一种天然抗菌蛋白及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种天然抗菌蛋白及其制备方法和应用。

背景技术

随着抗生素的广泛长期使用，导致抗药菌株的产生，越来越多耐药菌株的出现成为棘手的医学难题，并出现了超级细菌(对几乎所有抗生素有抗药性的细菌)，这种病菌的可怕之处并不在于它对人的杀伤力，而是它对普通抗生素的抵抗能力，对这种病菌，人们几乎无药可用。

抗生素在食品加工、农业生产、生态防治等领域的广泛使用也导致了耐药问题越发严重。在全球范围内，大力度控制抗生素滥用是大势所趋。因此，急需寻找新型抗菌药物来应对耐药性所引发的疾病、环境、农业生产、食品安全问题。天然抗菌肽(蛋白)具有抗菌(细菌和真菌)、抗病毒、抗寄生虫、免疫调节等多种生物学活性。它可通过环孔模型、孔洞模型或覆毯模型在细菌细胞膜上形成不可逆损伤，导致细胞膜最终渗漏破裂，进而导致细菌死亡。抗菌肽(蛋白)破膜作用的特异性极低，细菌很难通过变异而形成耐药性。因其抗菌活性高，抗菌谱广，种类多，可供选择的范围广等原因，被认为是开发前景和应用潜力最佳的抗生素替代物。

天然抗菌肽的来源广泛，包括植物来源抗菌肽、动物来源抗菌肽、微生物来源抗菌肽、人工合成抗菌蛋白等。微生物来源抗菌肽的种类和数量相对较少，公开号为CN112094323A的中国专利文献公开了一种植物乳杆菌源广谱抗菌肽，植物乳杆菌FZU 122产生的抗菌肽对食品中多种致病、腐败菌具有显著的抑制作用，公开号为CN103772490A的中国专利文献公开了一种地衣芽孢杆菌分泌的抗菌肽及其制备方法和应用，该抗菌肽具有显著的抗菌活性，且不会对猪的红细胞产生溶血作用，可用于开发制备饲用抗菌药物。

侧孢芽孢杆菌(BreviBacillus laterosporus)属于芽孢杆菌属，是一种非病原性的细菌，可以做杀虫剂和微生物肥料。该细菌能产生多种生物活性物质，譬如抗菌多肽、抗菌蛋白质、多糖等，其产生的抗菌多肽、抗菌蛋白质等具有安全性高，抗菌谱广，稳定性好，无残留的特点，但目前从中分离出单一抗菌物质，并对蛋白序列和功能研究清楚的很少。

发明内容

本发明提供了一种产自侧孢芽孢杆菌的抗菌蛋白，该抗菌蛋白对G-菌和G+菌的都有较强的抑制作用，具有广谱抑菌性，且热稳定性好，它能有效替代抗生素广泛应用于饲料加工、医学、食品工业、畜牧业、啤酒工业、水产养殖等领域。

具体采用的技术方案如下：

一种抗菌蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。应当理解，与序列SEQ ID NO：1具有85％以上同源性且具有相同功能的蛋白质也在本发明的保护范围之内。

所述的抗菌蛋白由氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的蛋白(180个氨基酸组成，分子量为18.9kDa)切除信号肽后得到。

氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的蛋白从侧胞芽孢杆菌分泌到发酵液会切除25个氨基酸的信号肽，成为成熟蛋白(即所述的抗菌蛋白)，所述的抗菌蛋白分子量大小约为16.4kDa，由155个氨基酸组成，热稳定性好，具有广谱抑菌性。

本发明还提供了编码所述的抗菌蛋白的基因，核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。基于密码子的简并性，编码上述抗菌蛋白的基因不只限定于SEQ ID NO：3所示序列，只要能够编码如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的蛋白即可。

本发明还提供了所述的抗菌蛋白在制备抗菌剂中的应用。

优选的，所述的抗菌剂用于抑制和/或杀灭革兰氏阳性菌和/或革兰氏阴性菌。

进一步的，所述的革兰氏阳性菌包括溶壁微球菌、金黄葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、无乳链球菌等；所述的革兰氏阴性菌包括大肠埃希菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、鼠伤寒沙门氏菌等。

本发明还提供了一种抗菌剂，该抗菌剂的有效成分包括所述的抗菌蛋白。

本发明还提供了一种饲料添加剂，该饲料添加剂的有效成分包括所述的抗菌蛋白。

本发明还提供了所述的抗菌蛋白的制备方法，包括以下步骤：将侧孢芽孢杆菌(BreviBacillus laterosporus)发酵培养后离心，收集上清液并用硫酸铵沉淀法富集抗菌蛋白、再经超滤浓缩、葡聚糖G50层析分离纯化步骤，真空浓缩冻干获得所述的抗菌蛋白；该抗菌蛋白的分子量为16.4kDa，等电点5.87。

优选的，发酵培养条件为：27～30℃，180～220rpm，18～24h。

具体的，所述的抗菌蛋白的制备方法为：

S1：在30℃，200rpm条件下，发酵侧胞芽孢杆菌(BreviBacillus laterosporus，保藏编号ACCC 11079)得到发酵培养液；

S2：将发酵培养液离心得到上清液，采用10％～80％(质量分数)硫酸铵沉淀，离心收集沉淀蛋白，再经10K超滤浓缩、葡聚糖G50层析分离纯化步骤，真空浓缩冻干获得所述的抗菌蛋白。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

(1)本发明分离获得的天然抗菌蛋白，该抗菌蛋白对8种常见细菌(4种G-菌和4种G+菌)都有较强的抑制作用，特别对致病的大肠埃希菌、鼠伤寒沙门氏菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌等G-菌的抑菌效果更好，抗菌蛋白效价达到了3.65×10

(2)本发明公开的天然抗菌蛋白，是分泌性胞外蛋白，其分泌在发酵液中，便于生产后期的分离纯化和产业化；且该天然抗菌蛋白产自侧孢芽孢杆菌，侧孢芽孢杆菌具有繁殖快速、生命力强、安全无毒等特点，便于该天然抗菌蛋白的规模化生产，具有巨大的经济价值。

附图说明

图1为侧胞芽孢杆菌的生长曲线和抑菌活性变化图。

图2为侧孢芽孢杆菌的表达方式鉴定图。

图3为侧孢芽孢杆菌发酵液上清液经不同浓度硫酸铵沉淀后蛋白的抑菌效果图。

图4为不同浓度硫酸铵沉淀后蛋白的Tricine-SDS-PAGE结果图，其中，M为蛋白非预染MarkerⅠ，泳道1为发酵培养液，泳道2～6分别为10、20、40、60、80％硫酸铵沉淀后蛋白。

图5为葡聚糖G50层析谱图。

图6为Tricine-SDA-PAGE电泳分析图，其中，M为蛋白非预染MarkerⅠ，泳道1为发酵培养液，泳道2为80％硫酸铵沉淀后蛋白，泳道3为80％硫酸铵沉淀+10k超滤+G50纯化后的抗菌蛋白。

图7为80％硫酸铵沉淀后蛋白的稀释倍数与抑菌圈直径的关系图。

图8为抗菌蛋白的信号肽分析结果图。

图9为抗菌蛋白的疏水性分析结果图。

图10为80％硫酸铵沉淀后蛋白的热稳定性试验结果图。

具体实施方式

下面结合实施例与附图，进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。

本发明的涉及的菌种：侧胞芽孢杆菌(BreviBacillus laterosporus)购买于中国农业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为：ACCC 11079。地址：北京市海淀区中关村南大街12号，中国农业科学院农业资源与农业区划研究所资源楼206，邮编：100081。

实施例1菌株的生长曲线和抑菌活性变化

S1侧胞芽孢杆菌培养上清液的抑菌活性检测方法

S11菌株和培养基

以食品加工用酶制剂通用卫生标准-抗菌活性检测标准菌株中的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ATCC 6538)和大肠埃希氏菌(Escherichia coli ATCC 11229)为供试菌。

LB培养基：胰蛋白胨10g、酵母提取物5.0g、氯化钠10g、加水定容到1L，pH 7.0，121℃高压灭菌20min。

S12供试菌平板的制备

在超净台中，刮取在LB平板培养18～24h的菌落，用无菌生理盐水调整浊度调配成与0.5麦氏标准比浊管相同，相当于1.0×10

用无菌棉签蘸取供试菌悬液，在管壁上挤压几次，去掉过多的菌液后，在平板培养基表面均匀涂抹3次。每涂抹1次，平板应转动60°，最后将棉签绕平板边缘涂抹2圈，保证涂布均匀。盖好平板，室温下静置30min。每种供试菌设两个重复平板。

用直径为8mm无菌打孔器打孔，用针头挑取孔内凝胶，并以酒精灯火焰封底，使培养基与培养皿充分融合。各圆孔中心之间相距25mm以上，与平板的周缘相距15mm以上。每个平板需要一个重复。

S13抑菌活性采用琼脂平板扩散法检测法

在打有直径为8mm孔的菌板上，每孔加入80μL发酵液上清液。4℃正置2h扩散完全后，37℃倒置培养过夜。用游标卡尺测量抑菌环的直径(包括孔洞)并记录。

S2菌株的生长曲线和抑菌活性

挑取侧胞芽孢杆菌单菌落在5mL LB培养基中，30℃过夜培养活化，而后按照1％接种量接种到100mL的LB培养基中，30℃、200r/min恒温振荡培养。每间隔6h取样5mL待检测，发酵72h终止。将取样菌液一部分用于测定OD

从图1看出，菌体从6h开始对数生长期，培养到18h时菌体浓度达到最大，随后又开始下降，这可能是由于分泌出的高难度抗菌物质对菌体的溶菌作用。抗菌蛋白从6h开始快速增多，在24h之后趋于稳定，抗菌物质在培养基中稳定性好。

实施例2侧胞芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)来源的抗菌物质提取S1侧胞芽孢杆菌的发酵培养液的制备

LB培养基：配制方法见实施例1。

取16％甘油保存的侧胞芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)，接种到LB固体培养基上，在大气条件下30℃恒温箱中18h。然后，挑选单菌落于盛有5mL LB培养基的50mL无菌离心管中，30℃、200r/min恒温振荡培养18h，制得种子发酵液。

在500mL三角瓶中装入100mL LB液体培养基，将上述种子发酵液按照1％(v/v)的接种量接种，30℃、200r/min恒温振荡培养18～24h，得发酵培养液。

S2表达方式鉴定

将获得的发酵培养液，在室温下，8000rpm离心10min，收集上清液用作胞外表达抑菌测试。将离心后的菌体用PBS洗涤3次后重悬，在液氮中反复冻融法破壁处理30min，8000rpm离心10分钟收集上清用作胞内表达抑菌测试。

发酵液上清及破碎菌体重悬上清液的抑菌圈实验结果如图2所示，上清液抑菌圈明显而沉淀的抑菌圈仅仅有一些模糊边界，这可能是由于菌体未清洗干净所致。因此，侧孢芽孢杆菌的抗菌物质为胞外分泌表达。

S3胞外抗菌蛋白的提取制备

将发酵培养液离心得到上清液，采用10％～80％硫酸铵沉淀、10K超滤和葡聚糖G50层析纯化分离，最后真空浓缩得到胞外抗菌蛋白。S31 10％～80％硫酸铵沉淀

取100mL烧杯，标号，每个加入50mL发酵液，冰浴条件下每个烧杯分别缓慢加入2.8g、5.7g、12.15g、19.5g、28.05g硫酸铵，分别对应10％、20％、40％、60％、80％浓度的硫酸铵。4℃静置过夜，10000rpm离心30min收集沉淀蛋白，PBS洗涤一次后重悬溶解。

如图3所示，发酵液上清液经过10％～80％梯度硫酸铵沉淀后的蛋白，均用5mL的PBS缓冲液重悬，每孔加样100μL样品做抑菌实验，结果显示均具有抗菌活性，且抗菌能力随着硫酸铵浓度逐步递增。硫酸铵沉淀后蛋白的Tricine-SDS-PAGE(方法见实施例3)结果如图4所示，随着硫酸铵浓度提高，沉淀的蛋白条带越多，蛋白浓度越高，推测抗菌蛋白条带在16kDa附近。

S32 10K超滤

选择

称取Sephadex G50干粉30g，加入300mL水充分溶胀24h后装柱(100cm×Φ1.6)，用20mM的PBS(pH7.4)以0.5mL/min流速平衡2个柱体积至OD

表1 G50纯化分离出3个组分峰的抑菌圈检测结果

经过Sephadex G50纯化分离出3个组分峰见图5，纯化后的蛋白峰的抑菌圈实验结果见表1，所述的抗菌蛋白在洗脱峰2。

实施例3抗菌蛋白的鉴定

S1抗菌蛋白分子量的Tricine-SDS-PAGE检测

Tricine-SDS-PAGE是不连续电泳，配制方法如表2所示。电泳前将阴极缓冲液添加到内槽中，将阳极缓冲液添加到外槽中。将发酵液培养液、80％硫酸铵沉淀后的蛋白、经过Sephadex G50纯化分离的蛋白分别先用TCA浓缩，取10μL浓缩样品与10μL 2×Tricine上样缓冲液于PCR管中混匀；100℃加热5min，冰上冷却后，每孔上样20μL。以30V电泳1-2h到分离凝胶的上边缘时，将电压调节至130V，直到电泳结束。电泳后，将凝胶染色0.5h，然后脱色进行成像。

表2.Tricine-SDS-PAGE凝胶的配制

Tricine-SDS-PAGE分析结果如图6所示，泳道3得到单一蛋白条带，大小约16.4kDa，抑菌圈结果表明具有抗菌活性，因此推测该分子量蛋白为活性蛋白。

S2侧孢芽孢杆菌抗菌蛋白的质谱鉴定鉴定

经过Sephadex G50纯化分离的蛋白经过Tricine-SDS-PAG电泳、考马斯亮蓝染色得到单一条带，将条带切割下用去离子水清洗2遍，吸干水分后封存至EP管中，交由上海生物技术工程公司做后续处理。其中包括胶条蛋白经过溶胶、酶切、干燥后经过液相色谱、串联质谱鉴定得到原始数据，将质谱数据与蛋白数据库的比对计算后，提供样品蛋白的氨基酸序列及相关信息。

样品蛋白经过LC-MS/MS，原始质谱数据在Mascot蛋白检索软件上分析，该蛋白是一个未知功能的假设蛋白(登录号WP_025365222.1，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/WP_025365222.1)，其理论质量18.902kDa，理论等电点pI 7.78。该假设蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，对应的基因序列(GeneID:66576830)如SEQ ID NO：3所示。

对该样品蛋白序列做生物学性质分析。具体包括：用SingalP 5.0分析信号肽序列https://services.healthtech.dtu.dk/service.php？SignalP-5.0；ProtScale疏水性分析https://web.expasy.org/protscale/；用ExPASy的ProtParam分析理化性质https://web.expasy.org/protparam/#opennewwindow。

样品蛋白序列通过SingalP 5.0分析结果如图8所示，1～25氨基酸为信号肽Sec/SPI(likelihood＝0.987)，抗菌蛋白分泌表达；26～180氨基酸为成熟蛋白序列，分子量大小为16.4kDa，氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

抗菌蛋白的疏水性结构分析结果如图9所示，图中Score高峰值(正值)的区域表示疏水的区域，而负值的“低谷”区域是亲水区域，从结果看出，本发明涉及的抗菌蛋白是一种亲水型蛋白。

表3.抗菌蛋白理化性质预测分析

将去除信号肽的抗菌蛋白序列(155aa的成熟蛋白)导入ProtParam在线软件中分析，其理化性质预测分析结果如表3所示，预测蛋白分子量大小与Tricine-SDS-PAGE显示的条带想一致，约为16.4kDa，等电点pI＝5.87，是一种酸性蛋白。由当平均亲水系数＜0时，为亲水性蛋白，这与图9的疏水性分析结果一致。而不稳定系数＜40，表明该抗菌蛋白为稳定性较好的蛋白。此外，蛋白的脂肪系数相对较高，也表明该抗菌蛋白是相对较为稳定的蛋白。

实施例4抗菌效价和抗菌谱的测定

S1抗菌效价测定

参考GB/T-39101-2020《多肽抗菌性测定抑菌圈法》根据抗菌物质在固体平板中与指示菌接触反应，使其周围菌株生长抑制从而长成抑菌圈，根据抑菌圈直径计算出抗菌效价U。具体操作见标准，本发明中以大肠埃希菌为指示菌株，80％硫酸铵沉淀粗制品为待测样品。将样品母液测定蛋白浓度(C)后，稀释成不同倍数(n)的稀释液，做抑菌圈实验。数据处理时将lg(1/n)为横坐标，抑菌圈直径为纵坐标，建立线性方程(R

其中，U表示抗菌效价，单位为AU/mg；V表示样品的测定体积，单位为mL；X

硫酸铵沉淀后测定蛋白浓度为681.6μg/mL，二倍梯度稀释5个浓度做抑菌圈，每孔100μL，抗菌蛋白粗制品对大肠埃希菌的线性关系如图7所示，抑菌圈直径与稀释倍数倒数的对数值之间的函数关系为y＝5.315x+22.20(R

S2抗菌谱测定

为检测该抗菌蛋白对不同致病细菌的抑制和杀灭能力，体外采用最低抑菌浓度(Minimal Inhibitory Concentration，MIC)的试验方法测定其抗菌谱，选择8种常见的致病菌作为体外抑菌实验的被检测菌株，革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌各4种，如表4所示。样品为硫酸铵沉淀后蛋白粗制品，取10mL玻璃试管，高温灭菌后各管加入2mL的LB培养液，8号空白管加入4mL的LB培养液，标记好顺序。第1管加入2mL样品母液，混匀后吸取2mL至第2管，依次二倍稀释至第7管，8管作为空白对照，不加样品。最后加入菌液至试管中菌液终浓度为0.5个麦氏比浊，混匀后37℃静置培养过夜。每个检测指示菌做3个重复实验，肉眼观察试管溶液的浑浊度，由澄清开始变浑浊的试管中样品浓度即为样品的最低抑菌浓度。通过测定对不同指示菌的最低抑菌浓度得到抗菌蛋白的体外抗菌谱效果。

表4最低抑菌浓度待检测菌株

硫酸铵沉淀后的蛋白粗制品用PBS缓冲液调整至200μg/mL，体外对4种革兰氏阴性菌和4种革兰氏阳性菌均具有抑制作用，如表5中所示，对大肠埃希菌、鼠伤寒沙门氏菌的抑菌效果特别好。

表5抗菌蛋白粗制品的体外抗菌谱

实施例5抗菌蛋白的热稳定性试验

取400μg/mL 80％硫酸铵沉淀后的蛋白粗制品0.5mL，分别在20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、100℃下处理30min，各取100μL做抑菌圈实验，4℃正置3h，37℃倒置过夜培养。测定抗菌活性，分析热稳定性。

结果如图10所示，抗菌蛋白粗制品在20～100℃之间热稳定好，在30℃处理后抗菌效果最优，之后随着温度上升活性慢慢下降，100℃时活性最小，酶活损耗最大也仅为7.2％。因此，该抗菌蛋白的热稳定性好。

以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述的仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。