一种亮脑啡肽固相合成中多肽粗产品沉淀的新方法

所属技术领域：

本发明涉及一种多亮脑啡肽固相合成中的多肽粗产品沉淀试剂及多肽粗产品沉淀新方法，具体来讲：就是以柠烯和对异丙基甲苯按照一定比例配制而成的试剂，从树脂切下的三氟乙酸与多肽粗产品混合物中将亮脑啡肽粗品分离和初步纯化，适用于多肽化学合成中多肽粗产品沉淀的新方法。

背景技术：

多亮脑啡肽固相合成是一种重要的生物化学合成方法，广泛应用于制备生物活性多肽和药物。在多肽合成的过程中，合成的多肽通常附着在树脂上，为了得到纯净的多肽产物，需要将多肽从树脂上切割下来并去除残余的保护基和杂质。传统上，乙醚是一种常用的沉淀剂，用于将多肽从溶液中析出，以便进一步纯化。同时，多肽通常附着在三氟乙酸可溶的树脂上，而三氟乙酸则是一种常用的切割剂，用于将多肽从树脂上释放出来。

然而，乙醚在多亮脑啡肽固相合成中使用存在一些缺陷，需要寻找更为优越的替代品。首先，乙醚具有挥发性，易燃，对操作人员和环境安全性构成潜在威胁。其次，乙醚的使用需要严格的溶剂处理和废弃流程，增加了实验室管理的难度和成本。此外，乙醚在与有机物混合时，可能会产生有毒的气体，对实验环境和人员健康带来潜在风险。乙醚在多个国家都属于易制毒试剂，其售卖与使用均受到公安部门的严格限制。

除了安全问题，乙醚作为沉淀剂还存在一些技术性的问题。乙醚的沉淀效果可能受到多肽的特性影响，有时产物的沉淀率不稳定，难以控制。此外，乙醚对一些特定的多肽结构可能表现出较低的沉淀效果，导致产物无法得到有效分离和纯化。

鉴于乙醚在多亮脑啡肽固相合成中的缺陷，迫切需要一种新型的沉淀剂，能够在确保安全性的同时提供更高的沉淀效率和更广泛的适用性。这种新型试剂应当具备稳定的沉淀性能，不受多肽结构的影响，同时能够简化工作流程，降低实验室管理的难度和成本。此外，新型试剂还应考虑环保性，避免产生有毒废物，从而更符合绿色合成的理念。

在这一技术背景下，我们开发了一种新型试剂，旨在替代乙醚，提高多肽的沉淀效率，并在操作安全性和环境友好性上有所改进。

柠烯是一种具有多重优点的天然溶剂，广泛存在于各种柑橘属果皮及香精油，加热蒸馏也不会分解。它具有极低的毒性，使得在实验室环境中更安全，对操作人员的健康风险较小；其良好挥发性使得使用后分离清除十分方便。柠烯也具有出色的选择性溶解力，能够有效溶解许多有机化合物，使其在有机合成和化学反应中成为理想的溶剂选择。由于其较低的相对极性，柠烯还能够减少产物中的杂质，有助于提高反应的选择性和纯度。此外，柠烯对环境友好，易于处理和回收，价格低廉，是著名的绿色溶剂和生物溶剂。综合来看，柠烯在化学实验和工业生产中表现出色，成为一种受欢迎的替代溶剂。

多肽在柠烯中溶解度极低。而柠烯的非环双键可以与三氟乙酸在甲苯中发生反马氏规则加成，生成三氟乙酸酯。因此，柠烯对多肽和三氟乙酸有极高的选择性沉淀/溶解能力。我们以对异丙基甲苯(又称对伞花烃，柠烯的一种氧化产物，同样为低毒绿色溶剂)替代有毒的甲苯，同时通过调节柠烯和对异丙基甲苯配比提升了三氟乙酸酯的生成速率和在混合溶剂中的溶解度。优化配比后的柠烯和对异丙基甲苯在保持对多肽低溶解的同时，其除去三氟乙酸的能力可与乙醚媲美，也具有类似的挥发性。此外，柠烯对于弱极性化合物广泛的溶解能力也有利于各种侧链保护基团的脱保护副产物的去除。因此具有作为绿色多肽沉淀剂和的潜力。我们在此测试了柠烯与对异丙基甲苯混合试剂的配比及其在多肽沉淀中的应用，为多肽合成领域的研究和应用提供新的解决方案。

发明内容：

发明首次提出了一种多亮脑啡肽固相合成中的多肽粗产品沉淀试剂。所述多肽粗产品沉淀试剂由柠烯和对异丙基甲苯按照体积比80:20混合制得。所述的多亮脑啡肽固相合成中多肽粗产品沉淀的新方法包括如下基本步骤：将以三氟乙酸切割树脂后分离得到的溶液，缓慢滴加到6倍以上体积的所述的多肽粗产品沉淀试剂中；滴加完毕后，震荡反应2小时；用能达到3000转每分钟的离心机对析出的多肽进行充分离心，使多肽得以完全沉淀；分离出多肽粗产品沉淀后，用所述的多肽粗产品沉淀试剂洗涤多肽粗产品3遍以洗掉残余的三氟乙酸和其他杂质；添加少量环己烷，冻干后，得到较纯净的亮脑啡肽粗产品。

与现有试剂相比，本发明所述的一种多亮脑啡肽固相合成中多肽粗产品沉淀的新方法的创新与优势在于：

1.与传统醚类不同，沉淀试剂通过化学和物理双重作用，高度选择性地清除去三氟乙酸及多肽脱保护的杂质；沉淀析出的多肽粗产品纯度较传统沉淀剂乙醚来得更高，降低了后续HPLC纯化成本和难度。

2.试剂完全由绿色/生物溶剂组成，相对于常规醚类试剂，毒性和危险性大大降低。

3.试剂配制简单，密封状态下易于保存，且相比于其他醚类溶剂(如环戊基甲醚或甲基叔丁基醚)成本低廉，不含乙醚等易制毒管制组分，具有优秀的应用潜力。

说明附图

图1.实施例1(应用冰乙醚作为多肽粗产品沉淀试剂的亮脑啡肽固相合成)和实施例2(应用不同体积配比的柠烯和对异丙基甲苯混合试剂作为多肽粗产品沉淀试剂的亮脑啡肽固相合成)的多肽产物的HPLC对比图。所述不同体积配比分别是100:0(不含对异丙基甲苯),90:10,80:20,70:30,60:40和50:50。HPLC检测条件：室温，样品等浓度当量10倍稀释，岛津C18 INERTSIL ODS-3反向色谱柱，流动相采用含0.1％三氟乙酸的90％乙腈和水，浓度梯度10％-60％，50分钟，波长220nm。

具体实施方式：

下述实施例中所使用的实验材料、试剂等均可通过商业途径或已知实验方法获得。下面将结合具体实施例和附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1，应用冰乙醚作为多肽粗产品沉淀试剂的亮脑啡肽(Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-OH)固相合成。

步骤1，预载树脂的制备：称量200.4mg的Wang树脂(载量0.82mmol/g)置于带筛板的针筒式反应器中。用5mL二氯甲烷(DCM)和5mL二甲基甲酰胺(DMF)依次溶胀树脂。将87.0mg Fmoc-L-Leu-OH(1.5当量)和128.3mg 1H-苯并三唑-1-基氧三吡咯烷基六氟磷酸盐(PyBOP，1.5当量)完全溶解于5mL DMF，添加85.9μL N,N-二异丙基乙基胺(DIPEA，3.0当量)，移入反应器与溶胀后的树脂充分混合后震荡反应40分钟。反应完毕后过滤树脂。添加含有31.0μL乙酸酐(2.0当量)和57.3μL DIPEA(2.0当量)的DCM溶液。在室温下再搅拌30分钟，对树脂上未反应的羟基进行封端。随后，过滤树脂依次用DMF洗涤3次，用DCM洗涤2次，再用DMF洗涤2次，最后用DCM洗涤3次。真空干燥树脂。

步骤2.脱除树脂上预载Fmoc-L-Leu的Fmoc保护基：添加5mL 20％哌啶的DMF溶液，在室温下震荡10分钟后过滤。对比20％(v/v)哌啶的DMF溶液空白样品(λ＝290nm)，测量脱保护样品的吸光度确认反应进度，并取极少树脂进行茚三酮检测，呈深蓝色，证明脱保护完全。

步骤3.依次加载氨基酸Phe、Gly、Gly和Tyr及其Fmoc脱保护：以DMF清洗预载树脂5次；将95.3mg Fmoc-L-Phe-OH(1.5当量)、85.9μL DIPEA(3.0当量)和128.3mg PyBOP(1.5当量)混合，溶解于5mL DMF，移入反应器与树脂充分混合后震荡反应40分钟。反应完毕后过滤树脂。用DMF洗涤3次，用DCM洗涤2次，再用DMF洗涤3次。添加5mL 20％哌啶的DMF溶液，在室温下震荡10分钟后过滤。对比20％(v/v)哌啶的DMF溶液空白样品(λ＝290nm)，测量脱保护样品的吸光度确认反应进度，并取极少树脂进行茚三酮检测，呈深蓝色，证明脱保护完全。重复以上步骤，依次以73.2mg Fmoc-L-Gly-OH、73.2mg Fmoc-L-Gly-OH和113.06mg Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH(1.5当量)为反应物加载其余氨基酸L-Gly、L-Gly和L-Tyr至树脂上。茚三酮检测显示，每个氨基酸加载后20％哌啶的DMF溶液均能实现脱保护完全。完成所有氨基酸加载及脱保护后，用DMF洗涤3次，用DCM洗涤2次，用DMF洗涤3次，再用DCM洗涤5次。冻干树脂。

步骤4.从树脂上切割多肽：向冻干后的树脂添加95％的三氟乙酸(TFA)水溶液，震荡反应1小时，过滤树脂收集液相部分溶液(约3mL)；溶液在20mL冷乙醚中沉淀；用能达到3000转每分钟的离心机对析出的多肽进行充分离心，使多肽得以完全沉淀；以乙醚清洗三遍以洗掉残余的三氟乙酸和其他杂质，添加少量环己烷，冻干后，得到亮脑啡肽粗产品75.72mg(HPLC纯度56.4％)。

实施例2，应用不同体积配比的柠烯和对异丙基甲苯混合试剂作为多肽粗产品沉淀试剂的亮脑啡肽(Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-OH)固相合成。

固相合成步骤1，2和3，与实施例1一致，不再赘述。

步骤4.从树脂上切割多肽：向冻干后的树脂添加95％的三氟乙酸(TFA)水溶液，震荡反应1小时，过滤树脂收集液相部分溶液(约3mL)。溶液缓慢滴加到20mL的柠烯和对异丙基甲苯混合试剂中；滴加完毕后，震荡反应2小时；用能达到3000转每分钟的离心机对析出的多肽进行充分离心，使多肽得以完全沉淀；分离出多肽粗产品沉淀后，用所述的多肽粗产品沉淀试剂洗涤多肽粗产品三遍以洗掉残余的三氟乙酸和其他杂质；添加少量环己烷，冻干后，依照柠烯和对异丙基甲苯混合试剂的不同体积配比(V(柠烯):V(异丙基甲苯))，分别得到亮脑啡肽粗产品质量与HPLC纯度如下：

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均包括在本发明的保护范围和公开范围之内。