CD83+、CD83+PD-L1+间充质干细胞及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种免疫抑制或抑炎功能易赋能型CD83

背景技术

随着干细胞治疗技术研究的深入，间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)已被认为是用于组织损伤性疾病以及免疫或炎症相关性疾病治疗的理想工具。MSCs是一种具有自我更新和多向分化潜能的多能干细胞，广泛分布于成人骨髓、脂肪、牙髓、胎盘和脐带等组织中。诸多研究证实，MSCs不仅具有极强的自我更新能力以及向中胚层、外胚层和内胚层的多向分化潜能，而且兼具良好的免疫/炎症调节能力，通过调节T细胞、NK细胞和巨噬细胞等免疫细胞的增殖、分化、分泌和极化等功能，从而有效调节机体免疫/炎症反应失衡。同时，其还能有效抑制受损组织原位细胞的凋亡，促进血管生成以及激活组织原位干细胞等多种生物学特性，参与受损组织的再生与修复。因此，MSCs移植不仅能恢复患者失衡的免疫反应或者炎症反应，同时又有组织再生和修复功能，基于这些特点使MSCs移植有望成为损伤、炎症和免疫相关性疾病治疗的一种理想策略。

已被证实，MSCs除通过分化和分泌细胞生长因子等方式直接参与受损组织的再生修复外，还可通过调节机体炎症/免疫反应失衡，修复机体免疫稳态，避免靶器官继发炎性损伤，改善机体组织修复微环境，促进受损组织再生修复。鉴于MSCs移植治疗炎症和免疫相关性疾病，既能从根本上恢复机体炎症/免疫反应失衡，同时又能促进受损组织的再生修复，因此MSCs移植被认为是一种治疗损伤、炎症和免疫相关性疾病极具潜力的理想策略。然而，随着MSCs移植治疗炎症/免疫相关疾病临床数据量的增加，发现MSCs移植治疗炎症/免疫相关疾病的临床疗效存在巨大个体差异，即使是同种疾病部分患者有疗，但部分患者无效甚至出现相反结果。

随着对MSCs特性及其炎症/免疫调节机制的深入了解，发现MSCs天然状态下无组织修复和炎症调节活性，其组织修复和免疫调节功能依赖微环境刺激才得以赋能。在组织修复方面，静息状态下的MSCs无组织修复能力，其组织修复能力的获得依赖TGF-β、BMP、HGF和PDGF等生长因子刺激才得以赋能，且不同的刺激因素可诱导MSCs不同的分化方向和细胞生长因子分泌谱，进而影响MSCs的组织修复功能，并呈现出不同的再生修复结果。同样，MSCs炎症/免疫调节功能也并不是组成性的，即天然状态下MSCs的炎症/免疫调节能力低下，其炎症/免疫调节功能的获得依赖炎性/免疫微环境刺激才得以赋能，并受众多因素调控，如MSCs需经IFN-γ、TNF-α和IL-1β等炎性因子刺激后，发生免疫抑制或者抑炎功能重编程，后表达PD-L1、IDO和IL-10等抑炎介质或者受体，才能发挥免疫抑制或者抑炎效应。此外，尽管目前我们认为MSCs具有强大的免疫抑制或者抑炎功能，但MSCs对宿主炎症/免疫的调节具有双向性，既可激活免疫或者促炎，也可抑制免疫或者抑炎，而MSCs兼具炎症/免疫调节的双向性极大影响其治疗炎症/免疫性疾病的临床疗效。已证实，TGF-β1和TLR4激动剂LPS可诱导MSCs重编程为免疫激活或者促炎表型，发挥促炎效应。TLR3激动剂或炎性因子(如IFN-γ、IL-1β和TNF-α等)则诱导MSCs重编程为抑炎或者免疫抑制表型，发挥抑炎效应。然而，众多炎症/免疫相关性疾病患者因病因和病程等差异，部分患者机体微环境中常共存即可诱导MSCs促炎赋能又可抑炎赋能的因子或者介质，致促/抑炎MSCs共存；或者部分患者缺乏抑炎赋能因子，致MSCs抑炎赋能重编程障碍。上述原因可能是MSCs移植治疗炎症/免疫相关疾病出现治疗抵抗和临床疗效存在巨大个体差异的重要原因。因此，如何赋能和维系MSCs的抑炎或者免疫抑制功能是提高MSCs移植治疗炎症/免疫相关性疾病临床疗效的关键技术环节。

大量研究证实，MSCs是一种异质性多潜能干细胞群，存在多功能亚群和组织来源差异。Wang Z等利用scRNA-seq比较脂肪、骨髓和脐带等来源的MSCs差异，发现了7个组织特异和5个功能保守的MSCs亚群，相较而言脐带MSCs(hUC-MSCs)具有更强的炎症调节潜能。Zhang S等在原代MSCs中发现2个炎症调节和组织分化功能差异的功能亚群。然而，尽管已有MSCs异质性研究，但仅简单比较了其组织来源差异，缺乏功能分群的特征信息。另外，从静态MSCs获得的异质性数据难以代表炎性疾病进程中MSCs炎性调节亚群的时空赋能编程信息。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的主要目的在于提供一种免疫抑制或抑炎功能易赋能型CD83

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

第一方面：CD83

基于MSCs的异质性和功能可塑性，本申请团队认为MSCs中存在抑炎和促炎易赋能亚群，且促/抑炎亚群平衡与炎症/免疫相关性疾病的转归和治疗抵抗相关。因此，若能明晰MSCs抑炎和促炎易赋能亚群细胞表面标志和功能特征信息，后通过磁珠或者流式等分选技术获得高纯度MSCs抑炎易赋能亚群，或者去除MSCs促炎易赋能亚群的抑炎专能MSCs，再以MSCs抑炎易赋能亚群或者抑炎专能MSCs为种子细胞，研发专治自身免疫/炎症相关性疾病的MSCs细胞新药，将极大提高其临床疗效，具有更高成药性。为此，团队通过单细胞测序技术，发现了CD83阳性MSCs亚群，且此亚群细胞对炎性因子介导的免疫抑制或者抑炎功能具有更敏感的抑炎赋能效应，并被定义为“免疫抑制或者抑炎易赋能CD83

另一个方面，CD83

在某些具体实施例中，所述CD83

在某些具体的实施例中，所述免疫抑制因子为IL-10、IDO、PD-L1、GDNF、IL-10Rα、IL-2Rγ、IL-4、IL-4R、IL-17B、LIF、GM-CSFRα、TIMP-3和IL-2Rβ中的至少一种；

在某些具体的实施例中，所述抑炎因子为IL-10、IDO、PD-L1、GDNF、IL-10Rα、IL-2Rγ、IL-4、IL-4R、IL-17B、LIF、GM-CSFRα、TIMP-3和IL-2Rβ中的至少一种；

在某些具体实施例中，所述自身免疫性疾病包括类风湿性关节炎、硬皮病、系统性红斑狼疮、强直性脊柱炎、重症肌无力和多发性溃疡性结肠炎等中的至少一种；所述炎性相关疾病包括脓毒症、退行性关节炎和新生儿支气管肺发育不良性肺炎等中的至少一种。

第二方面，一种前述应用中CD83

(1)分离并培养间充质干细胞；

(2)采用抗CD83抗体偶联的磁珠分离和流式分选技术，或慢病毒基因转导技术，分选获免疫抑制或抑炎功能易赋能型天然CD83

具体为：方法一--磁珠和流式分选技术：采用抗CD83抗体偶联的磁珠和流式分选技术，分选获天然CD83

或方法二--慢病毒等基因转导技术：采用慢病毒基因转导技术，获人CD83基因修饰的人造CD83

优选地，其中所述间充质干细胞来源于人脂肪、牙髓、骨髓、脐带、胎盘或脐带血。

在某些具体的实施例中，步骤(1)中所述分离并培养间充质干细胞包括：采集样本组织进行洗涤；分离组织；将分离出的组织块置于生理盐水中洗涤，并剪碎、称重，转入离心管中离心，弃上清液；向离心管中加入MSCs培养基，培养一段时间；当原代细胞生长至细胞密度>80％时，消化解离并进行传代培养，获得含CD83

第三方面：CD83

在某些具体的实施例中，所述CD83

在某些具体实施例中，所述免疫抑制因子为IL-10、IDO、PD-L1、GDNF、IL-10Rα、IL-2Rγ、IL-4、IL-4R、IL-17B、LIF、GM-CSFRα、TIMP-3和IL-2Rβ中的至少一种；

在某些具体的实施例中，所述抑炎因子为IL-10、IDO、PD-L1、GDNF、IL-10Rα、IL-2Rγ、IL-4、IL-4R、IL-17B、LIF、GM-CSFRα、TIMP-3和IL-2Rβ中的至少一种；

在某些具体实施例中，所述自身免疫性疾病包括类风湿性关节炎、硬皮病、系统性红斑狼疮、强直性脊柱炎、重症肌无力和多发性溃疡性结肠炎等中的至少一种；所述炎性相关疾病包括脓毒症、退行性关节炎和新生儿支气管肺发育不良性肺炎等中的至少一种。

第四方面，一种CD83

在某些具体的实施例中，所述诱导复合剂包括IFN-Υ和TNF-α免疫因子，所述IFN-Υ的浓度为5-20ng/ml，所述TNF-α的浓度为0-20ng/ml。

进一步的，在某些具体的实施例中，所述诱导复合剂包括IFN-Υ和TNF-α免疫因子，所述IFN-Υ的浓度为20ng/ml，所述TNF-α的浓度为5-20ng/ml。

在某些具体的实施例中，所述诱导复合剂还包括白蛋白赋形剂。

在某些具体的实施例中，所述加入诱导复合剂的时机为：3-5代CD83

在某些具体的实施例中，所述诱导培养具体为：采用免疫因子诱导复合剂诱导CD83

第五方面，一种根据前述制备方法制备得到的CD83

在某些具体实施例中，所述CD83阳性表达率至少≥70％，所述PD-L1受体的阳性表达率≥30％。

一种试剂盒，所述试剂盒通过采用前述质量评估方法检测CD83和PD-L1受体的阳性表达率，可有效用于评价CD83

与现有技术相比，本发明至少具有以下优点：

1)本发明首次发现且验证了CD83

2)本发明还发现，单独应用IFN-γ即能够从转录水平上调CD83

3)本发明还通过采用抗CD83抗体偶联的磁珠分离和流式分选技术，或慢病毒基因转导技术，成功分选或者制备出了免疫抑制或抑炎功能易赋能型天然或者人工CD83

4)本发明创新性将免疫抑制或者抑炎功能增强型CD83

5)本发明鉴于PD-L1信号在MSCs抑炎功能中的作用以及其是一个极易通过流式技术快速检测的膜受体，因此检测PD-L1的表达可作为MSCs抑炎功能评估的质量控制标准，为进一步研发可简易推广应用的抑炎型CD83

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为WT-MSCs表面标志分子流式检测结果；

图2为CD83

图3为MSCs分选前后CD83阳性表达率流式检测结果；

图4为人CD83基因修饰CD83过表达间充质细胞的检测结果；

图5为CD83

图6为CD83

图7为CD83

图8为CD83

图9为CD83

图10为不同浓度TNF-α联合IFN-Υ诱导MSCs细胞IDO1和PD-L1基因和蛋白表达检测结果；

图11为TNF-α联合IFN-Υ诱导CD83

图12为CD83

图13为天然CD83

图14为CD83

图15为假手术对照组(sham)、PBS对照组、WT-MSCs、CD83

具体实施方式

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明，但下述实施例仅仅为本发明的优选实施例，并非全部。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1人脐带间充质干细胞的分离、培养与鉴定

本实施例提供了建立人脐带间充质干细胞的制备工艺，具体为：从新生儿脐带分离、培养并鉴定人脐带间充质干细胞，包括如下步骤：

(1)MSCs的分离及培养

人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)的分离与培养：无菌条件下采集新鲜脐带样本(样本来源于乙肝、丙肝、HIV和梅毒等传染病检查阴性及无遗传疾病的健康产妇，且通过伦理申请并获取材知情同意)，后于GMP实验室内的超净工作台中用生理盐水洗涤，将样本表面的血液残留等物质洗净，转入酒精皿中浸泡1min中左右，再转入干净的生理盐水皿中洗净脐带上的酒精；剪掉脐带两端，排除脐带内凝固的血液，后将脐带剪成2cm大小的脐带块状组织；将剪小的脐带块置于干净的生理盐水皿中再次洗涤，进一步清净脐带凝固血液；取一干净培养皿，用于分离华通氏胶；用止血钳依次去除每段脐带中的血管(一根静脉和两根动脉)，再将剩下的脐带组织皮面向下沿边缘将组织皮与组织块分离(组织块为华尔氏通胶)；再将分离的胶体置于一干净的生理盐水皿中，分离好胶体后，用镊子将大条的华通氏胶尽量分细，最后将胶体在一干净的生理盐水皿中再次洗涤，并将华通氏胶转入已消毒的无菌小瓶中；用剪刀将华通氏胶尽量剪碎并称重，按重量分入15ml离心管中，每管0.5g，加入10ml生理盐水，2000rpm离心5min，后弃上清液；取两个25CM

(2)间充质干细胞的鉴定

①间充质干细胞的表面标志分子鉴定：

采用流式检测法对分离培养的间充质干细胞进行表面标记分子表达水平检测。流式检测干细胞标志分子有阳性分子CD73、CD44、CD90和CD105，以及阴性分子CD29、CD34和CD45；鉴定结果显示，本发明体外纯化培养获得的hUC-MSCs表面标志分子表达情况为：CD44、CD73、CD90和CD105为阳性，CD29、CD34和CD45为阴性，符合国际细胞治疗协会MSC的定义标准。其中，阴/阳性表达的表面标志分子流式检测结果如图1所示。

②间充质干细胞三系分化能力鉴定：

成骨诱导分化：取第3代野生型hUC-MSCs，消化计数后接种于六孔板，每孔加入一定量完全培养基，待细胞密度达60％-70％时，将培养基更换为OriCell人脐带间质干细胞成骨诱导分化完全培养基，根据细胞生长情况每隔一段时间更换一次新鲜成骨诱导分化完全培养基。培养约2-4周后，每孔中加入1mL茜素红染液染色，PBS洗涤两遍后置于显微镜下观察成骨染色效果。

成软骨诱导分化：取野生型第3代hUC-MSCs，消化后将4×10

成脂诱导分化：取第3代野生型hUC-MSCs，消化计数后接种于六孔板，每孔加入一定量完全培养基并置于培养箱中进行培养至细胞密度达到100％；将每孔中的培养基更换为OriCell人脐带间质干细胞成脂诱导分化培养基A液；诱导72h后，吸走六孔板中的A液，再加入OriCell人脐带间质干细胞成脂诱导分化培养基B液；24h后，吸走B液，再换回A液进行诱导，之后A液和B液交替培养3-5个周期后(约12-20天)，继续用B液维持培养(3天换液一次)7天；后用多聚甲醛固定细胞30min，PBS洗涤后每孔中加入1mL油红O染料工作液染色，PBS洗去多余染料，显微镜下观察评估成脂染色效果。

野生型间充质干细胞(WT-MSCs)三系分化能力鉴定结果如图2所示，由图2可知，本发明获得的野生型hUC-MSCs(图中标注为WT-MSCs)在特定的诱导培养条件下具有向骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞三系分化的能力，表明本发明培养纯化获得的野生型hUC-MSCs符合国际细胞治疗协会关于人MSCs的标准。

实施例2CD83

本实施例建立CD83

从野生型人脐带间充质干细胞种子库中，通过磁珠或者流式分选或者基因修饰过表达，获CD83

(1)CD83

①磁珠分选CD83

②或流式分选CD83

③或人CD83基因修饰制备人造CD83过表达间充质干细胞：应用LV-CD83慢病毒构建稳定CD83过表达间充质细胞，病毒载体元件顺序为：Ubi-MCS-3FLAG-CBh-gcGFP-IRES-puromycin，于GenBank中查询CD83基因序列(基因号：NM_004233.4)，构建LV-CD83慢病毒表达载体，后包装并纯化病毒待用。MSCs在进行转染前用完全培养基制备细胞悬液并接种至T25培养瓶中，37℃，5％ CO2培养16-24h至细胞融合度在40％左右准备做慢病毒转染。选择HiTransG A或HiTransG P感染液，根据细胞MOI值及病毒滴度，加入相应的病毒量，本实验MOI值为10，之后置于37℃，5％CO

(2)CD83

①CD83

②CD83

③CD83

④CD83

⑤CD83

(a)细胞划痕实验：用0.25％胰酶消化对数生长期的CD83

(b)Transwell实验：用0.25％胰酶消化对数生长期的CD83

图8A所示为细胞划痕实验0小时和24小时显微镜拍照结果，图8B为图8A的划痕面积统计结果，图8C所示为细胞培养24小时Transwell实验后下层细胞结晶紫染色结果，图8D所示为图8C的结晶紫染色阳性细胞统计结果，如图8A-8D结果所示，划痕实验和Transwell实验均显示，在无IFN-γ存在条件下，尽管CD83

实施例3免疫抑制或抑炎功能增强型CD83

通过IFN-γ单独和/或TNF-α联合诱导实施例2制备的CD83

1、体外诱导制备免疫抑制或者抑炎功能增强型CD83

将实施例1和/或2获得的WT-MSCs、CD83

2、炎性蛋白芯片检测免疫抑制或者抑炎功能增强型CD83

提取上述不同刺激因素处理的CD83

如图9A所示，CD83

3、定量PCR检测免疫抑制或者抑炎功能增强型CD83

采用定量PCR检测技术检测免疫抑制或者抑炎功能易赋型间充质干细胞的免疫抑制因子IDO和免疫抑制受体PD-L1 mRNA的表达。

图9B-9C示出20ng/ml IFN-γ单独诱导MSCs表达IDO1和PD-L1的定量PCR检测结果。由图9B-9C的定量PCR检测结果显示，WT-MSCs、CD83

图10A-10B示出不同浓度TNF-α联合IFN-Υ诱导MSCs表达IDO1和PD-L1的定量PCR检测结果图。由图所示，5、10和20ng/ml的TNF-α单独刺激均不能诱导IDO1和PD-L1的转录，mRNA仅见轻微升高。5、10和20ng/ml的IFN-γ单独刺激均能显著诱导IDO1和PD-L1的mRNA升高，特别是20ng/ml的IFN-γ可诱导PD-L1的mRNA升高达85倍。然而，有趣的是，不像免疫印记检测结果，TNF-α联合IFN-γ刺激并不能进一步增加IDO1和PD-L1的mRNA表达，相反20ng/ml的TNF-α反而轻微弱化了IFN-γ诱导的IDO1和PD-L1的mRNA表达。

4、免疫印记检测免疫抑制或者抑炎功能增强型CD83

提取上述不同刺激因素处理的WT-MSCs、CD83

图9D-9F示出20ng/ml IFN-γ单独诱导MSCs表达IDO1和PD-L1的免疫印迹检测结果，其中图9E和9F分别是图9D中IDO1和PD-L1(也称CD274)的免疫印迹光密度分析结果。由图9D-9F的免疫印迹结果显示，IFN-γ单独刺激MSCs 24小时，既能诱导IDO1和PD-L1(CD274)的蛋白表达，且相较CD83

图10C示出不同浓度TNF-α联合IFN-Υ诱导MSCs表达IDO1和PD-L1的免疫印记检测结果。由图10C的免疫印记结果显示，20ng/ml TNF-α单独刺激MSCs 24小时，既不能诱导IDO1的表达，也不能诱导PD-L1的表达。然而，保持20ng/ml IFN-γ联合不同浓度TNF-α处理MSCs，结果显示，加入5ng/ml的TNF-α即能同时诱导IDO1和PD-L1的表达，且随着TNF-α浓度的增加，IDO1和PD-L1的表达量逐渐增加。

5、流式细胞仪检测免疫抑制或者抑炎功能增强型CD83

CD83

图10D示出IFN-γ单独或者联合TNF-α诱导CD83

图11A中①-④分别表示无诱导因子、20ng/ml TNF-α单独诱导、20ng/ml IFN-γ单独诱导以及20ng/ml TNF-α与20ng/ml IFN-γ联合诱导CD83

6、流式细胞仪检测免疫抑制或者抑炎功能增强型CD83

于1×10

实施例4免疫抑制或者抑炎功能易赋型CD83

1、胶原诱导的小鼠关节炎(collagen induced arthritis，CIA)模型建立及MSCs治疗方案与流程

按文献构建CIA小鼠模型(构建CIA小鼠模型为现有技术，因此不在此详述)，同时为了减少动物个体差异以便更好地评价疗效。当在加强注射后关节炎评分达到或超过3分时，即在发病后再开始MSCs治疗。同时，按实施例1和2培养或者分选获得的WT-MSCs、CD83

CIA小鼠模型关节炎临床评分方案：使用足跖肿胀进行关节炎临床评分对CIA小鼠进行评估。临床关节炎评估采用以下系统：0分，无肿胀；1分，轻度肿胀和红斑；2分，明显水肿；3分，关节僵硬。对每条肢体都进行评分后汇总，最大可能评分为每只动物12分。

2、免疫抑制或者抑炎功能易赋型CD83

①MSCs治疗CIA小鼠关节炎大体观察与肿胀度评分

按足跖肿胀的关节炎临床评分标准，对各治疗组小鼠每条肢体肿胀度进行评分，图12B(大体观察)和12D(肿胀度评分)示出阴性对照组小鼠(NC)与静脉注射PBS、WT-MSCs、CD83

②MSCs治疗CIA小鼠关节炎影像学评价

在实验结束时(第50天)，用vivaCT 40小动物CT(SCANO MEDICAL，瑞士)和BrukerBioSpec 7T/20cm system小动物磁共振(Magnetic Resonance Imaging，MRI)(布鲁克(Bruker)，德国)对CIA小鼠的后肢进行影像学的成像检查。

图12C示出阴性对照组小鼠(NC)与静脉注射PBS、WT-MSCs、CD83

③MSCs治疗CIA小鼠关节炎脚趾痛阈评价

在实验结束时(第50天)，用热板疼痛仪评估热伤害性反应，获CIA小鼠热痛阈值；用Von Frey纤维丝施加压力法测定小鼠后足底表面缩足反应阈值，获CIA小鼠机械刺痛阈值。

图12E和12F分别示出阴性对照组小鼠(NC)与静脉注射PBS、WT-MSCs、CD83

④MSCs治疗CIA小鼠关节炎全身和脚趾局部炎症评价

在实验结束时(第50天)，处死小鼠，取小鼠血清和脚趾局部软组织，ELISA检测血清和软组织中TNF-α和IL-6的含量，以此判断MSCs对CIA小鼠全身和局部抑炎效应。

图12G和12H中分别表示第50天三种细胞治疗CIA小鼠血清炎性因子TNF-α和IL-6的ELISA检测结果；图12I和12J中分别表示第50天三种细胞治疗CIA小鼠四肢足跖局部组织炎性因子TNF-α和IL-6的ELISA检测结果。如图12G-12J所示，较阴性对照相比，CIA小鼠血清和软组织局部炎症介质TNF-α和IL-6均明显升高，与PBS处理组相比，经WT-MSCs、CD83

⑤MSCs治疗CIA小鼠关节炎组织病理学评价

实验第50天，处死所有小鼠，取小鼠肢体关节组织，4％多聚甲醛固定的肢体标本用含15％ EDTA的脱钙液脱钙，然后按照标准的组织学方法将脱钙肢体进行脱水处理和石蜡包埋。

a)苏木精-伊红染色(H&E)染色：切片常规二甲苯脱蜡及梯度酒精水化后，入温热苏木精染液2分钟，清水快速漂净染液，1％的盐酸酒精水化15秒后再次清水漂洗，镜下观察染色效果，标准为胞核呈蓝紫色，细胞间质无着色。而后伊红染色1分钟，依次梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。用H&E染色对关节炎的严重程度进行评估：正常滑膜0分，滑膜肥大和细胞浸润1分，血管膜和软骨侵蚀2分，软骨和软骨下骨侵蚀3分，关节完整性丧失和强直4分。评估由多名第三方检测者进行，使用多名检测者评分的平均值作为终值。

b)番红O(Safranin O)和固绿(Fast Green)染色：脱蜡并再水化成水，0.02％固绿5分钟(不冲洗)，1％乙酸30秒(不要冲洗)，0.1％番红O 20分钟(不冲洗)，在95％乙醇中冲洗2分钟，然后用100％酒精冲洗3分钟2次。二甲苯2min 2次。覆盖盖玻片。切片Safranin O和Fast Green染色来评价软骨破坏情况。

图12K表示第50天处死小鼠组织病理学评估结果图，分别为用H&E以及Safranin O和Fast Green对CIA小鼠的掌骨和指骨后关节的石蜡包埋切片进行染色以平均其组织学关节损伤和软骨破坏，并选取其中具有代表性的图像，比例尺＝200μm。每组至少使用5只小鼠：图12K中，NC为阴性对照(n＝5只小鼠)、PBS为CIA小鼠PBS处理组(n＝10只小鼠)，WT-MSCs为CIA小鼠WT-MSCs治疗组(n＝10只小鼠)，CD83

实施例5免疫抑制或者抑炎功能易赋型人工CD83过表达间充质干细胞在胶原诱导的关节炎小鼠治疗中的应用与疗效评估

1、胶原诱导的小鼠关节炎(collagen induced arthritis，CIA)模型建立及MSCs治疗方案与流程

CIA小鼠模型建立按实施例4进行，人工CD83过表达间充质干细胞的制备按实施例2进行，即分别以实施例1获得的野生型人脐带间充质干细胞(WT-MSCs)和实施例2筛选获得的CD83

2、免疫抑制或者抑炎功能易赋型人工CD83过表达间充质干细胞治疗CIA小鼠关节炎的疗效评估

疗效评估包括关节炎大体观察与肿胀度评分、痛阈评价、全身与脚趾局部炎症评价、影像学和病理学评估，具体评估方法和措施参见实施例4执行。图13示出人工CD83过表达间充质干细胞对CIA小鼠关节炎的治疗效果评估。其中图13A为人工CD83过表达间充质干细胞治疗CIA小鼠关节炎的流程；图13B和13D为人工CD83过表达间充质干细胞治疗CIA小鼠关节炎足趾关节的大体红肿情况观察与肿胀度评分，结果显示，较PBS治疗组相比，CD83

实施例6：免疫抑制或者抑炎功能易赋型CD83

1、脓毒症小鼠CLP模型建立及MSCs治疗方案与流程

选择8周龄，体重约22～25g BALB/c小鼠进行盲肠结扎穿孔术(CLP)，术后3小时，假手术对照组(sham)和PBS治疗对照组经尾静脉注射0.2mL无菌PBS，WT-MSCs、CD83

本实施例6中所用MSCs细胞的制备过程参见实施例5方法与步骤进行，不同之处在于各组MSCs在收获前48小时，按照实施例3中的方案添加20ng/ml的IFN-γ和20ng/ml的TNF-α进行PD-L1阳性表达抑炎赋能刺激处理24小时，后换成无IFN-γ和TNF-α培养基继续培养24小时，收获细胞进行后续脓毒症小鼠治疗实验。

2、免疫抑制或者抑炎功能易赋型CD83

图14示出IFN-γ和TNF-α联合抑炎赋能处理的WT-MSCs、CD83

3、免疫抑制或者抑炎功能易赋型CD83

图14B-14I所示，分别为假手术对照组(sham)、PBS对照组、WT-MSCs、CD83

4、免疫抑制或者抑炎功能易赋型CD83

图14J-14L所示，分别为假手术对照组(sham)、PBS对照组、WT-MSCs、CD83

5、免疫抑制或者抑炎功能易赋型CD83

图15A-15B所示，分别为假手术对照组(sham)、PBS对照组、WT-MSCs、CD83

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。