一种血红蛋白鲨源纳米抗体及其制备方法和应用

文献发布时间：2024-04-18 20:00:50

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种血红蛋白鲨源纳米抗体及其制备方法和应用。

背景技术

血红蛋白(hemoglobin，Hb)是血液中的一种含铁金属蛋白，用于运输含氧血红细胞，在生物体新陈代谢过程中起着非常重要的作用。血红蛋白是人血清中含量最丰富的蛋白质，其水平对人体健康状况十分重要，人血清中Hb含量异常可导致某些健康问题，如贫血和红细胞增多症等。血红蛋白对疾病的诊断有着十分重要的意义。抗人血红蛋白抗体能特异性地结合人血红蛋白，而不与其他蛋白，如肌红蛋白、动物血红蛋白起反应，不会受到各种因素的干扰而导致假阴性及假阳性。此外，该法不需要特殊仪器，操作简便、反应迅速，具有较高的临床应用价值。

传统单抗为了保障生产中正确的结构折叠和糖基化等翻译后修饰，较多采用哺乳动物细胞株进行生产。此外，传统抗体Fab片段及单链抗体scFv的抗原结合表面常形成凹形拓扑结构，通常只能识别位于抗原表面的位点，制约其广泛使用和疗效的发挥。使用传统的抗体检测Hb，可能会受到Hb变异体的影响。比如，像Hb的一些常见变异体HbF和HbS都有使Hb测定结果出现误差的可能性，存在特异度不高或无法精确定量的问题。

20世纪90年代，比利时布鲁塞尔自由大学的Hamers Casterman和Muyldermans发现，在骆驼科动物，如单峰驼、双峰驼、美洲驼等的血清中，存在着一种天然缺失了轻链部分，只含有重链部分的重链抗体。随后，在软骨鱼类如鲨鱼体内，也检测到重链抗体的存在，其抗体可变区仅由1个重链可变区组成，该区域被称为单域抗体(sdAb)。单域抗体蛋白直径小于10纳米，因此又被称为纳米抗体。羊驼和鲨鱼的单域抗体分别称为VHH和VNAR。单域抗体比传统的scFv或Fab具有居多优势，其分子量小、穿透性强、稳定性及可溶性更高，其发挥功能不依赖糖基化修饰等。与传统抗体相比，单域抗体通常具有一个扩展的CDR3，可以形成一个凸出的表面结构来识别抗原表位，因此可以利用其帮助识别传统抗体难以识别的隐藏抗原表位。在分子成像、疾病诊断、免疫检测、环境监测等领域具有潜在的应用前景。目前尚无抗血红蛋白的鲨源纳米抗体序列专利。

发明内容

为了解决背景技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种血红蛋白鲨源纳米抗体及其制备方法和应用。本发明提供了能够以高亲和力结合血红蛋白的鲨源重链抗体可变区序列(VNAR)，该可变区序列又称为纳米抗体，其能够用于血红蛋白的亲和纯化、免疫学检测、细胞成像、疾病诊断制药等领域。

本发明所采用的技术方案如下：

一、一种血红蛋白鲨源纳米抗体：

所述鲨源纳米抗体的核苷酸序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3；所述鲨源纳米抗体的氨基酸序列为SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6。

二、一种血红蛋白鲨源纳米抗体的应用：

所述鲨源纳米抗体在血红蛋白的亲和纯化、免疫学检测、细胞成像、疾病诊断等领域的应用。

鲨源纳米抗体在血红蛋白的亲和纯化中的应用具体是指利用鲨源纳米抗体从血液或组织样品中富集并纯化出血红蛋白。

所述鲨源纳米抗体在疾病诊断领域的应用包括鲨源纳米抗体在制备诊断红细胞增多症/贫血症药物中的应用。

所述免疫学检测包括血红蛋白的酶联免疫分析、化学发光免疫分析、荧光免疫分析、胶体金免疫分析和免疫传感分析。

所述细胞成像包括免疫荧光成像和体内定位成像。

三、一种血红蛋白鲨源纳米抗体的制备方法，包括以下步骤：

S1：制备血红蛋白溶液；

S2：对条纹斑竹鲨进行免疫；

S3：构建噬菌体抗体文库；

S4：筛选特异性纳米抗体；

S5：纳米抗体重组表达：将抗体序列构建到原核或真核表达载体中，诱导表达重组蛋白，以亲和层析柱纯化抗体。

所述S1中具体为：首先从人血细胞中分离纯化得到血红蛋白抗原，再将血红蛋白抗原溶于特定溶剂/水中，得到血红蛋白溶液。

所述S2具体为：将血红蛋白溶液与弗氏完全佐剂以体积比1:1混合，待乳化完全后，皮下注射入条纹斑竹鲨侧鳍，并将此次皮下注射作为一次免疫；对条纹斑竹鲨共进行四次免疫，每次均采用皮下注射方式；皮下注射之间相间隔时间为20天，单次免疫剂量为每只条纹斑竹鲨100μg。

具体地，首先将S1制得的血红蛋白溶液与弗氏完全佐剂以体积比1:1混合，待乳化完全后，皮下注射入条纹斑竹鲨侧鳍，此为第一次免疫；接着，每间隔20天对条纹斑竹鲨进行加强免疫，每次加强免疫是指将血红蛋白溶液与弗氏不完全佐剂以体积比1:1混合，待乳化完全后，皮下注射入条纹斑竹鲨侧鳍。重复4次，即可完成对条纹斑竹鲨的免疫。

所述S3具体为：

S31、在末次免疫结束后10天，利用质量分数为0.1％的麻醉剂MS-222喷洒条纹斑竹鲨的口鼻和鳃，使条纹斑竹鲨麻醉，再经尾静脉采集条纹斑竹鲨的外周血，对外周血进行离心收集淋巴细胞溶液，再从淋巴细胞溶液中提取总RNA并反转录为cDNA；

S32、以cDNA为模板，利用高保真酶扩增获得VNAR片段；

S33、以pR2噬菌粒为模板，用高保真酶扩增pR2噬菌粒，利用内切酶酶切pR2噬菌粒模板；所述内切酶具体为Dpn I；

S34、将VNAR片段与酶切之后的pR2噬菌粒通过无缝克隆连接，电转化感受态细菌，稀释涂布细菌，将细菌刮板冻存，得到噬菌体抗体文库。

具体实施中，可计数噬菌体抗体文库的文库大小，若文库大小小于预设的阈值，则舍弃该噬菌体抗体文库病并重复S3以重新处理制备抗体文库。

所述S4具体为：

S41、活化噬菌体抗体文库的菌株，并加入辅助噬菌体，经静置培养和离心收集菌体后，将菌体震荡培养过夜；

S42、利用PEG沉淀法富集噬菌体，计算富集的噬菌体的滴度；

S43、包被0.1mg/mL血红蛋白溶液于96孔免疫板的孔中，并将包被有蛋白的孔作为血红蛋白组，将未包被蛋白的孔作为阴性对照组，上述两组孔中均加入富集的噬菌体，使噬菌体与免疫板上的蛋白结合，经多次洗涤，用胰酶洗脱得到特异性结合血红蛋白的噬菌体；

具体是将血红蛋白溶液与阴性对照包被于免疫板的孔中，再将富集的噬菌体加入到血红蛋白溶液实验组与阴性对照组中。

S44、将特异性结合血红蛋白的噬菌体侵染TG1细菌，稀释涂布平板，培养获得单菌落，并计数血红蛋白组与阴性对照组的菌落数量，并使得血红蛋白组菌落大于阴性对照组菌落的数量；

S45、挑取血红蛋白组单菌落于96孔免疫板中，加入辅助噬菌体，扩增得到单克隆噬菌体；

S46、再次包被1μg/mL血红蛋白溶液于96孔免疫板中，并将包被有蛋白的孔作为血红蛋白组，将未包被蛋白的孔作为阴性对照组，上述两组均加入单克隆噬菌体，使单克隆噬菌体与免疫板上的蛋白结合；加入辣根过氧化物酶标记的噬菌体特异性抗体，使用TMB显色液进行显色，测定显色后溶液的吸光度，筛选出阳性菌落，从而获得血红蛋白特异性的抗体序列。

此处的阳性是指OD

所述测序引物具体为：5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’。

所述S34中无缝克隆连接具体为：连接体系共100μL，包含50μL无缝克隆连接酶、0.5pmol pR2噬菌粒、2pmol VNAR片段，其中pR2噬菌粒和VNAR片段体积共50μL；连接反应条件为50℃水浴1h。

本发明的纳米抗体核苷酸序列如SEQ ID NO：1-3，氨基酸序列如SEQ ID NO：4-6；制备是将血红蛋白抗原免疫条纹斑竹鲨，提取外周血淋巴细胞总RNA并反转录为cDNA；扩增VNAR片段，并与噬菌粒连接，构建噬菌体抗体文库；从文库中筛选血红蛋白特异性的纳米抗体序列并重组表达，获得靶向血红蛋白的鲨源纳米抗体。

本发明与现有技术相比，具有以下优点：

1、本发明的纳米抗体来源于条纹斑竹鲨，其分子量小、易于改造和表达、低免疫原性、高抗原结合性、组织穿透性强等优点，可用于血红蛋白的亲和纯化、免疫学检测、体内定位和成像、疾病诊断和蛋白质结构研究等领域。

2、所述鲨源纳米抗体筛选仅需要2条鲨鱼，所述纳米抗体具有与原重链抗体相当的结构稳定性及抗原结合活性，是已知的可结合目标抗原的最小单位。具有特异性强、亲和性好、稳定性高，广泛用于生化机制研究、结构生物学及肿瘤等疾病诊疗领域。

3、纳米抗体溶解性高，复性能力强，还可以通过重组表达系统大量获取。且纳米抗体已经实现胞内抗体的药物细胞内递送，被应用于临床实践。目前，对羊驼源单域抗体的研究较多，而对鲨鱼源单域抗体研究较少。因此本发明解决了现有鲨鱼源单域抗体研究较少的现状，优化传统人源单抗分子量大、亲和力弱、操作复杂等缺点。

附图说明

图1是血红蛋白免疫鲨鱼方案示意图。

图2是单克隆噬菌体ELISA结果图。

图3是所述纳米抗体氨基酸序列比对结果图。

图4是所述纳米抗体Fc融合蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳结果和泳道M为标准蛋白。

图5是采用ELISA表征所述纳米抗体Fc融合蛋白与血红蛋白之间结合的结果图。

图6是采用BLI表征所述纳米抗体与血红蛋白之间的亲和力示意图。其中实线是实时监测的动力学曲线，虚线是软件拟合的曲线。不同血红蛋白浓度梯度的动力学曲线从上到下与右侧标识的从上到下的浓度依次对应。

具体实施方式

下面结合附图及具体实施例对本发明作进一步详细说明，以下实施例是对本发明的解释而本发明并不局限于以下实施例。

本发明的实施例如下：

实施例1血红蛋白免疫鲨鱼

利用分离纯化的血红蛋白免疫鲨鱼，免疫方案如图1所示。本发明共进行四次免疫，均为皮下注射。免疫间隔时间为20天，第四次免疫后10天，通过尾静脉采集鲨鱼外周血。本发明共使用2条条纹斑竹鲨，每条鲨鱼每次免疫血红蛋白剂量均为100μg。

实施例2血红蛋白纳米抗体筛选

1)将抽取的鲨鱼外周血缓慢加至等体积30％(m/v)蔗糖溶液上层，300g水平离心30min，取中间淋巴细胞层，经PBS洗涤两次后，离心收集细胞沉淀。利用RNA抽提试剂盒提取总RNA，并反转录为cDNA。

2)以cDNA为模板，以特异性引物扩增VNAR序列，正向引物为：

5’-GCTGCACAGCCTGCTATGGCAACTCAACGGGTTGAA CAAACACCGAC-3’，反向引物为：5’-GAGTTTTTGTTCGGCTGCT GCTGGTTTTACAGTCAGAATGGTGCCGC-3’。扩增所用DNA聚合酶为高保真酶PrimeSTAR Max DNA Polymerase，扩增程序为：98℃、10s，57℃、15s，72℃、25s，循环30次。利用试剂盒回收扩增的VNAR片段。以pR2噬菌粒为模板，特异性引物扩增pR2噬菌粒，特异性引物扩增pR2噬菌粒，正向引物为：5’-AGCAGCC

GAACAAAAACTCATCTCAGAAGAG-3’，反向引物为：5’-CCATA GCAGGCTGTGCAGCATAGAAAGGTACCACTAAAGGAATTGC-3’。扩增所用DNA聚合酶为高保真酶PrimeSTAR GXL DNAPolymerase，扩增程序为：98℃、10s，53℃、15s，68℃、4min 15s，循环30次。利用Dpn I酶切扩增产物中的模板pR2噬菌粒，而后利用试剂盒回收扩增的pR2噬菌粒。利用无缝克隆连接pR2噬菌粒和VNAR片段，其摩尔比为1:4。利用试剂盒回收连接产物，洗脱所用溶液为无菌水。将连接产物电转化至TG1感受态细胞中，37℃、200rpm培养1h，分别取0.2μL和0.02μL(稀释法)菌液涂布90mm固体平板，培养13h后计数菌落数目，并计算所构建抗体文库大小。将剩余的菌液经离心后涂布至5块150mm固体平板，37℃培养13h，而后刮取菌苔，液氮速冻后于-80℃储存，此为噬菌体抗体文库。

3)活化冻存的抗体库细菌，加入KM13辅助噬菌体。取细菌培养上清，测量噬菌体滴度，此为扩增后的噬菌体。以0.1mg/mL浓度包被血红蛋白至免疫板，加入1×10

4)从以上平板中随机挑取95个单菌落，活化过夜。加入KM13辅助噬菌体，离心收集裂解后的上清，此为单克隆噬菌体。以1μg/mL浓度包被血红蛋白至96孔免疫板，每孔分别加入以上制备的单克隆噬菌体溶液，室温孵育1h。利用HRP-anti M13抗体捕获与血红蛋白结合的噬菌体，并用TMB底物显色5min，以1M H

5)挑取OD

6)比对分析所测得抗体序列，排除重复的克隆后，共得到三条不同的纳米抗体序列(图3)。SEQ ID NO.1-3所示为纳米抗体核苷酸序列，由此可得如SEQ ID NO.4-6所示的纳米抗体氨基酸序列。

实施例3表达纯化所得血红蛋白纳米抗体Fc融合蛋白

将本发明中的纳米抗体序列构建到带信号肽的哺乳动物表达载体pTT5中，使其与人IgG1 Fc融合表达，Fc片段表达在C末端，并可用TEV酶酶切获得纳米抗体。将重组质粒转染HEK 293细胞，收集培养上清，经rProtein A亲和层析柱纯化纳米抗体Fc融合蛋白。如图4所示，我们获得了高纯度的血红蛋白纳米抗体Fc融合蛋白。

实施例4表征所述血红蛋白纳米抗体

1)采用非竞争性ELISA表征所述纳米抗体Fc融合蛋白与血红蛋白的结合情况：将浓度为10μg/mL的血红蛋白包被于免疫板中，添加1：5梯度稀释的纳米抗体Fc融合蛋白，室温孵育1h。而后，加入HRP anti-IgG1 Fc抗体以检测结合的VNAR-Fc。结果如图5所示，两个纳米抗体与血红蛋白的结合力大小依次为：7-11A-Fc＞5-10C，其EC

2)采用BLI表征所述纳米抗体与血红蛋白的亲和力。为了表征纳米抗体与血红蛋白的亲和力，首先用生物素标记血红蛋白，得到生物素化的血红蛋白(biotin-Hb)。而后，将其固化在SA生物传感器上，设置不同的纳米抗体浓度梯度，检测不同的纳米抗体Fc融合蛋白浓度梯度与血红蛋白的亲和力。结果如图6所示，三个纳米抗体与血红蛋白的结合力大小依次为：5-10C-Fc<7-11A-Fc

以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

本发明涉及的序列如下：

SEQ ID NO.1：

名称：血红蛋白鲨源纳米抗体5-10C的核苷酸序列

DNA类型：other DNA