一种鞘脂类化合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物材料发酵培养领域，具体涉及一种鞘脂类化合物及其制备方法和应用。

背景技术

侵袭性致病真菌感染（IFIs）是一种由白色念珠菌和新型隐球菌等机会性致病真菌引起的感染，主要感染深层实体器官和/或血液，易感人群为免疫功能低下的患者，如免疫缺陷、肿瘤以及器官移植的患者，死亡率高达45%，每年造成全球约170万人死亡。导致高发病率和高死亡率的主要原因之一是抗生素耐药性，这几乎在所有临床使用的抗生素中都有观察到。除了令人担忧的抗生素耐药性外，很多抗生素，如多烯类、棘白菌素类和唑类，已被证明具有高毒性或可引起急性不良事件。鉴于这些挑战，迫切需要开发新型抗生素药物。

药用真菌作为珍贵的药物来源，其粗提物显示了多种多样的活性，如抗菌、抗肿瘤和降血糖等。其中，云芝和灵芝作为备受关注的两种药用真菌，具有巨大的代谢潜力，可以作为挖掘抗菌活性物质的重要资源。

发明内容

基于云芝和灵芝的药用价值，本发明提供了一种鞘脂类化合物及其制备方法和应用。本发明以云芝和灵芝共培养发酵的方式制备得到了能够抑制白色念珠菌与新型隐球菌活性的鞘脂类化合物，继而为抗菌制剂的制备开辟了新的途径。

为解决上述技术问题，本发明拟采用的技术方案是：

本发明提供了一种鞘脂类化合物，其结构式如式I或式II所示：

。

本发明还提供了所述的鞘脂类化合物的制备方法，其包括以下步骤：

S1：固体培养云芝和灵芝；

S2：取所述步骤S1中培养得到的云芝和灵芝，将其进行液体共培养，得到云芝和灵芝共培养发酵液；

S3：对所述步骤S2的共培养发酵液进行有机提取、减压浓缩，得到粗提取物；

S4：对所述步骤S3的粗提取物进行分离纯化，得到鞘脂类化合物。

进一步的，所述步骤S1中固体培养的温度为26℃~30℃，培养时间为6天~8天。

进一步的，所述步骤S2中液体培养的温度为26℃~30℃，培养时间为12天~16天。

进一步的，所述步骤S2中液体培养的培养基的组份及组份含量为：葡萄糖8~12 g/L，蛋白胨1~3 g/L，MgSO

进一步的，所述步骤S2中液体培养的培养基的组份及组份含量为：葡萄糖10 g/L，蛋白胨2 g/L，MgSO

进一步的，所述步骤S3的具体步骤为：使用乙酸乙酯萃取共培养发酵液，得到萃取液，利用旋转蒸发仪减压浓缩得到粗提取物。

进一步的，所述步骤S4是将所述粗提取物溶解后，采用HPLC分离纯化，所用流动相为甲醇和水。

进一步的，所述步骤S4的具体步骤为：设置流动相梯度淋洗方法为：0-2min，5％甲醇，95％水；2-30 min，由5％甲醇，95％水逐渐调整至100％甲醇；30-40min，100％甲醇；制备得到的组分再使用以下梯度淋洗方法纯化：0-2min，50％甲醇，50％水；2-30 min，由50％甲醇，50％水逐渐调整至100％甲醇；30-40min，100％甲醇；从而得到鞘脂类化合物。

本发明还提供了所述的鞘脂类化合物在制备抗菌制剂或者抗菌药物中的应用。

进一步的，所述抗菌制剂或者抗菌药物抑制的致病菌包括白色念珠菌和新型隐球菌。

与现有技术相比，本发明具有的优点和有益效果是：本发明通过将云芝和灵芝共培养发酵的方式，模拟其在自然环境中与其他微生物竞争或者拮抗的状态，旨在激活或者上调其抗生素的生物合成途径，并对所得混合发酵浓缩液进行活性检测和化学分析，从而获得新颖的高活性抗菌活性物质；经研究发现采用以上共培养的方式，可以得到两种具有抗菌活性的鞘脂类化合物。

本发明通过将云芝与灵芝共培养获得了两种鞘脂类化合物，包括一个新化合物和一个新天然产物，实验数据证实，这两种鞘脂类化合物能够显著抑制白色念珠菌和新型隐球菌的生长，可用作抗菌制剂，也可用于新型抗菌药物的制备，具有广阔的应用前景。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1为本发明实施例中式I所示结构化合物的

图2为本发明实施例中式I所示结构化合物的

图3为本发明实施例中式I所示结构化合物的HSQC谱图；

图4为本发明实施例中式I所示结构化合物的HMBC谱图；

图5为本发明实施例中式I所示结构化合物的HRESIMS谱图；

图6为本发明实施例中式II所示结构化合物的

图7为本发明实施例中式II所示结构化合物的

图8为本发明实施例中式II所示结构化合物的ESIMS谱图；

实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以下实施例是对本发明的解释而本发明并不局限于以下实施例。

实施例1：利用云芝和灵芝发酵共培养制备鞘脂类化合物的方法

所述鞘脂类化合物的具体制备步骤如下：

步骤1：取云芝与灵芝（取自市售云芝和市售灵芝）菌丝适量，并分别将其接种至PDA固体平板培养基上，在28℃的培养箱中，培养6~8天，优选7天。

步骤2： 取步骤1中培养得到的云芝与灵芝各3块，每块取直径约0.5 mm，将其接种至装有200 mL培养基的500 mL锥形瓶中，在28℃，180 rpm条件下共发酵培养12~16天，优选14天；其中，所用培养基各组份及组份含量如下：葡萄糖8~12 g/L，蛋白胨1~3 g/L，MgSO

步骤3：将步骤2所得的共培养发酵液（18 L）用乙酸乙酯萃取三次，将乙酸乙酯萃取溶液合并，用旋转蒸发仪减压浓缩得到粗提取物（2.9 g）。

步骤4：对步骤3中得到的粗提取物利用甲醇溶解后，采用HPLC分离纯化，所用流动相为甲醇和水。

首先，设置流动相梯度淋洗方法为：0-2min，5％甲醇，95％水；2-30 min，由5％甲醇，95％水逐渐调整至100％甲醇；30-40min，100％甲醇；制备得到的4个组分。其中组分3再使用以下梯度淋洗方法纯化：0-2min，50％甲醇，50％水；2-30 min，由50％甲醇，50％水逐渐调整至100％甲醇；30-40min，100％甲醇；最终得到结构式如式I所示的化合物I（3.2 mg，

所述化合物I和化合物II的结构式分别如式I、式II所示：

。

使用500 MHz核磁共振波谱仪测定式I所示化合物的

使用500 MHz核磁共振波谱仪测定式II所示化合物的

实施例2：所述鞘脂化合物的抗菌活性测试

1、实验样品：测试样品为上述实施例1中分离精制的化合物I和II。精密称取适量样品，用甲醇配制成浓度为5 mg/mL的溶液，供测活性。取适量制霉菌素、氟康唑，用甲醇溶解后配置为5 mg/mL，作为阳性对照药。

2、抑菌活性实验方法：

将白色念珠菌（

3、实验结果如下

对所述化合物Ⅰ和Ⅱ的抑菌活性进行了研究，以抗菌药物制霉菌素和氟康唑为阳性对照药，结果发现，所述化合物Ⅰ和Ⅱ对白色念珠菌和新型隐球菌均有显著的抑制作用，MIC均为3.13

表1. 化合物Ⅰ和Ⅱ对白色念珠菌和新型隐球菌的抑制活性

4、结论

本发明提供的所述式I、式II所示的化合物具有显著的抑制白色念珠菌和新型隐球菌活性，可作为抗菌制剂使用，也可应用于新型抗菌药物的制备。

此外，需要说明的是，本说明书中所描述的具体实施例，其零、部件的形状、所取名称等可以不同。凡依本发明专利构思所述的构造、特征及原理所做的等效或简单变化，均包括于本发明专利的保护范围内。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离本发明的结构或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。