一种来源于岩茶茶渣的ACE抑制肽及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于ACE抑制肽技术领域，具体涉及一种来源于岩茶的ACE抑制肽及其制备方法与应用。

背景技术

高血压是全球范围内最常见的慢性病之一，引发的并发症严重危害人类的健康。目前高血压无法根治，患者必须长期服用降压药。ACE抑制剂(ACEI)能够抑制ACE酶活性，起到调节血压作用。当前常见的治疗高血压的药物依那普利、氯沙坦、厄贝沙坦等都属于合成的ACE抑制剂，虽然其降压效果显著，但是在应用过程中也出现了严重的负作用，如咳嗽、血管性水肿、头痛等不良反应。

食品源的ACE抑制肽，对高血压具有定向抑制功能，且不影响正常血压，相对于传统降血压药而言，对人体无毒、副作用。目前植物蛋白质源的生物活性肽研究得到被重视，特别是降压肽，因其具有天然、安全性高、易吸收、无副作用的特点而备受关注。武夷岩茶茶渣含有丰富的蛋白质，具有很高的营养价值，可作为天然植物蛋白和生物活性肽的良好来源。

武夷岩茶产于福建闽北地区，具有独特的风味和营养价值，市场空间巨大。目前对岩茶的研究多集中在研究岩茶组成成分和香气物质等方面，对于岩茶蛋白的研究鲜有报道。本发明旨在对岩茶潜在的价值进行开发利用，首次对岩茶ACE抑制肽进行研究，丰富紫苏籽在功能食品中的应用，增加岩茶的附加值。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种岩茶ACE抑制肽及其制备方法与应用，提高岩茶的附加价值，实现资源的综合利用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种来源于岩茶的ACE抑制肽，其氨基酸序列为：Phe-Pro-Phe-Pro-Arg-Pro-Pro，缩写为FPFPRPP，即苯丙氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸-精氨酸-脯氨酸-脯氨酸，通过数据库AHTPDB、PlantPepD、biopepDB、UniProt比对，发现其为新型肽。

进一步，上述ACE抑制肽来源于岩茶天然提取或人工合成。

一种制备上述岩茶ACE抑制肽的方法，具体操作步骤如下：

(1)碱提酸沉法制备岩茶粗蛋白：粉碎后的岩茶碎渣与0.24mol/L的NaOH溶液以1：34w/v的料液比混合，66℃下水浴120min，水浴结束后，于4℃条件下12000r/min离心15min，将上清pH调到紫苏籽蛋白等电点1.4-1.8，过夜沉淀后，4℃条件下12000r/min离心15min，取沉淀复溶，pH调到7.0，冷冻干燥即得到岩茶粗蛋白；

(2)酶解制备粗岩茶ACE抑制肽：选用中性蛋白酶酶解岩茶粗蛋白，酶解条件为：加酶6800U/g、温度45℃、pH值7.0、底物浓度2％w/v、酶解时间3h，酶解后沸水浴10min灭酶，冷却后调节pH至中性，于4℃条件下12000rpm离心15min，取上清液冷冻干燥，即得到粗岩茶ACE抑制肽；

(3)岩茶ACE抑制肽的分离纯化：将粗岩茶ACE抑制肽加入蒸馏水配成浓度为50mg/mL的溶液，将溶液过0.22μm滤膜后，用Sephadex G-15凝胶色谱进行分离，以过滤后的去离子水为洗脱液，流速0.3mL/min，测量洗脱组分在214nm波长处的吸光值；收集具有最佳ACE抑制活性的峰，利用反相高效液相色谱RP-HPLC进一步分离；RP-HPLC的洗脱梯度为0-3min，5％v/v乙腈(含0.05％TFA)；3-43min，5％-40％v/v乙腈(含0.05％TFA)；43-53min，40％v/v乙腈(含0.05％TFA)；流速为2.0mL/min，检测波长214nm，收集洗脱时间为46-47min的洗脱峰，真空冷冻干燥即得所述ACE抑制肽。

上述岩茶ACE抑制肽可应用于制备高血压预防药物。

上述岩茶ACE抑制肽在引用于制备降血压保健食品。

本申请的有益效果在于：通过体外ACE抑制活性测定发现，该岩茶ACE抑制肽的IC

附图说明

图1：岩茶ACE抑制肽Sephadex G-15色谱图。

图2：Sephadex G-15洗脱峰F1的半制备反相高效液相色谱图。

图3：岩茶ACE抑制肽FPFPRPP质谱图。

图4：FPFPRPP的ACE抑制活性IC

图5：不同浓度的FPFPRPP对人脐静脉内皮细胞毒性的影响。

图6：不同浓度的FPFPRPP对人脐静脉内皮细胞NO释放的影响。

图7：不同浓度的FPFPRPP对人脐静脉内皮细胞ROS释放的影响。

图8：不同浓度的FPFPRPP对人脐静脉内皮细胞内皮素ET-1释放的影响。

图9：FPFPRPP与ACE的分子对接结果。其中，A为ACE与FPFPRPP分子对接结果图；B为相互作用位点放大图；C为相互作用的二维显示图，无虚线连接的ACE上的氨基酸与FPFPRPP的相互作用为范德华力。

具体实施方式

为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1

本发明所述ACE抑制肽的分离纯化包括Sephadex G-15凝胶过滤色谱和反相高效液相色谱(RP-HPLC)两个步骤。

碱提酸沉法制备岩茶粗蛋白：粉碎后的岩茶碎渣与0.24mol/L的NaOH溶液以1：34w/v的料液比混合，66℃下水浴120min，水浴结束后，于4℃条件下12000r/min离心15min，将上清pH调到紫苏籽蛋白等电点1.4-1.8，过夜沉淀后，4℃条件下12000r/min离心15min，取沉淀复溶，pH调到7.0，冷冻干燥即得到岩茶粗蛋白；

酶解制备岩茶粗多肽：选用中性蛋白酶酶解岩茶粗蛋白，酶解条件为：加酶6800U/g、温度45℃、pH值7.0、底物浓度2％w/v、酶解时间3h，酶解后沸水浴10min灭酶，冷却后调节pH至中性，于4℃条件下12000rpm离心15min，取上清液冷冻干燥，即得到粗岩茶ACE抑制肽；

凝胶过滤色谱(Sephadex G-15)分离：将上述粗岩茶ACE抑制肽溶解于去离子水中，使其浓度为50mg/mL，于4℃条件下15000rpm离心15min。取上清液用0.22μm微滤膜过滤除杂后上样。Sephadex G-15凝胶柱(1.6cm×100cm)用去离子水平衡，将已过滤的样品上柱。用去离子水洗脱，流速0.3mL/min，于214nm波长处检测洗脱液吸光值，绘制洗脱曲线，如图1所示。收集各组分进行ACE抑制活性测定，以检测ACE抑制肽不同分子量的组分的ACE抑制活性情况。组分F1的ACE抑制率最高，其值为74.08％，于是对F1进行富集，以备后续反相高效液相色谱分离纯化。

反相高效液相(RP-HPLC)色谱分离纯化：去离子水溶解上述组分F1冻干粉，浓度为40mg/mL，采用高效液相色谱柱(SP-120-10-C18-AP，250mm×10mm)进行进一步分离纯化，用水和乙腈(均含0.05％(v/v)的三氟乙酸)构成的洗脱系统进行梯度洗脱。参数选择二元泵，A泵为超纯水，B泵为乙腈(均含0.05％(v/v)三氟乙酸)；流动相时间参数：0-3min，5％B；3-43min，5-40％B；43-53min，40％B。柱温为25℃，流速为2mL/min，上样体积为100μL，紫外检测波长为214nm，共得到21个洗脱峰，如图2所示。收集46-47min的20号洗脱峰，冷冻干燥后即得所述岩茶ACE抑制肽。对其进行对其进行液相色谱质谱联用(LC-ESI-MS/MS)分析和鉴定，所得岩茶ACE抑制肽的氨基酸序列为Phe-Pro-Phe-Pro-Arg-Pro-Pro(FPFPRPP)，质谱图如图3所示。

实施例2

固相合成FPFPRPP，纯度为98％以上，测定其ACE抑制活性IC

式中，ΔA

如图4所示，得到FPFPRPP的ACE抑制活性IC

实施例3

固相合成FPFPRPP，纯度为98％以上，测定其对人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)毒性：选择生长状态良好的HUVEC细胞，加入DMEM培养基制成单细胞悬液，用血细胞计数板计数，以1×10

公式中：A：样品组吸光度；B：对照组吸光度；C：空白组吸光度；

由图5可以发现，当FPFPRPP浓度为0.125、0.25、0.5和1mg/mL时，HUVECs细胞存活率略微有下降的趋势，存活率分别为95.58％、95.34％、95.04％、94.56％，与对照组相比存活率略微下降，但均大于94.5％，仍在安全浓度范围内(细胞存活率大于80％)。

实施例4

固相合成FPFPRPP，纯度为98％以上，测定其降血压功能：选择生长状态良好的HUVEC细胞，加入DMEM培养基，制成单细胞悬液，用血细胞计数板计数，以1×10

由图6可以发现，对照组在Ang II的刺激下，细胞的NO水平显著降低(P<0.01)。与Ang II对照组相比，不同浓度的FPFPRPP处理组NO释放量均显著增加，说明ACE抑制肽FPFPRPP可以刺激HUVECs细胞释放NO，可减少血管收缩剂Ang II对细胞的影响，起到一定的降血压的作用。

实施例5

固相合成FPFPRPP，纯度为98％以上，测定其降血压功能：选择生长状态良好的HUVEC细胞，加入DMEM培养基，制成单细胞悬液，用血细胞计数板计数，以1×10

由图7可以发现，在Ang II的刺激下，细胞的ROS水平显著提高(P<0.01)。随着多肽FPFPRPP的加入，细胞的ROS水平显著降低(P<0.01)，但随着浓度的逐步提升，细胞的ROS水平无显著性差异，说明低至0.05mg/mL的FPFPRPP就能起到抑制Ang II诱导的细胞氧化应激的效果，在细胞水平上能够发挥较好的抗氧化作用。

实施例6

固相合成FPFPRPP，纯度为98％以上，测定其降血压功能：选择生长状态良好的HUVEC细胞，加入DMEM培养基，制成单细胞悬液，用血细胞计数板计数，以1×10

由图8可以发现，不同浓度的FPFPRPP均能显著降低细胞中ET-1含量(P＜0.05)，并在一定范围内，细胞内ET-1的分泌量与FPFPRPP浓度呈负相关，说明ACE抑制肽FPFPRPP可以起到一定的降血压的作用。

实施例7

岩茶ACE抑制肽FPFPRPP与ACE的分子对接：ACE晶体结构(ID：1O8A)从NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)获得，使用AutoDockTools 1.5.6结合AutoDockVina对蛋白和多肽进行对接，对接位点坐标为：x：40.79，y：33.61，z：43.48。由图9可以发现，FPFPRPP与ACE的残基Arg522、Tyr523、Ser517、Ala354、Glu384形成5个氢键，与Ala63、Ala356、Tyr62、Glu403、Phe512、Phe391、Glu411、Glu123、Trp220、Trp200、His353、His383、Ser355存在范德华力相互作用，与Trp357以π-π作用力结合，与Ala207、Arg124、Ile204、His410、His387、Met223、Pro407以π-烷基作用力结合，从而起到抑制ACE的作用。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。