ATP13A2蛋白或ATP13A2基因在制备改善阿尔茨海默病药物中的应用
文献发布时间:2024-04-18 19:58:53
技术领域
本发明涉及生物技术领域,特别是涉及一种ATP13A2蛋白或ATP13A2基因在制备改善阿尔茨海默病药物中的应用。
背景技术
阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种最常见的神经退行性疾病,在临床上表现为记忆障碍、失语、失用、失认等执行功能障碍,以及人格和行为完全改变为特征的痴呆症状,是发生在老年期及老年前期的一种慢性进行性退化性脑变性疾病。AD患者大脑萎缩,脑部聚集着大量的老年斑块和神经纤维缠结。AD一个主要病理特征即是神经原纤维缠结,是tau蛋白在细胞内形成的纤维聚集物,由于tau蛋白的过度磷酸化和乙酰化修饰导致微管聚合障碍,最终形成神经元纤维缠结。此外tau能够加速脊柱形成和树突伸长,并参与记忆通路,神经元活动与tau病理之间的直接关系仍有待确定。从最近的研究来看,似乎存在一种反馈机制,即神经元活动导致tau病理增加,从而改变神经传递,并进一步促进tau聚集和繁殖。
ATP13A2(ATPase cation transporting 13A2)属于三磷酸腺苷酶P5型超家族成员之一,其基因位于人类染色体1p36位点上,全长26kb,含有29个外显子,开放编码区含3543个核苷酸,共编码130kDa的1180个氨基酸,它定位于溶酶体和晚期核内体等酸性囊泡内,主要参与无机离子的跨膜转运。ATP13A2在哺乳动物细胞中发挥重要的生理功能,广泛表达于各个组织,在脑组织中表达水平最高。ATP13A2基因突变已参与了不同的神经变性疾病,过多的ATP13A2蛋白突变体可能会损害溶酶体膜的稳定性并抑制神经元中溶酶体对底物的清除作用。但是,目前尚未有关于ATP13A2和tau蛋白关联性的研究,以及对阿尔茨海默病的影响的相关报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种ATP13A2蛋白或ATP13A2基因在制备改善阿尔茨海默病药物中的应用,以解决上述现有技术存在的问题,本发明通过敲除小鼠的ATP13A2基因可以抑制Tau蛋白表达水平及磷酸化水平,改善阿尔茨海默病最典型的病理特征,为阿尔茨海默病的治疗提供了新靶点和新方法。
为实现上述目的,本发明提供了如下方案:
本发明提供ATP13A2蛋白或ATP13A2基因在制备调控tau蛋白表达水平和/或磷酸化水平产品中的应用。
进一步地,通过负调控ATP13A2蛋白或ATP13A2基因的表达量来抑制tau蛋白表达水平和/或磷酸化水平。
本发明还提供负调控ATP13A2蛋白或ATP13A2基因表达量的试剂在制备治疗因tau蛋白聚集和增殖介导的疾病药物中的应用。
进一步地,所述试剂包含如SEQ ID NO:1-4所示序列的gRNA。
进一步地,所述因tau蛋白聚集和增殖介导的疾病包括神经退行性疾病。
进一步地,所述神经退行性疾病包括阿尔茨海默病。
本发明还提供负调控ATP13A2蛋白或ATP13A2基因表达量的试剂在构建改善阿尔茨海默病的小鼠模型中的应用。
进一步地,所述试剂包含如SEQ ID NO:1-4所示序列的gRNA。
本发明公开了以下技术效果:
本发明发现ATP13A2蛋白与阿尔茨海默病等神经退行性疾病有关,通过敲除小鼠的ATP13A2基因可以抑制Tau蛋白表达水平及磷酸化水平,对阿尔茨海默病最典型的病理特征之一的tau蛋白水平显著升高有改善作用,为阿尔茨海默病的治疗提供了新靶点和新方法。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为同源重组载体的质粒图谱;图中Rep:复制起始位点,Amp:氨苄抗性筛选基因,5’homologous arm:5’同源臂,Flox region:Flox区域,3’homologous arm:3’同源臂;
图2为同源重组载体酶切鉴定图;1:EcoR I酶切鉴定结果;M:1kb DNA ladder;
图3为gRNA引导的Cas9酶切效率鉴定图;g-1:gRNA1;g-2:gRNA2;g-3:gRNA3;g-4:gRNA4;M:100bp DNA ladder;
图4为ATP13A2
图5为KO组和Ctrl组实验小鼠大脑皮层中tau蛋白和tau蛋白磷酸化水平的变化;A:Westernblot检测KO组和Ctrl组实验小鼠大脑皮层中tau蛋白表达情况和tau蛋白磷酸化水平;B:KO组和Ctrl组实验小鼠大脑皮层中tau蛋白和tau蛋白磷酸化的表达量分析(Means±SEM,n=4,*p<0.05,**p<0.01KO vs Ctrl);C:免疫组织化学染色显示KO组和Ctrl组实验小鼠大脑皮层中ATP13A2的表达情况(Bar1=200μm;Bar2=25μm);
图6为HEK293、HEK293KO细胞中tau蛋白和tau蛋白磷酸化水平的变化;A:Westernblot检测HEK293、HEK293KO细胞中ATP13A2、tau蛋白表达情况和tau蛋白磷酸化水平;B:HEK293、HEK293KO细胞中ATP13A2、tau蛋白和tau蛋白磷酸化的表达量分析(Means±SEM,n=4,*p<0.05,**p<0.01HEK293 vs HEK293KO)。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式,该详细说明不应认为是对本发明的限制,而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式,并非用于限制本发明。另外,对于本发明中的数值范围,应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值,以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明,否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料,但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入,用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时,以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下,可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化,这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等,均为开放性的用语,即意指包含但不限于。
本发明前期研究发现,ATP13A2与tau之间存在共定位现象,在tauP301S小鼠脑中ATP13A2表达降低,因此本发明以特异性敲除ATP13A2基因的ATP13A2flox/flox;Camk2a-Cre(KO)转基因小鼠和HEK293-ATP13A2KO(HEK293KO)细胞为研究对象,探讨ATP13A2与tau蛋白之间的关系,为研究阿尔茨海默病以及tau相关疾病的作用靶点提供了理论依据和实验基础。具体研究如下:
实施例1
1实验方法:
1.1转基因小鼠(ATP13A2flox/flox;Camk2a-Cre)的建立以及鉴定
(1)受精卵的准备:
筛选3-4周C57BL/6雌鼠,分别注射孕马血清(PMSG)与绒毛膜促性腺激素(HCG),两者时间间隔46-48h;注射HCG后将雌鼠与成年的可育雄鼠交配,使雌鼠受精;次日将雌鼠安乐死后,从输卵管内收集受精卵,放置37℃恒温5%的CO
(2)原核显微注射:
制备显微注射注射针和固定针;通过In-Fusion cloning的方法构建同源重组载体(donor vector),同源重组载体的质粒图谱如图1所示,核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示:
TTCTCATGTTTGACAGCTTATCATCGATAAGCTGCGGCCGCAAAGGCCGCGGTCGACAAGCTGGGCTCAAGCCTCGTCTCTGCCATGCGTGTCTTTATGTTGGTCTTTCATTCTTGGCCTGCCTTTTCTTGGGCTTTGTGTTTGGGTTTCTGGCTGAGTGCTGAGAAGGGTGTCAAACCTGGACCTTTTGCTCTACTGGAGCTATATTGTAATTTTGTTGTTGTTGTTGTTGTTGTTGTTTTGTTTTTTGAGATAGGGTTTCTCTCTGTAGCCCTGGCTGTTCTGGAACTCACTTTGTAGACCAGGCTGGCCTCGAACTCAGAAATCCGCCTGCCTCTGCCTCCCCAGTGCTGGGATTAAAGGCATGTGCCACCACACCCGGTGCAATCTTTGCATTATATTATTTAATCTTTTAAAGATTTGTTTTTAAAATGTTTGTGTGTGTATGTGTGTGTGTGGCTTTGAGGGGATTACAGAAGGTTGTGAATGCTGAAAAGCAAACTCATGTCCTCTAGGAGAGCTGACTGTACTCTTAACTGCTGAGGTAACTCTCCAGCCCCTATTATTTTTATTGTTTGAGATTGGGGTGTCATGTAGCCCAGGCTGGCCTCAAATCCAATACTTAGTCGTGGATGACCTTGGACTAATCCTGTTTGCATGTCTTCAGTGCTGGTATTACAGTCATGGGCCACTAAACCTAGCTCTCATTTTAAATCTGTGATCATTTTTATTACTATTTCCTGTGCACACATACTTTTGTCCCAGCCTGTGTGTGTCAGTCCGAGGACTTTTCCACCCCGACTCCCTGCTTGGAACTCAGGTCATGAGGTTTGTGCAGCCAGGGCCTTTGCCTGCTGTACCACCACCCCTCCCCCATTTTAAATGAGTCTCCTACTCTGCGCTTTTCTCGAGGCTGTGAGGGTGAATTAAAGGCCCTGTTCATCATAGCCAGCTTCCCCATTTGAGGTCATACGATTCAGGACCTGACTCTTCACAGCTGGGTTCCCGGTCTCTGACCAAGAACATTTCATTAGTTCCTCCCTCGCTGGGTGAACTACAATGTTGCCACTGCTGTGGGAGAGGCCCTCTGGCTGCCTGGGCTGTGACTCCGGAGAGCTCGAGAGCTTAGAGTTTCCATCCCCCAATGCCCACAGCCTGAGCAAGCCAGCTTTTGAGGTTGCCTTACCAGTGAGTCCTGGGACACTATCCCTTGATGGGTGATCAGTGGCTAAGCCTATCCAAGTGCTTTGAAGATGGCCTGTGCCCCTGCCAGACAGTGCATCACTGGGTGTGGCCCTTATGGACGCTCTAGAGGTTTCCTGAGATGTGACTTCCTCTTTTGGCAAGACCCTTTGCCCACCTTCCCCAGGCTGGCTGTGAACATCCTTGTGAAACACTGGGATTCATGATGGACACTGGGGTTTATGGTGGACACTGGAAAGAGCTTTCCAGATTAGCCCCCAGGGGCTGAGAGTAGGGAGGGGTCAGACACGGGGGTGGGGAGGCGCAAGGGGGCTGGCCCATGCCCTCCCTGTTCCGAAGTGCTTGGGTGTGAGTTCATTCAGTGTCCGCTGTGGTCAGGAACCAATGATCAAGGGTGAGAGTGCGGAGACCCATTTCCAGTCTCCAGCCCCTGGCAGAGTGGCCGTGGGAAACACAGCCCTTCCATTGGTAACCGCAGTAAGAGGCCATCTCGCTACTGCTGGCAGGTGGAACCAGGTCTCGTGATTGGCCCTGGGTTGGCTCTGTGACATCTTTATCAGCCTGAGCCCTGTCTAGCTGGTGTCCCAAGGGCCACAAGCTACAGGAAGGAGCGGCTGTTCAGGCCTGGAGGCCAGCACCCCTGCAGGTTTCTGTCTGGGTGATGAGAAAGGAGAGGAGATGCCACGCCCTGGTGGGAAGCCACACAGCTGGCACCAGCCTCAGATGCCCTTTATGACGCCGGCTGACACTCACTCCTCTCTTCCTCCACGTCGGTGTCGTCTCGCCGCACACACTATCGGCTTAGAGATTGGAAATGGAAGTCCAGAGAGGCTGGGGCACCTGCCTTATGAATCACAGCGTGGCAGAGAGGGCAGTTGATGATGGAGACATTAACTGTGGCTCTTGGGCAGGGTACCTCCCCACACCCGTTTCCCAGCTATAAAATAGAGATAGATGTGGTACCTGCTTGGTAGGGTTGTGTAGAGGAAAAAGCAGGTGATTATACTGCCTGGGTCAGCCCTTTGAAACCCTAAGGTGCTGTTTCCTGGCTATCTGGAAGGTGGCTGAGCCCCCACTCTTGACATCGTAGGCAGATGAGGGGCTCCAGCAGGAAAAGCTGCTGGTGATGGAGGACCTGAGAACTTCTTCCTGAACTTCCTGTCCGGGATTCAGGTCCCCTCAGAGAGAGCCAGCCTACTCCTTGGGGCCAAGGGAAAGAGATGATGTTCCTCTTGACTGGCTTTGCTCCTGTGCATGGTCTACGGTTCTGTGGGAGAGGGCCCACTGGCCGGGCTCTGGTTTGGCTATTTTCTGGGTCCCCAGCTTAAAGATGCCTCAGGTGGCATGGCACATCAGTTCCCAGCTGTTCTGTGTAGTGTGTGTGAAAGCCCGAGATGCCGACTTCCTGGCCCTTGTGGGCCTTAGTGGCCTAACCCCAGTTCCCTGAGAGTGGGTATCCATCCCAGGAGTAAGAACGGCTTCTGGAACGTGGGAAGTACGCTCTTTCATCAGTCCTGACTGCCACACCCAGATTTGTCTCTGTTTATTGTTTTGTTTTTCAAGATACTGCTTCTCTGGAACCAGATCTGTAGACCGGGCTGGCCTTGAACTCATAGAGATCAAGTGCCTCTGCCTCCTGAGCGCTGGGACTAAAGTTGTAGACCACCACCTCCCACCCTCGATTTGTCTTCGTTCAAGAACAATAAAACCTATTGTTTAATTATGAAAATAGTAAGCAAAACCAGTCTGAGAGCAACCTGCCTGGGCCTGCCTCCCTAGGCTCCATCTCCTTGCTGTGTGATCTTGGCCAAGTTATAATATCCTCCTCCCTTTTCTTTAAAATGGAGAGGGGAGGCTTGTGGGTAAAGTGCGAGCGTGAGGTCCAGAGTTGGGATCTCCTGGACCAACATAAAAAAGCTGCAGCACACACTTGAAATTCCGTCGCCATGGGGACAGAGACAGGCTGATCCTGGGGACACTCTCTAGCCAGCCTAGACTAACTGGTGAGCTCTCGGTTCAGGGAGAGACCCTGTCTCAAATGAAGTAAGGAGGAGGAGAATAAAGATTCCCAACCTCGCCGGGCGTGGTGGTACATGCCTTTAAGAATCCCAGCACTTAGGAGGCAGAGGCAGGCGGATTTCTGAGTTCGAGGCCAGCCTGGTCTACAGAGTGAGTTCCAGGACAGCCAGGGCTACACAGAGAAACCTTGTCTCCAAAAAACAAAAAAAAATTTAAAAAAAAATTTTAAAAATTCCCAACCTCAACTTCTGGCATGTGTGTGTGTGTGTGTACACTTGAGCCTGTACATGCACACACAAAACACACCTACACACAAAATAAATGAAAACTAAAATGGAGAGATACCTGGCAGACTTATTATGATAGCCATGTAAAAAGGGCTGGGGACAGAAGCCCACATGTGATTAGCTATCAAGCTGCAAGCATGGGAGACTTGCCACCTGCCTCTCACACACAAGCTCCGCCCAGCTGGTCAGGACCTTAATGGTCCTGGAGAAACTGCAGGAGGCTCAGCCTCTAGGGACTGAGCAGTCCAGGGACTAAGGCATGCTGTGACTACTGCAGCTTCGAGAGGAAAGAGGGACCTACTGGGTAGAAACTTCCAGAAAGACCTCTGCCCTGTTGGGACTACAGCCCTGCAGATGGGGAAGAAGGAGAAAGGGTCCTCCGCAGTGGCCTGGTTGGTGCTGGTCCCTGCCACTGACAGGATCAGGGTGGACTTGACTTTATAGAGCACTGGGCACCAGGTCTGAATGAGAACAGCCTGGCCCCTGCCCACGGGTGGCACTGTAGAAGGGTACGTGGATGAAATGCAGCACCCCATGGTAGTAGCAAGACTGTGCAGGGCAGTTGATGATGGAGACAATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATAGGGAGGGCAGTTACGTGCCTCTCTCTAACTCTGTCGAGAGATCACACTCGGGAGAGCTACGGGCCATTCAGTTCACAGGCTCAGAAGGCCTGAGGACAGAGTGACCAGTCTTGCCAGCTGCGGAAGGAAGAGGAGGCCTGGGGTTGTGGCCTGGCCCCGGGGTGGATTGTCTAGCACCGTAAGGGCCTGGGCTCCAGCCCCAGCACTGAGAAAGAAAGGCGCCTTCCCTTCTCTGACCTTTCTCCTTCCTGTCCACAGACAGCAGCCTGCTCATGGGCAGCACGCCCCCCAGCTATGGGACCCTGACGACAGGGACGTCAATCGATCCCCTCAGCTCCTCAGCTTCATCCGTGGTAGGTGGTGGTGGGTGGAGCGGCACTCTGTCTGCCCCAGTATCCTCCCGACATCTGTTCAGTCCCCCTGACTGCCCCCAGCTTCATCAGCCCTGTCTCCTGCATCCCCAGAGGCTCAGCGGCTACTGTGGCAGTCCATGGAGGGCCATCGGCTATCACGCCGCGGTCTGGATGCTGGCCGGGATCCCTTGGCTGCTATTCCGCTGGAAGCCCTTGTGGGGCGTGCGCCTGCGCCTGAAGCCATGCAGCCTGGCCCACGCCGAAACACTCGTTATAGAAATAAAAGACAAAGAGGTGAGTGAAGCCACGGGGTCTGAGGAGGAGTAACGGGGTACTGGGGTGCTCCGTGCAACCACCTTTGCCTTGGCTCGGGGTAGGCAGAAGGGAAGCCTTCATATTCCAGTATCCCAGTCTGAGCGGTGGACAGAGGCAGCCAGGTGTGGCCTGCTGGGCTCCCTTATATACTTCTTTAGAAAATGCTTTCTTAGTTTTCACCACCAAAGCCACATAGATAAGACTGTATCTG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ID NO:5)。
将核酸酶(CRISPR/Cas9 Nuclease mRNA,THERMOFISHERA29378)、引导RNA(gRNA)和donor vector显微注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中;将注射完毕的受精卵转移到M16培养基中,并放入37℃恒温5%的CO
表1
图2为同源重组载体酶切鉴定图;1:EcoR I酶切鉴定结果,理论条带大小为6.9kb、5.6kb、1.8kb、544bp(554bp条带因为产物量太少,无条带显示);M:1kb DNA ladder。
gRNA引导的Cas9酶切效率鉴定:cDNA 50ng,gRNA 10ng,Cas9酶1μL,10×缓冲液1μL,H
(1)制胶:将琼脂糖加入到锥形瓶中,用1×TAE放在微波炉中加热至完全溶解(2%),室温冷却至约60℃后加入溴化已锭溶液(终浓度0.5μg/ml)摇匀,将琼脂糖溶液倒入制胶板中,插入梳子,静置冷却凝固。
(2)点样:将琼脂糖凝胶放入水平电泳槽中,孔朝向负极加1×TAE,完全浸没凝胶。用DNA Loading Buffer将样品充分混匀将样品充分混匀,每孔加入10μL样品,空余一孔加入6μL DL2000 DNA Marker。
(3)电泳:恒压120V,30min,溴酚蓝印记跑至凝胶过半处,停止电泳。
(4)将凝胶置于BIORAD凝胶成像仪中显像。
结果如图3所示,gRNA1、gRNA2、gRNA3和gRNA4均能引导Cas9酶切,但是gRNA2和gRNA4引导的Cas9酶切效果比较理想,可作为后续实验的最佳选择。
(3)代孕鼠制备及胚胎移植:
选取适龄可育母鼠与输精管结扎后绝育的雄鼠交配,剌激母鼠发生一系列妊娠变化而得到假孕母鼠,作为受精卵转基因后的代孕鼠;将已经注射了外源基因的受精卵移植到见栓当天的代孕母鼠的输卵管内;移植后将代孕母鼠放在干净的笼盒中,并保温待其清醒后放回笼架饲养;输卵管移植成功后,母鼠会在手术后19-20d产仔。
(4)出生小鼠的鉴定:
采集1-2周龄的后代幼鼠尾巴组织,对组织进行裂解和提取基因组,用针对目的基因的特异性引物进行PCR扩增及电泳检测,筛选出外源基因整合的后代。鼠尾DNA提取:将待检测的鼠尾剪下2-3mm,并进行编号,放置于对应的1.5mLEP管中,每管加入60μL的NaOH(25mM)和EDTA(0.2mM)的混合液,放入96℃煮样器煮1h。取出置于冰上,每管加入60μL的Tris-HCl(40mM,pH=5.5),混匀后4000rpm离心3min,取上清加入PCR体系进行琼脂糖凝胶电泳检测,鉴定出需要的转基因小鼠。
ATP13A2基因鉴定:
表2 ATP13A2基因引物序列
表3 ATP13A2 PCR反应体系
PCR扩增反应条件:94℃预变性2min;94℃变性30s,62℃退火35s,72℃延伸35s,后延伸72℃,5min,共35个循环。
选取ATP13A2
Camk2a-Cre基因鉴定:
表4 Camk2a-Cre基因引物序列
表5 Camk2a-Cre PCR反应体系
PCR扩增反应条件:94℃预变性2min;94℃变性30s,62℃退火35s,72℃延伸35s,后延伸72℃,5min,共35个循环。
1.2动物组织取材
(1)灌流:将要取材小鼠麻醉,将小鼠置于灌流通风处内,固定四肢和头部,剪开腹腔及胸腔,暴露心脏,将灌流针的针头从左心室插至右心房,止血钳固定后,剪开右心耳,打开灌流泵,使用0.9%生理盐水灌流,然后用自来水冲洗胸腔残留的血液,观察到小鼠肝脏变白且流出无色透明的灌流液后,即可终止灌流。
(2)解剖:解剖取出小鼠的整个脑组织,注意不要让解剖器具刮伤到大脑皮层表面。沿矢状缝方向将小鼠大脑分成左右两半,一半放入4%多聚甲醛中进行固定,放4℃冰箱备用;另一半剥离海马、皮层、小脑,分别装入1.5mL EP管,冷冻在-80℃冰箱备用。
1.3主要抗体
表6主要抗体列表
1.4免疫组织化学染色
1.4.1石蜡包埋
(1)脱水:将在4%多聚甲醛固定48h的脑组织进行修块后脱水,第一天依次进ddH
(2)包埋:二甲苯透明15-30min后,根据脑组织块的大小调整透明时间;将组织在软蜡中浸泡1.5h,再更换硬蜡中浸泡1.5h后,用包埋盒用蜡液进行包埋,标记好名称。
(3)切片:待组织在蜡中常温凝固后,取出蜡块,使用石蜡切片机切5μm厚度的组织切片,标记好名称、日期,保存待用。
1.4.2免疫组织化学染色
(1)脱蜡:将所需的石蜡切片脱蜡,100%二甲苯I10min,100%二甲苯II 10min,100%乙醇I10min,95%乙醇I10min,95%乙醇II 5min,90%乙醇I 5min,80%乙醇5min,70%乙醇5min,最后PBS清洗5min×3次。
(2)抗原修复:将柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液(pH=6.0)在微波炉中大火3-5min煮沸,然后将片子浸泡在缓冲液中,小火1-2min,之后室温放置30min降温,PBS清洗5min×3次。
(3)阻断:用组化笔在组织周围画圈,使用过氧化物酶阻断剂滴加在组织上10min,用PBS清洗5min,3次。
(4)封闭:将羊血清滴加到组织上,室温封闭1h。
(5)一抗孵育:洗掉封闭液,将按比例稀释好的抗体滴加到组织上,4℃过夜。
(6)二抗孵育:将一抗吸除后,PBS清洗5min,3次,滴加二抗,室温孵育1h。
(7)三抗孵育:将二抗吸除后,PBS清洗5min,3次,滴加三抗红色链霉素,室温孵育1h。
(8)DAB显色:将片子放入到配制好的DAB显色液中30s-2min,在显微镜下观察阳性反应,显色反应结束后放入ddH
(9)脱水:70%乙醇5min,80%乙醇5min,90%乙醇I 5min,95%乙醇I 5min,95%乙醇II 5min,100%二甲苯I10min,100%二甲苯II 10min,100%二甲苯I10min,
100%二甲苯II 10min。
(10)封片:使用中性树脂封片,通风橱晾干。
(11)光学显微镜下采集图像和分析。
1.5蛋白提取
1.5.1细胞提蛋白
(1)从细胞间将细胞取出来,倒掉培养液,用预冷的PBS清洗细胞2次,在4℃直立放置控水3min。
(2)用负压除去残留的PBS,加入适量含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液,使用细胞刮板将细胞从皿底刮下,冰上操作,转移至1.5mL离心管中,冰上裂解30min。
(3)使用4℃离心机13000rpm条件下离心30min。
(4)收集蛋白上清液转移到新的1.5mL离心管中,做好标记,于-80℃冰箱保存。
1.5.2组织提蛋白
(1)取适量的组织放入1.5mL离心管中,加入适量的含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的PBS,在冰上用剪刀将组织剪碎。
(2)4℃条件下5000rpm离心10min。
(3)除去上清,加入含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液,用超声组织破碎仪将组织破碎。
(4)使用四维旋转混匀器在4℃条件下旋转过夜,使组织细胞充分裂解。
(5)第二天取出组织,4℃条件下12000rpm离心40min,将蛋白上清液转移到新的1.5mL离心管中,做好标记,置于-80℃冰箱保存。
1.6Westernblot
(1)蛋白定量:使用BCA试剂盒测定蛋白浓度,将2μL蛋白样品和梯度标准蛋白样品与100μLBCA工作液(98μLA液与2μLB液均匀混合)混匀,加入到96孔板中,在37℃条件下孵育30min,用酶标仪测定562波长下的OD值,依据标准曲线计算蛋白浓度并进行定量,按体系加入5×上样缓冲液和0.01M PBS(补充),分装到1.5mL离心管中,然后沸水浴5min蛋白变性,将变性的蛋白置于-80℃冰箱保存。
(2)制胶
①分离胶:根据目的蛋白分子量的大小,选择合适浓度的分离胶,本实验多采用10%浓度的分离胶(表7)。
表7 SDS-PAGE电泳10%分离胶
②浓缩胶:待分离胶凝固后加入浓缩胶,小心插入梳子,待浓缩胶凝固(表8)。
表8 SDS-PAGE电泳5%浓缩胶
(3)上样:拔出梳子,向点样孔中加入一定量的蛋白样品和Marker。
(4)电泳:本实验多采用90V恒压2h的方式进行电泳。
(5)转膜:本实验多采用湿转方式,最终将蛋白样品转移到PVDF膜上,条件为恒压90V,2h或40V转膜过夜。
(6)封闭:采用5%的脱脂奶粉或5%BSA室温封闭1h。
(7)一抗孵育:根据Marker标记裁出所需要的分子量条带,加入相应的抗体,在摇床上4℃孵育过夜。Marker:10kDa、15kDa、25kDa、35kDa、40kDa、55kDa、70kDa、100kDa、130kDa、180kDa;目的蛋白分子量:Anti-tau(60kDa)、p-tau181(55kDa)、p-tau199(55kDa)、p-tau404(60kDa)、p-tau181(55kDa)。
(8)二抗孵育:取出条带,用1×TBST将膜浸洗3次,每次5min,然后加入相应的二抗在摇床上室温孵育1h。
(9)发光鉴定:二抗孵育后,用1×TBST浸洗3次,每次5min,将发光液A和B液1:1混合均匀加在膜上,利用凝胶成像系统进行发光,拍照保存图片。
1.7统计学分析
数据用平均值±标准差(Means±SEM)表示,每组实验平行重复3次,利用GraphpadPrism 8软件对数据进行分析,当数据只有两组时使用t检验分析,有3组或3组以上时使用OneWay-ANOVA检验分析,p<0.05时说明有显著差异,有统计学意义。
2实验结果:
2.1 ATP13A2
本发明通过Crisprcas9技术构建了杂合ATP13A2
2.2 ATP13A2
为探究ATP13A2敲除后对小鼠大脑中tau蛋白及tau蛋白磷酸化的影响,本发明检测了12月龄KO组小鼠和Ctrl组小鼠大脑皮层中tau蛋白及tau蛋白磷酸化的变化,Westernblot结果显示(如图5中A、B),与Ctrl组小鼠相比,KO组小鼠大脑皮层中tau蛋白的表达量降低(Ctrl vs KO,3.050±0.04501 vs 2.185±0.1650,p<0.01),同时p-tau181(Ctrl vsKO,1.435±0.03075 vs 1.264±0.002396,p<0.01)、p-tau199(Ctrl vs KO,0.6349±0.008013vs 0.3132±0.06694,p<0.01)、p-tau231(Ctrl vs KO,0.6434±0.04480 vs0.5292±0.003210,p<0.05)、p-tau404(Ctrl vs KO,0.5521±0.01295 vs 0.4023±0.04353,p<0.05)的磷酸化水平也有所降低;免疫组织化学染色结果显示(如图5中C),tau蛋白的免疫组织化学阳性反应呈棕褐色围绕细胞核周围并在细胞突起中表达,与Ctrl组小鼠相比,KO组小鼠皮层中tau蛋白棕褐色阳性反应减弱,在大脑皮层的锥体细胞层中分布的突起变细。上述结果说明ATP13A2的缺失会抑制大脑皮层中tau蛋白的表达和tau蛋白的磷酸化。
1.3 HEK293-ATP13A2
为了探究ATP13A2敲除后对细胞中tau蛋白及tau蛋白磷酸化的影响,本发明检测了HEK293和HEK293-ATP13A2
综上,本发明确定了ATP13A2蛋白与阿尔茨海默病等神经退行性疾病有关,通过敲除小鼠的ATP13A2基因可以抑制Tau蛋白表达水平及磷酸化水平,对阿尔茨海默病最典型的病理特征之一的tau蛋白水平显著升高有改善作用,为阿尔茨海默病的治疗提供了新靶点和新方法。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述,并非对本发明的范围进行限定,在不脱离本发明设计精神的前提下,本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进,均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
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