL/10g戊巴比妥钠的原则对小鼠进行腹腔注射麻醉操作，并适当以玻璃酸钠滴眼液(爱丽)点眼，保护角膜上皮。麻醉成功后，拍摄小鼠眼底无赤光眼底照相。按60mg/kg的标准行小鼠腹腔荧光素钠注射，立即行眼底荧光造影，拍摄荧光照片。图像获得后，分别由两名研究人员各自读图，使用Image J软件计算CNV病灶面积。每只小鼠每眼CNV面积定义为三个光斑的平均面积。

图4为融合蛋白治疗激光诱导脉络新生血管的无赤光眼底照相图，FFA图，从图4中可知，RhuA-HRH-VHP蛋白可有效抑制CNV生成，治疗效果与阳性药物阿柏西普媲美。

综上所述，本发明藉由上述技术方案，构建RhuA-HRH-VHP双功能融合蛋白，利用RhuA蛋白的多价效应和VHP的血管靶向作用，显著提高了HRH单肽的治疗效果，实现了抗VEGF药物对新生血管性黄斑变性疾病的选择性治疗，改善了治疗效果，提供了一种新的策略。

本发明以上实施例提供的制备工艺步骤简单，条件温和，解决了现有技术中构建融合蛋白复杂的步骤、差的分散性和稳定性等技术问题；并且所获融合蛋白具有良好的分散性，稳定性和生物安全性，在生物成像、眼科疾病方向具有潜在的价值。

此外，本案发明人还参照前述实施例，以本说明书述及的其它原料、工艺操作、工艺条件进行了试验，并均获得了较为理想的结果。

应当理解，上述实施例仅为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。