一株贝莱斯芽孢杆菌及中药复配制剂和在农业上的应用

技术领域

本发明属于生物资源利用技术领域，涉及一株贝莱斯芽孢杆菌及中药复配制剂和在农业上的应用。

背景技术

作为一种重要的生产资料，农药在植物病害防治方面发挥着重要作用。然而，化学农药在农业生产中的大量应用，不仅给人类赖以生存的生态环境带来了不可避免的危害，也严重影响了人体健康。为了既保证粮食安全，又保持生态健康，科研工作者将研究重点投向了与化学农药功能相似的生物农药。与化学农药相比，生物农药的残留普遍较低或无，可从源头上有效解决化学农药对生态环境和人类健康的影响，有利于社会经济的可持续发展。已有研究发现，许多植物提取物即中药对多种植物病原菌具有抑制作用。

苹果产业已经逐步成为陕西省的重要支柱产业，但由子囊菌苹果黑腐皮壳属(Valsa mali)引起的苹果树腐烂病对苹果产业的发展造成了严重威胁。目前，对于该病害的防治主要以喷洒化学药剂为主，但是长期使用杀菌剂使病原菌抗药性逐年增强，同时也对生态环境造成破坏，危害人类健康。因此，安全无污染且成本更低的生物防治逐渐被人们所注意。中药主要通过破坏致病菌的细胞壁和细胞膜的结构，使细胞内物质外渗透，改变蛋白质结构，影响其功能以及进入细胞内，破坏细胞的内能代谢过程等途径达到抑菌作用。因植物提取物药效发挥慢、含量和活性存在不稳定性，在防治方面存在局限性，因而可以将其与同样具有对生物友好特点的生防细菌复配，从而达到更好的防治效果，中药复方制剂-生防菌株复合制剂在未来农业防治上具有巨大前景。

发明内容

本发明提供一株贝莱斯芽孢杆菌及中药复配制剂和在农业上的应用，弥补中药复方制剂在在苹果树腐烂病防治应用中的空白，对苹果树腐烂病的防治提供理论参考，预估其在农业生产中将具有重要的潜在应用价值。

本发明采用如下技术方案：

一株贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis zaB4)，所述zaB4菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.28339。

所述的贝莱斯芽孢杆菌在苹果树腐烂病防治中的应用。

所述的应用，应用所述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis zaB4)的菌体，或贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis zaB4)的发酵液，或所述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis zaB4)菌体和发酵液的混合物防治苹果树腐烂病。

一种中药复方制剂-生防菌株复配制剂，包括权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis zaB4)的菌体或其发酵液或其菌体和发酵液的混合物与中药复方制剂的复合制剂，中药复方制剂包括蛇床子提取液、白头翁汤、如圣散、肉桂提取液四种组分中的任意一种组分、两种组分复配、三种组分复配及四种组分复配。

所述的复配制剂，蛇床子提取液:白头翁汤:如圣散:肉桂提取液四者体积比例为3:4:1:2

所述的复配制剂在苹果树腐烂病防治中的应用。

所述的应用，所述复配制剂对苹果树腐烂病菌(Valsa mali)的野生型菌株03-8具有拮抗作用。

所述的应用，所述复配制剂加工成农业上可接受的制剂后施用。

通过平板对峙试验获知，所述中药复方制剂-生防菌株复合制剂对苹果树腐烂病菌(Valsa mali)的野生型菌株03-8具有拮抗作用。中药复方制剂-生防菌株复合制剂四种组分中的任意一种组分、两种组分复配、三种组分复配及四种组分复配均可对苹果树腐烂病菌(Valsa mali)的野生型菌株03-8产生有效的抑制作用，参与复配的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis zaB4)对苹果树腐烂病菌(Valsa mali)的野生型菌株03-8产生有效的抑制作用。由此，基于本发明的技术效果，本领域普通技术人员，结合现有技术，可以开发出一种苹果树腐烂病菌(Valsa mali)的野生型菌株03-8的抑制剂，该抑制剂的活性成分为蛇床子提取液、白头翁汤、如圣散、肉桂提取液和一株贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)，各组分的最优比例为3：4：1：2：10。

本发明所述中药复方制剂-生防菌株复合制剂具有生防效果好、对环境友好的特点，可作为一种较好的生防资源进行挖掘。因此，本发明进一步提出该中药复方制剂-生防菌株复合制剂在苹果树腐烂病防治中的应用，弥补该中药复方制剂-生防菌株复合制剂在苹果病害防治的技术空白。

与现有技术相比，本发明具有以下优点。

(1)本发明从16种中药、复方制剂中筛选出对苹果树腐烂病菌有良好拮抗效果的中药复方制剂并对其自由组合进行筛选，从肉桂、蛇床子、连翘、黄岑、石菖蒲、苍耳子、山苍子、广藿香、金银花、甘草、五倍子、白英、土元、川厚朴、如圣散和白头翁汤中以乙醇提取法获得中药复方制剂，通过平板对峙法筛选出了4种有良好抑菌效果的中药复方制剂，分别是蛇床子提取液、白头翁汤、如圣散和肉桂提取液。将4种中药复方制剂进行不同比例复配，通过抑制率测定比较不同中药提取物复配的抑制效果，确定出最优配伍比例为蛇床子提取液:白头翁汤:如圣散:肉桂提取液＝3:4:1:2，抑制率达到84.33％。再将中药复方制剂和生防菌以1:1的比例混合后进行抑菌活性的测定，抑制率可达90.33％。

(2)本发明所述中药复方制剂-生防菌株复合制剂具有稳定的天然来源，发酵过程简便易控、成本较低，对人畜无毒无害，为新型生物菌剂的开发提供了有利条件，在农业生产中的植物病害防治领域具有重要的潜在应用价值。

(3)通过皿内试验和叶片实验获知，本发明所述zaB4菌株防治苹果树腐烂病效果显著，是一种优异的苹果树腐烂病生物防治复合制剂。

附图说明

图1是本发明所述中药复方制剂-生防菌株复合制剂中四种中药复方制剂对苹果树腐烂病菌的皿内抑菌活性图；a：蛇床子提取液，b：白头翁汤，c：如圣散，d：肉桂提取液。

图2是本发明四种中药复方制剂的最优配比对苹果树腐烂病菌的皿内抑菌活性图，a：四种中药复方制剂的最优配比。

图3是本发明所述中药复方制剂-生防菌株复合制剂对苹果树腐烂病菌的皿内抑菌活性图：a：四种中药复方制剂的最优配比。

图4是本发明所述中药复方制剂-生防菌株复合制剂中zaB4菌株的皿内形态图。

图5是本发明所述中药复方制剂-生防菌株复合制剂中zaB4菌株对苹果树腐烂病菌的皿内抑菌活性图。

图6是基于ML法构建的本发明所述zaB4菌株的系统发育树。

图7是本发明所述中药复方制剂-生防菌株复合制剂对苹果树腐烂病菌的离体叶片防效试验，a：接种中药复方制剂-生防菌株复合制剂2d后接种03-8菌饼，b：只接种03-8菌饼；

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

实施例1

本实施例描述4种中药复方制剂的筛选及其对苹果树腐烂病病原菌03-8的皿内抑菌活性试验。

1、中药复方制剂有效成分的提取

称取中药复方制剂粉末60g于三角瓶中，倒入95％的乙醇溶液直至浸没，室温提取2d，置于200r/min摇床震荡提取18h，将中药乙醇混合液抽滤，得到第一次浸提滤液，再将中药残渣以上述方法重复浸提2次，将3次浸提滤液混合后，置于旋转蒸发仪中，85℃水浴加热，冷凝回流提取3h，加入95％乙醇溶液定容至60mL，制成1g/mL95％乙醇溶液。

2、4种中药复方制剂的筛选

以上述乙醇提取法从肉桂、蛇床子、连翘、黄岑、石菖蒲、苍耳子、山苍子、广藿香、金银花、甘草、五倍子、白英、土元、川厚朴、如圣散(北柴胡、白茯苓、甘草、熟地黄、人参、当归各一两，鳖甲、胡黄连、沉香、知母各半两，桑寄生、干葛各三分)和白头翁汤(白头翁15g，黄连6g，黄柏12g，秦皮12g)中获得16种中药乙醇提取液，其中如圣散和白头翁汤购买于同仁堂大药房旗舰店。使用0.22μm细菌过滤器将16种中药乙醇提取液分别过滤3次，按10％的比例制作中药PDA混合平板，接种新鲜的苹果树腐烂病病原菌03-8菌饼，放置于25℃培养箱倒置培养3d后观察结果并测量病原菌菌饼直径，以不加中药乙醇提取液的PDA平板上的病原菌菌落直径为对照，计算抑制率。结果表明不同中药乙醇提取液对腐烂病菌的抑菌效果显著不同，抑制率从5.6％-41.22％，其中有4种中药乙醇提取液显示出了良好的抑制效果，在使用1000ppm浓度下，蛇床子提取液抑制率达22.79％，白头翁汤达到41.22％，如圣散达到38.67％，肉桂提取液达到32.48％(图1)。

实施例2

本实施例描述4种中药复方制剂与一株生防细菌的最优配伍确定。

1、4种中药复方制剂的最优配伍

将筛选出的4种中药(蛇床子提取液、白头翁汤、如圣散、肉桂提取液)中任意两种组分按照2:8，4:6，6:4，8:2的体积比例混合后通过平板对峙试验测定其抑制效果。同样地，将任意三种组分按照1:4:1、1:4:2、1:4:3、1:4:4、2:3:1、2:3:2、2:3:3、2:3:4、3:2:1、3:2:2、3:2:3、3:2:4、4:1:1、4:1:2、4:1:3、4:1:4的体积比例混合后通过平板对峙试验测定其抑制效果。综合两种组分复配和三种组分复配结果，确定4种中药复配的待选体积比例3:4:1:2、3:4:2:1、4:3:1:2、4:3:2:1、3:3:2:2、3:3:1:3、3:3:3:1，通过平板对峙试验测定不同比例的抑制效果，从而筛选出最佳组合方式和体积比例(图2)，即蛇床子提取液:白头翁汤:如圣散:肉桂提取液＝3:4:1:2，抑制率达到84.33％。

2、生防细菌zaB4对苹果树腐烂病菌03-8的拮抗效果及其16S鉴定

在LB平板上划线活化ZAB4菌株，如图4所示，用液体LB培养基接种ZAB4单菌落28℃，220rpm/min，摇床培养两天。用打孔器在PDA平板中央打孔，滴加ZAB4菌液，并在平板两侧放置03-8菌饼，25℃培养24小时后用十字交叉法测量抑菌圈直径，试验设2个重复，取其平均值，抑菌圈直径达20mm(图5)。由此可以得出，ZAB4菌株对苹果树腐烂病菌具有拮抗作用。

按照细菌基因组总DNA提取试剂盒(Omega Bio-Tek D3350)提取菌株zaB4的DNA，对菌株的16S rDNA基因序列进行PCR扩增，并使用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，确定目标条带；按照胶回收试剂盒(Omega Bio-Tek D2500)操作进行胶回收并将回收产物送往擎科生物科技有限公司测序。测序得生防细菌zaB4的16S rDNA基因序列(SEQ ID NO：1)；

将测序结果在NCBI数据库进行BLAST比对得到多株亲缘关系相近菌株的16SrDNA序列，使用MEGA11软件进行多序列比对并修剪对齐，再基于NJ法构建系统发育树，从而确定拮抗菌株的分类地位。构建的系统发育树如图6所示。发现zaB4菌株(图4)与贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)归为一支，因而将其鉴定为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)。

保藏信息如下：

分类命名：贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis

保藏时间：2023年9月4日

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所

保藏编号：CGMCC No.28339

3、4种中药复方制剂与一株生防细菌的最优配伍

然后将4种中药复方制剂按最优配伍混合后与已有生防菌株zaB4菌液(OD值1.0)进行1：1混合(图3中a图)，测定其抑制率高达90.33％(图3)，对苹果树腐烂病的拮抗效果显著。

实施例3

本实施例描述中药复方制剂-生防菌株复合制剂的叶片抑菌活性试验。

采集新鲜的苹果健康叶片，用无菌水冲洗三次，0.6％次氯酸钠溶液避光消毒10min，再用无菌水冲洗3次，晾干。使用一次性无菌注射器在叶脉两侧对称位置打孔，分别贴上用中药复方制剂-生防菌株复合制剂和无菌水浸泡过的圆形滤纸片枝条，24h后去掉滤纸片，接种03-8菌饼，72h后观察实验结果并记录，实验过程中材料置于人工气候培养箱。

试验结果如图7所示，在离体条件下，只接种03-8菌饼的右侧叶片发病较重，而提前24h用中药复方制剂-生防菌株复合制剂处理的左侧叶片几乎不发病，预防效果显著。本试验说明，中药复方制剂-生防菌株复合制剂对苹果树被苹果树腐烂病菌的侵染具有保护作用，可以用于防治苹果树腐烂病。

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。