与细胞粘附分子3结合的抗体
文献发布时间：2023-06-19 10:00:31
技术领域
本发明涉及例如与细胞粘附分子3(CADM3)结合的抗体或其抗体片段、产生所述抗体或其抗体片段的杂交瘤、包含编码所述抗体或其抗体片段的核苷酸序列的核酸、包含含有所述核酸的载体的转化体细胞、生产所述抗体或其抗体片段的方法、包含所述抗体或其抗体片段的组合物，以及用于检测或测量脑中存在的抗原的方法、用于诊断或治疗脑部疾病的方法、用于提高抗体在脑中积累的性质的方法和用于增加脑中抗体量的方法等，每种所述方法均使用所述抗体或其抗体片段。
背景技术
自从FDA在1986年批准小鼠抗CD3抗体莫罗单抗-CD3(OKT3)作为第一种抗体药物以来，已开发了许多抗体药物。1994年，嵌合抗体阿昔单抗获得批准，在所述抗体中将小鼠抗体的可变区和人类抗体的恒定区相连以降低小鼠抗体的抗原性。
为了进一步降低抗原性，开发了人源化抗体技术，其中将小鼠抗体可变区的在与抗原的结合中发挥重要作用的互补决定区(CDR)移植到人类抗体的构架区(FR)中，并在1997年批准了人源化抗CD20抗体dacizumab。
此外，利用人类抗体序列文库的噬菌体展示技术已被使用，并且完全人类的抗TNF-α抗体阿达木单抗作为使用噬菌体展示技术获得的第一种抗体在2002年获得批准。靶向抗原例如CD20、CD52、TNF-α、HER2和EGFR的六十种以上的抗体药物已被批准(NPL 1)。
通过这种方式，抗体已变成一种被广泛认可的药物格式。到目前为止已被批准的大多数抗体药物是用于癌症和免疫疾病的抗体药物，占所有抗体药物的约75％以上。
在中枢神经系统疾病的治疗中，生物制品例如抗体的重要性也越来越高，已报道在阿兹海默氏病中研究了一种针对淀粉样肽β的单克隆抗体，并且在动物模型中各种不同类型的具有神经保护作用的神经营养因子(脑源性神经营养因子BDNF和胶质细胞源性神经营养因子GDNF)在中枢神经系统疾病中表现出神经保护作用(NPL 2)。
然而，当抗体被外周给药时，递送到中枢神经系统的量低于递送到其他器官的量，并且据报道抗体迁移率(在脑脊液(CSF)中的浓度与血清浓度的比率)为0.1至0.3％(NPL 3至5)。
药物递送量在包含脑和骨髓的中枢神经系统中降低的原因是被称为血脑屏障(BBB)的机制，其限制物质在血液与脑的间质液之间的转运。血脑屏障具有由血管内皮细胞的细胞间黏附造成的物理/非特异性控制机制和由外排转运蛋白造成的底物特异性外排机制，保护中枢神经系统免受外来物质或药物的影响，并在维持体内平衡中发挥重要作用。
然而，由于血脑屏障的存在，不容易获得给药时中枢神经系统中的有效浓度，并且药物开发困难。例如，尽管通过向贺勒氏综合征(I型黏多糖贮积症)静脉内给药α-L-艾杜糖醛酸酶或向亨特氏综合征(II型黏多糖贮积症)静脉内给药艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶进行了酶替代疗法，但所述酶由于分子量高而不通过血脑屏障，因此没有观察到针对中枢神经系统症状的功效(NPL 6至9)。此外，据报道，由于一定量的重组酶被定期连续给药，引起了副作用例如中和抗体的产生(NPL 10)。
此外，也已进行了将生物制品直接给药到骨髓腔或脑中的尝试以提高在脑中的浓度。例如，报道了一种将艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶给药到患有亨特氏综合征(II型黏多糖贮积症)的患者的脑中以阻止所述患者的脑部障碍的进展的方法(PTL 1)。然而，直接给药到骨髓腔或脑中是高度侵入性的(NPL 11)。
因此，已研究了各种不同的递送技术以提高具有高分子量的物质例如生物制品在脑中的浓度。例如，已报道了通过将具有高分子量的物质与在脑血管内皮细胞中表达的膜蛋白结合以形成所述物质与所述膜蛋白的复合体，并允许其通过内吞作用而通过血脑屏障的方法。
大多数已报道的技术使用受体介导的转胞吞作用(RMT)，并且在脑血管内皮细胞中表达的充当靶的受体包含例如转铁蛋白受体、胰岛素受体、胰岛素样生长因子受体、低密度脂蛋白受体家族(LDLRf)等。
已报道了通过产生抗转铁蛋白受体抗体与神经生长因子的融合蛋白，经由转铁蛋白受体通过血脑屏障的技术。作为使用抗转铁蛋白受体抗体的技术，已报道了抗转铁蛋白受体抗体和抗β分泌酶(BACE1)抗体的双特异性抗体(PTL 2和3以及NPL 12和13)，以及通过将单价抗转铁蛋白受体抗体融合到抗淀粉样肽β抗体的羧基端一侧而获得的融合抗体(PTL4和NPL 14)。
已报道，对于使用抗转铁蛋白受体抗体和抗BACE1抗体的双特异性抗体的脑部递送而言，当所述抗体以20mg/kg体重的剂量给药到小鼠时，并入到脑中的所述抗体的量与对照的量相比提高约4倍(NPL 13)。
此外，报道了通过将药物用表面上具有抗转铁蛋白受体抗体的脂质体包封而允许所述药物通过血脑屏障的技术。已报道，通过抗大鼠转铁蛋白受体抗体和免疫胶束的融合体，并入到大鼠脑中的量提高约2至5倍(NPL 15)。
此外，报道了通过产生将神经营养因子、酶或抗淀粉样肽抗体融合到抗胰岛素受体抗体的羧基端一侧的融合蛋白，经由胰岛素受体通过血脑屏障的技术(NPL 16至19)。
已报道在恒河猴中，在标记的抗人类胰岛素受体抗体和GDNF的融合抗体给药后2小时，与GDNF相比脑中并入的量为约15倍(NPL 17)。
然而，转铁蛋白受体和胰岛素受体不仅在脑血管内皮细胞中表达，而且在全身包含肝脏等中表达，因此，当在这些技术中递送到中枢神经系统的药物的量增加时，所述药物也被递送到肝脏等(NPL 20)。此外，由于抗原在全身表达，因此所述抗体在血液中的半衰期短(NPL 12)。
另外已报道，针对在脑血管内皮细胞膜上表达的抗原TMEM30A的抗体(Fc5)显示出RMT样活性(PTL 5以及NPL 21和22)。Fc5是一种源自于美洲驼的单结构域的重链抗体的重链可变结构域(VHH)的抗体，并且在体外BBB模型中和大鼠体内模型中证实了与对照IgG相比，递送到脑的Fc5和人类Fc的融合体的量增加。
报道了在大鼠模型中，Fc5来源的单链抗体(scFv)和I型亲代谢性谷氨酸受体(mGluRI)抗体的融合体与对照单链抗体和mGluRI抗体的融合体相比CSF暴露提高，但所述量的提高为5倍左右(NPL 23)。
还已报道，IgG抗体通过新生Fc受体(FcRn)从脑快速排出到循环血(NPL 24和25)，并且例如在大鼠中，在给药到脑中之后IgG在脑中的半衰期短至48分钟(NPL 24)。
CADM3是一种钙离子不依赖性免疫球蛋白样细胞粘附分子(NPL 26至31)。CADM3被分成多个结构，包含作为胞外结构域的三个免疫球蛋白样结构域、一个跨膜结构域和一个胞质结构域(NPL 29)。
从RNA印迹和原位杂交分析来看，CADM3被特异性表达在包含小脑、大脑皮层、海马、杏仁体、嗅球和延髓的各种不同中枢神经以及外周神经两者的神经组织中(NPL 26、27和32)。CADM3位于两个轴突末梢之间、轴突末梢与轴突轴之间以及轴突末梢与轴突末梢处的神经胶质细胞突起之间的接触位点处(NPL 26)。
CADM3通过钙离子不依赖性同嗜性结合而表现出细胞-细胞粘附活性。另外，CADM3通过与Necl-2、连接蛋白-1和连接蛋白-3的钙离子不依赖性同嗜性结合而表现出细胞-细胞粘附活性，但不与Necl-5和连接蛋白-2表现出粘附活性。与连接蛋白-1和连接蛋白-3相互作用的CADM3以与小脑形态的形成中相同的方式参与神经元活性依赖性突触重塑过程(NPL 32和33)。从体外结合分析证实，参与肌动蛋白细胞骨架重排的蛋白4.1N与CADM3彼此结合(NPL 27)。
在CADM3敲除小鼠中，视神经和脊髓中的具髓鞘轴突的数目在出生后的早期阶段减少。然而，在正常个体与成熟后的突变体之间，具髓鞘轴突的数目或髓鞘的厚度没有差异(NPL 30)。此外，已报道了与CADM3结合的多克隆抗体(NPL 27)。
引文表
专利文献
PTL 1：WO 2012/023623
PTL 2：WO 2016/081640
PTL 3：WO 2016/081643
PTL 4：WO 2014/033074
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非专利文献
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发明内容
技术问题
本发明涉及例如与CADM3结合的CADM3结合分子和使用所述分子的方法等。具体来说，目的是提供与CADM3结合的抗体或其抗体片段、产生所述抗体或其抗体片段的杂交瘤、包含编码所述抗体或其抗体片段的核苷酸序列的核酸、包含含有所述核酸的载体的转化体细胞、用于生产所述抗体或其抗体片段的方法、包含所述抗体或其抗体片段的组合物以及用于检测或测量脑中存在的抗原的方法、用于诊断或治疗脑部疾病的方法、用于提高抗体在脑中积累的性质的方法和用于提高脑中抗体量的方法等，每种所述方法均使用所述抗体或其抗体片段。
问题的解决方案
作为解决所述问题的手段，本发明提供了一种与CADM3结合的CADM3结合分子和使用所述分子的方法，具体来说提供了一种与CADM3结合的抗体或其抗体片段。
也就是说，本发明涉及以下<1>至<22>。
<1>一种与细胞粘附分子3(CADM3)结合的抗体或其抗体片段。
<2>根据<1>所述的抗体或其抗体片段，其中所述抗体具有在脑中积累的性质。
<3>根据<1>或<2>所述的抗体或其抗体片段，其中所述抗体对神经元和/或神经组织具有亲和性。
<4>根据<1>至<3>中的任一项所述的抗体或其抗体片段，其中所述抗体或其抗体片段选自以下(a)至(x)：
(a)一种抗体，其中重链可变结构域(VH)的互补决定区(CDR)1至3的氨基酸序列分别包含由SEQ ID NO：23、24和25表示的氨基酸序列，并且其中VL的CDR1至CDR3的氨基酸序列分别包含由SEQ ID NO：28、29和30表示的氨基酸序列；
(b)一种抗体，其中VH的CDR1至CDR3的氨基酸序列分别包含由SEQ ID NO：34、35和36表示的氨基酸序列，并且其中VL的CDR1至CDR3的氨基酸序列分别包含由SEQ ID NO：38、39和40表示的氨基酸序列；
(c)一种抗体片段，其中重链抗体的重链可变结构域(VHH)的CDR1至CDR3的氨基酸序列分别包含由SEQ ID NO：3、4和5表示的氨基酸序列；
(d)一种抗体片段，其中VHH的CDR1至CDR3的氨基酸序列分别包含由SEQ ID NO：8、9和10表示的氨基酸序列；
(e)一种抗体片段，其中VHH的CDR1至CDR3的氨基酸序列分别包含由SEQ ID NO：13、14和15表示的氨基酸序列；
(f)一种抗体片段，其中VHH的CDR1至CDR3的氨基酸序列分别包含由SEQ ID NO：18、19和20表示的氨基酸序列；
(g)一种抗体，其中VH的CDR1至CDR3的氨基酸序列分别包含由SEQ ID NO：89、90和91表示的氨基酸序列，并且其中VL的CDR1至CDR3的氨基酸序列分别包含由SEQ ID NO：94、95和96表示的氨基酸序列；
(h)一种抗体，其中VH的CDR1至CDR3的氨基酸序列分别包含由SEQ ID NO：99、100和101表示的氨基酸序列，并且其中VL的CDR1至CDR3的氨基酸序列分别包含由SEQ ID NO：134、135和136表示的氨基酸序列；
(i)一种抗体，其中VH的CDR1至CDR3的氨基酸序列分别包含由SEQ ID NO：104、105和106表示的氨基酸序列，并且其中VL的CDR1至CDR3的氨基酸序列分别包含由SEQ ID NO：134、135和136表示的氨基酸序列；
(j)一种抗体，其中VH的CDR1至CDR3的氨基酸序列分别包含由SEQ ID NO：109、110和111表示的氨基酸序列，并且其中VL的CDR1至CDR3的氨基酸序列分别包含由SEQ ID NO：134、135和136表示的氨基酸序列；
(k)一种抗体，其中VH的CDR1至CDR3的氨基酸序列分别包含由SEQ ID NO：114、115和116表示的氨基酸序列，并且其中VL的CDR1至CDR3的氨基酸序列分别包含由SEQ ID NO：134、135和136表示的氨基酸序列；
(1)一种抗体，其中VH的CDR1至CDR3的氨基酸序列分别包含由SEQ ID NO：119、120和121表示的氨基酸序列，并且其中VL的CDR1至CDR3的氨基酸序列分别包含由SEQ ID NO：134、135和136表示的氨基酸序列；
(m)一种抗体，其中VH的CDR1至CDR3的氨基酸序列分别包含由SEQ ID NO：124、125和126表示的氨基酸序列，并且其中VL的CDR1至CDR3的氨基酸序列分别包含由SEQ ID NO：134、135和136表示的氨基酸序列；
(n)一种抗体，其中VH的CDR1至CDR3的氨基酸序列分别包含由SEQ ID NO：129、130和131表示的氨基酸序列，并且其中VL的CDR1至CDR3的氨基酸序列分别包含由SEQ ID NO：134、135和136表示的氨基酸序列；
(o)一种抗体，其中VH的CDR1至CDR3的氨基酸序列分别包含由SEQ ID NO：139、140和141表示的氨基酸序列，并且其中VL的CDR1至CDR3的氨基酸序列分别包含由SEQ ID NO：164、165和166表示的氨基酸序列；
(p)一种抗体，其中VH的CDR1至CDR3的氨基酸序列分别包含由SEQ ID NO：144、145和146表示的氨基酸序列，并且其中VL的CDR1至CDR3的氨基酸序列分别包含由SEQ ID NO：164、165和166表示的氨基酸序列；
(q)一种抗体，其中VH的CDR1至CDR3的氨基酸序列分别包含由SEQ ID NO：149、150和151表示的氨基酸序列，并且其中VL的CDR1至CDR3的氨基酸序列分别包含由SEQ ID NO：164、165和166表示的氨基酸序列；
(r)一种抗体，其中VH的CDR1至CDR3的氨基酸序列分别包含由SEQ ID NO：154、155和156表示的氨基酸序列，并且其中VL的CDR1至CDR3的氨基酸序列分别包含由SEQ ID NO：164、165和166表示的氨基酸序列；
(s)一种抗体，其中VH的CDR1至CDR3的氨基酸序列分别包含由SEQ ID NO：159、160和161表示的氨基酸序列，并且其中VL的CDR1至CDR3的氨基酸序列分别包含由SEQ ID NO：164、165和166表示的氨基酸序列；
(t)一种抗体，其中VH的CDR1至CDR3的氨基酸序列分别包含由SEQ ID NO：169、170和171表示的氨基酸序列，并且其中VL的CDR1至CDR3的氨基酸序列分别包含由SEQ ID NO：174、175和176表示的氨基酸序列；
(u)一种抗体，其与(a)至(t)中描述的抗体或抗体片段中的至少一者竞争与CADM3的结合；
(v)一种抗体，其与包含(a)至(t)中描述的抗体或抗体片段中的任一者所结合的表位的表位结合；
(w)一种抗体，其结合到与(a)至(t)中描述的抗体或抗体片段中的任一者所结合的表位相同的表位；和
(x)一种抗体，其包含与(a)至(t)中描述的抗体或抗体片段中的任一者的氨基酸序列具有85％或更高同源性的氨基酸序列。
<5>根据<1>至<4>中的任一项所述的抗体或其抗体片段，其中所述抗体或其抗体片段选自以下(1)至(31)：
(1)一种抗体，其中VH的氨基酸序列包含由SEQ ID NO：22表示的氨基酸序列，并且其中VL的氨基酸序列包含由SEQ ID NO：27表示的氨基酸序列；
(2)一种抗体，其中VH的氨基酸序列包含由SEQ ID NO：32表示的氨基酸序列，并且其中VL的氨基酸序列包含由SEQ ID NO：37表示的氨基酸序列；
(3)一种抗体片段，其中VHH的氨基酸序列包含由SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列；
(4)一种抗体片段，其中VHH的氨基酸序列包含由SEQ ID NO：7表示的氨基酸序列；
(5)一种抗体片段，其中VHH的氨基酸序列包含由SEQ ID NO：12表示的氨基酸序列；
(6)一种抗体片段，其中VHH的氨基酸序列包含由SEQ ID NO：17表示的氨基酸序列；
(7)一种抗体片段，其中VHH的氨基酸序列包含由SEQ ID NO：68表示的氨基酸序列；
(8)一种抗体片段，其中VHH的氨基酸序列包含由SEQ ID NO：70表示的氨基酸序列；
(9)一种抗体片段，其中VHH的氨基酸序列包含由SEQ ID NO：72表示的氨基酸序列；
(10)一种抗体片段，其中VHH的氨基酸序列包含由SEQ ID NO：74表示的氨基酸序列；
(11)一种抗体片段，其中VHH的氨基酸序列包含由SEQ ID NO：76表示的氨基酸序列；
(12)一种抗体片段，其中VHH的氨基酸序列包含由SEQ ID NO：78表示的氨基酸序列；
(13)一种抗体片段，其中VHH的氨基酸序列包含由SEQ ID NO：80表示的氨基酸序列；
(14)一种抗体片段，其中VHH的氨基酸序列包含由SEQ ID NO：82表示的氨基酸序列；
(15)一种抗体片段，其中VHH的氨基酸序列包含由SEQ ID NO：84表示的氨基酸序列；
(16)一种抗体片段，其中VHH的氨基酸序列包含由SEQ ID NO：86表示的氨基酸序列；
(17)一种抗体，其中VH的氨基酸序列包含由SEQ ID NO：88表示的氨基酸序列，并且其中VL的氨基酸序列包含由SEQ ID NO：93表示的氨基酸序列；
(18)一种抗体，其中VH的氨基酸序列包含由SEQ ID NO：98表示的氨基酸序列，并且其中VL的氨基酸序列包含由SEQ ID NO：133表示的氨基酸序列；
(19)一种抗体，其中VH的氨基酸序列包含由SEQ ID NO：103表示的氨基酸序列，并且其中VL的氨基酸序列包含由SEQ ID NO：133表示的氨基酸序列；
(20)一种抗体，其中VH的氨基酸序列包含由SEQ ID NO：108表示的氨基酸序列，并且其中VL的氨基酸序列包含由SEQ ID NO：133表示的氨基酸序列；
(21)一种抗体，其中VH的氨基酸序列包含由SEQ ID NO：113表示的氨基酸序列，并且其中VL的氨基酸序列包含由SEQ ID NO：133表示的氨基酸序列；
(22)一种抗体，其中VH的氨基酸序列包含由SEQ ID NO：118表示的氨基酸序列，并且其中VL的氨基酸序列包含由SEQ ID NO：133表示的氨基酸序列；
(23)一种抗体，其中VH的氨基酸序列包含由SEQ ID NO：123表示的氨基酸序列，并且其中VL的氨基酸序列包含由SEQ ID NO：133表示的氨基酸序列；
(24)一种抗体，其中VH的氨基酸序列包含由SEQ ID NO：128表示的氨基酸序列，并且其中VL的氨基酸序列包含由SEQ ID NO：133表示的氨基酸序列；
(25)一种抗体，其中VH的氨基酸序列包含由SEQ ID NO：138表示的氨基酸序列，并且其中VL的氨基酸序列包含由SEQ ID NO：163表示的氨基酸序列；
(26)一种抗体，其中VH的氨基酸序列包含由SEQ ID NO：143表示的氨基酸序列，并且其中VL的氨基酸序列包含由SEQ ID NO：163表示的氨基酸序列；
(27)一种抗体，其中VH的氨基酸序列包含由SEQ ID NO：148表示的氨基酸序列，并且其中VL的氨基酸序列包含由SEQ ID NO：163表示的氨基酸序列；
(28)一种抗体，其中VH的氨基酸序列包含由SEQ ID NO：153表示的氨基酸序列，并且其中VL的氨基酸序列包含由SEQ ID NO：163表示的氨基酸序列；
(29)一种抗体，其中VH的氨基酸序列包含由SEQ ID NO：158表示的氨基酸序列，并且其中VL的氨基酸序列包含由SEQ ID NO：163表示的氨基酸序列；
(30)一种抗体，其中VH的氨基酸序列包含由SEQ ID NO：168表示的氨基酸序列，并且其中VL的氨基酸序列包含由SEQ ID NO：173表示的氨基酸序列；和
(31)一种抗体，其包含与(1)至(30)中描述的抗体或抗体片段中的任一者的氨基酸序列具有85％或更高同源性的氨基酸序列。
<6>根据<1>至<5>中的任一项所述的抗体或其抗体片段，其中所述抗体或其抗体片段是双特异性抗体。
<7>根据<6>所述的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体与CADM3和脑中存在的抗原结合。
<8>根据<6>或<7>所述的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体包含与CADM3结合的抗原结合位点和与脑中存在的抗原结合的抗原结合位点。
<9>根据<1>至<8>中的任一项所述的抗体片段，其中所述抗体片段选自Fab、Fab’、F(ab’)
<10>根据<1>至<9>中的任一项所述的抗体及其抗体片段，其中所述抗体是遗传重组抗体。
<11>根据<1>至<10>中的任一项所述的抗体及其抗体片段，其中所述抗体选自小鼠抗体、大鼠抗体、兔抗体、羊驼抗体、骆驼抗体、美洲驼抗体、嵌合抗体、人源化抗体和人类抗体。
<12>一种融合抗体或其融合抗体片段，其中将选自以下(i)至(iii)的至少一者连接到根据<1>至<11>中的任一项所述的与CADM3结合的抗体或其抗体片段：
(i)亲水性聚合物；
(ii)两亲性聚合物；和
(iii)功能性分子。
<13>一种杂交瘤，其产生根据<1>至<12>中的任一项所述的抗体、其抗体片段、融合抗体或其融合抗体片段。
<14>一种核酸，其包含编码根据<1>至<12>中的任一项所述的抗体、其抗体片段、融合抗体或其融合抗体片段的核苷酸序列。
<15>一种转化体细胞，其包含含有根据<14>所述的核酸的载体。
<16>一种用于生产根据<1>至<12>中的任一项所述的抗体、其抗体片段、融合抗体或其融合抗体片段的方法，所述方法包含：
培养根据<13>所述的杂交瘤或根据<15>所述的转化体细胞，以及
从培养溶液收集根据<1>至<12>中的任一项所述的抗体、其抗体片段、融合抗体或其融合抗体片段。
<17>一种组合物，其包含根据<1>至<12>中的任一项所述的抗体、其抗体片段、融合抗体或其融合抗体片段。
<18>根据<17>所述的组合物，其是用于检测或测量脑中存在的抗原的组合物。
<19>根据<17>所述的组合物，其是用于诊断或治疗脑部疾病的组合物。
<20>一种用于检测或测量脑中存在的抗原的方法，所述方法使用根据<1>至<12>中的任一项所述的抗体、其抗体片段、融合抗体或其融合抗体片段或根据<17>所述的组合物。
<21>一种用于诊断或治疗脑部疾病的方法，所述方法使用根据<1>至<12>中的任一项所述的抗体、其抗体片段、融合抗体或其融合抗体片段或根据<17>所述的组合物。
<22>一种用于提高抗体、其抗体片段、融合抗体或其融合抗体片段在脑中积累的性质的方法，所述方法使用根据<1>至<12>中的任一项所述的抗体、其抗体片段、融合抗体或其融合抗体片段或根据<17>所述的组合物。
<23>一种用于增加脑中的抗体的量、其抗体片段的量、融合抗体的量或其融合抗体片段的量的方法，所述方法使用根据<1>至<12>中的任一项所述的抗体、其抗体片段、融合抗体或其融合抗体片段或根据<17>所述的组合物。
本发明的有利效果
本发明的CADM3结合分子不仅通过与CADM3特异性结合而提高所述结合分子本身在脑中积累的性质，而且可以通过用另一个靶分子修饰所述CADM3结合分子并将所述靶分子转运并保留在脑中而应用于脑部疾病的治疗。作为本发明的特异性CADM3结合分子，示例了抗体或其抗体片段。本发明的抗体或其抗体片段是通过与脑中的CADM3结合而具有在脑中积累的性质的抗体或其抗体片段。因此，本发明的抗体或其抗体片段可以用作用于检测或测量脑中存在的抗原(CADM3，或CADM3和脑中存在的另一种抗原)的组合物、用于诊断脑部疾病的组合物和用于治疗脑部疾病的药物组合物。
附图说明
[图1]图1(A)和(B)示出了测量组织中每种抗体的浓度的结果。图1(A)示出了在给药抗体后3天血清中的抗体浓度。竖直轴表示抗体浓度(ng/mL)，水平轴表示给药的抗体。图1(B)示出了在给药抗体后3天脑组织中的抗体浓度。竖直轴表示抗体浓度(ng/g脑)，水平轴表示给药的抗体。
[图2]图2(A)和(B)示出了测量组织中每种抗体的浓度的结果。图2(A)示出了在给药抗体后7天血清中的抗体浓度。竖直轴表示抗体浓度(ng/mL)，水平轴表示给药的抗体。图2(B)示出了在给药抗体后7天脑组织中的抗体浓度。竖直轴表示抗体洗脱量(ng/g脑)，水平轴表示给药的抗体。
[图3]图3(A)和(B)示出了测量组织中每种抗体的浓度的结果。图3(A)示出了在给药抗体后7天血清中的抗体浓度。竖直轴表示抗体浓度(ng/mL)，水平轴表示给药的抗体。图3(B)示出了在给药抗体后7天脑组织中的抗体浓度。竖直轴表示抗体洗脱量(ng/g脑)，水平轴表示给药的抗体。抗体浓度被表示为使用单克隆抗体的分子量(150kDa)从摩尔浓度转变而获得的值。
[图4]图4(A)和(B)示出了每种抗体在小鼠脑中的迁移能力的成像评估的结果。图4(A)示出了在给药抗体后9天脑的成像图像。图4(B)示出了用给药的抗体的荧光强度校正过的脑中的荧光量的值与抗AVM抗体的比率。竖直轴表示与抗AVM抗体的比率，水平轴表示给药的抗体。
[图5]图5示出了每种抗体在小鼠脑中的迁移能力的成像评估的结果，并指示了在给药抗体后7天脑的成像图像。
[图6]图6示出了每种抗体在小鼠脑中的迁移能力的成像评估的结果，并指示了用给药的抗体的荧光强度校正过的脑中的荧光量的值与抗AVM抗体的比率。竖直轴表示与抗AVM抗体的比率，水平轴表示给药的抗体。
[图7]图7(A)和(B)示出了测量组织中每种抗体的浓度的结果。图7(A)示出了在给药抗体后7天血清中的抗体浓度。竖直轴表示抗体浓度(ng/mL)，水平轴表示给药的抗体。图7(B)示出了在给药抗体后7天脑组织中的抗体浓度。竖直轴表示抗体洗脱量(ng/g脑)，水平轴表示给药的抗体。
[图8]图8(A)和(B)示出了每种抗体在小鼠脑中的迁移能力的成像评估的结果。图8(A)示出了在给药抗体后7天脑的成像图像。图8(B)示出了用给药的抗体的荧光强度校正过的脑中的荧光量的值与抗AVM抗体的比率。竖直轴表示与抗AVM抗体的比率，水平轴表示给药的抗体。
实施方式描述
本发明涉及与CADM3结合的抗原结合分子。更具体来说，本发明涉及与CADM3结合的抗体或其抗体片段。
本发明的CADM3结合分子可以为任何分子形式，只要所述分子与CADM3特异性结合并且得到的分子保留在脑中即可，并且可以是任何分子例如蛋白质、核酸或通过有机合成获得的低分子量化合物/高分子量化合物。具体来说，所述CADM3结合分子可以是重组蛋白、抗体、适体、通过低分子量筛选获得的低分子量化合物等中的任一者，但优选地示例了抗体及其抗体片段。所述CADM3结合分子优选为与CADM3的胞外结构域结合的分子。
CADM3是一种钙离子不依赖性免疫球蛋白样细胞粘附分子，并通过钙离子不依赖性同嗜性结合表现出细胞-细胞粘附活性。例如，包含信号序列的全长人类CADM3由398个氨基酸构成，在外周神经系统和中枢神经系统中的两个轴突末梢之间、轴突末梢与轴突轴之间以及轴突末梢与轴突末梢处的神经胶质细胞突起之间的接触位点处表达，并在细胞粘附作用中发挥作用。
本发明的CADM3结合分子结合的CADM3的动物物种是小鼠、大鼠、食蟹猴和/或人类等，但不特别限于这些物种，并且可以根据抗体的用途来选择适合的动物物种。例如，当本发明的抗体用于医学目的用于人类时，所述抗体优选为至少与人类CADM3结合的抗体。
在本发明中，作为人类CADM3，实例是包含由SEQ ID NO：52表示的氨基酸序列或NCBI登记号AAH33819的氨基酸序列的多肽，由其中在SEQ ID NO：52表示的氨基酸序列或NCBI登记号AAH33819的氨基酸序列中一个或多个氨基酸被缺失、替换或添加的氨基酸序列构成并具有人类CADM3的功能的多肽，由与SEQ ID NO：52表示的氨基酸序列或NCBI登记号AAH33819的氨基酸序列具有60％或更高、优选地80％或更高、更优选地90％或更高、最优选地95％或更高同源性的氨基酸序列构成并具有人类CADM3的功能的多肽等。
所述具有其中在SEQ ID NO：52表示的氨基酸序列或NCBI登记号AAH33819表示的氨基酸序列中一个或多个氨基酸被缺失、替换或添加的氨基酸序列的多肽，可以例如通过使用定点突变方法[《分子克隆实验指南》(Molecular Cloning，A Laboratory Manual)，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)；《分子生物学现代方法》(CurrentProtocols in Molecular Biology)，John Wiley&Sons(1987-1997)；Nucleic AcidsResearch，10，6487(1982)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79，6409(1982)；Gene，34，315(1985)；Nucleic Acids Research，13，4431(1985)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82，488(1985)]在编码包含SEQ ID NO：52的氨基酸序列的多肽的DNA中引入位点特异性突变等来获得。
被缺失、替换或添加的氨基酸的数目没有特别限制，但优选为一至几十个例如1至20个、更优选地一至几个例如1至5个氨基酸。
这同样适用于小鼠CADM3的氨基酸序列[SEQ ID NO：54或NCBI登记号NP_444429.1]、大鼠CADM3的氨基酸序列[NCBI登记号AAI61811.1]和食蟹猴CADM3的氨基酸序列[SEQ ID NO：56或NCBI登记号NP_001270618.1]。
在本发明中，作为编码人类CADM3的基因，实例是由SEQ ID NO：51表示的核苷酸序列或NCBI登记号BC033819.1的核苷酸序列。由其中在SEQ ID NO：51表示的核苷酸序列或NCBI登记号BC033819.1的核苷酸序列中一个或多个核苷酸被缺失、替换或添加的核苷酸序列构成并包含编码具有CADM3的功能的多肽的DNA的基因，由与SEQ ID NO：51表示的核苷酸序列或NCBI登记号BC033819.1的核苷酸序列具有至少60％或更高同源性的核苷酸序列、优选地具有80％或更高同源性的核苷酸序列、更优选地具有95％或更高同源性的核苷酸序列构成并包含编码具有CADM3的功能的多肽的DNA的基因，或由在严紧条件下与包含SEQ IDNO：51表示的核苷酸序列或NCBI登记号BC033819.1的核苷酸序列的DNA杂交并编码具有CADM3的功能的多肽的DNA构成的基因等，在本发明中也包含在所述编码CADM3的基因中。
所述在严紧条件下杂交的DNA是指使用包含由SEQ ID NO：51表示的核苷酸序列或NCBI登记号BC033819.1的核苷酸序列的DNA作为探针，通过集落杂交方法、噬斑杂交方法、southern印迹杂交方法、DNA微阵列方法等获得的可杂交的DNA。
具体来说，可以示例的是可以如下鉴定的DNA：在65℃下，在0.7至1.0mol/L氯化钠存在下，使用其上固定有源自于被杂交的集落或噬斑的DNA或具有所述序列的PCR产物或寡聚DNA的滤膜或显微镜载片来执行杂交方法[《分子克隆实验指南》(Molecular Cloning，ALaboratory Manual)，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)；《分子生物学现代方法》(Current Protocols in Molecular Biology)，John Wiley&Sons(1987-1997)；《DNA克隆1：核心技术实用方法》(DNA Cloning 1：Core Techniques，A PracticalApproach)，第二版，Oxford University(1995)]，然后在65℃条件下使用0.1至2倍浓度的盐水柠檬酸钠(SSC)溶液(1倍浓度的SSC溶液的组合物由150mmol/L氯化钠和15mmol/L柠檬酸钠构成)清洗所述滤膜或显微镜载片。
作为所述可杂交DNA，可以示例的是与SEQ ID NO：51表示的核苷酸序列或NCBI登记号BC033819.1的核苷酸序列具有至少60％或更高同源性的DNA，优选地具有80％或更高同源性的DNA，更优选地具有95％或更高同源性的DNA。
这同样适用于小鼠CADM3的核苷酸序列[SEQ ID NO：53或NCBI登记号NM_053199.3]、大鼠CADM3的核苷酸序列[NCBI登记号NM_001047103.1]和食蟹猴CADM3的核苷酸序列[SEQ ID NO：55或NCBI登记号NM_001283689.1]。
CADM3的功能的实例包含参与如上所述中枢神经系统和外周神经系统中轴突末梢和其他位点之间的细胞粘附等。
在真核生物的编码蛋白质的基因的核苷酸序列中常常观察到基因多态性。其中由于本发明中使用的基因中的这种多态性而造成在核苷酸序列中已发生小规模突变的基因，在本发明中也包含在所述编码CADM3的基因中。
在本发明中，除非另有指明，否则同源性的数值可以是使用本领域技术人员已知的同源性搜索程序计算的数值，然而，对于核苷酸序列来说，实例是使用BLAST中的默认参数[J.Mol.Biol.，215，403(1990)]等计算的数值，并且对于氨基酸序列来说，实例是使用BLAST2中的默认参数[Nucleic Acids Res.，25，3389(1997)，Genome Res.，7，649(1997)，http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Education/BLASTinfo/information3.html]等计算的数值。
关于所述默认参数，G(开放空位成本)在核苷酸序列的情况下是5，并且在氨基酸序列的情况下是11；-E(延长空位成本)在核苷酸序列的情况下是2，并且在氨基酸序列的情况下是1；-q(核苷酸错配罚分)是-3；-r(核苷酸匹配奖励)是1，-e(期望值)是10；-W(字长)在核苷酸序列的情况下是11，并且在氨基酸序列的情况下是3；-y[对于blast延伸来说以位为单位的衰减(X)]在blastn的情况下是20，并且在blastn之外的程序的情况下是7；-X(对于带空位比对来说以位为单位的X衰减值)是15；并且-Z(对于带空位比对来说以位为单位的最终X衰减值)在blastn的情况下是50，并且在blastn之外的程序的情况下是25(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/html/blastcgihelp.html)。
包含上面提到的各种不同类型的CADM3中的任一者的氨基酸序列的部分序列的多肽可以通过本领域技术人员已知的方法来生产。具体来说，所述多肽可以通过将编码上面提到的各种不同类型的CADM3中的任一者的氨基酸序列的DNA缺失一部分，并培养用包含所述得到的DNA的表达载体转染的转化体来生产。另外，具有其中在各种不同类型的CADM3中的任一者的氨基酸序列中一个或多个氨基酸被缺失、替换或添加的氨基酸序列的多肽，可以以与上述相同的方式来获得。
此外，由各种不同类型的CADM3中的任一者的氨基酸序列构成的多肽或具有其中在各种不同类型的CADM3中的任一者的氨基酸序列中一个或多个氨基酸被缺失、替换或添加的氨基酸序列的多肽，也可以通过化学合成方法例如芴基甲氧基羰基(Fmoc)方法或叔丁氧基羰基(tBoc)方法来生产。
在本发明中，人类CADM3的胞外结构域是指在由SEQ ID NO：52或NCBI登记号AAH33819表示的氨基酸序列中从第25位至第330位的氨基酸序列。
小鼠CADM3的胞外结构域是指在由SEQ ID NO：54或NCBI登记号NP_444429.1表示的氨基酸序列中从第23位至第328位的氨基酸序列。大鼠CADM3的胞外结构域是指在由NCBI登记号AAI61811.1表示的氨基酸序列中从第23位至第328位的氨基酸序列。
食蟹猴CADM3的胞外结构域是指在由SEQ ID NO：56或NCBI登记号NP_001270618.1表示的氨基酸序列中从第23位至第328位的氨基酸序列。
通过使用酶联免疫吸附测定法(ELISA)、流式细胞术、表面等离子体共振方法等测量本发明的CADM3结合分子对表达CADM3的细胞或重组CADM3蛋白的亲和性，可以确认本发明的CADM3结合分子与CADM3的胞外结构域结合。此外，也可以组合使用已知的免疫检测方法[《单克隆抗体原理和实践》(Monoclonal Antibodies-Principles and practice)，第三版，Academic Press(1996)；《抗体实验指南》(Antibodies-A Laboratory Manual)，ColdSpring Harbor Laboratory(1988)；《单克隆抗体实验手册》(Manual for monoclonalantibody experiments)，Kodansha scientific books(1987)]等来确认它。
本发明的CADM3结合分子是通过与脑中的CADM3特异性结合而具有在脑中积累的性质的分子，并且例如，本发明的抗体是通过与脑中的CADM3结合而具有在脑中积累的性质的抗体。此外，本发明的抗体是当将所述抗体在动物的外周给药时，通过从外周穿过脑中的血脑屏障、迁移到脑中并与脑中的CADM3结合而具有在脑中积累的性质的抗体。本发明的抗体优选为具有出色的在脑中积累的性质的抗体或具有增强的在脑中积累的性质的抗体。
在本发明中，所述“在脑中积累的性质”是指其中当将靶主体给药到试验动物时，所述靶主体保留在脑中的性质。也就是说，它意味着所述靶主体在脑中的浓度(或在脑中的量)提高，或者所述靶主体以固定浓度存在，使得它由于选自以下的至少任一原因而可以被检测：向脑中的迁移增加，在脑中的积累增加，从脑内部向外部的迁移减少，从脑内部向外部的外排减少，和在脑中的分解减少。
在本发明中，“具有出色的在脑中积累的性质”、“具有高的在脑中积累的性质”或“具有增强的在脑中积累的性质”意味着当将靶主体给药到试验动物时，所述靶主体与对照相比在从给药起经过同样的天数后在脑中的浓度(或在脑中的量)提高，或者所述靶主体以固定浓度(量)存在，使得它可以在脑中长时间被检测到。
出现这种现象是由于至少任一下述原因：所述靶主体与所述对照相比向脑中的迁移增加，在脑中的积累增加，从脑内部向外部的迁移减少，从脑内部向外部的外排减少，和在脑中的分解减少。
在本发明中，“具有出色的在脑中积累的性质”、“具有高的在脑中积累的性质”或“具有增强的在脑中积累的性质”包含例如当将所述靶主体给药到试验动物时，所述靶主体与所述对照相比在给药后1至10天、优选地在给药后2至10天、3至10天、更优选地4至10天在脑中的浓度(量)更高，或者所述靶主体在脑中的浓度(或在脑中的量)在给药后第4天或更晚，优选地在给药后第5天或更晚、第6天或更晚、第7天或更晚、第8天或更晚、第9天或更晚，更优选地第10天或更晚达到其峰值，等等。
所述具有出色的在脑中积累的性质的抗体、具有高的在脑中积累的性质的抗体或具有增强的在脑中积累的性质的抗体可以是任何抗体，只要所述抗体是在脑中的抗体浓度(抗体量)比对照抗体更高的抗体或者是具有能够长时间存在于脑中的特征的抗体即可。
例如，实例是具有向脑中迁移的能力和/或在脑中积累的能力比对照抗体更高的特征，从脑内部向外部迁移的能力、外排的能力和/或在脑中分解的能力比对照抗体更低的特征，以及向脑中迁移的能力和/或在脑中积累的能力比从脑内部向外部迁移的能力、外排的能力和/或在脑中分解的能力更高的特征等的抗体。
因此，作为本发明的抗体或其抗体片段，实例是当所述抗体或其抗体片段被给药到动物时，与对照抗体相比在从给药起经过同样的天数后在脑中的抗体浓度(或抗体量)更高的抗体或其抗体片段，或能够在脑中长时间存在的抗体或其抗体片段等。
脑中的抗体浓度(或抗体量)的变化可以是任何变化，实例是例如在所述脑中的抗体浓度在测量期间一旦达到峰值后，所述抗体浓度逐渐下降的情况，在所述脑中的抗体浓度已达到峰值后，所述抗体浓度继续维持的情况，或在所述抗体给药后所述脑中的抗体浓度持续提高的情况，等等。
作为本发明的抗体或其抗体片段，实例是例如在给药到大鼠后第4天或第10天脑中的抗体浓度或抗体量比对照抗体更高的抗体，在给药到大鼠后第4天至第10天的时间段中脑中的抗体浓度或抗体量维持或提高的抗体，或甚至在给药到大鼠后第10天或更晚时间在脑中的存在可以被清楚地确认的抗体等，但不限于此。
所述对照抗体可以是任何抗体，只要所述对照抗体是与所述试验抗体同一类型或亚类的抗体即可，但可以使用例如抗阿维菌素(AVM)抗体等。
在本发明中，作为“在脑中”，实例是在脑实质中、在脑室中、在脑脊液中等，但不限于此。
通过免疫电子显微术，在例如颗粒细胞的平行纤维末梢、平行纤维末梢与平行纤维轴突之间的接触位点以及平行纤维末梢与神经胶质细胞突起(NPL 26)之间的接触位点处确认了CADM3的染色。因此，作为本发明的CADM3结合分子的一种情况，实例是通过与神经元和/或神经组织中的CADM3特异性结合而对神经元具有亲和性，从而具有在脑中积累的性质的分子。作为本发明的抗体的一种情况，实例是例如通过与神经元和/或神经组织中的CADM3结合而对神经元具有亲和性，从而具有在脑中积累的性质的抗体。
在本发明中，作为将抗体给药到动物的方法，实例是例如静脉内给药、脑室内给药、腹膜内给药、皮下给药、真皮内给药、鼻内给药、鞘内给药等，但不限于此。
在本发明中，作为测量抗体在脑中积累的性质的方法，实例是例如在将抗体给药到动物后几天收集脑组织，然后匀浆并离心，然后测量得到的上清液中的抗体浓度并计算每单位脑重量的抗体量的方法，使用收集的脑组织通过已知的免疫学方法检测抗体的存在的方法，将标记的抗体给药到动物并使用体内成像系统随时间检测所述抗体的存在的方法，等等。
作为本发明的抗体或其抗体片段，实例是选自以下(a)至(x)的抗体或抗体片段。其中，从所述抗体在脑中积累的性质和脑中的抗体量的观点来看，(d)、(j)、(o)或(t)是优选的。
(a)一种抗体，其中VH的CDR1至CDR3的氨基酸序列分别包含由SEQ ID NO：23、24和25表示的氨基酸序列，并且其中VL的CDR1至CDR3的氨基酸序列分别包含由SEQ ID NO：28、29和30表示的氨基酸序列；
(b)一种抗体，其中VH的CDR1至CDR3的氨基酸序列分别包含由SEQ ID NO：34、35和36表示的氨基酸序列，并且其中VL的CDR1至CDR3的氨基酸序列分别包含由SEQ ID NO：38、39和40表示的氨基酸序列；
(c)一种抗体片段，其中VHH的CDR1至CDR3的氨基酸序列分别包含由SEQ ID NO：3、4和5表示的氨基酸序列；
(d)一种抗体片段，其中VHH的CDR1至CDR3的氨基酸序列分别包含由SEQ ID NO：8、9和10表示的氨基酸序列；
(e)一种抗体片段，其中VHH的CDR1至CDR3的氨基酸序列分别包含由SEQ ID NO：13、14和15表示的氨基酸序列；
(f)一种抗体片段，其中VHH的CDR1至CDR3的氨基酸序列分别包含由SEQ ID NO：18、19和20表示的氨基酸序列；
(g)一种抗体，其中VH的CDR1至CDR3的氨基酸序列分别包含由SEQ ID NO：89、90和91表示的氨基酸序列，并且其中VL的CDR1至CDR3的氨基酸序列分别包含由SEQ ID NO：94、95和96表示的氨基酸序列；
(h)一种抗体，其中VH的CDR1至CDR3的氨基酸序列分别包含由SEQ ID NO：99、100和101表示的氨基酸序列，并且其中VL的CDR1至CDR3的氨基酸序列分别包含由SEQ ID NO：134、135和136表示的氨基酸序列；
(i)一种抗体，其中VH的CDR1至CDR3的氨基酸序列分别包含由SEQ ID NO：104、105和106表示的氨基酸序列，并且其中VL的CDR1至CDR3的氨基酸序列分别包含由SEQ ID NO：134、135和136表示的氨基酸序列；
(j)一种抗体，其中VH的CDR1至CDR3的氨基酸序列分别包含由SEQ ID NO：109、110和111表示的氨基酸序列，并且其中VL的CDR1至CDR3的氨基酸序列分别包含由SEQ ID NO：134、135和136表示的氨基酸序列；
(k)一种抗体，其中VH的CDR1至CDR3的氨基酸序列分别包含由SEQ ID NO：114、115和116表示的氨基酸序列，并且其中VL的CDR1至CDR3的氨基酸序列分别包含由SEQ ID NO：134、135和136表示的氨基酸序列；
(1)一种抗体，其中VH的CDR1至CDR3的氨基酸序列分别包含由SEQ ID NO：119、120和121表示的氨基酸序列，并且其中VL的CDR1至CDR3的氨基酸序列分别包含由SEQ ID NO：134、135和136表示的氨基酸序列；
(m)一种抗体，其中VH的CDR1至CDR3的氨基酸序列分别包含由SEQ ID NO：124、125和126表示的氨基酸序列，并且其中VL的CDR1至CDR3的氨基酸序列分别包含由SEQ ID NO：134、135和136表示的氨基酸序列；
(n)一种抗体，其中VH的CDR1至CDR3的氨基酸序列分别包含由SEQ ID NO：129、130和131表示的氨基酸序列，并且其中VL的CDR1至CDR3的氨基酸序列分别包含由SEQ ID NO：134、135和136表示的氨基酸序列；
(o)一种抗体，其中VH的CDR1至CDR3的氨基酸序列分别包含由SEQ ID NO：139、140和141表示的氨基酸序列，并且其中VL的CDR1至CDR3的氨基酸序列分别包含由SEQ ID NO：164、165和166表示的氨基酸序列；
(p)一种抗体，其中VH的CDR1至CDR3的氨基酸序列分别包含由SEQ ID NO：144、145和146表示的氨基酸序列，并且其中VL的CDR1至CDR3的氨基酸序列分别包含由SEQ ID NO：164、165和166表示的氨基酸序列；
(q)一种抗体，其中VH的CDR1至CDR3的氨基酸序列分别包含由SEQ ID NO：149、150和151表示的氨基酸序列，并且其中VL的CDR1至CDR3的氨基酸序列分别包含由SEQ ID NO：164、165和166表示的氨基酸序列；
(r)一种抗体，其中VH的CDR1至CDR3的氨基酸序列分别包含由SEQ ID NO：154、155和156表示的氨基酸序列，并且其中VL的CDR1至CDR3的氨基酸序列分别包含由SEQ ID NO：164、165和166表示的氨基酸序列；
(s)一种抗体，其中VH的CDR1至CDR3的氨基酸序列分别包含由SEQ ID NO：159、160和161表示的氨基酸序列，并且其中VL的CDR1至CDR3的氨基酸序列分别包含由SEQ ID NO：164、165和166表示的氨基酸序列；
(t)一种抗体，其中VH的CDR1至CDR3的氨基酸序列分别包含由SEQ ID NO：169、170和171表示的氨基酸序列，并且其中VL的CDR1至CDR3的氨基酸序列分别包含由SEQ ID NO：174、175和176表示的氨基酸序列；
(u)一种抗体，其与(a)至(t)中描述的抗体或抗体片段中的至少一者竞争与CADM3的结合；
(v)一种抗体，其与包含(a)至(t)中描述的抗体或抗体片段中的任一者所结合的表位的表位结合；
(w)一种抗体，其结合到与(a)至(t)中描述的抗体或抗体片段中的任一者所结合的表位相同的表位；和
(x)一种抗体，其包含与(a)至(t)中描述的抗体或抗体片段中的任一者的氨基酸序列具有85％或更高同源性的氨基酸序列。
作为本发明的抗体，包括包含与(a)至(t)中描述的抗体或抗体片段中的任一者的VH的CDR1至CDR3和VL的CDR1至CDR3的氨基酸序列具有85％或更高、优选地90％或更高的同源性的抗体的VH的CDR1至CDR3和VL的CDR1至CDR3的氨基酸序列的抗体。所述90％或更高的同源性更优选为91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性等。
在本发明中，作为在(a)至(t)中描述的抗体或抗体片段的一种情况，实例是各自作为人类抗CADM3单克隆抗体的CADM301抗体、CADM3102抗体、CADM3219抗体、CADM3301抗体、CADM3309抗体、CADM3312抗体、CADM3314抗体、CADM3316抗体、CADM3349抗体、CADM3351抗体、CADM3402抗体、CADM3404抗体、CADM3432抗体、CADM3448抗体、CADM3458抗体和CADM3501抗体，以及各自作为羊驼抗CADM3单克隆VHH抗体的iCADM3-3R1-L5抗体、iCADM3-3R1-L8抗体、iCADM3-3R1-L10抗体和iCADM3-3R1-L11抗体。其中，从所述抗体在脑中积累的性质和在脑中的抗体量的观点来看，CADM3312抗体、CADM3402抗体、CADM3502抗体或iCADM3-3R1-L8抗体是优选的。
其另外的实例包含通过遗传重组技术等从任何上述单克隆抗体产生的人类嵌合抗体和人源化抗体。其具体实例也包含iCADM3-3R1-L8_01人源化抗体、iCADM3-3R1-L8_02人源化抗体、iCADM3-3R1-L8_03人源化抗体、iCADM3-3R1-L8_04人源化抗体、iCADM3-3R1-L11_01人源化抗体、iCADM3-3R1-L11_02人源化抗体、iCADM3-3R1-L11_03人源化抗体、iCADM3-3R1-L11_04人源化抗体、iCADM3-3R1-L11_05人源化抗体、iCADM3-3R1-L11_06人源化抗体等。
在本发明中，所述抗体(u)是指当(a)至(t)中描述的抗体或抗体片段中的任一者被定义为第一种抗体时，抑制所述第一种抗体与CADM3的结合的第二种抗体。
在本发明中，所述抗体(w)是指当(a)至(t)中描述的抗体或抗体片段中的任一者被定义为第一种抗体，并且所述第一种抗体结合的表位被定义为第一表位时，与包含所述第一表位的第二表位结合的第二种抗体。
此外，本发明的抗体(x)是指当(a)至(t)中描述的抗体或抗体片段中的任一者被定义为第一种抗体，并且所述第一种抗体结合的表位被定义为第一表位时，与所述第一表位结合的第二种抗体。
此外，作为本发明的抗体或其抗体片段，具体来说还示例了选自以下(1)至(31)的抗体或抗体片段。其中，从所述抗体在脑中积累的性质和脑中的抗体量的观点来看，(4)、(20)、(25)或(30)是优选的。
(1)一种抗体，其中VH的氨基酸序列包含由SEQ ID NO：22表示的氨基酸序列，并且其中VL的氨基酸序列包含由SEQ ID NO：27表示的氨基酸序列；
(2)一种抗体，其中VH的氨基酸序列包含由SEQ ID NO：32表示的氨基酸序列，并且其中VL的氨基酸序列包含由SEQ ID NO：37表示的氨基酸序列；
(3)一种抗体片段，其中VHH的氨基酸序列包含由SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列；
(4)一种抗体片段，其中VHH的氨基酸序列包含由SEQ ID NO：7表示的氨基酸序列；
(5)一种抗体片段，其中VHH的氨基酸序列包含由SEQ ID NO：12表示的氨基酸序列；
(6)一种抗体片段，其中VHH的氨基酸序列包含由SEQ ID NO：17表示的氨基酸序列；
(7)一种抗体片段，其中VHH的氨基酸序列包含由SEQ ID NO：68表示的氨基酸序列；
(8)一种抗体片段，其中VHH的氨基酸序列包含由SEQ ID NO：70表示的氨基酸序列；
(9)一种抗体片段，其中VHH的氨基酸序列包含由SEQ ID NO：72表示的氨基酸序列；
(10)一种抗体片段，其中VHH的氨基酸序列包含由SEQ ID NO：74表示的氨基酸序列；
(11)一种抗体片段，其中VHH的氨基酸序列包含由SEQ ID NO：76表示的氨基酸序列；
(12)一种抗体片段，其中VHH的氨基酸序列包含由SEQ ID NO：78表示的氨基酸序列；
(13)一种抗体片段，其中VHH的氨基酸序列包含由SEQ ID NO：80表示的氨基酸序列；
(14)一种抗体片段，其中VHH的氨基酸序列包含由SEQ ID NO：82表示的氨基酸序列；
(15)一种抗体片段，其中VHH的氨基酸序列包含由SEQ ID NO：84表示的氨基酸序列；
(16)一种抗体片段，其中VHH的氨基酸序列包含由SEQ ID NO：86表示的氨基酸序列；
(17)一种抗体，其中VH的氨基酸序列包含由SEQ ID NO：88表示的氨基酸序列，并且其中VL的氨基酸序列包含由SEQ ID NO：93表示的氨基酸序列；
(18)一种抗体，其中VH的氨基酸序列包含由SEQ ID NO：98表示的氨基酸序列，并且其中VL的氨基酸序列包含由SEQ ID NO：133表示的氨基酸序列；
(19)一种抗体，其中VH的氨基酸序列包含由SEQ ID NO：103表示的氨基酸序列，并且其中VL的氨基酸序列包含由SEQ ID NO：133表示的氨基酸序列；
(20)一种抗体，其中VH的氨基酸序列包含由SEQ ID NO：108表示的氨基酸序列，并且其中VL的氨基酸序列包含由SEQ ID NO：133表示的氨基酸序列；
(21)一种抗体，其中VH的氨基酸序列包含由SEQ ID NO：113表示的氨基酸序列，并且其中VL的氨基酸序列包含由SEQ ID NO：133表示的氨基酸序列；
(22)一种抗体，其中VH的氨基酸序列包含由SEQ ID NO：118表示的氨基酸序列，并且其中VL的氨基酸序列包含由SEQ ID NO：133表示的氨基酸序列；
(23)一种抗体，其中VH的氨基酸序列包含由SEQ ID NO：123表示的氨基酸序列，并且其中VL的氨基酸序列包含由SEQ ID NO：133表示的氨基酸序列；
(24)一种抗体，其中VH的氨基酸序列包含由SEQ ID NO：128表示的氨基酸序列，并且其中VL的氨基酸序列包含由SEQ ID NO：133表示的氨基酸序列；
(25)一种抗体，其中VH的氨基酸序列包含由SEQ ID NO：138表示的氨基酸序列，并且其中VL的氨基酸序列包含由SEQ ID NO：163表示的氨基酸序列；
(26)一种抗体，其中VH的氨基酸序列包含由SEQ ID NO：143表示的氨基酸序列，并且其中VL的氨基酸序列包含由SEQ ID NO：163表示的氨基酸序列；
(27)一种抗体，其中VH的氨基酸序列包含由SEQ ID NO：148表示的氨基酸序列，并且其中VL的氨基酸序列包含由SEQ ID NO：163表示的氨基酸序列；
(28)一种抗体，其中VH的氨基酸序列包含由SEQ ID NO：153表示的氨基酸序列，并且其中VL的氨基酸序列包含由SEQ ID NO：163表示的氨基酸序列；
(29)一种抗体，其中VH的氨基酸序列包含由SEQ ID NO：158表示的氨基酸序列，并且其中VL的氨基酸序列包含由SEQ ID NO：163表示的氨基酸序列；
(30)一种抗体，其中VH的氨基酸序列包含由SEQ ID NO：168表示的氨基酸序列，并且其中VL的氨基酸序列包含由SEQ ID NO：173表示的氨基酸序列；和
(31)一种抗体，其包含与(1)至(30)中描述的抗体或抗体片段中的任一者的氨基酸序列具有85％或更高同源性的氨基酸序列。
作为本发明的抗体，包括包含与(1)至(30)中描述的抗体或抗体片段中的任一者的VH和VL的氨基酸序列具有85％或更高、优选地90％或更高同源性的抗体的VH和VL的氨基酸序列的抗体。所述90％或更高的同源性更优选为91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性等。
在本发明中，作为(1)至(31)中描述的抗体或抗体片段的一种情况，实例是各自作为人类抗CADM3单克隆抗体的CADM301抗体、CADM3102抗体、CADM3219抗体、CADM3301抗体、CADM3309抗体、CADM3312抗体、CADM3314抗体、CADM3316抗体、CADM3349抗体、CADM3351抗体、CADM3402抗体、CADM3404抗体、CADM3432抗体、CADM3448抗体、CADM3458抗体和CADM3501抗体，以及各自作为羊驼抗CADM3单克隆VHH抗体的iCADM3-3R1-L5抗体、iCADM3-3R1-L8抗体、iCADM3-3R1-L10抗体和iCADM3-3R1-L11抗体。其中，从所述抗体在脑中积累的性质和脑中的抗体量的观点来看，CADM3312抗体、CADM3402抗体、CADM3502抗体或iCADM3-3R1-L8抗体是优选的。
其另外的实例包含通过遗传重组技术等从上述单克隆抗体中的任一者产生的人类嵌合抗体和人源化抗体。其具体实例还包含：其中在SEQ ID NO：177的氨基酸序列中选自第6位、第27位、第37位、第44位、第45位、第47位、第49位、第79位和第98位的位置处的至少一个氨基酸残基被替换的人源化抗体；其中在SEQ ID NO：178的氨基酸序列中选自第1位、第12位、第14位、第27位、第28位、第29位、第37位、第44位、第45位、第46位、第47位、第49位、第78位、第96位和第97位的位置处的至少一个氨基酸残基被替换的人源化抗体；包含SEQID NO：177的氨基酸序列中的下述氨基酸残基替换中的至少一个氨基酸残基替换的人源化抗体：将第6位处的氨基酸残基用Glu替换，将第27位处的氨基酸残基用Arg替换，将第37位处的氨基酸残基用Phe替换，将第44位处的氨基酸残基用Glu替换，将第45位处的氨基酸残基用Arg替换，将第47位处的氨基酸残基用Phe替换，将第49位处的氨基酸残基用Ala替换，将第79位处的氨基酸残基用Val替换，和将第98位处的氨基酸残基用Ala替换；包含SEQ IDNO：178的氨基酸序列中的下述氨基酸残基替换中的至少一个氨基酸残基替换的人源化抗体：将第1位处的氨基酸残基用Gln替换，将第12位处的氨基酸残基用Val替换，将第14位处的氨基酸残基用Ala替换，将第27位处的氨基酸残基用Ser替换，将第28位处的氨基酸残基用Ile替换，将第29位处的氨基酸残基用Phe替换，将第37位处的氨基酸残基用Tyr替换，将第44位处的氨基酸残基用Gln替换，将第45位处的氨基酸残基用Arg替换，将第46位处的氨基酸残基用Gly替换，将第47位处的氨基酸残基用Leu替换，将第49位处的氨基酸残基用Ala替换，将第78位处的氨基酸残基用Val替换，将第96位处的氨基酸残基用Asn替换，和将第97位处的氨基酸残基用Ala替换；iCADM3-3R1-L8_01人源化抗体；iCADM3-3R1-L8_02人源化抗体；iCADM3-3R1-L8_03人源化抗体；iCADM3-3R1-L8_04人源化抗体；iCADM3-3R1-L11_01人源化抗体；iCADM3-3R1-L11_02人源化抗体；iCADM3-3R1-L11_03人源化抗体；iCADM3-3R1-L11_04人源化抗体；iCADM3-3R1-L11_05人源化抗体；iCADM3-3R1-L11_06人源化抗体；等等。
在本发明中，EU指数是指根据《免疫学重要蛋白质的序列》(Sequences ofProteins of Immunological Interest)第5版(1991)所述的氨基酸残基的位置。除非另有规定，否则下文示出的氨基酸残基的位置都是指根据EU指数的氨基酸残基的位置。
抗体分子也被称为免疫球蛋白(Ig)，并且它的基本结构是四聚体，具有两条被称为重链(H链)的多肽和两条被称为轻链(L链)的多肽。
此外，每条H链从N-端一侧起由H链的可变结构域(也被称为VH)和H链的恒定结构域(也被称为CH)的相应结构域构成，并且每条L链从N-端一侧起由L链的可变结构域(也被称为VL)和L链的恒定结构域(也被称为CL)的相应结构域构成。
作为CH，对于每个亚类来说已知有α、δ、ε、γ和μ链。所述CH从N-端一侧起进一步由CH1结构域、铰链结构域、CH2结构域和CH3结构域的相应结构域构成。
所述结构域是指组成抗体分子的每条多肽的功能结构单元。此外，所述CH2结构域和CH3结构域被合称为Fc(可结晶片段)区或简称Fc。作为CL，已知有C
其中CH是α、δ、ε、γ和μ链的抗体的亚类分别被称为IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。对于每种抗体的亚类来说，取决于动物，有时存在同种型。在人类中，对于IgA来说存在IgA1和IgA2同种型，对于IgG来说存在IgG1、IgG2、IgG3和IgG4同种型。
在本发明中，所述CH1结构域、铰链结构域、CH2结构域、CH3结构域和Fc区可以按照EU指数从N-端起的氨基酸残基编号来规定。
具体来说，CH1被规定为根据EU指数第118至215位处的氨基酸序列，铰链被规定为根据EU指数第216至230位处的氨基酸序列，CH2被规定为根据EU指数第231至340位处的氨基酸序列，CH3被规定为根据EU指数第341至447位处的氨基酸序列，并且Fc区被规定为根据EU指数第231至447位处的氨基酸序列。
作为本发明的抗体，多克隆抗体、单克隆抗体和寡克隆抗体均被包含。所述多克隆抗体是指由不同克隆的抗体产生细胞分泌的一组抗体分子。所述单克隆抗体是由单一克隆的抗体产生细胞分泌的抗体，并且是指仅仅识别一个表位(也被称为抗原决定簇)的抗体，并且其中构成所述单克隆抗体的氨基酸序列(一级序列)是均质的。所述寡克隆抗体是指其中混合了多种不同单克隆抗体的一组抗体分子。
作为本发明中的单克隆抗体，实例是由杂交瘤产生的抗体或由用包含抗体基因的表达载体转化的转化体产生的遗传重组抗体。
作为所述表位，实例是各自被所述单克隆抗体识别并结合的单一氨基酸序列、由氨基酸序列构成的构象、由氨基酸序列构成的构象、翻译后修饰的氨基酸序列和由翻译后修饰的氨基酸序列构成的构象等。
作为所述翻译后修饰的氨基酸序列，实例是其中聚糖被附连到具有OH取代基的Tyr和Ser的O-连接的聚糖，其中聚糖被附连到具有NH
本发明的抗体结合的CADM3的表位可以通过使用其中CADM3的某些结构域被缺失的缺失变体、其中CADM3的某些结构域被源自于另一种蛋白质的结构域替换的突变体、CADM3的部分肽片段等进行抗体结合试验来鉴定。此外，所述抗体结合试验也可以使用表达所述缺失变体或所述突变体的细胞来进行。
可选地，本发明的抗体结合的CADM3的表位也可以通过向使用蛋白酶消化获得的CADM3的肽片段添加本发明的抗体并使用已知的质谱术进行表位作图来鉴定。
作为本发明的抗体，还包含通过遗传重组技术产生的遗传重组抗体，例如小鼠抗体、大鼠抗体、仓鼠抗体、兔抗体、美洲驼抗体、骆驼抗体、羊驼抗体、嵌合抗体、人源化抗体(也被称为“CDR-移植抗体”)和人类抗体。
在本发明中，所述嵌合抗体是指其中VH和VL源自于与CH和CL不同的动物物种的抗体。由人类之外的动物(非人类动物)的抗体的VH和VL和人类抗体的CH和CL构成的抗体被称为人类嵌合抗体，由小鼠之外的动物的抗体的VH和VL和小鼠抗体的CH和CL构成的抗体被称为小鼠嵌合抗体。其他嵌合抗体也以相同方式命名。
作为非人类动物，可以使用任何动物例如小鼠、大鼠、仓鼠、兔、美洲驼、骆驼或羊驼，只要它是能够产生杂交瘤或抗体噬菌体文库的动物即可。
所述杂交瘤是指通过用抗原免疫接种非人类动物获得的B细胞与源自于小鼠等的骨髓瘤细胞的细胞融合获得的并产生具有所需抗原特异性的单克隆抗体的细胞。
抗体噬菌体文库是指通过将免疫球蛋白可变区的基因克隆到噬菌体中并在其表面上表达抗原结合分子的文库。作为所使用的噬菌体，实例是M13噬菌体等，但不特别限制。
在噬菌体上展示的抗原结合分子可以是任何形式，但优选为抗体片段例如scFv、Fab或VHH。
在本发明中，所述抗体噬菌体文库可以是免疫文库、天然文库和合成文库中的任何文库。
所述免疫文库是指在源自于用抗原免疫接种的动物或患者的淋巴细胞的抗体基因的基础上构建的抗体噬菌体文库。所述天然文库是指在源自于正常动物或健康人类的淋巴细胞的抗体基因的基础上构建的抗体噬菌体文库。所述合成文库是指其中基因组DNA中的V基因或重建的功能性V基因的CDR被编码适合长度的随机氨基酸序列的寡核苷酸替换的文库。
作为产生嵌合抗体的方法，下面将描述一种用于产生人类嵌合抗体的方法。其他嵌合抗体也可以以相同的方式产生。
所述人类嵌合抗体可以如下产生：从源自于产生单克隆抗体的非人类动物细胞的杂交瘤获得编码VH和VL的cDNA，将每个所述cDNA插入到具有编码人类抗体的CH和CL的DNA的用于动物细胞的表达载体中，由此构建人类嵌合抗体表达载体，然后将所述载体引入到动物细胞中并表达所述抗体。
此外，所述人类嵌合抗体也可以如下产生：从源自于非人类动物的抗体噬菌体文库克隆编码VH和VL的基因，将每个所述基因插入到具有编码人类抗体的CH和CL的DNA的用于动物细胞的表达载体中，由此构建人类嵌合抗体表达载体，然后将所述载体引入到动物细胞中并表达所述抗体。
所述人源化抗体是指其中将非人类动物抗体的VH和VL的CDR的氨基酸序列移植到人类抗体的VH和VL的相应CDR中的抗体。VH和VL的CDR之外的区域被称为FR。
所述人源化抗体可以如下产生：构建编码由非人类动物抗体的VH的CDR的氨基酸序列和任意人类抗体的VH的FR的氨基酸序列构成的VH的氨基酸序列的cDNA以及编码由非人类动物抗体的VL的CDR的氨基酸序列和任意人类抗体的VL的FR的氨基酸序列构成的VL的氨基酸序列的cDNA，将每个所述cDNA插入到具有编码人类抗体的CH和CL的DNA的用于动物细胞的表达载体中，由此构建人源化抗体表达载体，然后将所述载体引入到动物细胞中并表达所述抗体。
所述人类抗体最初是指天然存在于人体中的抗体，但也包含从人类抗体噬菌体文库或产生人类抗体的转基因动物获得的抗体等。
所述人类抗体可以通过用所需抗原免疫接种具有人类免疫球蛋白基因的小鼠来获得(Tomizuka K.等，Proc Natl Acad Sci USA.97，722-7，2000)。此外，所述人类抗体可以不使用免疫接种，通过使用从人类来源的B细胞扩增抗体基因而获得的噬菌体展示文库来选择具有所需结合活性的人类抗体来获得(Winter G.等，Annu Rev Immunol.12：433-55.1994)。
此外，所述人类抗体可以通过使用EB病毒将人类B细胞永生化以产生生产具有所需结合活性的人类抗体的细胞来获得(Rosen A.等，Nature 267，52-54.1977)。
所述人类抗体噬菌体文库是通过将从人类(健康人类或患者)的淋巴细胞制备的抗体基因插入到噬菌体基因中而获得的在表面上表达抗体片段例如Fab、scFv或VHH的噬菌体的文库。可以使用与其上固定有抗原的基材的结合活性作为指标，从所述文库收集表达具有所需抗原结合活性的抗体片段的噬菌体。所述抗体片段也可以使用遗传工程技术进一步转变成由两条完整H链和两条完整L链构成的人类抗体分子。
所述产生人类抗体的转基因动物是指其中人类抗体基因被并入到宿主动物的染色体中的动物。具体来说，产生人类抗体的转基因动物可以如下产生：将人类抗体基因引入到小鼠ES细胞中，将所述ES细胞植入到另一只小鼠的早期胚胎中，然后允许所述胚胎发育成动物。
从所述产生人类抗体的转基因动物生产人类抗体可以如下进行：对通过使用人类之外的哺乳动物进行的通用杂交瘤生产方法获得的产生人类抗体的杂交瘤进行培养以便在培养物中产生并积累所述人类抗体，并从所述培养物纯化所述抗体。
本发明的抗体包含仅由重链构成的重链抗体。所述重链抗体是指从骆驼科动物例如美洲驼、骆驼和羊驼获得的抗体或在所述抗体的基础上产生的遗传重组抗体。
在本发明中，所述抗体片段是抗体的片段，并且是指具有抗原结合活性的片段。其实例包含Fab、Fab’、F(ab’)
所述Fab是在通过用木瓜蛋白酶(在H链中第224位处的氨基酸残基处切割)处理IgG抗体而获得的片段中的一种抗体片段，其具有约50,000的分子量并具有抗原结合活性，并且其中在N-端一侧约一半的H链和整个L链通过二硫键(S-S键)连接。
所述F(ab’)
所述Fab’是一种具有约50,000的分子量并具有抗原结合活性，并且其中上述F(ab’)
所述scFv是VH-P-VL或VL-P-VH多肽，其中使用适合的肽连接物(P)例如通过连接任意数目的由4个Gly残基和1个Ser残基构成的连接物(G4S)而获得的连接肽将一个VH和一个VL相连，并且是具有抗原结合活性的抗体片段。
所述双体抗体是其中具有相同或不同抗原结合特异性的scFv形成二聚体的一种抗体片段，并且是具有对同一抗原的二价抗原结合活性或特异性针对不同抗原的抗原结合活性的抗体片段。
所述dsFv是通过将其中VH和VL中的每一者中的一个氨基酸残基被半胱氨酸残基替换的多肽通过所述半胱氨酸残基之间的S-S键相连而获得，并且具有抗原结合活性的一种抗体片段。
所述包含CDR的肽被构造成至少包含VH或VL的一个或多个CDR区域，并且是具有抗原结合活性的抗体片段。在包含多个CDR的肽中，所述CDR可以直接或通过适合的肽连接物连接。作为本发明的包含CDR的肽，实例是包含源自于本发明的抗体的6个CDR的肽。
所述包含CDR的肽可以如下产生：构建编码本发明的抗体的VH和VL的CDR的DNA，将所述DNA插入到用于原核生物的表达载体或用于真核生物的表达载体中，然后将所述表达载体引入到原核生物或真核生物中并表达所述肽。另外，所述包含CDR的肽也可以通过化学合成方法例如Fmoc方法或tBoc方法来产生。
所述VHH是重链抗体的可变结构域，并且也被称为纳米抗体。本发明的抗体片段包含任何抗体片段，只要所述抗体片段包含上述任何抗体片段或其部分片段并具有CADM3结合活性即可。
在本发明中，具有一个抗原结合位点的抗体或其抗体片段被称为单价抗体。单价抗体的格式的实例包含在WO 2014/054804、WO 2011/090754、WO 2007/048037、WO 2012/116927等中描述的具有一个抗原结合位点的抗体或其抗体片段的格式以及其他格式。
在本发明中，一个分子与三种或更多种不同抗原或表位结合的抗体或其抗体片段被称为多特异性抗体。此外，在本发明中，一个分子与两种不同抗原或表位结合的抗体或其抗体片段被称为双特异性抗体。
多特异性抗体或双特异性抗体的格式的实例包含在下述文献中描述的格式以及其他格式：WO 2009/131239；WO 2014/054804；WO 01/077342；美国专利申请公布号2007/0071675；WO 2007/024715；Wu等[Nature Biotechnology，2007，25(11)，pp.1290-1297]；Labrijn等[PNAS 2013，vol.110，no.13，pp.5145-5150]；Jong等[http：//dx.doi.org/10.1371/journal.pbio.1002344]；Kontermann等[mAbs 2012，vol.4，issue 2，pp.182-197]；Spiess等[Molecular Immunology 67(2015)95-106]；Ridgway等[Proteinengineering，1996 vol.9，no.7，pp.617-621]；WO 2009/080251；WO 2010/151792；WO2014/033074等。
所述双特异性抗体的具体实例包含下述双特异性抗体等。
(1)一种双特异性抗体，其中氨基酸修饰S354C/T366W被引入到抗体的两条重链中的一条重链(重链A)的CH3中，并且氨基酸修饰Y349C/T366S/L368A/Y407V被引入到另一条重链(重链B)的CH3中。
(2)一种双特异性抗体，其中抗体片段被融合到抗体的C-端。
(3)一种双特异性抗体，其中抗体片段被融合到抗体的N-端。
所述在(1)中描述的双特异性抗体可以是其中包含重链A的VH的抗原结合位点与CADM3结合并且其中包含重链B的VH的抗原结合位点与脑中存在的抗原结合的双特异性抗体，或其中抗原结合位点以正好相反的方式结合的双特异性抗体。
所述在(2)中描述的双特异性抗体的实例包含其中抗体片段被连接到构成抗体的两条重链之一的C-端的双特异性抗体、其中抗体片段被连接到构成抗体的两条重链两者的C-端的双特异性抗体、其中抗体片段被连接到构成抗体的两条轻链之一的C-端的双特异性抗体、其中抗体片段被连接到构成抗体的两条轻链两者的C-端的双特异性抗体、其中抗体片段被连接到构成抗体的两条轻链的C-端和两条重链的C-端中的每一者的双特异性抗体等。注意在所述抗体的C-端与所述抗体片段之间可能存在适合的连接物。
所述包含在(2)中描述的双特异性抗体中的抗体片段优选为scFv、Fab、VHH等，但不特别限于此。
所述在(2)中描述的双特异性抗体可以是其中在N-端处的抗原结合位点与CADM3结合并且其中在C-端处的抗原结合位点与脑中存在的抗原结合的双特异性抗体或其中所述抗原结合位点以正好相反的方式结合的双特异性抗体。
所述在(3)中描述的双特异性抗体是指其中抗体片段被连接到构成抗体的两条重链或两条轻链中的至少任一者的N-端的双特异性抗体。此外，在所述抗体的重链和/或轻链的N-端与所述抗体片段之间可能存在适合的连接物。所述包含在(3)中描述的双特异性抗体中的抗体片段优选为scFv、Fab、VHH等，但不特别限于此。
此外，所述在(3)中描述的双特异性抗体的实例包含从重链的N-端起具有VH
在本发明中，所述多特异性抗体或双特异性抗体可以是任何抗体，只要所述抗体是与CADM3结合的多特异性抗体或双特异性抗体即可。在这些抗体中，与CADM3和脑中存在的抗原结合的多特异性抗体或双特异性抗体是优选的，并且包含与CADM3结合的抗原结合位点和与脑中存在的抗原结合的抗原结合位点的多特异性抗体或双特异性抗体是更加优选的。
在本发明中，所述脑中存在的抗原的实例包含蛋白质、聚糖、脂类等，并且在这些抗原中所述抗原优选为蛋白质。
脑中存在的蛋白质的实例包含朊蛋白、5T4、AFP、ADAM10、ADAM12、ADAM17、AFP、AXL、BCAM、BSG、C5、C5R、CA9、CA72-4、CADM3、CCL11、CCL2、CCR1、CCR4、CCR5、CCR6、CD2、CD3E、CD4、CD5、CD6、CD8、CD11、CD18、CD19、CD20、CD22、CD24、CD25、CD29、CD30、CD32B、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40LG、CD44、CD47、CD52、CD55SC1、CD56、CD66E、CD71、CD72、CD74、CD79a、CD79b、CD80、CD86、CD95、CD98、CD137、CD147、CD138、CD168、CD200、CD248、CD254、CD257、CDH2、CDH3、CEA、CEACAM1、CEACAM5、CEACAM6、CEACAM8、紧密连接蛋白3、紧密连接蛋白4、CSF-1、CSF2RA、CSPG-4、CSPG5、CTLA4、CRF-1、Cripto、CXCR4、CXCR5、DJ-1、DLL4、DR4、DR5、ED-B、EFNA2、EGFR、EGFRvIII、ETBR、ENPP3、EPCAM、EphA2、EphA4、EPOR、ERBB2、ERBB3、ERBB4、FAPα、FAS、FcγRI、FCER2、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FLT1、FOLH1、FOLR1、GDF2、GFR、GLP1R、磷脂酰基醇蛋白聚糖-3、GPNMB、GRP78、HAPLN4、HB-EGF、HGF、HLA-DRβ、HMGB1、ICAM1、ICAM5、IFNA1、IFNB、IgE、IgE-Fc、IGF1R、IL10、IL12B、IL13、IL15、IL17A、IL1A、IL1B、IL2RA、IL4、IL5、IL5RA、IL6、IL6R、IL9、IL2Rα、IL2Rβ、IL2Rγ、INSR、ITGA2、ITGA2B2、ITGB3、ITGA4、ITGB7、ITGA5、ITGAL、ITGAV、ITGB3、ITGB2、KDR、L1CAM、LAG3、LRP3、间皮素、MAG、MMP14、MMP15、MOG、MST1R、MSTN、MUC1、MUC4、MUC16、MUC5AC、肌生成抑制蛋白、连接蛋白4、NCAN、NGF、NMDAR、NOTCH、NRG1、NRP、OX40、OX40L、P2Y6、PAR1、PDGFA、PDGFB、PDGFRA、PDGFRB、PD1、PDL1、PLP1、PSCA、PTPRZ、RET、RGMA、SLAM7、SLC44A4、TAG-72、TCR、TGFB1、TGFB2、TGFBR、TIMP2、TLR9、TNF、TNFR、TNFRSF10A、TNFRSF10B、TNFRSF12A、TNFSF13、TNFSF14、TNFSF2、TNFSF7、TREM2、TRAILR2、TRKA、TRKB、TRKC、转铁蛋白、VEGF、VEGFR、VLA-4、CGRP、α-突触核蛋白、TDP-43、Tau、FUS、淀粉样肽-β(Aβ)、APP、BACE1、早老蛋白、LINGO-1、Nogo、Troy、polyQ、雄激素受体、亨廷顿蛋白、脊髓小脑共济失调蛋白1、脊髓小脑共济失调蛋白2、磷酸化Tau、磷酸化α-突触核蛋白等，但所述蛋白质不限于这些蛋白质。
脑中存在的聚糖的实例包含Lewis-x、Lewis-y、CD15等，但所述聚糖不限于这些聚糖。
脑中存在的脂类的实例包含GD1a、GD2、GD3、GM1、GM2、GM3、磷脂酰丝氨酸等，但所述脂类不限于这些脂类。
本发明的抗体或其抗体片段还包括包含任何翻译后修饰的氨基酸的抗体。所述翻译后修饰的实例包含H链C-端处赖氨酸残基的缺失(赖氨酸修剪)、多肽N-端处的谷氨酰胺残基转变成焦谷氨酰胺(pyroGlu)等[Beck等，Analytical Chemistry，85，715-736(2013)]。
在本发明的抗体或其抗体片段中，可以进行Fc区的氨基酸修饰。作为所述Fc区的氨基酸修饰，实例是例如用于使所述抗体稳定或调节在血液中的半衰期的氨基酸修饰等。所述Fc区的氨基酸修饰的具体实例包含在WO 2006/033386、WO 2006/075668、WO 2011/122011、WO 2009/125825等中描述的那些。
本发明的抗体或其抗体片段还包含通过将所需分子连接到所述抗体或其抗体片段而修饰的融合抗体或其融合抗体片段。用于修饰抗体的方法没有特别限制，并且可以使用任何方法，只要所述方法可以修饰所需氨基酸残基和聚糖即可。
例如，实例是使用化学反应的化学修饰[《抗体工程入门》(Introduction toAntibody Engineering)，Chijinshokan Co.，Ltd.(1994)；Kolb等，Angew Chem Int EdEngl.40.2004-21，2001]，通过遗传工程技术进行的修饰，其中使用遗传重组技术将重组蛋白表达载体引入到用于表达的适合宿主细胞中，等等。
在本发明中，用于修饰所述抗体或其抗体片段的分子的实例包含亲水性聚合物、两亲性聚合物、功能性分子等。所述亲水性聚合物和两亲性聚合物的实例包含聚氧化烯、包含多元醇或多糖的分子等。
在本发明中，当所述抗体或其抗体片段通过化学修饰用另一个分子修饰时，作为修饰位点，实例是所述抗体或抗体片段的恒定区，并且具体来说，C-端处的Cys残基或S-S键位点是优选的。也可以通过遗传工程技术事先在所述抗体或抗体片段的任意位置处引入可以在晚些时候被化学修饰的残基。
此外，当所述抗体或其抗体片段通过遗传工程技术用另一个分子直接修饰时，作为修饰位点，实例是所述抗体或抗体片段的轻链或重链的N-端或C-端。
所述聚氧化烯的实例包含由直链或支链构成的聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、聚丙二醇-乙二醇等。
所述包含多元醇或多糖的分子的实例包含葡萄糖被聚合在其中的直链或支链多糖，例如直链淀粉、葡聚糖、普鲁兰多糖和糖原等。此外，所述分子不限于同聚多糖，而是可以是异聚多糖。
所述包含亲水性聚合物或两亲性聚合物的分子的分子量没有特别限制，但优选为100Da以上，并且优选为例如100Da至100kDa。
所述功能性分子的实例包含抗原结合分子、抗原结合分子的片段、药物、生物活性肽、生物活性蛋白质、核酸、放射性标记化合物、聚糖、脂类、荧光化合物等。作为用功能性分子例如抗原结合分子修饰的结果而具有双特异性的分子是双特异性抗体。
所述抗原结合分子的实例包含抗体、受体、配体等。
所述抗原结合分子的片段可以是任何片段，只要所述片段是抗原结合分子的片段并具有抗原结合活性即可。
所述药物的实例包含抗癌药剂例如烷化剂、亚硝基脲药剂、抗代谢物、抗病毒剂、抗生素、植物生物碱、拓扑异构酶抑制剂、微管蛋白聚合抑制剂、激素疗法药剂、激素拮抗剂、芳香酶抑制剂、P-糖蛋白抑制剂、铂络合物衍生物、M期抑制剂和激酶抑制剂[Clinicaloncology，Japanese Journal of Cancer and Chemotherapy(1996)]、抗炎剂例如甾体药剂、非甾体药剂、免疫调节剂、免疫抑制剂和抗组胺药剂[Inflammation and anti-inflammatory therapy，Ishiyaku Publishers，Inc.(1982)]等。
其更具体的实例包含美坦新(mertansine)、安坦辛(emtansine)、阿米福汀(Ethyol)、顺铂、达卡巴嗪(DTIC)、更生霉素、二氯甲基二乙胺(氮芥)、链脲佐菌素、环磷酰胺、异环磷酰胺、卡莫司汀(BCNU)、洛莫司丁(CCNU)、多柔比星(阿霉素)、表柔比星、吉西他滨(Gemzar)、道诺霉素、丙卡巴肼、丝裂霉素、阿糖胞苷、依托泊苷、5-氟尿嘧啶、氟尿嘧啶、长春碱、长春新碱、博来霉素、道诺霉素、培洛霉素、雌莫司汀、紫杉醇(Taxol)、多西他赛(Taxotere)、阿地白介素、天冬酰胺酶、白消安、卡铂、奥沙利铂、奈达铂、克拉屈滨、喜树碱、10-羟基-7-乙基-喜树碱(SN38)、氟尿苷、氟达拉滨、羟基脲、伊达比星、美司钠、伊立替康(CPT-11)、拓扑替康、米托蒽醌、拓扑替康、亮丙瑞林、甲地孕酮、马法兰、巯基嘌呤、羟基脲、普卡霉素、米托坦、培门冬酶、喷司他丁、哌泊溴烷、链脲佐菌素、他莫昔芬、戈舍瑞林、亮丙瑞林、氟他胺、替尼泊苷、睾内酯、硫鸟嘌呤、噻替哌、乌拉莫司汀、长春瑞滨、苯丁酸氮芥、氢化可的松、泼尼松龙、甲基泼尼松龙、长春地辛、尼莫司汀、司莫司汀、卡培他滨、雷替曲塞、阿扎胞苷、UFT、奥沙利铂、吉非替尼(Iressa)、伊马替尼(STI571)、埃罗替尼、FMS样酪氨酸激酶3(Flt3)抑制剂、血管内皮生长因子受体(VEGFR)抑制剂、成纤维细胞生长因子受体(FGFR)抑制剂、表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂例如特罗凯、根赤壳菌素、17-烯丙基氨基-17-去甲氧基格尔德霉素、雷帕霉素、安吖啶、全反式视黄酸、沙利度胺、来那度胺、阿那曲唑、法倔唑、来曲唑、依西美坦、布西拉明、硫唑嘌呤、咪唑立宾、环孢菌素、雷帕霉素、氢化可的松、蓓萨罗丁(Targretin)、他莫苷芬、地塞米松、孕酮、雌激素、阿那曲唑(Arimidex)、柳菩林、阿司匹林、吲哚美辛、塞来昔布、硫唑嘌呤、青霉胺、硫代苹果酸金、马来酸氯苯那敏、氯苯那敏、克立马丁、维甲酸、砷、硼替佐米、别嘌呤醇、加利车霉素、替伊莫单抗、塔革雷汀、奥唑米星、克拉霉素、四氢叶酸、酮康唑、氨鲁米特、苏拉明、甲氨蝶呤、美登素类生物碱等，并且也可以包含它们的衍生物。
用于连接所述药物与所述抗体或其抗体片段的方法的实例除了上述方法之外还包含通过戊二醛连接所述药物与所述抗体的氨基的方法、通过水溶性碳二亚胺连接所述药物的氨基与所述抗体的羧基的方法等。
所述生物活性肽或生物活性蛋白的实例包含干扰素(IFN)-α、IFN-β、IFN-y、白介素(IL)-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、激活免疫活性细胞例如NK细胞、巨噬细胞或嗜中性粒细胞的细胞因子或生长因子、蛋白酶例如水化酶、裂解酶或异构酶、酶例如酸性鞘磷脂酶和葡糖脑苷脂酶、包含细菌毒素和植物毒素例如蓖麻毒素、白喉毒素或ONTAK等的毒素，具有细胞膜损伤活性的抗微生物肽、具有细胞膜亲和性或细胞膜通透性的肽、其衍生物等。
所述核酸可以是任何分子，只要它是核苷酸或具有与核苷酸等同的功能的分子被聚合在其中的分子即可，其实例包含siRNA、microRNA、反义RNA/DNA、DNA适体等。
所述放射性标记化合物可以是任何放射性标记化合物，只要它是用于诊断或治疗目的的核素即可，并且其实例包含
所述放射性标记化合物可以通过氯胺T方法等直接连接到所述抗体。此外，可以将螯合所述放射性标记化合物的物质连接到所述抗体。所述螯合剂的实例包含1，4，7，10-四氮杂环十二烷四乙酸(DOTA)、1-[2-(4-氨基苯基)乙基]-1，4，7，10-四氮杂环十二烷四乙酸(PA-DOTA)、1，4，7，10-四氮杂环十三烷四乙酸(TRITA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)等，并且用所述螯合剂修饰的抗体和通过所述螯合剂用所述放射性标记化合物标记的修饰抗体也被包含在本发明的抗体中。
所述聚糖的实例包含单糖、二糖和寡糖等，并且其更具体的实例包含岩藻糖、甘露糖、葡萄糖、阿洛糖、醛糖(aldose)、古洛糖、艾杜糖、半乳糖、塔洛糖、核糖、阿拉伯糖、木糖、来苏糖、赤藓糖(erythose)、赤藓糖、苏阿糖、纤维二糖、麦芽糖、异麦芽糖、乳糖、脂阿拉伯糖甘露聚糖、Lewis X三糖、唾液酸化Lewis X四糖等。此外，所述聚糖可以是包含被称为免疫佐剂的聚糖的天然产物，其实例包含β(1→3)葡聚糖(香菇多糖或裂褶菌多糖)、α-半乳糖苷神经酰胺(KRN7000)等。
所述脂类的实例包含简单脂类(中性脂类)，其是脂肪酸与各种不同类型的醇中的任一者的酯或其类似物。其实例包含脂肪(例如三酰甘油)、蜡(例如长链醇的脂肪酸酯)、甾醇酯、胆甾醇酯、维生素的脂肪酸酯等，除了脂肪酸和醇之外还具有极性基团例如磷酸、糖、硫酸或胺的复合脂类例如磷脂(例如甘油磷脂、鞘磷脂等)和糖脂(例如甘油糖脂、鞘糖脂等)，衍生脂类，其是指在通过简单脂类或复合脂类的水解产生的化合物中的脂溶性化合物例如脂肪酸、长链醇、脂溶性维生素、甾类、糖类等。
所述荧光化合物的实例包含荧光染料，包括荧光素系列例如荧光素异硫氰酸酯(FITC)、罗丹明系列例如罗丹明异硫氰酸酯(RITC)、Cy3、Cy5、曙红系列、Alexa Fluor系列、NBD系列等，发光物质例如吖啶酯或洛粉碱，荧光蛋白例如绿色荧光蛋白(GFP)等。
所述亲水性聚合物、两亲性聚合物或功能性分子可以直接地或通过适合的连接物连接到本发明的抗体或其抗体片段。所述连接物的实例包含酯、二硫化物、腙、二肽等。
当融合抗体或融合抗体片段通过用遗传工程技术修饰本发明的抗体或其抗体片段来产生时，融合抗体或融合抗体片段可以如下产生：将编码蛋白质的cDNA连接到编码抗体的cDNA，由此构建编码所述融合抗体或融合抗体片段的DNA，将所述DNA插入到用于原核生物或真核生物的表达载体中，将所述表达载体引入到原核生物或真核生物中，并表达所述融合抗体或融合抗体片段。
本发明的组合物可以是任何组合物，只要所述组合物包含本发明的抗体或其抗体片段即可。除了所述抗体或其抗体片段之外，所述组合物还可以包含适合的载体或添加剂例如稳定剂。
本发明的组合物的实例包括包含本发明的抗体或其抗体片段的用于检测或测量的组合物等。本发明的组合物的实例包括包含本发明的抗体或其抗体片段作为活性成分的药物组合物(治疗剂)等，并且所述组合物与可药用载体一起配制成所需剂型。
在本发明中，所述用于检测或测量的组合物可以是任何组合物，只要所述组合物包含本发明的抗体或其抗体片段并且可以检测或测量与本发明的抗体或其抗体片段特异性结合的抗原即可。作为与本发明的抗体或其抗体片段特异性结合的抗原，实例是CADM3或CADM3和脑中存在的抗原等。
本发明的抗体或其抗体片段当给药到动物时，具有与脑中的CADM3结合并在脑中积累的性质。因此，通过使用包含所述抗体或其抗体片段的用于检测或测量的组合物，所述抗体可以在脑中维持，或者可以提高脑中的抗体浓度，使得CADM3或CADM3和脑中存在的抗原可以被长时间检测或测量，和/或也可以以高灵敏度检测或测量CADM3或CADM3和脑中存在的抗原。
例如，当所述用于检测或测量的组合物是包含与CADM3和脑中存在的抗原结合的双特异性抗体的组合物时，所述双特异性抗体所结合的CADM3和脑中存在的抗原可以被长时间检测或测量，和/或可以以高灵敏度检测或测量CADM3和脑中存在的抗原。
此外，例如，当所述用于检测或测量的组合物是包含用放射性标记化合物或荧光染料标记并与CADM3结合的融合抗体或其融合抗体片段的组合物时，CADM3可以被长时间检测或测量，和/或可以以高灵敏度检测或测量CADM3。
包含本发明的抗体或其抗体片段的药物组合物(治疗剂)可以是用于任何疾病的治疗剂，只要与本发明的抗体或其抗体片段特异性结合的抗原在所述疾病中表达即可，但优选为用于脑部疾病的治疗剂。
所述脑部疾病的实例包含阿兹海默氏病、阿兹海默氏病的前驱期、亨廷顿氏病、帕金森氏病、脑肿瘤、多发性硬化症、肌营养不良症、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、多系统萎缩症、进行性核上性麻痹、黑质纹状体变性、橄榄体脑桥小脑萎缩、脊髓延髓性肌肉萎缩、脊髓小脑变性、脑血管障碍、癫痫、偏头痛、多动症、克雅病、皮质基底节变性、溶酶体贮积病、抑郁症、肌张力障碍等。
本发明的抗体或其抗体片段在给药到动物时具有与脑中的CADM3结合并在脑中积累的性质。因此，通过使用包含所述抗体或其抗体片段的治疗剂，所述抗体或其抗体片段可以在脑中长时间维持，并且可以提高脑中的抗体浓度，以便可以表现出对上述疾病的治疗效果。
例如，当所述治疗剂是包含本发明的抗CADM3抗体的融合抗体的治疗剂时，通过将融合分子递送到脑中，可以表现出所述分子的治疗效果。具体来说，当所述治疗剂是包含其中将药物、酶等融合到抗CADM3抗体的融合抗体的治疗剂时，可以表现出所述药物或酶的治疗效果，并且当所述治疗剂是包含与CADM3和脑中存在的抗原结合的双特异性抗体的治疗剂时，可以表现出对与所述脑中存在的并与所述双特异性抗体结合的抗原相关的脑部疾病的治疗效果。
此外，例如，当所述治疗剂是用低分子量药物修饰并与CADM3结合的融合抗体或融合抗体片段时，可以表现出对所述低分子量药物所靶向的脑部疾病的治疗效果。此时，与单独使用所述低分子量药物的情况相比，使用本发明的治疗剂时治疗效果优选更高。
所述包含本发明的抗体或其抗体片段的治疗剂可以是仅包含所述抗体或其抗体片段作为活性成分的治疗剂，然而通常情况下，所述治疗剂理想情况下作为使用制药学技术领域中已知的任意方法通过与一种或多种可药用载体混合而生产的药物制剂提供。
作为给药途径，优选地使用对治疗最有效的途径，其实例包含口服给药或肠胃外给药例如口内、气道内、直肠内、皮下、真皮内、肌肉内、脑室内、鞘内、鼻内、腹膜内或静脉内给药，并且静脉内或脑室内给药等是特别优选的实例。剂型的实例包含喷雾剂、胶囊、片剂、粉剂、颗粒剂、糖浆、乳液、栓剂、注射剂、软膏、胶带等。
给药的剂量或频率随着所打算的治疗效果、给药方法、治疗持续时间、年龄、体重等而变，但通常对于成人来说为每天10μg/kg至20mg/kg。
此外，本发明还包含用于将抗体保留在脑中的方法、用于增强抗体在脑中积累的性质的方法和用于提高脑中的抗体浓度(或抗体量)的方法，每种所述方法均使用本发明的抗体或其抗体片段。
此外，本发明还涉及与CADM3结合的肽，包含编码所述肽的核苷酸序列的核酸，包含含有所述核酸的载体的转化体细胞，包含培养所述转化体细胞并从培养溶液收集所述肽的生产所述肽的方法，包含所述肽的组合物，或用于检测或测量脑中存在的抗原的方法，用于诊断或治疗脑部疾病的方法，用于增强肽在脑中积累的性质的方法，或用于提高所述肽在脑中的量的方法，每种所述方法均使用所述肽或组合物。
本发明的肽包含其中肽被修饰的融合肽。
对于与所述结合到CADM3等的肽相关的各种不同术语的定义来说，除非另有规定，否则使用与上文为结合到CADM3等的抗体所描述的术语定义相同的定义。
在下文中，将具体描述用于生产本发明的抗体或其抗体片段的方法、用于治疗疾病的方法、用于诊断疾病的方法等。
1.用于生产抗体的方法
(1)抗原的制备
充当抗原的CADM3或表达CADM3的细胞可以通过将包含编码全长CADM3或其部分长度的cDNA的表达载体引入到大肠杆菌、酵母、昆虫细胞、动物细胞等中来获得。此外，CADM3也可以通过从CADM3在其中被大量表达的各种不同类型的动物细胞系、动物细胞、动物组织等纯化CADM3来获得。
此外，所述动物细胞系、动物细胞、动物组织等，也可以将它们作为抗原来使用。此外，使用化学合成方法例如Fmoc方法或tBoc方法制备具有CADM3的部分序列的合成肽，并且所述合成肽也可以用作抗原。
可以向CADM3或具有CADM3的部分序列的合成肽的C-端或N-端添加已知的标签例如FLAG或His。
在本发明中使用的CADM3可以使用在《分子克隆实验指南》(Molecular Cloning，ALaboratory Manual)第二版(Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))、《分子生物学现代方法》(Current Protocols In Molecular Biology)(John Wiley&Sons(1987-1997))等中描述的方法等来生产，例如通过下述方法将编码CADM3的DNA在宿主细胞中表达。
首先，通过将在启动子下游包含编码CADM3的区域的全长cDNA插入到适合的表达载体中来产生重组载体。在所述全长cDNA的基础上制备的具有适合的长度并包含编码多肽的区域的DNA片段可以代替所述全长cDNA使用。随后，通过将得到的重组载体引入到适合于所述表达载体的宿主细胞中，可以获得产生所述多肽的转化体。
作为所述表达载体，可以使用任何载体，只要它可以自主复制或者可以整合到待使用的宿主细胞的染色体中，并在能够转录编码所述多肽的DNA的位置处包含适合的启动子即可。作为所述宿主细胞，可以使用任何细胞例如属于埃希氏杆菌属(Escherichia)的微生物例如大肠杆菌(E.coli)、酵母、昆虫细胞、动物细胞等，只要可以表达靶基因即可。
在使用原核生物例如大肠杆菌作为宿主细胞的情况下，所述表达载体优选为可以在原核生物中自主复制并且还包含启动子、核糖体结合序列、包含编码人类CADM3的区域的DNA和转录终止序列的载体。此外，尽管转录终止序列对于表达载体来说不是必需的，但所述转录终止序列优选被放置在紧靠结构基因的下游。此外，所述重组载体可以包含控制启动子的基因。
作为所述表达载体，优选地使用其中作为核糖体结合序列的Shine-Dalgarno序列(也被称为SD序列)与起始密码子之间的距离被调整到适合长度(例如6至18个核苷酸)的质粒。
此外，在所述编码CADM3的DNA的核苷酸序列中，核苷酸可以被替换，使得密码子对于在宿主中的表达来说变成最适，并且作为结果可以提高靶CADM3的生产速率。
作为所述表达载体，可以使用任何载体，只要它可以在待使用的宿主细胞中表现出它的功能即可，并且其实例包含pBTrp2、pBTac1、pBTac2(上文中由Roche DiagnosticsK.K.制造)、pKK233-2(由Pharmacia Corporation制造)、pSE280(由Invitrogen，Inc.制造)、pGEMEX-1(由Promega Corporation制造)、pQE-8(由QIAGEN，Inc.制造)、pKYP10(JP-A-S58-110600)、pKYP200[Agricultural Biological Chemistry，48，669(1984)]、pLSA1[Agric.Biol.Chem.，53，277(1989)]、pGEL1[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82，4306(1985)]、pBluescript II SK(-)(由Stratagene Corporation制造)、pTrs30[从大肠杆菌JM109/pTrS30(FERM BP-5407制备)]、pTrs32[从大肠杆菌JM109/pTrS32(FERM BP-5408)制备]、pGHA2[从大肠杆菌IGHA2(FERM BP-400)制备，JP-A-S60-221091]、pGKA2[从大肠杆菌IGKA2(FERM BP-6798)制备，JP-A-S60-221091]、pTerm2(美国专利号4,686，191、美国专利号4,939,094和美国专利号160,735)、pSupex、pUB110、pTP5、pC194、pEG400[J.Bacteriol.，172，2392(1990)]、pGEX(由Pharmacia Corporation制造)、pET系统(由Novagen，Inc.制造)、pME18SFL3等。
作为启动子，可以使用任何启动子，只要它可以在待使用的宿主细胞中表现出它的功能即可。实例是例如源自于大肠杆菌、噬菌体等的启动子如trp启动子(Ptrp)、lac启动子、PL启动子、PR启动子或T7启动子。此外，实例是例如人工设计和修饰的启动子例如其中将两个Ptrp串联连接的串联启动子、tac启动子、lacT7启动子或let I启动子等。
宿主细胞的实例包含大肠杆菌XL1-Blue、大肠杆菌XL2-Blue、大肠杆菌DH1、大肠杆菌MC1000、大肠杆菌KY3276、大肠杆菌W1485、大肠杆菌JM109、大肠杆菌HB101、大肠杆菌No.49、大肠杆菌W3110、大肠杆菌NY49、大肠杆菌DH5α等。
作为将重组载体引入到宿主细胞中的方法，可以使用任何方法，只要它是用于将DNA引入到待使用的宿主细胞中的方法即可，实例是例如使用钙离子的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，69，2110(1972)；Gene，17，107(1982)；和Molecular&GeneralGenetics，168，111(1979)]。
当使用动物细胞作为宿主时，作为表达载体，可以使用任何载体，只要它可以在动物细胞中表现出它的功能即可，并且其实例包含pcDNAI，pCDM8(由Funakoshi Co.，Ltd.制造)、pAGE107[JP-A-H3-22979；Cytotechnology，3，133(1990)]、pAS3-3(JP-A-H2-227075)、pCDM8[Nature，329，840(1987)]、pcDNAI/Amp(由Invitrogen，Inc.制造)、pcDNA3.1(由Invitrogen，Inc.制造)、pREP4(由Invitrogen，Inc.制造)、pAGE103[J.Biochemistry，101，1307(1987)]、pAGE210、pME18SFL3、pKANTEX93(WO 97/10354)、N5KG1val(美国专利号6,001，358)、INPEP4(由Biogen-IDEC，Inc.制造)、pCI(由Promega Corporation制造)、转座子载体(WO 2010/143698)等。
作为启动子，可以使用任何启动子，只要它可以在动物细胞中表现出它的功能即可，并且其实例包含巨细胞病毒(CMV)立即早期(IE)基因启动子、SV40早期启动子、反转录病毒启动子、金属硫蛋白启动子、热休克启动子、SRα启动子和莫洛尼鼠白血病病毒启动子或增强子。此外，人类CMV IE基因增强子可以与所述启动子一起使用。
宿主细胞的实例包含人类白血病细胞Namalwa细胞、猴细胞COS细胞、中华仓鼠卵巢细胞CHO细胞[Journal of Experimental Medicine，108，945(1958)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，60，1275(1968)；Genetics，55，513(1968)；Chromosoma，41，129(1973)；Methods in Cell Science，18，115(1996)；Radiation Research，148，260(1997)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77，4216(1980)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，60，1275(1968)；Cell，6，121(1975)；《分子细胞遗传学》(Molecular Cell Genetics)，附录I、II(pp.883-900)]、二氢叶酸还原酶基因(dhfr)缺陷型CHO细胞(CHO/DG44细胞)[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77，4216(1980)]、CHO-K1(ATCC CCL-61)、DUkXB11(ATCC CCL-9096)、Pro-5(ATCC CCL-1781)、CHO-S(Life Technologies，目录号11619)、Pro-3、大鼠骨髓瘤细胞YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20(或者也被称为YB2/0)、小鼠骨髓瘤细胞NS0、小鼠骨髓瘤细胞SP2/0-Ag14、叙利亚仓鼠细胞BHK或HBT5637(JP-A-S63-000299)等。
作为用于将表达载体引入到宿主细胞中的方法，可以使用任何方法，只要它是用于将DNA引入到动物细胞中的方法即可。其实例包含电穿孔方法[Cytotechnology，3，133(1990)]、磷酸钙方法(JP-A-H2-227075)、脂染法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84，7413(1987)]等。
CADM3可以如下生产：将如上所述获得的源自于微生物、动物细胞等的具有并入有编码CADM3的DNA的表达载体的转化体在培养基中培养，以便在培养溶液中产生并积累CADM3，然后从所述培养溶液收集CADM3。在培养基中培养所述转化体的方法可以按照用于培养宿主的常规方法来进行。
在源自于真核生物的细胞中进行表达的情况下，可以获得添加有糖或聚糖的CADM3。
在培养用使用诱导型启动子的表达载体转化的微生物时，可以根据需要向培养基添加诱导物。例如，在培养用使用lac启动子的表达载体转化的微生物时，可以向培养基添加异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷等，并且在培养用使用trp启动子的表达载体转化的微生物时，可以向培养基添加吲哚丙烯酸等。
用于培养使用动物细胞作为宿主获得的转化体的培养基的实例包含常用的RPMI1640培养基[The Journal of the American Medical Association，199，519(1967)]、Eagle’s MEM培养基[Science，122，501(1952)]、Dulbecco改良的MEM培养基[Virology，8，396(1959)]、培养基199[Proc.Soc.Exp.Biol.Med.，73，1(1950)]、Iscove改良的Dulbecco’s培养基(IMDM)，或向任何这些培养基添加了胎牛血清(FBS)等的培养基等。所述培养通常在pH 6至8和30至40℃的条件下，在存在5％CO
作为表达编码CADM3的基因的方法，除了直接表达之外，实例是例如分泌生产或融合蛋白表达方法[《分子克隆实验指南》(Molecular Cloning，A Laboratory Manual)，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)]。
用于生产CADM3的方法的实例包含在宿主细胞中生产CADM3的方法、将CADM3分泌到宿主细胞外的方法、在宿主细胞的外膜上生产CADM3的方法，并且可以通过改变待使用的宿主细胞或待生产的CADM3的结构来选择适合的方法。
当CADM3在宿主细胞中或宿主细胞的外膜上生产时，可以使用Paulson等人的方法[J.Biol.Chem.，264，17619(1989)]、Lowe等人的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，86，8227(1989)；Genes Develop.，4，1288(1990)]或在JP-A-H05-336963、WO 94/23021等中描述的方法将CADM3主动分泌到宿主细胞外。此外，利用使用二氢叶酸还原酶基因的基因扩增系统等(JP-A-H2-227075)，也可以提高CADM3的生产量。
所述得到的CADM3可以例如如下进行分离和纯化。当CADM3在细胞中以溶解状态表达时，在培养完成后通过离心收集细胞，悬浮在水性缓冲溶液中，然后使用超声波均质机、French压碎器、Manton Gaulin均质机、Dyno磨等将所述细胞均质化，由此获得无细胞提取溶液。从通过所述无细胞提取溶液的离心获得的上清液，可以使用诸如常规蛋白质分离和纯化方法的方法获得纯化的制备物，所述方法即单独或组合的溶剂萃取法、使用硫酸铵等的盐析法、脱盐法、使用有机溶剂的沉淀法、使用诸如二乙基氨基乙基(DEAE)-琼脂糖凝胶或DIAION HPA-75(由Mitsubishi Chemical Corporation制造)的树脂的阴离子交换层析、使用诸如S-琼脂糖凝胶FF(由Pharmacia Corporation制造)的树脂的阳离子交换层析、使用诸如丁基琼脂糖凝胶或苯基琼脂糖凝胶的树脂的疏水层析、使用分子筛的凝胶过滤法、亲和层析、层析聚焦、电泳例如等电聚焦电泳等。
当CADM3在细胞中通过形成不溶体表达时，收集所述细胞，然后以与上述相同的方式均质化，然后离心，由此将所述CADM3的不溶体作为沉积级分收集。将所述收集的CADM3不溶体用蛋白变性剂溶解。通过稀释或透析所述溶解的溶液，CADM3返回到正常构象，随后可以通过与上述相同的分离和纯化方法获得多肽的纯化制备物。
当CADM3或其衍生物例如糖修饰体被细胞外分泌时，可以在培养上清液中收集CADM3或其衍生物例如糖修饰体。以与上述相同的方式使用诸如离心的方法对所述培养物进行处理，由此获得可溶性级分，然后使用与上述相同的分离和纯化方法，可以从所述可溶性级分获得纯化的制备物。
此外，在本发明中使用的CADM3也可以使用化学合成方法例如Fmoc方法或tBoc方法来生产。此外，化学合成也可以使用由Advanced Chemtech，Inc.、PerkinElmer，Inc.、Pharmacia Corporation、Protein Technology Instrument，Inc.、Synthecell-VegaBiomolecules Corporation、Perceptive，Inc.、Shimadzu Corporation等制造的肽合成仪来进行。
(2)动物的免疫接种和用于融合的抗体产生细胞的制备
将3至20周龄的动物例如小鼠、大鼠、兔或仓鼠用在(1)中获得的抗原免疫接种，并在所述动物的脾、淋巴结或外周血中收集抗体产生细胞。此外，诸如美洲驼、羊驼或骆驼的动物也可用作免疫接种的动物。
所述免疫接种通过将抗原例如与适合的佐剂如弗氏完全佐剂、氢氧化铝凝胶或百日咳博德特氏菌疫苗一起皮下、静脉内或腹膜内给药到动物来进行。当所述抗原是部分肽时，产生所述抗原与载体蛋白例如牛血清白蛋白(BSA)或钥孔戚血蓝蛋白(KLH)的偶联物并将其用作免疫原。
当小鼠或大鼠被免疫接种时，所述抗原的给药在第一次给药后每1至2周进行5至10次。在每次给药后的第3至7天，从眼底静脉丛收集血液，并使用酶免疫测定法[《抗体实验指南》(Antibodies-A Laboratory Manual)，Cold Spring Harbor Laboratory(1988)]等测量其血清的抗体滴度。其血清显示出足够的针对用于免疫接种的抗原的抗体滴度的动物，被用作用于融合的抗体产生细胞的供应源。
在抗原的最后一次给药后第3至7天，从被免疫接种的动物摘除包含抗体产生细胞的组织例如脾脏，并收集所述抗体产生细胞。当使用脾细胞时，将脾脏切碎并分散，然后离心，然后除去红细胞，由此获得用于融合的抗体产生细胞。
待免疫接种的其他动物也可以以相同方式进行免疫接种，并且可以获得抗体产生细胞。免疫接种的时间间隔和最后一次免疫接种与组织摘除之间的时间长度的适合条件，可以根据待免疫接种的动物物种来选择。
(3)骨髓瘤细胞的制备
作为骨髓瘤细胞，使用从小鼠获得的已建立的细胞系，并且使用例如8-氮杂鸟嘌呤抗性小鼠(源自于BALB/c的)骨髓瘤细胞系P3-X63Ag8-U1(P3-U1)[Current Topics inMicrobiology and Immunology，18，1(1978)]、P3-NS1/1-Ag41(NS-1)[EuropeanJ.Immunology，6，511(1976)]、SP2/0-Ag14(SP-2)[Nature，276，269(1978)]、P3-X63-Ag8653(653)[J.Immunology，123，1548(1979)]、P3-X63-Ag8(X63)[Nature，256，495(1975)]等。
将所述骨髓瘤细胞在正常培养基[增补有谷氨酰胺、2-巯基乙醇、庆大霉素、FBS和8-氮杂鸟嘌呤的RPM1 1640培养基]中传代培养，然后在细胞融合前3至4天在正常培养基中传代培养，并在融合当天确保2×10
(4)细胞融合和产生单克隆抗体的杂交瘤的制备
将所述在(2)中获得的用于融合的抗体产生细胞和在(3)中获得的骨髓瘤细胞用最低必需培养基(MEM)或磷酸盐缓冲盐水(PBS：1.83g磷酸氢二钠，0.21g磷酸二氢钾，7.65g氯化钠，1L蒸馏水，pH 7.2)充分清洗并混合，以使细胞数变得如下：用于融合的抗体产生细胞∶骨髓瘤细胞＝5∶1至10∶1，然后离心，然后除去上清液。
在将沉淀的细胞集合体充分打散后，向其添加聚乙二醇1000(PEG-1000)、MEM培养基和二甲基亚砜的混合溶液，同时在37℃下搅拌。此外，每1至2分钟向其添加1至2mL MEM培养基共几次，然后向其添加MEM培养基，使总量变为50mL。
在离心后，除去上清液。将沉淀的细胞集合体轻柔打散，然后将所述细胞轻柔地悬浮在HAT培养基[增补有次黄嘌呤、胸腺嘧啶核苷和氨基蝶呤的正常培养基]中。将所述得到的悬液在5％CO
在培养后，取出一部分培养上清液，通过杂交瘤选择方法例如下文描述的结合测定法选择与CADM3反应但不与CADM3之外的抗原反应的细胞集合体。随后，通过有限稀释法进行克隆，并选择稳定地观察到高抗体滴度的细胞作为产生单克隆抗体的杂交瘤。
(5)纯化的单克隆抗体的制备
将在(4)中获得的产生单克隆抗体的杂交瘤腹膜内注射到已经历姥鲛烷处理[腹膜内给药0.5mL 2，6，10，14-四甲基十五烷(姥鲛烷)，然后饲养2周]的8至10周龄的小鼠或裸小鼠中。在10至21天内，所述杂交瘤转变成腹水瘤。
从该小鼠收集腹水，然后离心除去固体，然后使用40至50％硫酸铵进行盐析。随后，通过辛酸沉淀法、DEAE-琼脂糖凝胶柱、蛋白A柱或凝胶过滤柱进行纯化，然后收集IgG或IgM级分，由此制备纯化的单克隆抗体。
此外，在将所述在(4)中获得的产生单克隆抗体的杂交瘤在增补有10％FBS的RPMI1640培养基等中进行培养后，通过离心除去上清液，并将残留物悬浮在杂交瘤-SFM培养基中，然后培养3至7天。
将所述得到的细胞悬液离心，从所述得到的上清液通过蛋白A柱或蛋白G柱进行纯化，然后收集IgG级分，由此也可以获得纯化的单克隆抗体。注意也可以向所述杂交瘤-SFM培养基添加5％Daigo’s GF21。
抗体亚类的确定使用亚类分型试剂盒，通过酶免疫测定法来进行。蛋白量的定量确定可以通过Lowry法或从280nm处的吸光度计算来进行。
(6)抗体的选择
抗体的选择如下所示通过使用流式细胞术等测量所述抗体对表达CADM3的细胞的亲和性来进行。所述表达CADM3的细胞可以是任何细胞，只要CADM3被表达在所述细胞表面上即可，并且其实例包含动物细胞、动物细胞系、在(1)中获得的CADM3强制表达细胞系等。
在将所述表达CADM3的细胞分发到板例如96孔板中之后，将测试物质例如血清、杂交瘤的培养上清液或纯化的抗体分发在其中作为第一抗体，并允许其进行反应。在反应后将所述细胞用包含1至10％BSA的PBS(在后文中被称为BSA-PBS)等充分清洗，然后将作为第二抗体的用荧光试剂等标记的抗免疫球蛋白抗体分发在其中，并允许其进行反应。在用BSA-PBS等充分清洗后，使用流式细胞仪测量标记的抗体的荧光量，由此选择与表达CADM3的细胞特异性反应的抗体。
此外，抗体的选择也可以通过使用下文描述的ELISA或表面等离子体共振测量单克隆抗体对表达CADM3的细胞、CADM3蛋白等的亲和性来进行。所述CADM3蛋白可以是由CADM3的某些结构域构成的蛋白质或添加有标签例如GST的蛋白质。
在ELISA中，在将所述表达CADM3的细胞或CADM3蛋白分发到板例如96孔板中之后，将所述孔用BSA-PBS阻断，将测试物质例如血清、杂交瘤的培养上清液或纯化的抗体分发在其中作为第一抗体，并允许其进行反应。随后，在用PBS等充分清洗后，将作为第二抗体的用荧光试剂等标记的抗免疫球蛋白抗体分发在其中，并允许其进行反应。
然后，在用PBS等充分清洗后，添加显色溶液。在结束时，用反应终止溶液终止显色反应，并使用微孔板读板器测量每个孔中的吸光度，由此选择与所述表达CADM3的细胞或CADM3蛋白特异性反应的抗体。
在表面等离子体共振中，通过使用已知的方案，可以通过将抗体固定化在适合的传感器芯片上并使用CADM3蛋白作为被分析物，来测量与CADM3结合的抗体的亲和性。
利用得到的抗体的亲和性，可以选择对CADM3蛋白具有所需亲和性的抗体。此外，与CADM3结合的抗体的亲和性也可以通过将所述CADM3蛋白固定化在传感器芯片上并使用所述抗体作为被分析物来测量。
此外，与本发明的抗体竞争与CADM3的结合的抗体，可以通过将测试抗体添加到上述使用流式细胞术或ELISA的测定体系中以引起反应来获得。也就是说，通过筛选在添加测试抗体时抑制本发明的抗体与CADM3的结合的抗体，可以获得与本发明的抗体竞争与CADM3的氨基酸序列或其构象的结合的抗体。
此外，与包含本发明的抗体所结合的表位的表位结合的抗体可以如下获得：通过已知的方法鉴定通过上述筛选方法获得的抗体的表位，产生包含所述鉴定出的表位的合成肽、被制造成模拟所述表位的构象的合成肽等，然后使用其进行免疫接种。
此外，结合到与本发明的抗体所结合的表位相同的表位的抗体可以如下获得：鉴定通过上述筛选方法获得的抗体的表位，产生所述鉴定出的表位的部分合成肽、被制造成模拟所述表位的构象的合成肽等，然后使用其进行免疫接种。
(7)通过噬菌体展示方法获得抗体
(7-1)产生抗体噬菌体文库的方法
在本发明中，作为抗体噬菌体文库，可以使用免疫文库、天然文库和合成文库。相应文库的生产方法将在下文描述。
对于免疫文库来说，收集源自于以与上文(1)中描述的相同的方式免疫接种的动物或患者的淋巴细胞，并且对于天然文库来说，收集源自于正常动物或健康人类的淋巴细胞，从所述淋巴细胞提取RNA，并通过反转录反应合成cDNA。
将使用每种cDNA作为模板通过PCR扩增的抗体基因片段插入到噬菌粒载体中，并用所述噬菌粒载体转化大肠杆菌。当将所述得到的转化体用辅助噬菌体感染时，可以获得所述抗体基因的抗体噬菌体文库。
此外，对于合成文库来说，将基因组DNA中的V基因或重建的功能性V基因的CDR用编码适合长度的随机氨基酸序列的寡核苷酸替换，并用其中插入有所述V基因的噬菌粒载体转化大肠杆菌。当将所述得到的转化体用辅助噬菌体感染时，可以获得抗体噬菌体文库。
作为所述源自于淋巴细胞的cDNA和抗体噬菌体文库，也可以使用可商购产品。
作为所述噬菌粒载体，可以使用pCANTAB 5E(Amersham Pharmacia Biotech，Inc.)、pUC 118/pUC 119载体(TAKARA，Inc.)、pBlueScript II噬菌粒载体(AgilentTechnologies，Inc.)、pKSTV-02(Miyazaki等，Biochem.158(3)，205-215，2015)等。
作为所述辅助噬菌体，可以使用M13KO7辅助噬菌体(Invitrogen，Inc.)、VCSM13抗干扰辅助噬菌体(Agilent Technologies，Inc.)、R408抗干扰辅助噬菌体(AgilentTechnologies，Inc.)等。
在所述噬菌体展示中，也可以使用噬菌体载体。存在其中将丝状噬菌体g3p用作被展示分子的肽噬菌体文库(由New England Biolabs，Inc.等制造)、其中将g7p、g8p或g9p用作被展示分子的方法等。
此外，使用T7噬菌体的噬菌体展示也可以使用。作为在T7噬菌体上的展示系统，存在T7 Select载体(Novagen，Inc.)等。
(7-2)抗体噬菌体克隆的选择
从在(7-1)中产生的抗体噬菌体文库选择抗体噬菌体克隆，可以使用下文示出的ELISA方法来进行。
将CADM3固定化在免疫管上，并将所述管用阻断缓冲液阻断。向所述管的每个孔添加在(7-1)中产生的抗体噬菌体文库，并允许其进行反应。随后，将所述孔清洗，添加荧光标记的抗噬菌体抗体，并允许其反应。随后，将所述孔再次清洗并添加显色溶液。然后，用反应终止溶液终止显色反应，并使用微孔板读板器测量每个孔中的吸光度。通过这种方式选择出与CADM3结合的抗体噬菌体克隆。
2.遗传重组抗体的生产
作为遗传重组抗体的生产实例，下文将描述人类嵌合抗体和人源化抗体的生产方法。遗传重组小鼠抗体、大鼠抗体、兔抗体、仓鼠抗体、骆驼抗体、美洲驼抗体、羊驼抗体和人类抗体、各种不同类型的嵌合抗体、重链抗体等，也可以以相同的方式来生产。
(1)用于遗传重组抗体的表达载体的构建
用于遗传重组抗体的表达载体是其中并入有编码人类抗体的CH和CL的DNA的用于动物细胞的表达载体，并且可以通过将每个所述编码人类抗体的CH和CL的DNA克隆到用于动物细胞的表达载体中来构建。
作为人类抗体的恒定区(C区)，可以使用任意人类抗体的CH和CL。例如，使用人类抗体的γ1亚型的CH和κ亚型的CL等。作为编码人类抗体的CH或CL的DNA，使用cDNA，但是也可以使用由外显子和内含子构成的染色体DNA。
作为所述用于动物细胞的表达载体，可以使用任何载体，只要它可以并入编码人类抗体的C区的基因并表达所述基因即可。例如，使用pAGE107[Cytotechnol.，3，133(1990)]、pAGE103[J.Biochem.，101，1307(1987)]、pHSG274[Gene，27，223(1984)]、pKCR[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，78，1527(1981)]、pSG1bd2-4[Cytotechn0l.，4，173(1990)]、pSE1UK1Sed1-3[Cytotechnol.，13，79(1993)]等。
作为所述用于动物细胞的表达载体中的启动子和增强子，实例是SV40早期启动子[J.Biochem.，101，1307(1987)]、莫洛尼鼠白血病病毒LTR[Biochem.Biophys.Res.Commun.，149，960(1987)]或免疫球蛋白H链启动子[Cell，41，479(1985)]和增强子[Cell，33，717(1983)]等。
作为所述用于遗传重组抗体的表达载体，从用于遗传重组抗体的表达载体构建的容易程度、引入到动物细胞中的容易程度、抗体H链和L链在所述动物细胞中的表达水平的平衡等的观点来看，使用其中抗体H链和L链存在于同一载体上的类型(串联类型)的用于遗传重组抗体的表达载体[J.Immunol.Methods，167，271(1994)]，但也可以使用其中抗体H链和L链存在于分开的载体上的类型。作为串联类型的用于遗传重组抗体的表达载体，使用pKANTEX93(WO 97/10354)、pEE18[Hybridoma，17，559(1998)]等。
(2)编码源自于人类之外的动物的抗体的可变区(V区)的cDNA的获得和氨基酸序列的分析
编码非人类抗体的VH和VL的cDNA的获取和氨基酸序列的分析可以如下所述来进行。
(2-1)当通过杂交瘤方法获得抗体时
从产生非人类抗体的杂交瘤细胞提取mRNA并合成cDNA。将所述合成的cDNA各自克隆到载体例如噬菌体或质粒中，由此产生cDNA文库。
使用编码非人类抗体的C区结构域或V区结构域的DNA作为探针，从所述文库分离包含编码VH和VL的每种cDNA的重组噬菌体或重组质粒。确定所述重组噬菌体或重组质粒上的非人类抗体的靶VH或VL的每个完整的核苷酸序列，并从所述核苷酸序列推定VH或VL各自的完整氨基酸序列。
作为用于产生生产非人类抗体的杂交瘤细胞的人类之外的动物，使用小鼠、大鼠、仓鼠、兔、美洲驼、骆驼、羊驼等，但也可以使用任何动物，只要它能够产生杂交瘤细胞即可。
对于从杂交瘤细胞制备总RNA来说，使用异硫氰酸胍-三氟乙酸铯方法[Methodsin Enzymol.，154，3(1987)]或试剂盒例如RNA easy试剂盒(由QIAGEN，Inc.制造)等。
在从总RNA制备mRNA中，使用固定有寡聚(dT)的纤维素柱方法[《分子克隆实验指南》(Molecular Cloning，A Laboratory Manual)第二版，Cold Spring HarborLaboratory Press(1989)]或试剂盒例如Oligo-dT30
在cDNA的合成和cDNA文库的产生中，使用已知的方法[《分子克隆实验指南》(Molecular Cloning，A Laboratory Manual)第二版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress(1989)，《分子生物学现代方法》(Current Protocols in Molecular Biology)补充文件1，John Wiley&Sons(1987-1997)]或试剂盒例如用于cDNA合成和质粒克隆的SuperScript质粒系统(由Invitrogen，Inc.制造)或ZAP-cDNA合成(注册商标)试剂盒(由Stratagene Corporation制造)等。
在产生cDNA文库时，作为使用从杂交瘤细胞提取的mRNA作为模板合成的cDNA被并入在其中的载体，可以使用任何载体，只要它是能够并入所述cDNA的载体即可。例如，使用ZAP ExPress[Strategies，5，58(1992)]、pBluescript II SK(+)[Nucleic AcidsResearch，17，9494(1989)]、λZAPII(由Stratagene Corporation制造)、λgt 10、λgt 11[DNA Cloning：A Practical Approach，I，49(1985)]、Lambda BlueMid(由ClontechLaboratories，Inc.制造)、λExCell、pT7T3-18U(由Pharmacia Corporation制造)、pCD2[Mol.Cell.Biol.，3，280(1983)]、pUC 18[Gene，33，103(1985)]等。
作为通过噬菌体或质粒载体构建的cDNA文库被引入到其中的大肠杆菌，可以使用任何大肠杆菌，只要它可以引入、表达并维持所述cDNA文库即可。例如，使用XL1-Blue MRF’[Strategies，5，81(1992)]、C600[Genetics，39，440(1954)]、Y1088、Y1090[Science，222，778(1983)]、NM522[J.Mol.Biol.，166，1(1983)]、K802[J.Mol.Biol.，16，118(1966)]、JM105[Gene，38，275(1985)]等。
在从所述cDNA文库选择编码非人类抗体的VH或VL的cDNA克隆中，使用利用同位素或荧光标记的探针的菌落杂交法或噬斑杂交法[《分子克隆实验指南》(MolecularCloning，A Laboratory Manual)第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)]等。
此外，编码VH或VL的cDNA也可以通过制备引物并使用从mRNA合成的cDNA或所述cDNA文库作为模板执行聚合酶链反应(PCR)方法来制备[《分子克隆实验指南》(MolecularCloning，A Laboratory Manual)第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)，《分子生物学现代方法》(Current Protocols in Molecular Biology)补充文件1，JohnWiley&Sons(1987-1997)]。
将选出的cDNA用适合的限制性酶等切割，然后克隆到质粒例如pBluescript SK(-)(由Stratagene Corporation制造)中，并通过常用的核苷酸序列分析方法等确定所述cDNA的核苷酸序列。在核苷酸序列分析方法中，例如在进行反应如双脱氧法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，74，5463(1977)]后，使用自动核苷酸序列分析仪例如ABIPrism3700(由PE Biosystems，Inc.制造)或A.L.F.DN测序仪(由Pharmacia Corporation制造)等。
(2-2)当通过噬菌体展示方法获得抗体时
使用编码载体区或V区结构域的DNA作为探针，从所述选出的噬菌体克隆的质粒载体确定VH或VL各自的完整核苷酸序列，然后可以从所述核苷酸序列推定VH或VL各自的完整氨基酸序列。
在所述杂交瘤方法或噬菌体展示方法中，通过从确定的核苷酸序列推定VH和VL的完整氨基酸序列，并分别与已知抗体的VH和VL的完整氨基酸序列[《免疫学重要蛋白质的序列》(Sequences ofProteins of Immunological Interest)，US Dept.Health and HumanServices(1991)]进行比较，确认所述得到的cDNA是否编码包含分泌信号序列的抗体的VH和VL的完整氨基酸序列。
对于包含分泌信号序列的抗体的VH和VL的完整氨基酸序列来说，通过与已知抗体的VH和VL的完整氨基酸序列[《免疫学重要蛋白质的序列》(Sequences of Proteins ofImmunological Interest)，US Dept.Health and Human Services(1991)]进行比较，可以推断所述分泌信号序列的长度和N-端氨基酸序列，进而可以知道它们所属的亚组。
此外，也可以通过与已知抗体的VH和VL的氨基酸序列[《免疫学重要蛋白质的序列》(Sequences of Proteins of Immunological Interest)，US Dept.Health and HumanServices(1991)]进行比较，来找出VH和VL的CDR的氨基酸序列。
另外，利用得到的VH和VL的完整氨基酸序列，可以例如通过BLAST方法[J.Mol.Biol.，215，403(1990)]等针对任意数据库例如SWISS-PROT或PIR-Protein进行同源性搜索，来确认所述VH和VL的完整氨基酸序列是否是新的。
(3)人类嵌合抗体表达载体的构建
通过将编码非人类抗体的VH或VL的cDNA分别克隆到在(1)中获得的用于遗传重组抗体的表达载体中分别编码人类抗体的CH或CL的基因的上游，可以构建人类嵌合抗体表达载体。
为了将编码非人类抗体的VH或VL的cDNA的3’末端侧连接到人类抗体的CH或CL的5’末端侧，产生经过设计的VH和VL的cDNA，使得连接区的核苷酸序列编码适合的氨基酸并变成适合的限制性酶识别序列。
将所述产生的VH和VL的cDNA分别克隆到在(1)中获得的用于遗传重组抗体的表达载体中分别编码人类抗体的CH或CL的基因的上游，使得所述cDNA以适合的形式表达，由此构建了人类嵌合抗体表达载体。
此外，使用在两个末端处包含适合的限制性酶识别序列的合成DNA通过PCR方法来扩增分别编码非人类抗体的VH或VL的cDNA，并且也可以将其克隆到在(1)中获得的用于遗传重组抗体的表达载体中。
(4)编码人源化抗体的V区的cDNA的构建
编码人源化抗体的VH或VL的cDNA可以如下构建。
分别选择出用于移植非人类抗体的VH或VL的CDR的氨基酸序列的人类抗体的VH或VL的FR的氨基酸序列。作为待选择的FR的氨基酸序列，可以使用任何氨基酸序列，只要它源自于人类抗体即可。
例如，使用在数据库例如蛋白质数据库(Protein Data Bank)中登记的人类抗体的FR的氨基酸序列或人类抗体的FR的每个亚组中共同的氨基酸序列[《免疫学重要蛋白质的序列》(Sequences ofProteins of Immunological Interest)，US Dept.Health andHuman Services(1991)]等。为了抑制抗体结合活性的降低，选择与原始抗体的VH或VL的FR的氨基酸序列具有尽可能高的同源性(至少60％以上)的FR的氨基酸序列。
接下来，将原始抗体的CDR的氨基酸序列分别移植到所选的人类抗体的VH或VL的FR的氨基酸序列中，并分别设计出人源化抗体的VH或VL的氨基酸序列。通过考虑在抗体基因的核苷酸序列中发现的密码子使用频率[《免疫学重要蛋白质的序列》(Sequences ofProteins of Immunological Interest)，US Dept.Health and Human Services(1991)]将所述设计的氨基酸序列转变成DNA序列，分别设计出编码人源化抗体的VH或VL的氨基酸序列的DNA序列。
在所述设计的DNA序列的基础上，合成具有100个核苷酸左右的长度的几个合成DNA，并使用所述DNA进行PCR反应。在这种情况下，考虑到PCR反应的反应效率和可合成的DNA的长度，优选地为VH和VL中的每一者设计6个合成DNA。
此外，通过在位于两个末端处的合成DNA的5’或3’末端处引入适合的限制性酶识别序列，可以容易地将编码人源化抗体的VH或VL的cDNA克隆到在(1)中获得的用于遗传重组抗体的表达载体中。
在所述PCR反应后，将扩增产物分别克隆到质粒例如pBluescript SK(-)(由Stratagene Corporation制造)中，以与(2)中所述相同的方式确定核苷酸序列，并获得具有编码所需人源化抗体的VH或VL的氨基酸序列的DNA序列的质粒。
或者，也可以使用在所述设计的DNA序列的基础上各自作为单一长链DNA合成的全长VH和全长VL来代替所述PCR扩增产物。此外，通过在所述合成的长链DNA的两个末端处引入适合的限制性酶识别序列，可以容易地将编码人源化抗体的VH或VL的cDNA克隆到在(1)中获得的用于遗传重组抗体的表达载体中。
(5)人源化抗体的V区氨基酸序列的修饰
与原始的非人类抗体相比，仅通过将非人类抗体的VH和VL的CDR移植到人类抗体的VH和VL的FR中而制备的人源化抗体的抗原结合活性降低[BIO/TECHNOLOGY，9，266(1991)]。
在所述人源化抗体中，通过鉴定人类抗体的VH和VL的FR的氨基酸序列中直接参与抗原结合的氨基酸残基、与CDR的氨基酸残基相互作用的氨基酸残基和维持所述抗体的构象并间接参与抗原结合的氨基酸残基，并将这种氨基酸残基用原始的非人类抗体的氨基酸残基替换，可以提高所述降低的抗原结合活性。
为了鉴定FR的这种参与抗原结合活性的氨基酸残基，可以使用X-射线晶体学[J.Mol.Biol.，112，535(1977)]或计算机建模[Protein Engineering，7，1501(1994)]等来建立并分析抗体的构象。此外，通过为每种抗体产生几种类型的变体并通过试错重复地检查与其抗原结合活性的相关性，可以获得具有所需抗原结合活性的人源化抗体。
通过使用用于修饰的合成DNA进行(4)中描述的PCR反应，可以修饰人类抗体的VH和VL的FR的氨基酸序列。对于所述PCR反应后的扩增产物来说，通过(2)中描述的方法确定核苷酸序列以确认所打算的修饰是否已经进行。
(6)人源化抗体表达载体的构建
通过将编码构建的遗传重组载体的VH或VL的eDNA分别克隆到在(1)中获得的用于遗传重组抗体的表达载体中分别编码人类抗体的CH或CL的基因的上游，可以构建人源化抗体表达载体。
例如，通过在构建(4)和(5)中获得的任何人源化抗体的VH或VL时使用的合成DNA中位于两个末端处的合成DNA的5’或3’末端处引入适合的限制性酶识别序列，在(1)中获得的用于遗传重组抗体的表达载体中分别编码人类抗体的CH或CL的基因的上游进行所述克隆，使得所述cDNA以适合的形式表达。
(7)遗传重组抗体的瞬时表达
通过使用在(3)和(6)中获得的任何遗传重组抗体表达载体或其修饰的表达载体瞬时表达遗传重组抗体，可以高效地评估产生的许多类型的人类嵌合抗体和人源化抗体的抗原结合活性。
作为表达载体被引入到其中的宿主细胞，可以使用任何细胞，只要它是能够表达遗传重组抗体的宿主细胞即可，例如使用COS-7细胞[美国典型培养物保藏中心(AmericanType Culture Collection)(ATCC)编号CRL1651][Methods in Nucleic Acids Res-，CRCPress，283(1991)]。
在将所述表达载体引入到COS-7细胞中时，使用DEAE-葡聚糖方法[Methods inNucleic Acids Res.，CRC Press(1991)]、脂染法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84，7413(1987)]等。
在所述表达载体引入后，使用酶免疫测定法[《单克隆抗体原理与实践》(Monoclonal Antibodies-Principles and practice)第三版，Academic Press(1996)；《抗体实验指南》(Antibodies-A Laboratory Manual)，Cold Spring Harbor Laboratory(1988)；《单克隆抗体实验手册》(Monoclonal Antibody Experimental Manual)，Kodanshascientific books(1987)]等测量培养上清液中遗传重组抗体的表达水平和抗原结合活性。
(8)稳定表达遗传重组抗体的转化体的获得和遗传重组抗体的制备
稳定表达遗传重组抗体的转化体可以通过将在(3)和(6)中获得的任何遗传重组抗体表达载体引入到适合的宿主细胞中来获得。
在所述表达载体向宿主细胞的引入中，使用电穿孔方法[JP-A-H2-257891；Cytotechnology，3，133(1990)]等。
作为所述遗传重组抗体表达载体被引入到其中的宿主细胞，可以使用任何细胞，只要它是能够表达遗传重组抗体的宿主细胞即可。例如，使用CHO-K1(ATCC CCL-61)、DUKXB11(ATCC CCL-9096)、Pro-5(ATCC CCL-1781)、CHO-S(Life Technologies，目录号11619)、大鼠骨髓瘤细胞YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20(ATCC No.CRL1662，也被称为YB2/0)、小鼠骨髓瘤细胞NS0、小鼠骨髓瘤细胞SP2/0-Ag14(ATCC No.CRL1581)、小鼠P3X63-Ag8.653细胞(ATCC No.CRL1580)、dhfr缺陷型CHO细胞(CHO/DG44细胞)[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77，4216(1980)]等。
此外，也可以使用其中参与糖核苷酸GDP-岩藻糖的细胞内合成的蛋白质例如酶、参与聚糖修饰使得岩藻糖的1位被α-连接到N-糖苷连接的复合聚糖的还原端处的N-乙酰葡萄糖胺的6位的蛋白质例如酶、参与糖核苷酸GDP-岩藻糖向高尔基体的细胞内转运的蛋白质等的活性被降低或缺失的宿主细胞，例如α1，6-岩藻糖基转移酶基因缺陷型CHO细胞(WO2005/035586和WO 02/31140)、具有获得性凝集素抗性的Lec13[Somatic Cell andMolecular genetics，12，55(1986)]等。
在引入所述表达载体后，通过将所述转化体在包含药物例如G418硫酸盐(在后文中被称为G418)的用于动物细胞培养的培养基中培养，来选择稳定表达遗传重组抗体的转化体(JP-A-H2-257891)。
作为用于动物细胞培养的培养基，使用RPMI 1640培养基(由Invitrogen，Inc.制造)、GIT培养基(由Nippon Pharmaceutical Co.，Ltd.制造)、EX-CELL 301培养基(由JRHBiosciences，Inc.制造)、IMDM培养基(由Invitrogen，Inc.制造)或杂交瘤-SFM(由Invitrogen，Inc.制造)或向任何这些培养基添加任何各种不同的添加物例如FBS的培养基等。
通过将所述得到的转化体在培养基中进行培养，使遗传重组抗体表达并积累在培养上清液中。所述培养上清液中遗传重组抗体的表达水平和抗原结合活性可以通过ELISA方法等来测量。此外，由所述转化体产生的遗传重组抗体的表达水平可以使用dhfr基因扩增系统(JP-A-H2-257891)等来提高。
使用蛋白A柱从所述转化体的培养上清液纯化所述遗传重组抗体[《单克隆抗体原理与实践》(Monoclonal Antibodies-Principles and practice)第三版，Academic Press(1996)；《抗体实验指南》(Antibodies-A Laboratory Manual)，Cold Spring HarborLaboratory(1988)]。此外，也可以将用于纯化蛋白质的方法例如凝胶过滤、离子交换层析和超滤进行组合。
纯化的遗传重组抗体的H链、L链或整个抗体分子的分子量可以使用聚丙烯酰胺凝胶电泳[Nature，227，680(1970)]或Western印迹[《单克隆抗体原理与实践》(MonoclonalAntibodies-Principles and practice)第三版，Academic Press(1996)；《抗体实验指南》(Antibodies-A Laboratory Manual)，Cold Spring Harbor Laboratory(1988)]等来测量。
(9)产生抗体片段的方法
本发明的抗体片段可以按照已知方法来产生。本发明的抗体片段可以通过将按照上文(1)至(8)中描述的方法生产的抗体用酶等切割来产生，或者可以在制备编码所需抗体片段的核苷酸序列后通过遗传工程技术来产生。
(10)产生单价抗体的方法
在本发明中，单价抗体可以通过在WO 2014/054804、WO 2011/090754、WO 2007/048037、WO 2012/116927等中描述的方法或另一种方法来产生。
(11)产生双特异性抗体或多特异性抗体的方法
本发明的双特异性抗体或多特异性抗体可以按照上述用于产生抗体的方法来产生。例如，所述双特异性抗体或多特异性抗体可以使用在WO 2009/131239、WO 2014/054804、WO 01/077342、美国专利申请公布号2007/0071675、WO 2007/024715、Wu等[NatureBiotechnology，2007，25(11)，pp.1290-1297]、Labrijn等[PNAS 2013，vol.110，no.13，pp.5145-5150]、Jong等[http：//dx.doi.org/10.1371/journal.pbio.1002344]、Kontermann等[mAbs 2012，vol.4，issue 2，pp.182-197]、Spiess等[MolecularImmunology 67(2015)95-106]、Ridgway等[Protein engineering，1996vol.9no.7pp.617-621]、WO 2009/080251、WO 2010/151792、WO 2014/033074等中描述的方法来产生。
例如，用于其中与CADM3结合的scFv被融合到与脑中存在的抗原结合的IgG抗体的C-端的双特异性抗体的表达载体可以通过下述方法来产生，并且所述双特异性抗体可以按照上述用于表达抗体的方法和用于纯化抗体的方法来生产。此外，其中抗体片段被融合到抗体的C-端的双特异性抗体也可以以相同的方式来生产。
使用与脑中存在的抗原结合的IgG抗体的重链恒定区的合成基因作为模板，通过PCR方法扩增CH1-铰链-CH2-CH3-连接物区的基因片段。随后，使用与CADM3结合的抗体的核苷酸序列作为模板，使用PCR方法等制备其中抗体的VH和VL用适合的连接物相连的scFv区的核苷酸序列。将所述两个区域通过PCR方法等相连，并将得到的基因片段插入到适合的载体例如pCI载体中。
此外，使用适合的模板通过PCR方法分别扩增与脑中存在的抗原结合的IgG抗体的轻链结构域(VL和CL)的基因片段和所述抗体的VH的基因片段，并将其插入到所述载体的适合位置处。
此外，本发明的双特异性抗体也可以通过用化学方法将包含抗原结合位点的抗体片段与IgG抗体相连来产生。
3.抗体或其抗体片段的活性的评估
在本发明中，抗体或其抗体片段的活性可以如下进行评估。
(1)与CADM3的结合活性
本发明的抗体或其抗体片段与CADM3的结合活性使用在上文1-(6)中描述的流式细胞术、ELISA或表面等离子体共振检测等来测量。另外，所述结合活性也可以使用荧光抗体方法[Cancer Immunol.Immunother.，36，373(1993)]来测量。
当本发明的抗体或其抗体片段是与CADM3结合的单价抗体时，所述单价抗体与CADM3的结合活性也可以以相同的方式来测量。当本发明的抗体或其抗体片段是与CADM3和脑中存在的抗原结合的双特异性抗体或多特异性抗体时，所述双特异性抗体或多特异性抗体与CADM3或脑中存在的抗原的结合活性也可以以相同的方式来测量。
(2)在脑中积累的性质的测量方法
本发明的抗体或其抗体片段在脑中积累的性质可以通过下述方法来测量。
实例是下述方法：在将所述抗体或其抗体片段给药到动物后几天收集脑组织，将所述脑组织匀浆并离心，然后测量得到的上清液中所述抗体或其抗体片段的浓度，并计算每单位脑重量的所述抗体或其抗体片段的量的方法；使用收集的脑组织，通过已知的免疫学方法检测所述抗体或其抗体片段的存在的方法；等等。此外，实例是将用可药用标记物标记的所述抗体或其抗体片段给药到动物，并通过体内成像系统随时间检测所述抗体或其抗体片段的存在的方法等。
作为用于评估所述在脑中积累的性质的动物，可以根据本发明的抗体或其抗体片段的用途来选择适合的动物。
(3)抗体依赖性细胞毒性活性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性活性(CDC)的测量方法
本发明的抗体或其抗体片段对表达人类CADM3的细胞或表达CADM3和脑中存在的抗原的细胞的CDC或ADCC，可以通过已知的测量方法来测量[CancerImmunol.Immunother.，36，373(1993)；《免疫学现代方法》(Current protocols inImmunology)第7章，《人类中的免疫学研究》(Immunologic studies in humans)，John E，Coligan等主编，John Wiley&Sons，Inc.，(1993)]。
4.控制抗体或抗体片段的效应物活性的方法
作为控制本发明的抗体或其抗体片段的效应物活性的方法，已知的有：控制与N-连接的复合聚糖的还原端处存在的N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)结合的α1，6-岩藻糖(也被称为核心岩藻糖)的量的方法，所述N-连接的复合聚糖与所述抗体或其包含Fc的抗体片段的Fc区中第297位处的天冬酰胺(Asn)结合(WO 2005/035586、WO 2002/31140、WO 00/61739)；通过修饰所述抗体或其抗体片段的Fc区中的氨基酸残基而进行控制的方法；等等。本发明的抗体或其抗体片段的效应物活性可以使用所述方法中的任一者来控制。
所述效应物活性是指通过抗体或其抗体片段的Fc区引起的抗体依赖性活性，并且已知的有ADCC、CDC、由吞噬细胞例如巨噬细胞或树突状细胞引起的抗体依赖性细胞吞噬作用(ADP)等。
作为效应物活性的测量方法，例如将靶细胞、作为效应物的人类外周血单核细胞(PBMC)和靶细胞特异性抗体或其抗体片段混合，然后温育约4小时，随后可以测量释放出的乳酸脱氢酶(LDH)作为细胞毒性的指标。另外，效应物活性也可以通过
抗体或包含Fc的抗体片段的效应物活性可以通过控制抗体的Fc的N-连接的复合聚糖中核心岩藻糖的含量来提高或降低。作为用于降低与结合到抗体或其抗体片段的Fc上的N-连接的复合聚糖结合的岩藻糖的含量的方法，可以通过使用α1，6-岩藻糖基转移酶基因缺陷的CHO细胞表达抗体或其抗体片段，来获得未结合岩藻糖的抗体或其抗体片段。所述未结合岩藻糖的抗体或其抗体片段具有高的ADCC。
另一方面，作为用于提高与结合到抗体或其抗体片段的Fc上的N-连接的复合聚糖结合的岩藻糖的含量的方法，可以通过使用引入有α1，6-岩藻糖基转移酶基因的宿主细胞表达抗体或其抗体片段，来获得结合有岩藻糖的抗体或其抗体片段。所述结合有岩藻糖的抗体或其抗体片段与未结合岩藻糖的抗体或其抗体片段相比具有更低的ADCC。
此外，通过修饰所述抗体或其抗体片段的Fc区中的氨基酸序列，可以提高或降低ADCC或CDC。例如，使用在美国专利申请公布号2007/0148165中描述的Fc区的氨基酸序列，可以提高所述抗体或其抗体片段的CDC。
另外，通过进行美国专利号6,737,056、美国专利号7,297,775或美国专利号7,317,091中描述的氨基酸修饰，可以提高或降低ADCC或CDC。
此外，本发明的抗体或其抗体片段还包含通过控制与Fc受体的反应性来控制在血液中的半衰期的抗体或其抗体片段，所述控制例如依照上述抗体或其抗体片段中包含的恒定区中的氨基酸修饰或聚糖修饰，通过在JP-A-2013-165716、JP-A-2012-021004等中描述的氨基酸修饰来实现。
此外，通过将上述方法组合并用于一种抗体或其抗体片段，可以获得效应物活性或在血液中的半衰期受控的抗体或其抗体片段。
5.使用本发明的抗体或其抗体片段治疗疾病的方法
本发明的抗体或其抗体片段可用于治疗在脑中表达CADM3的动物的脑部疾病。
所述脑部疾病的实例包含阿兹海默氏病、阿兹海默氏病的前驱期、亨廷顿氏病、帕金森氏病、脑肿瘤、多发性硬化症、肌营养不良症、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、多系统萎缩症、进行性核上性麻痹、黑质纹状体变性、橄榄体脑桥小脑萎缩、脊髓延髓性肌肉萎缩、脊髓小脑变性、脑血管障碍、癫痫、偏头痛、多动症、克雅病、皮质基底节变性、溶酶体贮积病、抑郁症、肌张力障碍等。
可以使用本发明的抗体或其抗体片段治疗的脑部疾病根据本发明的抗体或其抗体片段所结合的抗原、在本发明的融合抗体或其融合抗体片段中修饰所述抗体或其抗体片段的分子的类型等而有所不同。
包含本发明的抗体或其抗体片段的治疗剂可以是只包含所述抗体或其抗体片段作为活性成分的治疗剂，但通常，所述治疗剂作为使用制药学技术领域中已知的方法通过与一种或多种可药用载体混合而生产的药物制剂提供。
给药途径的实例包含口服给药或肠胃外给药例如口内、气道内、直肠内、皮下、肌肉内、脑室内、腹膜内给药、真皮内给药、鼻内给药、鞘内给药或静脉内给药。剂型的实例包含喷雾剂、胶囊、片剂、粉剂、颗粒剂、糖浆、乳液、栓剂、注射剂、软膏、胶带等。
适合于口服给药的制剂的实例包含乳液、糖浆、胶囊、片剂、粉剂、颗粒剂等。
液体制剂例如乳液或糖浆使用水、糖类例如蔗糖、山梨糖醇或果糖、二醇类例如聚乙二醇或丙二醇、油类例如芝麻油、橄榄油或大豆油、防腐剂例如对羟基苯甲酸酯、调味剂例如草莓调味剂或胡椒薄荷等作为添加剂来生产。
胶囊、片剂、粉剂、颗粒剂等使用赋形剂例如乳糖、葡萄糖、蔗糖或甘露糖醇、崩解剂例如淀粉或藻酸钠、润滑剂例如硬脂酸镁或滑石、粘合剂例如聚乙烯醇、羟丙基纤维素或明胶、表面活性剂例如脂肪酸酯、增塑剂例如甘油等作为添加剂来生产。
适合于肠胃外给药的制剂的实例包含注射剂、栓剂、喷雾剂等。注射剂使用由盐溶液、葡萄糖溶液或两种溶液的混合物等构成的载体来生产。栓剂使用载体例如可可脂、氢化脂肪或羧酸来生产。
喷雾剂使用不刺激接受者的颊或气道粘膜并且将本发明的抗体或其抗体片段分散为细小粒子以便促进其吸收的载体等来生产。作为所述载体，使用例如乳糖、甘油等。此外，喷雾剂也可以作为气溶胶或干粉生产。此外，作为适合于口服给药的制剂的添加剂而示例的组分，也可以添加到上述肠胃外制剂中。
6.使用本发明的抗体或其抗体片段检测或测量脑中存在的抗原的方法或诊断疾病的方法
通过使用本发明的抗体或其抗体片段，可以检测或测量CADM3或CADM3和脑中存在的抗原。此外，通过检测或测量CADM3或CADM3和脑中存在的抗原，可以诊断在脑中表达CADM3的动物的脑部疾病。
所述脑部疾病的实例包含阿兹海默氏病、阿兹海默氏病的前驱期、亨廷顿氏病、帕金森氏病、脑肿瘤、多发性硬化症、肌营养不良症、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、多系统萎缩症、进行性核上性麻痹、黑质纹状体变性、橄榄体脑桥小脑萎缩、脊髓延髓性肌肉萎缩、脊髓小脑变性、脑血管障碍、癫痫、偏头痛、多动症、克雅病、皮质基底节变性、溶酶体贮积病、抑郁症、肌张力障碍等，然而，可以使用本发明的抗体或其抗体片段诊断的脑部疾病根据本发明的抗体或其抗体片段所结合的抗原、在本发明的融合抗体或其融合抗体片段中修饰所述抗体或其抗体片段的分子的类型等而有所不同。
在脑中表达CADM3的动物的脑部疾病，可以例如通过使用免疫学方法检测或测量在患者或患病动物的脑中存在的CADM3来诊断。此外，所述脑部疾病可以通过使用免疫学方法例如流式细胞术检测在患者或患病动物的脑中的细胞中表达或存在的CADM3来诊断。
当使用与CADM3结合的单价抗体作为本发明的抗体或其抗体片段时，脑中的CADM3可以以与上述相同的方式来测量。当使用与CADM3和脑中存在的抗原结合的双特异性抗体或多特异性抗体作为本发明的抗体或其抗体片段时，脑中的CADM3或脑中存在的抗原可以以与上述相同的方式来检测或测量。
所述免疫学方法是使用标记的抗原或抗体等检测或测量抗体量或抗原量的方法。例如，使用放射活性物质标记的免疫抗体法、酶免疫测定法、荧光免疫测定法、发光免疫测定法、Western印迹法、物理化学方法等。
在所述放射活性物质标记的免疫抗体法中，例如允许本发明的抗体或其抗体片段与抗原或表达抗原的细胞等进行反应，然后进一步允许经历放射性标记的抗免疫球蛋白抗体或其抗体片段与其反应，然后使用闪烁计数器等进行测量。
在所述酶免疫测定法中，例如允许本发明的抗体或其抗体片段与抗原或表达抗原的细胞等进行反应，然后进一步允许经历酶等的标记的抗免疫球蛋白抗体或其抗体片段与其反应，然后添加底物并使用吸收光度计测量反应溶液的吸光度。例如，使用夹心ELISA法等。作为在酶免疫测定法中使用的标记物质，可以使用已知的[Enzyme ImmunoassayMethod，Igaku-Shoin Ltd.(1987)]酶标记物。
例如，使用碱性磷酸酶标记物、过氧化物酶标记物、萤光素酶标记物、生物素标记物等。所述夹心ELISA法是在将抗体结合到固相后，捕获待检测或测量的抗原，然后允许第二抗体与所述被捕获的抗原反应的方法。
在所述ELISA方法中，制备识别需要被检测或测量的抗原并具有不同抗原识别位点的两种类型的抗体，其中第一抗体被事先吸附在板(例如96孔板)上，接下来将第二抗体预先用荧光物质例如FITC、酶例如过氧化物酶或生物素等标记。
允许从活生物体分离的细胞或其匀浆液、组织或其匀浆液、细胞培养上清液、血清、胸腔积液、腹水、眼内液等与吸附有所述第一抗体的板反应，然后允许所述第二抗体反应，随后根据标记物质进行检测反应。从通过将已知浓度的抗原连续稀释而制作的校准曲线来计算测试样品中的抗原浓度。
作为在夹心ELISA法中使用的抗体，可以使用多克隆抗体或单克隆抗体中的任一者。此外，可以使用抗体片段例如Fab、Fab’或F(ab)
在所述荧光免疫测定法中，通过文献中描述的方法[《单克隆抗体原理与实践》(Monoclonal Antibodies-Principles and practice)第三版，Academic Press(1996)；《单克隆抗体实验手册》(Manual for monoclonal antibody experiments)，Kodanshascientific books(1987)]等进行测量。作为在荧光免疫测定法中使用的标记物质，可以使用已知的[《荧光抗体方法》(Fluorescent Antibody Method)，Soft Science，Inc.(1983)]荧光标记物。例如，使用FITC、RITC等。
在所述发光免疫测定法中，通过文献中描述的方法[《生物发光和化学发光》(Bioluminescence and Chemiluminescence)，Clinical Test 42，Hirokawa-Shoten Ltd.(1998)]等进行测量。作为在发光免疫测定法中使用的标记物质，实例是已知的发光标记物，并且使用吖啶酯、洛粉碱等。
在所述Western印迹法中，在通过SDS(十二烷基硫酸钠)-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶)[《抗体实验指南》(Antibodies-A Laboratory Manua)，Cold Spring Harbor Laboratory(1988)]将抗原、表达抗原的细胞等分级后，将凝胶转印到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜或硝酸纤维素膜上，允许识别所述抗原的抗体或其抗体片段与所述膜反应，并进一步允许已经历荧光物质例如FITC标记、酶例如过氧化物酶标记、生物素标记等的抗小鼠IgG抗体或结合片段与其进行反应，然后将所述标记物可视化，由此进行测量。实例在下文示出。
将表达具有CADM3的氨基酸序列的多肽的细胞或组织裂解，在还原条件下通过SDS-PAGE方法对每道0.1至30μg的蛋白量进行电泳。将所述电泳后的蛋白质转移到PVDF膜并允许与BSA-PBS在室温下反应30分钟，以进行阻断操作。
此时，允许本发明的抗体或其抗体片段进行反应，将所述膜用包含0.05至0.1％聚氧乙烯失水山梨糖醇单月桂酸酯(Tween 20)的PBS(在后文中被称为Tween-PBS)清洗并允许其与过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG抗体在室温反应2小时。
通过用Tween-PBS清洗并使用ECL Western印迹检测试剂(由Amersham，Inc.制造)等检测结合有本发明的抗体或其抗体片段的条带，检测到具有CADM3的氨基酸序列的多肽。
作为利用Western印迹的检测中使用的抗体或其抗体片段，使用能够与不保留天然构象的多肽结合的抗体或其抗体片段。
物理化学方法例如通过使作为抗原的CADM3与本发明的抗体或其抗体片段结合以形成聚集体并检测所述聚集体来进行。作为另一种物理化学方法，还可以使用毛细管法、一维免疫扩散法、免疫比浊法、胶乳免疫比浊法[《临床检查方法提要》(Outline of ClinicalExamination Method)，KANEHARA&Co.，LTD.(1998)]等。
在所述胶乳免疫比浊法中，当使用粒径为约0.1-1μm的用抗体或抗原致敏的聚苯乙烯胶乳等载体来引起与相应的抗原或抗体的抗原-抗体反应时，反应溶液中的散射光增加，透射光减少。通过以吸光度或积分球浊度的形式检测这种变化，来测量测试样品中的抗原浓度等。
对于表达CADM3的细胞的检测或测量来说，可以使用已知的免疫学检测方法，但具体来说，优选地使用免疫沉淀法、免疫细胞化学染色法、免疫组织化学染色法、荧光抗体染色法等。
在所述免疫沉淀法中，在允许表达CADM3的细胞等与本发明的抗体或其抗体片段反应后，向其添加与免疫球蛋白具有特异性结合活性的载体例如蛋白G-琼脂糖凝胶来沉淀抗原-抗体复合物。或者，所述方法也可以通过下述方法来进行。
将上述本发明的抗体或其抗体片段固定化到用于ELISA的96孔板上，然后用BSA-PBS阻断。当所述抗体处于例如未纯化状态下例如是杂交瘤培养上清液时，将抗小鼠免疫球蛋白抗体、抗大鼠免疫球蛋白抗体、蛋白A、蛋白G等预先固定化在用于ELISA的96孔板上，然后用BSA-PBS阻断，然后分发所述杂交瘤培养上清液并进行结合。
接下来，舍弃BSA-PBS，将板用PBS充分清洗，然后允许表达人类CAMD3的细胞或组织的裂解液与其进行反应。从充分清洗后的板用SDS-PAGE用样品缓冲液提取免疫沉淀物，然后通过上述Western印迹法进行检测。
所述免疫细胞染色法或免疫组织化学染色法是包含下述步骤的方法：在某些情况下将表达抗原的细胞或组织等用表面活性剂或甲醇等处理，以增加所述抗体的透过性，然后允许其与本发明的抗体反应，并进一步允许其与用FITC等荧光标记、用酶例如过氧化物酶标记或用生物素标记等的抗免疫球蛋白抗体或其结合片段进行反应，然后将所述标记物可视化，然后用显微镜观察。
此外，检测也可以通过荧光抗体染色法进行，其中允许荧光标记的抗体与细胞反应并使用流式细胞仪进行分析[《单克隆抗体原理与实践》(Monoclonal Antibodies-Principles and practice)第三版，Academic Press(1996)；《单克隆抗体实验手册》(Monoclonal Antibody Experimental Manual)，Kodansha scientific books(1987)]。具体来说，本发明的抗体或其抗体片段能够利用荧光抗体染色法检测表达保留天然构象的检测靶的细胞。
此外，当在荧光抗体染色法中使用FMAT 8100 HTS系统(由Applied Biosystems，Inc.制造)等时，可以在不将形成的抗体-抗原复合物与不参与所述抗体-抗原复合物形成的游离抗体或抗原分离的情况下测量抗原量或抗体量。
在下文中将利用实施例更具体地描述本发明，然而，本发明不限于下述实施例。
实施例
[实施例1]抗CADM3抗体的获得
(1)使用羊驼抗体文库获得抗体
使用在下述实施例4中产生的hCADM3-FLAG_Fc和mCADM3-FLAG_Fc作为免疫原，用TiterMax(由TiterMax USA，Inc.制造)生产用于第一次免疫接种的乳液，用不完全佐剂(由BD company制造)生产用于第二至第五次免疫接种的乳液，并用它们免疫接种羊驼。
从被免疫的羊驼的血液(50mL)收集淋巴细胞(2×10
将得到的转化体用M13KO7辅助噬菌体(由Invitrogen，Inc.制造)感染，由此获得VHH基因的羊驼抗体M13噬菌体文库。
使用所述羊驼抗体M13噬菌体文库，使用下述生物淘选法获得抗CADM3抗体。将下文描述的实施例4的hCADM3-GST固定化在免疫管上，并将所述管用0.5％BSA阻断。允许所述羊驼抗体M13噬菌体文库与所述管在室温反应1小时，并用PBS-T进行清洗，然后将噬菌体用0.1mol/L甘氨酸-盐酸缓冲液(Gly-HCl)(pH2.7)洗脱。通过添加三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液(Tris-HCl)(pH9.1)将所述洗脱液中和。用洗脱的噬菌体感染大肠杆菌TG1，并扩增所述噬菌体。
随后，允许所述噬菌体与固定化在免疫管上的mCADM3-GST反应，然后清洗并洗脱。进一步地，允许所述噬菌体与固定化在免疫管上的hCADM3-GST反应，然后清洗并洗脱，由此将展示与hCADM3-GST和mCADM3-GST特异性结合的VHH的噬菌体浓缩。将所述浓缩的噬菌体单克隆化，并通过ELISA选出对hCADM3-GST和mCADM3-GST具有亲和性的克隆。
在所述ELISA中，将hCADM3-GST和mCADM3-GST固定化(50ng/50μL)在MAXISORP(由NUNC，Inc.制造)上，然后用0.5％BSA阻断。向每个孔添加每个噬菌体克隆并允许其在室温下反应1小时，随后将每个孔用PBS-T清洗5次。随后，以50μL的量向每个孔添加生物素标记的抗M13噬菌体抗体(由Abcam plc制造)和辣根过氧化物酶标记的链亲合素(由VectorCo.，Ltd.制造)，然后在室温下温育1小时。
在将微孔板用PBS-T清洗后，向每个孔添加3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)产色底物溶液(由Calbiochem，Inc.制造)，然后在室温下温育。通过向每个孔添加1mol/L盐酸来终止显色反应，并使用微孔板读板器测量在450nm波长处的吸光度(参比波长：570nm)。
对结合到hCADM3-GST和mCADM3-GST的克隆进行序列分析，并获得下述抗CADM3VHH抗体：iCADM3_3R1-L5，iCADM3_3R1-L8，iCADM3_3R1-L10和iCADM3_3R1-L11。编码各种不同类型的抗CADM3抗体的VHH的核苷酸序列和从所述核苷酸序列推定的氨基酸序列示出在表1中。
[表1]
(2)利用人类抗体噬菌体文库获得抗体
通过PCR从源自于人类PBMC的cDNA扩增VH基因片段和VL基因片段。将所述VH基因片段和VL基因片段分别插入到噬菌粒载体pCANTAB 5E(由Amersham Pharmacia Biotech，Inc.制造)中，并通过转化大肠杆菌TG1(由Lucigen Corporation制造)获得质粒。将所述得到的质粒用M13KO7辅助噬菌体(由Invitrogen，Inc.制造)感染，由此获得VH基因和VL基因的人类抗体M13噬菌体文库。
利用所述人类抗体M13噬菌体文库，使用下述噬菌体展示方法获得抗CADM3单克隆抗体。将下文描述的实施例4的hCADM3-FLAG_Fc、rCADM3-FLAG_Fc或mCADM3-FLAG_Fc固定化在MAXISORP STARTUBE(由NUNC，Inc.制造)上，然后使用SuperBlock阻断缓冲液(由ThermoFisher Scientific，Inc.制造)阻断。
允许所述人类抗体M13噬菌体文库与所述管在室温下反应1小时，并使用PBS或PBS-T进行清洗，随后将噬菌体用0.1mol/L Gly-HCl(pH 2.2)洗脱。通过添加Tris-HCl(pH8.5)将所述洗脱液中和。用所述洗脱的噬菌体感染TG1感受态细胞，并扩增所述噬菌体。
随后，允许所述噬菌体再次与固定化在MAXISORP STARTUBE上的hCADM3-FLAG_Fc、rCADM3-FLAG_Fc或mCADM3-FLAG_Fc进行反应，然后清洗并洗脱。重复这个程序以浓缩展示与hCADM3-FLAG_Fc、rCADM3-FLAG_Fc和mCADM3-FLAG_Fc特异性结合的scFv的噬菌体。将所述浓缩的噬菌体单克隆化，并通过ELISA选出对CADM3具有亲和性的克隆。
在所述ELISA中，将hCADM3-FLAG_Fc、rCADM3-FLAG_Fc和mCADM3-FLAG_Fc固定化在MAXISORP(由NUNC，Inc.制造)上，然后使用SuperBlock阻断缓冲液(由Thermo FisherScientific，Inc.制造)阻断。作为阴性对照，也制备了其上固定有Fc的板。
向每个孔添加各个噬菌体克隆，允许其在室温反应30分钟，然后将每个孔用PBS-T清洗。随后，向每个孔添加用包含10％Block Ace(由Dainippon Pharmaceutical Co.，Ltd.制造)的PBS-T稀释用辣根过氧化物酶标记的抗M13抗体(由GE Healthcare，Inc.制造)而获得的溶液，并在室温下温育30分钟。
在将所述微孔板用PBS-T清洗3次后，向其添加TMB产色底物溶液(由DAKO，Inc.制造)，然后在室温下温育。通过向每个孔添加0.5mol/L硫酸来终止所述显色反应，并使用微孔板读板器测量450nm波长处的吸光度(参比波长：570nm)。
对使用CADM3-FLAG_Fc通过淘选获得的克隆进行序列分析，并获得分别编码CADM301、CADM3102、CADM3219、CADM3301、CADM3309、CADM3312、CADM3314、CADM3316、CADM3349、CADM3351、CADM3402、CADM3404、CADM3432、CADM3448、CADM3458或CADM3501的噬菌粒载体。
编码各种不同类型的抗CADM3抗体的VH或VL的核苷酸序列和从所述核苷酸序列推定的氨基酸序列示出在表2A和表2B中。
[表2A]
[实施例2]抗体的生产
(1)CADM3 VHH-hG4PE(R409K)表达载体的构建
构建了用于生产VHH-Fc抗体的表达载体，在所述抗体中每个抗CADM3 VHH抗体被连接到包含根据EU编号S228P、L235E和R409K的氨基酸残基替换的人类IgG4抗体(在后文中有时被简称为“IgG4变体”)的Fc区。
分别使用iCADM3_3R1-L5、iCADM3_3R1-L8、iCADM3_3R1-L10和iCADM3_3R1-L11的VHH的合成基因作为模板，通过PCR扩增了VHH区的基因片段。使用重链恒定区的合成基因作为模板，通过PCR扩增了铰链-CH2-CH3区的基因片段。将所述得到的基因片段插入到pCI载体(由Promega，Inc.制造)中，由此产生pCI_iCADM3_3R1-L5VHH-hG4PE(R409K)载体。
以相同的方式产生其中插入有表1中示出的各种不同类型的抗CADM3抗体中的每一者的VHH区的基因片段的抗体表达载体，并分别命名为pCI_iCADM3_3R1-L8 VHH-hG4PE(R409K)载体、pCI_iCADM3_3R1-L10 VHH-hG4PE(R409K)载体和pCI_iCADM3_3R1-L11 VHH-hG4PE(R409K)载体。
(2)CADM3 scFv-hG4PE(R409K)表达载体的构建
构建了用于生产其中抗CADM3抗体的抗体可变区被连接到人类IgG4变体的Fc区的scFv-Fc抗体的表达载体。使用在实施例1(2)中获得的编码CADM301的噬菌体载体作为模板，通过PCR扩增了scFv区的基因片段。使用重链恒定区的合成基因作为模板，通过PCR扩增了铰链-CH2-CH3区的基因片段。
将所述得到的基因片段插入到N5载体(由IDEC，Inc.制造)中，由此产生N5_CADM301 scFv-hG4PE载体。使用在实施例1(2)中获得的编码CADM3102的噬菌体载体作为模板，产生了N5_CADM3102 scFv-hG4PE载体。
(3)CADM3 hG4PE(R409K)表达载体的构建
分别使用在实施例1(2)中获得的编码CADM3219、CADM3301、CADM3309、CADM3312、CADM3314、CADM3316、CADM3349、CADM3351、CADM3402、CADM3404、CADM3432、CADM3448、CADM3458或CADM3501的噬菌粒载体作为模板，通过PCR扩增了每个可变区的基因片段。将每个得到的基因片段插入到pCI载体(由Promega，Inc.制造)中，由此分别产生pCI-hKG4PE(R409K)_CADM3219、pCI-hKG4PE(R409K)_CADM3301、pCI-hKG4PE(R409K)_CADM3309、pCI-hKG4PE(R409K)_CADM3312、pCI-hKG4PE(R409K)_CADM3314、pCI-hKG4PE(R409K)_CADM3316、pCI-hKG4PE(R409K)_CADM3349、pCI-hKG4PE(R409K)_CADM3351、pCI-hKG4PE(R409K)_CADM3402、pCI-hKG4PE(R409K)_CADM3404、pCI-hKG4PE(R409K)_CADM3432、pCI-hKG4PE(R409K)_CADM3448、pCI-hKG4PE(R409K)_CADM3458和pCI-hKG4PE(R409K)_CADM3501。
(4)pCI_AVM-hLG4PE(R409K)-CADM3 VHH载体的构建
构建了用于生产其中两个抗CADM3 VHH抗体被连接到抗AVM-IgG4抗体的C-端一侧的抗AVM-IgG4-CADM3 VHH双特异性抗体的表达载体。使用抗AVM抗体的可变区作为模板，通过PCR扩增了VL和VH区的基因片段，并使用合成基因作为模板，通过PCR扩增了CL和CH1-铰链-CH2-CH3-连接物区的基因片段。此外，分别使用iCADM3_3R1-L5、iCADM3_3R1-L8、iCADM3_3R1-L10和iCADM3_3R1-L11的VHH的合成基因作为模板，通过PCR扩增了VHH区的基因片段。
将所述得到的基因片段插入到pCI载体(由Promega，Inc.制造)中，由此产生了pCI_AVM-hLG4PE(R409K)-iCADM3_3R 1-L5 VHH载体、pCI_AVM-hLG4PE(R409K)-iCADM3_3R1-L8 VHH载体、pCI_AVM-hLG4PE(R409K)-iCADM3_3R1-L10 VHH载体和pCI_AVM-hLG4PE(R409K)-iCADM3_3R1-L11 VHH载体。
所述抗体表达载体的名称、编码所述抗体的重链或轻链的核苷酸序列以及从所述核苷酸序列推定的氨基酸序列示出在表3中。
[表3]
(5)抗阿维菌素抗体表达载体和pCI_AVM-hLG4PE(R409K)_AVMscFv5载体的构建
产生了嵌合抗阿维菌素(AVM)抗体作为阴性对照抗体。将SD大鼠用AVM免疫接种，并通过常规方法建立产抗AVM抗体的杂交瘤。使用源自于所述杂交瘤的可变区作为模板，通过PCR扩增了VL和VH的基因片段。将编码人类IgG的λ链恒定区的合成的核苷酸序列和所述扩增的可变区插入到N5KG4PE载体(在WO 2002/088186中描述)中，由此产生表达载体N5LG4PE_AVM。
使用合成基因作为模板，通过PCR扩增了CL和CH1-铰链-CH2-CH3-连接物区的基因片段。此外，使用N5LG4PE_AVM作为模板，通过PCR扩增了AVM的VH和VL的基因片段。将所述得到的基因片段插入到pCI载体(由Promega，Inc.制造)中，由此产生了pCI_AVM-hLG4PE(R409K)-AVMscFv5载体。
(6)抗体的制备
使用Expi293(商标)表达系统(由Thermo Fisher Scientific，Inc.制造)，将抗体表达质粒载体引入到Expi293F细胞(由Thermo Fisher Scientific，Inc.制造)中，并对所述细胞进行培养，以在瞬时表达系统中表达所述抗体。在所述载体引入后3至4天收集培养上清液，并通过孔径为0.22μm的膜滤器(由Merck Millipore Corporation制造)进行过滤。使用蛋白A树脂(MabSelect SuRe，由GE Healthcare Biosciences，Inc.制造)对该培养上清液中的抗体蛋白进行亲和纯化。
使用磷酸盐缓冲液作为洗脱液。将吸附在蛋白A上的蛋白质用20mmol/L柠檬酸钠和50mmol/L NaCl缓冲液(pH 3.4)洗脱，并收集在包含1mol/L Tris-HCl(pH 8.0)的管中。随后，通过使用Amicon Ultra(由Merck Millipore Corporation制造)的超滤和NAP柱(由GE Healthcare Biosciences，Inc.制造)，将所述洗脱液中的溶剂用PBS替换，然后将得到的溶液通过孔径为0.22μm的膜滤器(由Merck Millipore Corporation制造)过滤除菌。测量所述抗体溶液在280nm处的吸光度，并计算纯化的抗体的浓度。
通过表达在实施例2(1)中产生的载体而获得的抗CADM3VHH-Fc抗体分别被命名为iCADM3_3R1-L5 VHH-hG4PE(R409K)、iCADM3_3R1-L8 VHH-hG4PE(R409K)、iCADM3_3R1-L10VHH-hG4PE(R409K)和iCADM3_3R1-L11 VHH-hG4PE(R409K)。
通过表达在实施例2(2)中产生的载体而获得的抗CADM3 scFv-Fc抗体分别被命名为CADM301 scFv-hG4PE和CADM3102 scFv-hG4PE。
通过表达在实施例2(3)中产生的载体而获得的抗CADM3抗体分别被命名为CADM3219-hG4PE、CADM3301-hG4PE、CADM3309-hG4PE、CADM3312-hG4PE、CADM3314-hG4PE、CADM3316-hG4PE、CADM3349-hG4PE、CADM3351-hG4PE、CADM3402-hG4PE、CADM3404-hG4PE、CADM3432-hG4PE、CADM3448-hG4PE、CADM3458-hG4PE和CADM3501-hG4PE。
通过表达在实施例2(4)中产生的pCI_AVM-hLG4PE(R409K)-iCADM3_3R1-L5 VHH载体、pCI_AVM-hLG4PE(R409K)-iCADM3_3R1-L8 VHH载体、pCI_AVM-hLG4PE(R409K)-iCADM3_3R1-L10 VHH载体和pCI_AVM-hLG4PE(R409K)-iCADM3_3R1-L11 VHH载体而获得的抗AVM-IgG4-CADM3 VHH双特异性抗体分别被命名为AVM IgG4PE(R409K)_iCADM3_3R1-L5 dVHH、AVM IgG4PE(R409K)_iCADM3_3R1-L8 dVHH、AVM IgG4PE(R409K)_iCADM3_3R1-L10 dVHH和AVM IgG4PE(R409K)_iCADM3_3R1-L11 dVHH。
此外，通过表达在实施例2(5)中产生的N5LG4PE_AVM而获得的抗AVM-IgG4抗体和通过表达在实施例2(4)中产生的pCI_AVM-hLG4PE(R409K)-AVMscFv5载体而获得的抗AVM-IgG4-AVM dscFv双特异性抗体分别被命名为抗AVM抗体和AVM IgG4PE(R409K)_AVMdscFv5。
[实施例3]与CADM3表达细胞的反应性的分析
编码人类CADM3的核苷酸序列由SEQ ID NO：51表示，从所述核苷酸序列推定的氨基酸序列由SEQ ID NO：52表示，编码小鼠CADM3的核苷酸序列由SEQ ID NO：53表示，从所述核苷酸序列推定的氨基酸序列由SEQ ID NO：54表示，编码猴CADM3的核苷酸序列由SEQ IDNO：55表示，并且从所述核苷酸序列推定的氨基酸序列由SEQ ID NO：56表示。
合成了人类CADM3、小鼠CADM3和猴CADM3的全长基因序列，并将所述基因序列分别插入到pEF6/V5-His(由Thermo Fisher Scientific，Inc.制造)载体的BamHI-NotI位点中，由此产生下述用于各种不同类型的CADM3的膜表达的质粒载体：pEF6_人类CADM3，pEF6_小鼠CADM3和pEF6_食蟹猴CADM3。
使用FreeStyle(商标)293表达系统(由Thermo Fisher Scientific，Inc.制造)将所述各种不同类型的膜CADM3抗原表达载体分别引入到Expi293F细胞中，并对所述细胞进行培养，以在瞬时表达系统中表达所述膜抗原。使用所述细胞，按照下述程序通过荧光激活细胞分拣(FACS)方法分析在实施例2中产生的抗体与所述表达CADM3的细胞的反应性。
将Expi293F细胞、人类CADM3/Expi293F细胞、小鼠CADM3/Expi293F细胞和猴CADM3/Expi293F细胞分别悬浮在包含0.1％NaN
在离心(2000rpm，4℃，2分钟)后，除去上清液，向得到的沉淀物添加10μg/mL的在实施例2中获得的每种抗体以悬浮所述沉淀物，并将得到的悬液在冰上静置30分钟。在再次离心(2000rpm，4℃，2分钟)后，除去上清液，并将得到的沉淀物用SB清洗，然后向其添加1μg/mL RPE荧光标记的山羊抗人类抗体(由Southern Biotech，Inc.制造)，并将得到的混合物在冰上温育30分钟。
在用SB清洗后，将细胞悬浮在SB中，使用流式细胞仪FACS CANTO II(由Becton，Dickinson and Company制造)测量每种细胞的荧光强度。注意作为阴性对照，使用10μg/mL的抗AVM抗体。
分析检测结果，并使用几何平均值计算平均荧光强度(MFI)。另外，对于每种抗体的浓度为10μg/mL时的MFI来说，计算人类CADM3/Expi293F细胞与Expi293F细胞(母体细胞系)之间的MFI的比率(平均荧光强度比率)。
对于猴CADM3/Expi293F细胞和小鼠CADM3/Expi293F细胞来说，也通过相同的程序计算相对于Expi293F细胞(母体细胞系)的平均荧光强度比率，结果示出在表4中。
[表4]
正如表4中所示，在所有抗CADM3抗体的情况下，与作为阴性对照的抗AVM抗体相比平均荧光强度比率提高，并且所述抗CADM3抗体显示出与人类CADM3/Expi293F细胞、小鼠CADM3/Expi293F细胞和猴CADM3/Expi293F细胞的反应性(然而对于某些抗CADM3抗体来说，与猴CADM3/Expi293F细胞的反应性未评估)。因此，揭示出所述抗CADM3抗体识别并结合人类CADM3、小鼠CADM3或猴CADM3。
此外，对于AVM IgG4PE(R409K)_iCADM3_3R1-L5 dVHH、AVM IgG4PE(R409K)_iCADM3_3R1-L8 dVHH、AVM IgG4PE(R409K)_iCADM3_3R1-L10 dVHH和AVM IgG4PE(R409K)_iCADM3_3R1-L11 dVHH来说，也通过相同的程序分析了与Expi293F细胞、人类CADM3/Expi293F细胞和小鼠CADM3/Expi293F细胞的反应性，结果示出在表5中。
[表5]
正如在表5中所示，在所有抗体的情况下，与作为阴性对照的抗AVM抗体相比平均荧光强度比率提高，揭示出所述抗体与人类CADM3/Expi293F细胞和小鼠CADM3/Expi293F细胞反应。
[实施例4]可溶性CADM3抗原的生产
(1)结合有FLAG_Fc的CADM3的胞外结构域蛋白的生产
作为人类CADM3、小鼠CADM3或大鼠CADM3的可溶性抗原，通过下述方法生产了在C-端添加有FLAG_Fc的CADM3的胞外结构域蛋白。
将人类CADM3的胞外结构域的合成基因和FLAG_Fc的合成基因插入到INPEP4(由IDEC，Inc.制造)载体中，由此产生了用于表达在C-端一侧添加有FLAG_Fc的人类CADM3的胞外结构域的质粒载体：INPEP4-hCADM3-FLAG_Fc。编码hCADM3-FLAG_Fc的核苷酸序列由SEQID NO：57表示，从所述核苷酸序列推定的氨基酸序列由SEQ ID NO：58表示。
对于小鼠CADM3和大鼠CADM3来说，也以相同的方式产生了质粒载体INPEP4-mCADM3-FLAG_Fc和INPEP4-rCADM3-FLAG_Fc。编码mCADM3-FLAG_Fc的核苷酸序列由SEQ IDNO：59表示，从所述核苷酸序列推定的氨基酸序列由SEQ ID NO：60表示，编码rCADM3-FLAG_Fc的核苷酸序列由SEQ ID NO：61表示，并且从所述核苷酸序列推定的氨基酸序列由SEQ IDNO：62表示。
使用Expi293(商标)表达系统(由Thermo Fisher Scientific，Inc.制造)将INPEP4-hCADM3-FLAG_Fc、INPEP4-mCADM3-FLAG_Fc和INPEP4-rCADM3-FLAG_Fc分别引入到Expi293F细胞中，并对所述细胞进行培养以在瞬时表达系统中表达所述蛋白质，并将所述蛋白质以与实施例2中相同的方式进行纯化。溶液中纯化的人类、小鼠和大鼠CADM3-FLAG_Fc蛋白的浓度在280nm处的吸光度的基础上确定。
(2)结合有GST的CADM3的胞外结构域蛋白的生产
作为人类CADM3或小鼠CADM3的可溶性抗原，通过下述方法生产了在C-端添加有GST的CADM3的胞外结构域蛋白。
将人类或小鼠CADM3的胞外结构域的合成基因和GST的合成基因插入到N5载体(由IDEC，Inc.制造)中，由此产生了下述用于表达在C-端一侧添加有GST的人类和小鼠CADM3的胞外结构域的质粒载体：N5-hCADM3-GST和N5-mCADM3-GST。
编码hCADM3-GST的核苷酸序列由SEQ ID NO：63表示，从所述核苷酸序列推定的氨基酸序列由SEQ ID NO：64表示，编码mCADM3-GST的核苷酸序列由SEQ ID NO：65表示，并且从所述核苷酸序列推定的氨基酸序列由SEQ ID NO：66表示。
使用Expi293(商标)表达系统(由Thermo Fisher Scientific，Inc.制造)将N5-hCADM3-GST和N5-mCADM3-GST分别引入到Expi293F细胞中，并对所述细胞进行培养以在瞬时表达系统中表达所述蛋白质。在引入载体后3至4天收集培养上清液，并通过孔径为0.22μm的膜滤器(由Merck Millipore Corporation制造)过滤。
使用谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B(由GE Healthcare Biosciences，Inc.制造)对该培养上清液中的蛋白质进行亲和纯化。使用磷酸盐缓冲液作为清洗溶液。将吸附在谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B上的蛋白质用50mmol/L Tris-HCl和10mmol/L还原型谷胱甘肽(pH 8.0)洗脱。
随后，通过使用Amicon Ultra(由Merck Millipore Corporation制造)的超滤和NAP柱(由GE Healthcare Biosciences，Inc.制造)将所述溶液中的溶剂用PBS替换。将得到的溶液通过孔径为0.22μm的膜滤器(由Merck Millipore Corporation制造)过滤除菌。所述溶液中纯化的人类和小鼠CADM3-GST蛋白的浓度在280nm处的吸光度的基础上确定。
[实施例5]通过表面等离子体共振检测评估对CADM3的亲和性
使用Biacore T-100(GE Healthcare)测量在实施例2中产生的抗CADM3抗体对人类CADM3和小鼠CADM3的亲和性。使用人类抗体捕获试剂盒将每种抗体固定化在CM5传感器芯片上，并使用在实施例4中生产的hCADM3-GST和mCADM3-GST作为被分析物评估结合能力。
使用BIA评估软件分析得到的传感器图，并计算解离常数(K
[实施例6]在小鼠脑中的迁移能力的评估
(1)抗体量的测量
将每种抗体以9mg/kg体重的剂量通过尾静脉(i.v.)给药到小鼠，并在3天后收集血液。在收集血液的同一天，在麻醉下进行全身灌注，随后收集脑组织并测量其重量。进一步地，向收集的脑组织添加缓冲液，将脑组织匀浆，然后离心并收集在上清液中洗脱的抗体溶液。测量其体积，并且也使用AlphaLISA(由PerkinElmer，Inc.制造)测量抗体浓度，并计算每单位脑重量的抗体量。注意使用试剂盒随附的抗体产生标准曲线。
在抗体给药后3天血清中的抗体浓度示出在图1(A)中，脑组织中每单位脑重量的抗体量示出在图1(B)中。如图1(A)中所示，在抗体给药后3天抗CADM3 VHH-Fc抗体的血清浓度与阴性对照(抗AVM抗体)相比没有差异。另一方面，如图1(B)中所示，证实了下述每种抗CADM3 VHH-Fc抗体在脑中的抗体量与阴性对照相比提高约10倍：iCADM3_3R1-L5 VHH-hG4PE(R409K)，iCADM3_3R1-L8VHH-hG4PE(R409K)，和iCADM3_3R1-L10VHH-hG4PE(R409K)。
此外，在不同于上面描述的条件下执行试验方法，结果将在下文示出。
将阴性对照抗体(抗AVM抗体)、抗CADM3 VHH-Fc抗体iCADM3_3R1-L8以及抗CADM3抗体CADM3312hG4PE(R409K)、CADM3402 hG4PE(R409K)和CADM3501hG4PE(R409K)分别以5mg/kg的剂量通过尾静脉(i.v.)给药，并在7天后收集血液。在收集血液后，在麻醉下进行全身灌注，随后收集脑组织并测量其重量。向收集到的脑组织添加缓冲液，将脑组织匀浆，然后离心，并收集在上清液中洗脱的抗体溶液。测量其体积，并且也使用AlphaLISA(由PerkinElmer，Inc.制造)测量抗体浓度，并计算每单位脑重量的抗体量。注意使用每种抗体分别产生标准曲线。
在抗体给药后7天血清中的抗体浓度示出在图2(A)中，脑组织中每单位脑重量的抗体量示出在图2(B)中。如图2(A)中所示，在抗体给药后7天，CADM3 VHH-Fc抗体iCADM3_3R1-L8和抗CADM3抗体CADM3312hG4PE(R409K)、CADM3402 hG4PE(R409K)和CADM3501hG4PE(R409K)抗体中的每一者的血清浓度与阴性对照(抗AVM抗体)相比没有显著差异。另一方面，如图2(B)中所示，抗CADM3 VHH-Fc抗体iCADM3_3R1-L8和抗CADM3抗体CADM3312hG4PE(R409K)、CADM3402 hG4PE(R409K)和CADM3501 hG4PE(R409K)中的每一者在脑中的抗体量与抗AVM抗体相比提高。因此，提高脑中抗体量的效果得到确认。
随后，在不同于上面描述的条件下执行试验方法，结果将在下文示出。
将每种抗体以35nmol/kg体重的剂量通过尾静脉(i.v.)给药到小鼠，并在7天后收集血液。在收集血液的同一天，在麻醉下进行全身灌注，随后收集脑组织并测量其重量。然后，向收集到的脑组织添加缓冲液，将脑组织匀浆，然后离心，并收集在上清液中洗脱的抗体溶液。测量其体积，并且也使用AlphaLISA(由PerkinElmer，Inc.制造)测量抗体浓度，并计算每单位脑重量的抗体量。所述抗体浓度被表示成通过使用单克隆抗体的分子量(150kDa)从摩尔浓度转换而获得的值。注意使用每种抗体分别产生标准曲线。
AVM IgG4PE(R409K)_AVM dscFv5和AVM IgG4PE(R409K)_iCADM3_3R1-L8 dVHH各自在血清中的抗体浓度示出在图3(A)中，其脑组织中每单位脑重量的抗体量示出在图3(B)中。
如图3(B)中所示，证实了抗AVM-IgG4-CADM3 VHH双特异性抗体AVM IgG4PE(R409K)_iCADM3_3R1-L8 dVHH与作为双特异性抗体的阴性对照的抗AVM-IgG4-AVM dscFv双特异性抗体AVM IgG4PE(R409K)_AVM dscFv5相比在脑中的抗体量提高。因此，证实了与CADM3结合的双特异性抗体与不结合CADM3的双特异性抗体相比可以提高脑中的抗体量。
(2)成像分析
将抗CADM3 VHH-Fc抗体和阴性对照(抗AVM抗体)用Alexa FluorR 488蛋白质标记试剂盒(由Molecular Probes，Inc.制造)标记。将每种标记的抗体以9mg/kg体重的剂量通过尾静脉(i.v.)给药到小鼠，并在9天后收集血液。在收集血液后，在麻醉下进行全身灌注，随后收集脑组织，并使用IVIS光谱仪(由PerkinElmer，Inc.制造)测量荧光强度。
在抗体给药后9天脑的成像图像示出在图4(A)中。用给药的抗体的荧光强度校正过的脑中的荧光量的值与阴性对照的比率示出在图4(B)中。如图4(A)和(B)中所示，抗CADM3 VHH-Fc抗体iCADM3_3R1-L5 VHH-hG4PE(R409K)、iCADM3_3R1-L8VHH-hG4PE(R409K)、iCADM3_3R1-L10VHH-hG4PE(R409K)和iCADM3_3R1-L11 VHH-hG4PE(R409K)中的任一者与阴性对照相比在脑中的抗体量提高几倍，并且证实了抗体的分布遍及脑的整个区域。
此外，在不同于上面描述的条件下执行试验方法，结果将在下文示出。
将阴性对照抗体(抗AVM抗体)、抗CADM3 VHH-Fc抗体iCADM3_3R1-L8以及抗CADM3抗体CADM3312 hG4PE(R409K)、CADM3402 hG4PE(R409K)和CADM3501 hG4PE(R409K)用SAIVIAlexa Fluor 647抗体/蛋白1mg标记试剂盒荧光标记，并以5mg/kg的剂量分别通过尾静脉(i.v.)给药，7天后收集血液。在收集血液后，在麻醉下进行全身灌注，随后收集脑组织，并使用IVIS光谱仪(由PerkinElmer，Inc.制造)测量荧光强度。
在抗体给药后7天脑的成像图像示出在图5中。尽管在脑的中央部分略微观察到给药的阴性对照抗体(仅在脑的中央部分显色)，但证实了任何CADM3抗体的分布均遍及脑的整个区域(在整个脑中显色)。注意在黑白图像中，在抗CADM3 VHH-Fc抗体iCADM3_3R1-L8的情况下显现的颜色过于强烈，因此图像总体显现为白色，然而，这不同于没有显色而显得白色的阴性对照的图像。
随后，用给药的抗体的荧光强度校正过的抗体给药后7天脑中的荧光量的值与阴性对照的比率示出在图6中。抗CADM3 VHH-Fc抗体iCADM3_3R1-L8以及抗CADM3抗体CADM3312 hG4PE(R409K)、CADM3402 hG4PE(R409K)和CADM3501 hG4PE(R409K)中的任一者与阴性对照相比在脑中的抗体量提高几倍。
[实施例7]人源化抗CADM3抗体的产生
(1)iCADM3_3R1-L8人源化抗体的各种不同类型的VHH的氨基酸序列的设计
通过下文描述的方法，设计了iCADM3_3R1-L8人源化抗体的各种不同类型的VHH的氨基酸序列。对于VHH来说，比较iCADM3_3R1-L8抗体的FR的氨基酸序列与Kabat等人[《免疫学重要蛋白质的序列》(Sequences of Proteins of Immunological Interest)，USDept.Health and Human Services(1991)]报道的人类FR共有序列之间的同源性。结果，GenBank登记号ACR16109.1与iCADM3_3R1-L8抗体的VHH的FR的氨基酸序列具有最高的同源性。因此，设计了一种iCADM3_3R1-L8_00抗体(SEQ ID NO：177)，在其包含的氨基酸序列中将分别由SEQ ID NO：8、9和10表示的iCADM3_3R1-L8抗体的CDR1至CDR3的氨基酸序列移植在ACR16109.1的FR的氨基酸序列的适当位置处。所述iCADM3_3R1-L8_00抗体是一种人源化抗体，在其包含的氨基酸序列中仅将源自于羊驼抗体iCADM3_3R1-L8抗体的CDR1至CDR3的氨基酸序列移植到所选人类抗体的FR的氨基酸序列中。
然而，一般来说，在生产人源化抗体时，通过仅仅将源自于动物例如啮齿动物、兔或羊驼的抗体的CDR的氨基酸序列移植到人类抗体的FR的氨基酸序列中，通常只是使人源化抗体的生物活性变差。为了避免这种结合活性的变差，在移植CDR的氨基酸序列的同时，对在人类抗体与羊驼抗体之间不同的FR的氨基酸残基中被认为影响抗体结合活性的氨基酸残基进行修饰。
因此，在本实施例中，也如下所述对被认为影响抗体结合活性的FR的氨基酸残基进行鉴定和修饰。iCADM3_3R1-L8_00抗体的可变区的三维结构使用计算机建模技术来构建。
为了产生三维结构坐标并展示三维结构，使用了Discovery Studio(BIOVIA，Inc.)。此外，也以相同方式构建了iCADM3_3R1-L8抗体的可变区的三维结构的计算机模型。此外，产生了其中在iCADM3_3R1-L8_00抗体的VHH的FR的氨基酸序列中，将不同于iCADM3_3R1-L8抗体的氨基酸残基用iCADM3_3R1-L8抗体的相同位置处存在的氨基酸残基替换的氨基酸序列，并以相同方式构建了三维结构模型。
将这些产生的iCADM3_3R1-L8抗体、iCADM3_3R1-L8_00抗体和变体的可变区的三维结构进行比较，并鉴定推测影响抗体的结合活性的氨基酸残基。
通过将iCADM3_3R1-L8_00抗体的所述鉴定到的氨基酸残基中的至少一个以上的氨基酸残基用iCADM3_3R1-L8抗体的相同位置处存在的氨基酸残基替换，设计了具有各种不同修饰的人源化抗体的VHH。
具体来说，产生了在由SEQ ID NO：177表示的氨基酸序列中，在所述鉴定到的氨基酸残基中，包含选自以下氨基酸残基替换的至少一个氨基酸残基替换的人源化抗体的氨基酸序列：第6位的Gln被Glu替换，第27位的Phe被Arg替换，第37位的Val被Phe替换，第44位的Gly被Glu替换，第45位的Leu被Arg替换，第47位的Trp被Phe替换，第49位的Ser被Ala替换，第79位的Leu被Val替换，和第98位的Lys被Ala替换；并设计了具有各种不同修饰的人源化抗体的VHH。
具体来说，作为iCADM3_3R1-L8人源化抗体的VHH，设计了iCADM3_3R1-L8_01(SEQID NO：68)、iCADM3_3R1-L8_02(SEQ ID NO：70)、iCADM3_3R1-L8_03(SEQ ID NO：72)和iCADM3_3R1-L8_04(SEQ ID NO：74)。编码iCADM3_3R1-L8人源化抗体的各种不同类型的VHH的氨基酸序列示出在表6中。
(2)iCADM3_3R1-L11人源化抗体的各种不同类型的VHH的氨基酸序列的设计
以与实施例7(1)中相同的方式，也设计了iCADM3_3R1-L11人源化抗体的VHH的氨基酸序列。具有同源性最高的氨基酸序列的人类FR是GenBank登记号AAQ05734.1，但据推测它的抗原性高，因此使用种系序列VH3-53。
设计了iCADM3_3R1-L11_00抗体(SEQ ID NO：178)，在其包含的氨基酸序列中将iCADM3_3R1-L11抗体的VHH的CDR1至CDR3的氨基酸序列(分别为SEQ ID NO：18、19和20)移植在VH3-53的FR的氨基酸序列的适当位置处。也以与实施例7(1)中相同的方式选出了被认为影响iCADM3_3R1-L11_00抗体的结合活性的FR的氨基酸残基。
产生了在由SEQ ID NO：178表示的氨基酸序列中，在所述选出的氨基酸残基中，包含选自以下氨基酸残基替换的至少一个氨基酸残基替换的人源化抗体的氨基酸序列：第1位的Glu被Gln替换，第12位的Ile被Val替换，第14位的Pro被Ala替换，第27位的Phe被Ser替换，第28位的The被Ile替换，第29位的Val被Phe替换，第37位的Val被Tyr替换，第44位的Gly被Gln替换，第45位的Lys被Arg替换，第46位的Glu被Gly替换，第47位的Trp被Leu替换，第49位的Ser被Ala替换，第78位的Leu被Val替换，第96位的Ala被Asn替换，以及第97位的Arg被Ala替换；并设计了具有各种不同修饰的人源化抗体的VHH。
具体来说，作为iCADM3_3R1-L11人源化抗体的VHH，设计了iCADM3_3R1-L11_01(SEQ ID NO：76)、iCADM3_3R1-L11_02(SEQ ID NO：78)、iCADM3_3R1-L11_03(SEQ ID NO：80)、iCADM3_3R1-L11_04(SEQ ID NO：82)、iCADM3_3R1-L11_05(SEQ ID NO：84)和iCADM3_3R1-L11_06(SEQ ID NO：86)。编码iCADM3_3R1-L11人源化抗体的各种不同类型的VHH的氨基酸序列示出在表6中。
使用在动物细胞中高频使用的密码子设计了编码表6中示出的人源化抗体的可变区的氨基酸序列的核苷酸序列，并示出在表6中。
[表6]
(3)CADM3人源化抗体的制备
以与实施例2(1)中相同的方式，产生了其中插入有表6中示出的人源化抗CADM3抗体的各种不同类型的VHH区中的每一者的基因片段的抗体表达载体。通过以与实施例2(5)中相同的方式表达每种产生的载体，获得了抗体。
所述产生的人源化抗CADM3 VHH-Fc抗体被分别命名为iCADM3_3R1-L8_01VHH-hG4PE(R409K)、iCADM3_3R1-L8_02VHH-hG4PE(R409K)、iCADM3_3R1-L8_03 VHH-hG4PE(R409K)、iCADM3_3R1-L8_04 VHH-hG4PE(R409K)、iCADM3_3R1-L11_01VHH-hG4PE(R409K)、iCADM3_3R1-L11_02 VHH-hG4PE(R409K)、iCADM3_3R1-L11_03 VHH-hG4PE(R409K)、iCADM3_3R1-L11_04 VHH-hG4PE(R409K)、iCADM3_3R1-L11_05 VHH-hG4PE(R409K)和iCADM3_3R1-L11_06 VHH-hG4PE(R409K)。
(4)CADM3人源化抗体与CADM3表达细胞的反应性的分析
对于所述产生的人源化抗CADM3 VHH-Fc抗体来说，通过与实施例3中相同的程序分析了与Expi293F细胞、人类CADM3/Expi293F细胞和小鼠CADM3/Expi293F细胞的反应性。结果示出在表7和表8中。
[表7]
[表8]
如表7和8中所示，在所有抗体的情况下，与作为对照的抗AVM抗体相比平均荧光强度比率提高，并且揭示出所述人源化抗CADM3抗体与人类CADM3/Expi293F细胞和小鼠CADM3/Expi293F细胞反应。
对于所述产生的人源化抗CADM3抗体来说，通过与实施例6中相同的程序，利用表面等离子体共振检测评估了对CADM3的亲和性。结果如表9和10中所示，所有抗体均对人类CADM3和小鼠CADM3表现出亲和性。
[表9]
与人类CADM3的亲和性
[表10]
与小鼠CADM3的亲和性
[实施例8]人源化抗CADM3抗体在小鼠脑中的迁移能力的评估
使用SAIVI Alexa Fluor 647抗体/蛋白质1mg标记试剂盒对阴性对照抗体(抗AVM抗体)、抗CADM3 VHH-Fc抗体(iCADM3_3R1-L8VHH-hG4PE(R409K))和人源化抗CADM3 VHH-Fc抗体(iCADM3_3R1-L8_04VHH-hG4PE(R409K))进行标记。将每种标记的抗体以5mg/kg体重的剂量通过尾静脉(i.v.)给药，并在7天后收集血液。
在收集血液后，在麻醉下进行全身灌注，随后收集脑组织并测量其重量。向所述收集的脑组织添加缓冲液，将脑组织匀浆，然后离心，并收集在上清液中洗脱的抗体溶液。测量其体积，并且也使用AlphaLISA(由PerkinElmer，Inc.制造)测量抗体浓度，并计算每单位脑重量的抗体量。注意使用每种抗体分别产生标准曲线。此外，对于在相同条件下收集的脑组织来说，使用IVIS光谱仪(由PerkinElmer，Inc.制造)测量荧光强度。
在抗体给药后7天血清中的抗体浓度示出在图7(A)中，并且脑组织中每单位脑重量的抗体量示出在图7(B)中。如图7(A)和(B)中所示，在iCADM3_3R1-L8 VHH-hG4PE(R409K)与iCADM3_3R1-L8_04 VHH-hG4PE(R409K)之间，在血清中的抗体浓度和每单位脑重量的抗体量两方面没有差异，并且证实了即使在抗体人源化后，提高在脑中的抗体量的效果仍然维持。
在抗体给药后7天脑的成像图像示出在图8(A)中。用给药的抗体的荧光强度校正过的脑中的荧光量的值与阴性对照的比率示出在图8(B)中。如图8(A)和(B)中所示，抗CADM3 VHH-Fc抗体和人源化抗CADM3 VHH-Fc抗体中的每一者与阴性对照相比在脑中的抗体量提高几倍，并且证实了所述抗体的分布遍及脑的整个区域。从上述结果看出，产生了维持与抗CADM3 VHH抗体等同的活性的人源化VHH。
本发明已使用具体情况进行了详细解释，但对于本领域技术人员来说，显然可以在不背离本发明的精神和范围的情况下做出各种不同的改变和修改。本申请是基于2018年6月26日提交的日本专利申请(专利申请号2018-120477)，其整体通过参考并入本文。
序列表自由文本
SEQ ID NO：1-人工序列的描述：编码iCADM3_3R1-L5的VHH(不包含信号序列)的核苷酸序列
SEQ ID NO：2-人工序列的描述：iCADM3_3R1-L5的VHH(不包含信号序列)的氨基酸序列
SEQ ID NO：3-人工序列的描述：iCADM3_3R1-L5的CDR1的氨基酸序列
SEQ ID NO：4-人工序列的描述：iCADM3_3R1-L5的CDR2的氨基酸序列
SEQ ID NO：5-人工序列的描述：iCADM3_3R1-L5的CDR3的氨基酸序列
SEQ ID NO：6-人工序列的描述：编码iCADM3_3R1-L8的VHH(不包含信号序列)的核苷酸序列
SEQ ID NO：7-人工序列的描述：iCADM3_3R1-L8的VHH(不包含信号序列)的氨基酸序列
SEQ ID NO：8-人工序列的描述：iCADM3_3R1-L8的CDR1的氨基酸序列
SEQ ID NO：9-人工序列的描述：iCADM3_3R1-L8的CDR2的氨基酸序列
SEQ ID NO：10-人工序列的描述：iCADM3_3R1-L8的CDR3的氨基酸序列
SEQ ID NO：11-人工序列的描述：编码iCADM3_3R1-L10的VHH(不包含信号序列)的核苷酸序列
SEQ ID NO：12-人工序列的描述：iCADM3_3R1-L10的VHH(不包含信号序列)的氨基酸序列
SEQ ID NO：13-人工序列的描述：iCADM3_3R1-L10的CDR1的氨基酸序列
SEQ ID NO：14-人工序列的描述：iCADM3_3R1-L10的CDR2的氨基酸序列
SEQ ID NO：15-人工序列的描述：iCADM3_3R1-L10的CDR3的氨基酸序列
SEQ ID NO：16-人工序列的描述：编码iCADM3_3R1-L11的VHH(不包含信号序列)的核苷酸序列
SEQ ID NO：17-人工序列的描述：iCADM3_3R1-L11的VHH(不包含信号序列)的氨基酸序列
SEQ ID NO：18-人工序列的描述：iCADM3_3R1-L11的CDR1的氨基酸序列
SEQ ID NO：19-人工序列的描述：iCADM3_3R1-L11的CDR2的氨基酸序列
SEQ ID NO：20-人工序列的描述：iCADM3_3R1-L11的CDR3的氨基酸序列
SEQ ID NO：21-人工序列的描述：编码CADM301的VH(不包含信号序列)的核苷酸序列
SEQ ID NO：22-人工序列的描述：CADM301的VH(不包含信号序列)的氨基酸序列
SEQ ID NO：23-人工序列的描述：CADM301的HCDR1的氨基酸序列
SEQ ID NO：24-人工序列的描述：CADM301的HCDR2的氨基酸序列
SEQ ID NO：25-人工序列的描述：CADM301的HCDR3的氨基酸序列
SEQ ID NO：26-人工序列的描述：编码CADM301的VL(不包含信号序列)的核苷酸序列
SEQ ID NO：27-人工序列的描述：CADM301的VL(不包含信号序列)的氨基酸序列
SEQ ID NO：28-人工序列的描述：CADM301的LCDR1的氨基酸序列
SEQ ID NO：29-人工序列的描述：CADM301的LCDR2的氨基酸序列
SEQ ID NO：30-人工序列的描述：CADM301的LCDR3的氨基酸序列
SEQ ID NO：31-人工序列的描述：编码CADM3102的VH(不包含信号序列)的核苷酸序列
SEQ ID NO：32-人工序列的描述：CADM3102的VH(不包含信号序列)的氨基酸序列
SEQ ID NO：33-人工序列的描述：CADM3102的HCDR1的氨基酸序列
SEQ ID NO：34-人工序列的描述：CADM3102的HCDR2的氨基酸序列
SEQ ID NO：35-人工序列的描述：CADM3102的HCDR3的氨基酸序列
SEQ ID NO：36-人工序列的描述：编码CADM3102的VL(不包含信号序列)的核苷酸序列
SEQ ID NO：37-人工序列的描述：CADM3102的VL(不包含信号序列)的氨基酸序列
SEQ ID NO：38-人工序列的描述：CADM3102的LCDR1的氨基酸序列
SEQ ID NO：39-人工序列的描述：CADM3102的LCDR2的氨基酸序列
SEQ ID NO：40-人工序列的描述：CADM3102的LCDR3的氨基酸序列
SEQ ID NO：41-人工序列的描述：编码抗AVM抗体的轻链(不包含信号序列)的核苷酸序列
SEQ ID NO：42-人工序列的描述：抗AVM抗体的轻链(不包含信号序列)的氨基酸序列
SEQ ID NO：43-人工序列的描述：编码pCI_AVM-hLG4PE(R409K)-iCADM3_3R1-L5VHH的重链(不包含信号序列)的核苷酸序列
SEQ ID NO：44-人工序列的描述：pCI_AVM-hLG4PE(R409K)-iCADM3_3R1-L5 VHH的重链(不包含信号序列)的氨基酸序列
SEQ ID NO：45-人工序列的描述：编码pCI_AVM-hLG4PE(R409K)-iCADM33R1-L8VHH的重链(不包含信号序列)的核苷酸序列
SEQ ID NO：46-人工序列的描述：pCI_AVM-hLG4PE(R409K)-iCADM3_3R1-L8 VHH的重链(不包含信号序列)的氨基酸序列
SEQ ID NO：47-人工序列的描述：编码pCI_AVM-hLG4PE(R409K)-iCADM3_3R1-L10VHH的重链(不包含信号序列)的核苷酸序列
SEQ ID NO：48-人工序列的描述：pCI_AVM-hLG4PE(R409K)-iCADM3_3R1-L10 VHH的重链(不包含信号序列)的氨基酸序列
SEQ ID NO：49-人工序列的描述：编码pCI_AVM-hLG4PE(R409K)-iCADM3_3R1-L11VHH的重链(不包含信号序列)的核苷酸序列
SEQ ID NO：50-人工序列的描述：pCI_AVM-hLG4PE(R409K)-iCADM3_3R1-L11 VHH的重链(不包含信号序列)的氨基酸序列
SEQ ID NO：51-人工序列的描述：编码包含信号序列的人类CADM3(包含信号序列)的核苷酸序列
SEQ ID NO：52-人工序列的描述：包含信号序列的人类CADM3(包含信号序列)的氨基酸序列
SEQ ID NO：53-人工序列的描述：编码包含信号序列的小鼠CADM3(包含信号序列)的核苷酸序列
SEQ ID NO：54-人工序列的描述：包含信号序列的小鼠CADM3(包含信号序列)的氨基酸序列
SEQ ID NO：55-人工序列的描述：编码包含信号序列的猴CADM3(包含信号序列)的核苷酸序列
SEQ ID NO：56-人工序列的描述：包含信号序列的猴CADM3(包含信号序列)的氨基酸序列
SEQ ID NO：57-人工序列的描述：编码hCADM3-FLAG_Fc(包含信号序列)的核苷酸序列
SEQ ID NO：58-人工序列的描述：hCADM3-FLAG_Fc(包含信号序列)的氨基酸序列
SEQ ID NO：59-人工序列的描述：编码mCADM3-FLAG_Fc(包含信号序列)的核苷酸序列
SEQ ID NO：60-人工序列的描述：mCADM3-FLAG_Fc(包含信号序列)的氨基酸序列
SEQ ID NO：61-人工序列的描述：编码rCADM3-FLAG_Fc(包含信号序列)的核苷酸序列
SEQ ID NO：62-人工序列的描述：rCADM3-FLAG_Fc(包含信号序列)的氨基酸序列
SEQ ID NO：63-人工序列的描述：编码hCADM3-GST(包含信号序列)的核苷酸序列
SEQ ID NO：64-人工序列的描述：hCADM3-GST(包含信号序列)的氨基酸序列
SEQ ID NO：65-人工序列的描述：编码mCADM3-GST(包含信号序列)的核苷酸序列
SEQ ID NO：66-人工序列的描述：mCADM3-GST(包含信号序列)的氨基酸序列
SEQ ID NO：67-人工序列的描述：编码iCADM3_3R1-L8_01的VHH(不包含信号序列)的核苷酸序列
SEQ ID NO：68-人工序列的描述：iCADM3_3R1-L8_01的VHH(不包含信号序列)的氨基酸序列
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序列表
<110> 协和发酵麒麟株式会社（Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd.）
国立大学法人鹿儿岛大学（Kagoshima University）
<120> 与细胞粘附分子3结合的抗体
<130> W527352
<150> JP2018-120477
<151> 2018-06-26
<160> 178
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 372
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：不包括信号序列的iCADM3_3R1-L5的VHH的碱基序列
<400> 1
caggtgcagc tcgtggagtc tgggggaggc ttggtgcagg ctggggggtc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggaag catcgtcagt gtcaatgcca tgggctggta ccgccaggct 120
ccagggaagc agcgcgagtt ggtcgcaact attactagtg ggggtagcac aaactatgca 180
gactccgcga agggccgatt caccatctcc agagacaacg ccaagaacac gatgtatctg 240
caaatgaaca gcctgaaacc tgaggacaca gccgtctatt actgtaacgg ggaattctgg 300
tcgcgccggg acacacgccc cccaggggtc gtaaactact ggggccaggg gacccaggtc 360
accgtctcct ca 372
<210> 2
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：不包括信号序列的iCADM3_3R1-L5的VHH的氨基酸序列
<400> 2
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Val Ser Val Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Thr Ile Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Met Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn
85 90 95
Gly Glu Phe Trp Ser Arg Arg Asp Thr Arg Pro Pro Gly Val Val Asn
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 3
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：iCADM3_3R1-L5的CDR1的氨基酸序列
<400> 3
Val Asn Ala Met Gly
1 5
<210> 4
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：iCADM3_3R1-L5的CDR2的氨基酸序列
<400> 4
Thr Ile Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Ala Lys Gly
1 5 10 15
<210> 5
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：iCADM3_3R1-L5的CDR3的氨基酸序列
<400> 5
Glu Phe Trp Ser Arg Arg Asp Thr Arg Pro Pro Gly Val Val Asn Tyr
1 5 10 15
<210> 6
<211> 372
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：不包括信号序列的iCADM3_3R1-L8的VHH的碱基序列
<400> 6
caggtgcagc tcgtggagtc tgggggaggc ttggtgcagc ctggggggtc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggacg caccttcagt aattatgccc ggggctggtt ccgccaggct 120
ccagggaagg agcgtgagtt tgtagcagct attgactaca gtggtggtag cacaaactat 180
gcagactccg cgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa cacggtgtat 240
ctgcaaatga acagcctgaa acccggggac acggccgttt attactgtgc agcgcccgca 300
agccggcgtc ctagttggga tgctgatggg tatgactact ggggccaggg gacccaggtc 360
accgtctcct ca 372
<210> 7
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：不包括信号序列的iCADM3_3R1-L8的VHH的氨基酸序列
<400> 7
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Arg Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Asp Tyr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Ala
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Gly Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Pro Ala Ser Arg Arg Pro Ser Trp Asp Ala Asp Gly Tyr Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 8
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：iCADM3_3R1-L8的CDR1的氨基酸序列
<400> 8
Asn Tyr Ala Arg Gly
1 5
<210> 9
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：iCADM3_3R1-L8的CDR2的氨基酸序列
<400> 9
Ala Ile Asp Tyr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Ala Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 10
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：iCADM3_3R1-L8的CDR3的氨基酸序列
<400> 10
Pro Ala Ser Arg Arg Pro Ser Trp Asp Ala Asp Gly Tyr Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 11
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：不包括信号序列的iCADM3_3R1-L10的VHH的碱基序列
<400> 11
caggtgcagc tcgtggagtc tgggggaggc ttggtgcagg ctggggggtc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggaag catcttcagt atacatgcca tgggctggta ccgtcaggct 120
ccagggaagc agcgcgagtt ggtcgcaact gttactagtg gtggtagcac aaactatgca 180
gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaacg ccaagaacac ggtgtatctg 240
caaatgaaca gcctgaaacc tgaggacaca gccgtctatt actgtaatgc agaaaccccc 300
tactatagta gtacttacta cacgaactac tggggccagg ggacccaggt caccgtctcc 360
tca 363
<210> 12
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：不包括信号序列的iCADM3_3R1-L10的VHH的氨基酸序列
<400> 12
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ile His
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Thr Val Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn
85 90 95
Ala Glu Thr Pro Tyr Tyr Ser Ser Thr Tyr Tyr Thr Asn Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 13
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：iCADM3_3R1-L10的CDR1的氨基酸序列
<400> 13
Ile His Ala Met Gly
1 5
<210> 14
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：iCADM3_3R1-L10的CDR2的氨基酸序列
<400> 14
Thr Val Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
1 5 10 15
<210> 15
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：iCADM3_3R1-L10的CDR3的氨基酸序列
<400> 15
Glu Thr Pro Tyr Tyr Ser Ser Thr Tyr Tyr Thr Asn Tyr
1 5 10
<210> 16
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：不包括信号序列的iCADM3_3R1-L11的VHH的碱基序列
<400> 16
caggtgcagc tcgtggagtc tgggggaggc ttggtgcagg ctggggggtc tctgagactt 60
tcctgtgcag cctctggaag catcttcagc ttcaatgcca tgggctggta ccgccaggct 120
ccagggaagc agcgcgggtt ggtcgcagtt attactagtg gtggttacac aaactatgcg 180
gactccgtga agggccgatt caccatcacc agagacaacg ccaagaacac ggtgtatctg 240
caaatgaaca gcctgaaacc tgaggacaca gccgtctatt actgtaatgc agaaggagtc 300
tacagcgact atgtgatcat gaactactgg ggccagggga cccaggtcac cgtctcctca 360
<210> 17
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：不包括信号序列的iCADM3_3R1-L11的VHH的氨基酸序列
<400> 17
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Phe Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Gly Leu Val
35 40 45
Ala Val Ile Thr Ser Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Thr Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn
85 90 95
Ala Glu Gly Val Tyr Ser Asp Tyr Val Ile Met Asn Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 18
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：iCADM3_3R1-L11的CDR1的氨基酸序列
<400> 18
Phe Asn Ala Met Gly
1 5
<210> 19
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：iCADM3_3R1-L11的CDR2的氨基酸序列
<400> 19
Val Ile Thr Ser Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
1 5 10 15
<210> 20
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：iCADM3_3R1-L11的CDR3的氨基酸序列
<400> 20
Glu Gly Val Tyr Ser Asp Tyr Val Ile Met Asn Tyr
1 5 10
<210> 21
<211> 369
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：不包括信号序列的CADM301的VH的碱基序列
<400> 21
caggtgcagc tggtgcaatc tggggctgag gtgaggaggc ctgggacctc agtgaaagtc 60
tcctgcaagg cttctggata cagcttcacc agttatgata ttaactgggt gcgcctggcc 120
actggacaag ggcttgagtg gatggggtgg atgaacccta acactggtga tacaggctct 180
ccacagaagt tccaggacag agtcaccatg accagggaca tctccacagg cacagcctac 240
ttagaactga gaggcctgaa gtctgaggac acggccattt attattgtgc gagaggcttc 300
ctggtgacag catataccgc tgagttcttc ccgcactggg gccagggcac cctggtcacc 360
gtctcctca 369
<210> 22
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：不包括信号序列的CADM301的VH的氨基酸序列
<400> 22
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Arg Arg Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Asp Ile Asn Trp Val Arg Leu Ala Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Met Asn Pro Asn Thr Gly Asp Thr Gly Ser Pro Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Ile Ser Thr Gly Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Leu Arg Gly Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Phe Leu Val Thr Ala Tyr Thr Ala Glu Phe Phe Pro His
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 23
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：CADM301的HCDR1的氨基酸序列
<400> 23
Ser Tyr Asp Ile Asn
1 5
<210> 24
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：CADM301的HCDR2的氨基酸序列
<400> 24
Trp Met Asn Pro Asn Thr Gly Asp Thr Gly Ser Pro Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Asp
<210> 25
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：CADM301的HCDR3的氨基酸序列
<400> 25
Gly Phe Leu Val Thr Ala Tyr Thr Ala Glu Phe Phe Pro His
1 5 10
<210> 26
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：不包括信号序列的CADM301的VL的碱基序列
<400> 26
tcctatgtgc tgactcagcc accctcagtg tcagtggccc caggaaagac ggccaggctc 60
acctgtgggg gaaacaacat tggaagtaaa agtgttcact ggtaccagca gaggccaggc 120
caggcccctg tgctggtcat aaattatgat agtgaccggc cctctgggat ccctgagcga 180
ttctctggct ccaactctga gaacacggcc accctgacca tcagcagggt cgaagccggg 240
gatgaggccg actattactg tcaggtgtgg gatagtggta gtgatcatgt ggtattcggc 300
ggaggaaccc agctgatcat ttta 324
<210> 27
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：不包括信号序列的CADM301的VL的氨基酸序列
<400> 27
Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Lys
1 5 10 15
Thr Ala Arg Leu Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Asn
35 40 45
Tyr Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Glu Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Gly Ser Asp His
85 90 95
Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Ile Ile Leu
100 105
<210> 28
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：CADM301的LCDR1的氨基酸序列
<400> 28
Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val His
1 5 10
<210> 29
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：CADM301的LCDR2的氨基酸序列
<400> 29
Tyr Asp Ser Asp Arg Pro Ser
1 5
<210> 30
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：CADM301的LCDR3的氨基酸序列
<400> 30
Gln Val Trp Asp Ser Gly Ser Asp His Val Val
1 5 10
<210> 31
<211> 372
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：不包括信号序列的CADM3102的VH的碱基序列
<400> 31
cagatgcagc tagtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatcccta tgtctggcac agcaaactac 180
gcacagaaat tccagggcag agtcacgatt accgcggacg aatccacgag cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtct actactgtgc gagagttgag 300
gaaagtggct ggtacgacca ctaccacggt atggacgtct ggggccaagg gaccacggtc 360
accgtctcct ca 372
<210> 32
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：不包括信号序列的CADM3102的VH的氨基酸序列
<400> 32
Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Met Ser Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Glu Glu Ser Gly Trp Tyr Asp His Tyr His Gly Met Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 33
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：CADM3102的HCDR1的氨基酸序列
<400> 33
Ser Tyr Ala Ile Ser
1 5
<210> 34
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：CADM3102的HCDR2的氨基酸序列
<400> 34
Gly Ile Ile Pro Met Ser Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 35
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：CADM3102的HCDR3的氨基酸序列
<400> 35
Val Glu Glu Ser Gly Trp Tyr Asp His Tyr His Gly Met Asp Val
1 5 10 15
<210> 36
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：不包括信号序列的CADM3102的VL的碱基序列
<400> 36
gatgttgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctcc 60
atctcctgca cgtctagtca gagcctcctg tatagtaatg gattcaacta tttggattgg 120
tacctgcaga aaccagggca gtctccacag ctcctgatct atttgggttc taatcgggcc 180
tccggggtcc ctgacaggtt cagtggcagt ggatcaggca cagattttac actgaaaatc 240
agtagagtgg aggctgagga tgttggggtg tattactgca tgcaagctct aacaactcat 300
cccacttttg gcggagggac caaagtggat atcaaa 336
<210> 37
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：不包括信号序列的CADM3102的VL的氨基酸序列
<400> 37
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Thr Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Asn Gly Phe Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala
85 90 95
Leu Thr Thr His Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
100 105 110
<210> 38
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：CADM3102的LCDR1的氨基酸序列
<400> 38
Thr Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Asn Gly Phe Asn Tyr Leu Asp
1 5 10 15
<210> 39
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：CADM3102的LCDR2的氨基酸序列
<400> 39
Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser
1 5
<210> 40
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：CADM3102的LCDR3的氨基酸序列
<400> 40
Met Gln Ala Leu Thr Thr His Pro Thr
1 5
<210> 41
<211> 648
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pCI_AVM-hLG4PE(R409K)-iCADM3_3R1-L5 VHH、pCI_AVM-hLG4PE(R409K)-iCADM3_3R1-L8 VHH、pCI_AVM-hLG4PE(R409K)-iCADM3_3R1-L10 VHH的不包括信号序列的轻链抗体的碱基序列
<400> 41
cagtttgtgc tttctcagcc aaactctgtg tctacgaatc tcggaagcac agtcaaactg 60
tcttgcaagc gcagcactgg taacattgga agcaattatg tgagctggta ccagcagcat 120
gagggaagat ctcccaccac tatgatttat agggatgata agagaccaga tggagttcct 180
gacaggttct ctggctccat tgacagatct tccgactcag ccctcctgac aatcaataat 240
gtgcagactg aagatgaagc tgactacttc tgtcagtctt acagtagtgg tattaatatt 300
ttcggcggtg gaaccaagct cactgtccta ggtcagccca aggccgcccc ctcggtcact 360
ctgttcccgc cctcctctga ggagcttcaa gccaacaagg ccacactggt gtgtctcata 420
agtgacttct acccgggagc cgtgacagtg gcctggaagg cagatagcag ccccgtcaag 480
gcgggagtgg agaccaccac accctccaaa caaagcaaca acaagtacgc ggccagcagc 540
tacctgagcc tgacgcctga gcagtggaag tcccacagaa gctacagctg ccaggtcacg 600
catgaaggga gcaccgtgga gaagacagtg gcccctacag aatgttca 648
<210> 42
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pCI_AVM-hLG4PE(R409K)-iCADM3_3R1-L5 VHH、pCI_AVM-hLG4PE(R409K)-iCADM3_3R1-L8 VHH、pCI_AVM-hLG4PE(R409K)-iCADM3_3R1-L10 VHH的不包括信号序列的轻链抗体的氨基酸序列
<400> 42
Gln Phe Val Leu Ser Gln Pro Asn Ser Val Ser Thr Asn Leu Gly Ser
1 5 10 15
Thr Val Lys Leu Ser Cys Lys Arg Ser Thr Gly Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Glu Gly Arg Ser Pro Thr Thr Met
35 40 45
Ile Tyr Arg Asp Asp Lys Arg Pro Asp Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Ile Asp Arg Ser Ser Asp Ser Ala Leu Leu Thr Ile Asn Asn
65 70 75 80
Val Gln Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Ser Tyr Ser Ser
85 90 95
Gly Ile Asn Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln
100 105 110
Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu
115 120 125
Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr
130 135 140
Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys
145 150 155 160
Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr
165 170 175
Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His
180 185 190
Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys
195 200 205
Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210 215
<210> 43
<211> 1764
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：不包括信号序列的pCI_AVM-hLG4PE(R409K)-iCADM3_3R1-L5VHH的重链抗体序列的碱基序列
<400> 43
gaggtgcagc tggtggaatc tgggggaggc ttagtgcagc ctggaagatc cctgaaactc 60
tcctgtgcag cctcaggatt cactttcagt aactatgcca tggcttgggt ccgccgggct 120
ccaacgaagg gtctggagtg ggtcgcatcc attagtaatg gtggtggtaa cacttactat 180
cgcgactccg tgaagggccg attcactatc tccagagatg atgcaaaaaa caccctatac 240
ctgcaaatgg acagtctgag gtctgaggac acggccactt attactgtgc aagacacggg 300
aattatatat attatgggtc cttctttgat tactggggcc aaggagtcat ggtcacagtc 360
tcctcagcta gcaccaaggg gccatccgtc ttccccctgg cgccctgctc caggagcacc 420
tccgagagca cagccgccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg 480
gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag 540
tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacg 600
aagacctaca cctgcaacgt agatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagagagtt 660
gagtccaaat atggtccccc atgcccacca tgcccagcac ctgagttcga ggggggacca 720
tcagtcttcc tgttcccccc aaaacccaag gacactctca tgatctcccg gacccctgag 780
gtcacgtgcg tggtggtgga cgtgagccag gaagaccccg aggtccagtt caactggtac 840
gtggatggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gttcaacagc 900
acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggag 960
tacaagtgca aggtctccaa caaaggcctc ccgtcctcca tcgagaaaac catctccaaa 1020
gccaaagggc agccccgaga gccacaggtg tacaccctgc ccccatccca ggaggagatg 1080
accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctaccccag cgacatcgcc 1140
gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1200
gactccgacg gctccttctt cctctacagc aagctaaccg tggacaagag caggtggcag 1260
gaggggaatg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacacag 1320
aagagcctct ccctgtctct gggtggagga ggagggtccg gaggaggagg gtccggtgga 1380
ggtgggtccc aggtgcagct cgtggagtct gggggaggct tggtgcaggc tggggggtct 1440
ctgagactct cctgtgcagc ctctggaagc atcgtcagtg tcaatgccat gggctggtac 1500
cgccaggctc cagggaagca gcgcgagttg gtcgcaacta ttactagtgg gggtagcaca 1560
aactatgcag actccgcgaa gggccgattc accatctcca gagacaacgc caagaacacg 1620
atgtatctgc aaatgaacag cctgaaacct gaggacacag ccgtctatta ctgtaacggg 1680
gaattctggt cgcgccggga cacacgcccc ccaggggtcg taaactactg gggccagggg 1740
acccaggtca ccgtctcctc atga 1764
<210> 44
<211> 587
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：不包括信号序列的pCI_AVM-hLG4PE(R409K)-iCADM3_3R1-L5VHH的重链抗体序列的氨基酸序列
<400> 44
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Ala Trp Val Arg Arg Ala Pro Thr Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Asn Gly Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Gly Asn Tyr Ile Tyr Tyr Gly Ser Phe Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr
130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp
195 200 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr
210 215 220
Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
435 440 445
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln
450 455 460
Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser
465 470 475 480
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Val Ser Val Asn Ala
485 490 495
Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala
500 505 510
Thr Ile Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Ala Lys Gly
515 520 525
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Met Tyr Leu Gln
530 535 540
Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Gly
545 550 555 560
Glu Phe Trp Ser Arg Arg Asp Thr Arg Pro Pro Gly Val Val Asn Tyr
565 570 575
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
580 585
<210> 45
<211> 1764
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：不包括信号序列的pCI_AVM-hLG4PE(R409K)-iCADM3_3R1-L8VHH的重链抗体序列的碱基序列
<400> 45
gaggtgcagc tggtggaatc tgggggaggc ttagtgcagc ctggaagatc cctgaaactc 60
tcctgtgcag cctcaggatt cactttcagt aactatgcca tggcttgggt ccgccgggct 120
ccaacgaagg gtctggagtg ggtcgcatcc attagtaatg gtggtggtaa cacttactat 180
cgcgactccg tgaagggccg attcactatc tccagagatg atgcaaaaaa caccctatac 240
ctgcaaatgg acagtctgag gtctgaggac acggccactt attactgtgc aagacacggg 300
aattatatat attatgggtc cttctttgat tactggggcc aaggagtcat ggtcacagtc 360
tcctcagcta gcaccaaggg gccatccgtc ttccccctgg cgccctgctc caggagcacc 420
tccgagagca cagccgccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg 480
gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag 540
tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacg 600
aagacctaca cctgcaacgt agatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagagagtt 660
gagtccaaat atggtccccc atgcccacca tgcccagcac ctgagttcga ggggggacca 720
tcagtcttcc tgttcccccc aaaacccaag gacactctca tgatctcccg gacccctgag 780
gtcacgtgcg tggtggtgga cgtgagccag gaagaccccg aggtccagtt caactggtac 840
gtggatggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gttcaacagc 900
acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggag 960
tacaagtgca aggtctccaa caaaggcctc ccgtcctcca tcgagaaaac catctccaaa 1020
gccaaagggc agccccgaga gccacaggtg tacaccctgc ccccatccca ggaggagatg 1080
accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctaccccag cgacatcgcc 1140
gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1200
gactccgacg gctccttctt cctctacagc aagctaaccg tggacaagag caggtggcag 1260
gaggggaatg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacacag 1320
aagagcctct ccctgtctct gggtggagga ggagggtccg gaggaggagg gtccggtgga 1380
ggtgggtccc aggtgcagct cgtggagtct gggggaggct tggtgcagcc tggggggtct 1440
ctgagactct cctgtgcagc ctctggacgc accttcagta attatgcccg gggctggttc 1500
cgccaggctc cagggaagga gcgtgagttt gtagcagcta ttgactacag tggtggtagc 1560
acaaactatg cagactccgc gaagggccga ttcaccatct ccagagacaa cgccaagaac 1620
acggtgtatc tgcaaatgaa cagcctgaaa cccggggaca cggccgttta ttactgtgca 1680
gcgcccgcaa gccggcgtcc tagttgggat gctgatgggt atgactactg gggccagggg 1740
acccaggtca ccgtctcctc atga 1764
<210> 46
<211> 587
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：不包括信号序列的pCI_AVM-hLG4PE(R409K)-iCADM3_3R1-L8VHH的重链抗体序列的氨基酸序列
<400> 46
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Ala Trp Val Arg Arg Ala Pro Thr Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Asn Gly Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Gly Asn Tyr Ile Tyr Tyr Gly Ser Phe Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
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Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
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165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
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210 215 220
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225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
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275 280 285
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355 360 365
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405 410 415
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420 425 430
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435 440 445
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450 455 460
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Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Asn Tyr Ala
485 490 495
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<210> 47
<211> 1755
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：不包括信号序列的pCI_AVM-hLG4PE(R409K)-iCADM3_3R1-L10VHH的重链抗体序列的碱基序列
<400> 47
gaggtgcagc tggtggaatc tgggggaggc ttagtgcagc ctggaagatc cctgaaactc 60
tcctgtgcag cctcaggatt cactttcagt aactatgcca tggcttgggt ccgccgggct 120
ccaacgaagg gtctggagtg ggtcgcatcc attagtaatg gtggtggtaa cacttactat 180
cgcgactccg tgaagggccg attcactatc tccagagatg atgcaaaaaa caccctatac 240
ctgcaaatgg acagtctgag gtctgaggac acggccactt attactgtgc aagacacggg 300
aattatatat attatgggtc cttctttgat tactggggcc aaggagtcat ggtcacagtc 360
tcctcagcta gcaccaaggg gccatccgtc ttccccctgg cgccctgctc caggagcacc 420
tccgagagca cagccgccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg 480
gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag 540
tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacg 600
aagacctaca cctgcaacgt agatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagagagtt 660
gagtccaaat atggtccccc atgcccacca tgcccagcac ctgagttcga ggggggacca 720
tcagtcttcc tgttcccccc aaaacccaag gacactctca tgatctcccg gacccctgag 780
gtcacgtgcg tggtggtgga cgtgagccag gaagaccccg aggtccagtt caactggtac 840
gtggatggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gttcaacagc 900
acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggag 960
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gtgtatctgc aaatgaacag cctgaaacct gaggacacag ccgtctatta ctgtaatgca 1680
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accgtctcct catga 1755
<210> 48
<211> 584
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：不包括信号序列的pCI_AVM-hLG4PE(R409K)-iCADM3_3R1-L10VHH的重链抗体序列的氨基酸序列
<400> 48
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
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Ala Met Ala Trp Val Arg Arg Ala Pro Thr Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
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Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
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<210> 49
<211> 1752
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：不包括信号序列的pCI_AVM-hLG4PE(R409K)-iCADM3_3R1-L11VHH的重链抗体序列的碱基序列
<400> 49
gaggtgcagc tggtggaatc tgggggaggc ttagtgcagc ctggaagatc cctgaaactc 60
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<210> 50
<211> 583
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：不包括信号序列的pCI_AVM-hLG4PE(R409K)-iCADM3_3R1-L11VHH的重链抗体序列的氨基酸序列
<400> 50
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Ala Trp Val Arg Arg Ala Pro Thr Lys Gly Leu Glu Trp Val
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580
<210> 51
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：包括信号序列的人类CADM3的碱基序列
<400> 51
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<210> 52
<211> 398
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：包括信号序列的人类CADM3的氨基酸序列
<400> 52
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145 150 155 160
Ala Arg Leu Thr Trp Arg Lys Gly Asp Gln Glu Leu His Gly Glu Pro
165 170 175
Thr Arg Ile Gln Glu Asp Pro Asn Gly Lys Thr Phe Thr Val Ser Ser
180 185 190
Ser Val Thr Phe Gln Val Thr Arg Glu Asp Asp Gly Ala Ser Ile Val
195 200 205
Cys Ser Val Asn His Glu Ser Leu Lys Gly Ala Asp Arg Ser Thr Ser
210 215 220
Gln Arg Ile Glu Val Leu Tyr Thr Pro Thr Ala Met Ile Arg Pro Asp
225 230 235 240
Pro Pro His Pro Arg Glu Gly Gln Lys Leu Leu Leu His Cys Glu Gly
245 250 255
Arg Gly Asn Pro Val Pro Gln Gln Tyr Leu Trp Glu Lys Glu Gly Ser
260 265 270
Val Pro Pro Leu Lys Met Thr Gln Glu Ser Ala Leu Ile Phe Pro Phe
275 280 285
Leu Asn Lys Ser Asp Ser Gly Thr Tyr Gly Cys Thr Ala Thr Ser Asn
290 295 300
Met Gly Ser Tyr Lys Ala Tyr Tyr Thr Leu Asn Val Asn Asp Pro Ser
305 310 315 320
Pro Val Pro Ser Ser Ser Ser Thr Tyr His Ala Ile Ile Gly Gly Ile
325 330 335
Val Ala Phe Ile Val Phe Leu Leu Leu Ile Met Leu Ile Phe Leu Gly
340 345 350
His Tyr Leu Ile Arg His Lys Gly Thr Tyr Leu Thr His Glu Ala Lys
355 360 365
Gly Ser Asp Asp Ala Pro Asp Ala Asp Thr Ala Ile Ile Asn Ala Glu
370 375 380
Gly Gly Gln Ser Gly Gly Asp Asp Lys Lys Glu Tyr Phe Ile
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<210> 53
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：包括信号序列的小鼠CADM3的碱基序列
<400> 53
atgggggccc cttccgccct gcccctgctc ctgctcctcg cctgctcctg ggcgcccggc 60
ggggccaatc tttcccagga cgatagccag ccctggacat ctgatgaaac agttgtggct 120
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cgggaaaagg agacagccac tctaaattgt cagtcttctg ggagcaaacc tgcagcccag 480
ctcacctgga ggaaaggtga ccaagaactc cacggggacc aaacacgaat ccaggaagat 540
cccaacggga aaaccttcac tgtgagcagc tcagtgtcat tccaggttac ccgggaggat 600
gatggagcaa acatcgtgtg ctctgtgaac catgaatctc tgaagggagc cgacagatcc 660
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catcctcgag aaggccagaa gctgttgtta cattgtgagg ggcgtggcaa tccagtcccc 780
cagcagtacg tgtgggtaaa ggaaggcagt gagccacccc tcaagatgac ccaagagagt 840
gctctcatct tccccttttt gaataagagt gacagtggca cttatggctg tacagccaca 900
agcaacatgg gcagctatac agcctacttc accctcaatg tcaacgaccc cagtccagtg 960
ccctcgtcct ccagtaccta ccacgccatc attggaggga ttgtggcttt cattgtcttc 1020
ctgctgctca ttctgctcat tttccttgga cactatttga tccggcacaa aggaacctac 1080
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gcagaaggcg ggcagtcagg cggggatgac aagaaggaat atttcatcta g 1191
<210> 54
<211> 396
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：包括信号序列的小鼠 CADM3的氨基酸序列
<400> 54
Met Gly Ala Pro Ser Ala Leu Pro Leu Leu Leu Leu Leu Ala Cys Ser
1 5 10 15
Trp Ala Pro Gly Gly Ala Asn Leu Ser Gln Asp Asp Ser Gln Pro Trp
20 25 30
Thr Ser Asp Glu Thr Val Val Ala Gly Gly Thr Val Val Leu Lys Cys
35 40 45
Gln Val Lys Asp His Glu Asp Ser Ser Leu Gln Trp Ser Asn Pro Ala
50 55 60
Gln Gln Thr Leu Tyr Phe Gly Glu Lys Arg Ala Leu Arg Asp Asn Arg
65 70 75 80
Ile Gln Leu Val Ser Ser Thr Pro His Glu Leu Ser Ile Ser Ile Ser
85 90 95
Asn Val Ala Leu Ala Asp Glu Gly Glu Tyr Thr Cys Ser Ile Phe Thr
100 105 110
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115 120 125
Gln Lys Pro Ile Ile Thr Gly Tyr Lys Ser Ser Leu Arg Glu Lys Glu
130 135 140
Thr Ala Thr Leu Asn Cys Gln Ser Ser Gly Ser Lys Pro Ala Ala Gln
145 150 155 160
Leu Thr Trp Arg Lys Gly Asp Gln Glu Leu His Gly Asp Gln Thr Arg
165 170 175
Ile Gln Glu Asp Pro Asn Gly Lys Thr Phe Thr Val Ser Ser Ser Val
180 185 190
Ser Phe Gln Val Thr Arg Glu Asp Asp Gly Ala Asn Ile Val Cys Ser
195 200 205
Val Asn His Glu Ser Leu Lys Gly Ala Asp Arg Ser Thr Ser Gln Arg
210 215 220
Ile Glu Val Leu Tyr Thr Pro Thr Ala Met Ile Arg Pro Glu Pro Ala
225 230 235 240
His Pro Arg Glu Gly Gln Lys Leu Leu Leu His Cys Glu Gly Arg Gly
245 250 255
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260 265 270
Pro Leu Lys Met Thr Gln Glu Ser Ala Leu Ile Phe Pro Phe Leu Asn
275 280 285
Lys Ser Asp Ser Gly Thr Tyr Gly Cys Thr Ala Thr Ser Asn Met Gly
290 295 300
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Pro Ser Ser Ser Ser Thr Tyr His Ala Ile Ile Gly Gly Ile Val Ala
325 330 335
Phe Ile Val Phe Leu Leu Leu Ile Leu Leu Ile Phe Leu Gly His Tyr
340 345 350
Leu Ile Arg His Lys Gly Thr Tyr Leu Thr His Glu Ala Lys Gly Ser
355 360 365
Asp Asp Ala Pro Asp Ala Asp Thr Ala Ile Ile Asn Ala Glu Gly Gly
370 375 380
Gln Ser Gly Gly Asp Asp Lys Lys Glu Tyr Phe Ile
385 390 395
<210> 55
<211> 1191
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：包括信号序列的食蟹猴CADM3的碱基序列
<400> 55
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catcctcgtg agggccagaa gctgttgcta cactgtgagg gtcgtggcaa tccagtcccc 780
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agcaacatgg gcagctacaa ggcctactac actctcaacg ttaatgaccc cagtccggtg 960
ccctcctcct ccagcaccta ccacgccatc atcggcggga tcgtggcttt cattgtcttc 1020
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<210> 56
<211> 396
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：包括信号序列的食蟹猴CADM3的氨基酸序列
<400> 56
Met Gly Ala Pro Val Ala Leu Leu Leu Leu Leu Leu Phe Ala Cys Cys
1 5 10 15
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Gln Val Lys Asp His Glu Asp Ser Ser Leu Gln Trp Ser Asn Pro Ala
50 55 60
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Met Pro Val Arg Thr Ala Lys Ser Leu Val Thr Val Leu Gly Ile Pro
115 120 125
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Ile Glu Val Leu Tyr Thr Pro Thr Ala Met Ile Arg Pro Asp Pro Pro
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275 280 285
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Gln Ser Gly Gly Asp Asp Lys Lys Glu Tyr Phe Ile
385 390 395
<210> 57
<211> 1713
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：包括信号序列的hCADM3-FLAG_Fc的碱基序列
<400> 57
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<210> 58
<211> 570
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：包括信号序列的hCADM3-FLAG_Fc的氨基酸序列
<400> 58
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1 5 10 15
Cys Cys Trp Ala Pro Gly Gly Ala Asn Leu Ser Gln Asp Asp Ser Gln
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195 200 205
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245 250 255
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<210> 59
<211> 1707
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：包括信号序列的mCADM3-FLAG_Fc的碱基序列
<400> 59
atgggggccc cttccgccct gcccctgctc ctgctcctcg cctgctcctg ggcgcccggc 60
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<210> 60
<211> 568
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：包括信号序列的mCADM3-FLAG_Fc的氨基酸序列
<400> 60
Met Gly Ala Pro Ser Ala Leu Pro Leu Leu Leu Leu Leu Ala Cys Ser
1 5 10 15
Trp Ala Pro Gly Gly Ala Asn Leu Ser Gln Asp Asp Ser Gln Pro Trp
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35 40 45
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100 105 110
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130 135 140
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245 250 255
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260 265 270
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305 310 315 320
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325 330 335
Asp Asp Lys Thr Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
340 345 350
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Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
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<210> 61
<211> 1707
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：包括信号序列的rCADM3-FLAG_Fc的碱基序列
<400> 61
atgggggccc cttccgccct gcccctgctc ctgctcctcg cctgctcctg ggcgcccggc 60
ggggccaatc tttcccagga cgatagccag ccctggacgt ctgatgaaac agtggtggct 120
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gcactcatct tcccattttt gaacaaaagt gacagtggca cctatggctg tacagccacg 900
agcaacatgg gcagctatac agcctacttc actctcaatg tcaacgaccc tagtccagtg 960
ccctcatcct ccagtactta ccactctaga gcagactaca aggacgacga tgacaagact 1020
agtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca 1080
gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 1140
acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 1200
gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 1260
taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 1320
aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 1380
aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga tgagctgacc 1440
aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 1500
gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 1560
tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 1620
gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 1680
agcctctccc tgtctccggg taaatga 1707
<210> 62
<211> 568
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：包括信号序列的rCADM3-FLAG_Fc的氨基酸序列
<400> 62
Met Gly Ala Pro Ser Ala Leu Pro Leu Leu Leu Leu Leu Ala Cys Ser
1 5 10 15
Trp Ala Pro Gly Gly Ala Asn Leu Ser Gln Asp Asp Ser Gln Pro Trp
20 25 30
Thr Ser Asp Glu Thr Val Val Ala Gly Gly Thr Val Val Leu Lys Cys
35 40 45
Gln Val Lys Asp His Glu Asp Ser Ser Leu Gln Trp Ser Asn Pro Ala
50 55 60
Gln Gln Thr Leu Tyr Phe Gly Glu Lys Arg Ala Leu Arg Asp Asn Arg
65 70 75 80
Ile Gln Leu Val Ser Ser Thr Pro His Glu Leu Ser Ile Ser Ile Ser
85 90 95
Asn Val Ala Leu Ala Asp Glu Gly Glu Tyr Thr Cys Ser Ile Phe Thr
100 105 110
Met Pro Val Arg Thr Ala Lys Ser Leu Val Thr Val Leu Gly Ile Pro
115 120 125
Gln Lys Pro Ile Ile Thr Gly Tyr Lys Ser Ser Leu Arg Glu Lys Glu
130 135 140
Thr Ala Thr Leu Asn Cys Gln Ser Ser Gly Ser Lys Pro Ala Ala Gln
145 150 155 160
Leu Ala Trp Arg Lys Gly Asp Gln Glu Leu His Gly Asp Gln Thr Arg
165 170 175
Ile Gln Glu Asp Pro Asn Gly Lys Thr Phe Thr Val Ser Ser Ser Val
180 185 190
Ser Phe Gln Val Thr Arg Asp Asp Asp Gly Ala Asn Val Val Cys Ser
195 200 205
Val Asn His Glu Ser Leu Lys Gly Ala Asp Arg Ser Thr Ser Gln Arg
210 215 220
Ile Glu Val Leu Tyr Thr Pro Thr Ala Met Ile Arg Pro Glu Pro Ala
225 230 235 240
His Pro Arg Glu Gly Gln Lys Leu Leu Leu His Cys Glu Gly Arg Gly
245 250 255
Asn Pro Val Pro Gln Gln Tyr Val Trp Val Lys Glu Gly Ser Glu Pro
260 265 270
Pro Leu Lys Met Thr Gln Glu Ser Ala Leu Ile Phe Pro Phe Leu Asn
275 280 285
Lys Ser Asp Ser Gly Thr Tyr Gly Cys Thr Ala Thr Ser Asn Met Gly
290 295 300
Ser Tyr Thr Ala Tyr Phe Thr Leu Asn Val Asn Asp Pro Ser Pro Val
305 310 315 320
Pro Ser Ser Ser Ser Thr Tyr His Ser Arg Ala Asp Tyr Lys Asp Asp
325 330 335
Asp Asp Lys Thr Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
340 345 350
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
355 360 365
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
370 375 380
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
385 390 395 400
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
405 410 415
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
420 425 430
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
435 440 445
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
450 455 460
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
465 470 475 480
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
485 490 495
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
500 505 510
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
515 520 525
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
530 535 540
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
545 550 555 560
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
565
<210> 63
<211> 1683
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：包括信号序列的hCADM3-GST的碱基序列
<400> 63
atgggggccc cagccgcctc gctcctgctc ctgctcctgc tgttcgcctg ctgctgggcg 60
cccggcgggg ccaacctctc ccaggacgac agccagccct ggacatctga tgaaacagtg 120
gtggctggtg gcaccgtggt gctcaagtgc caagtgaaag atcacgagga ctcatccctg 180
caatggtcta accctgctca gcagactctc tactttgggg agaagagagc ccttcgagat 240
aatcgaattc agctggttac ctctacgccc cacgagctca gcatcagcat cagcaatgtg 300
gccctggcag acgagggcga gtacacctgc tcaatcttca ctatgcctgt gcgaactgcc 360
aagtccctcg tcactgtgct aggaattcca cagaagccca tcatcactgg ttataaatct 420
tcattacggg aaaaagacac agccacccta aactgtcagt cttctgggag caagcctgca 480
gcccggctca cctggagaaa gggtgaccaa gaactccacg gagaaccaac ccgcatacag 540
gaagatccca atggtaaaac cttcactgtc agcagctcgg tgacattcca ggttacccgg 600
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agatccacct ctcaacgcat tgaagtttta tacacaccaa ctgcgatgat taggccagac 720
cctccccatc ctcgtgaggg ccagaagctg ttgctacact gtgagggtcg cggcaatcca 780
gtcccccagc agtacctatg ggagaaggag ggcagtgtgc cacccctgaa gatgacccag 840
gagagtgccc tgatcttccc tttcctcaac aagagtgaca gtggcaccta cggctgcaca 900
gccaccagca acatgggcag ctacaaggcc tactacaccc tcaatgttaa tgaccccagt 960
ccggtgccct cctcctccag cacctaccac ggtaccctgg aagttctgtt ccaggggccc 1020
atgtccccta tactaggtta ttggaaaatt aagggccttg tgcaacccac tcgacttctt 1080
ttggaatatc ttgaagaaaa atatgaagag catttgtatg agcgcgatga aggtgataaa 1140
tggcgaaaca aaaagtttga attgggtttg gagtttccca atcttcctta ttatattgat 1200
ggtgatgtta aattaacaca gtctatggcc atcatacgtt atatagctga caagcacaac 1260
atgttgggtg gttgtccaaa agagcgtgca gagatttcaa tgcttgaagg agcggttttg 1320
gatattagat acggtgtttc gagaattgca tatagtaaag actttgaaac tctcaaagtt 1380
gattttctta gcaagctacc tgaaatgctg aaaatgttcg aagatcgttt atgtcataaa 1440
acatatttaa atggtgatca tgtaacccat cctgacttca tgttgtatga cgctcttgat 1500
gttgttttat acatggaccc aatgtgcctg gatgcgttcc caaaattagt ttgttttaaa 1560
aaacgtattg aagctatccc acaaattgat aagtacttga aatccagcaa gtatatagca 1620
tggcctttgc agggctggca agccacgttt ggtggtggcg accatcctcc aaaatcggat 1680
tga 1683
<210> 64
<211> 560
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：包括信号序列的hCADM3-GST的氨基酸序列
<400> 64
Met Gly Ala Pro Ala Ala Ser Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Phe Ala
1 5 10 15
Cys Cys Trp Ala Pro Gly Gly Ala Asn Leu Ser Gln Asp Asp Ser Gln
20 25 30
Pro Trp Thr Ser Asp Glu Thr Val Val Ala Gly Gly Thr Val Val Leu
35 40 45
Lys Cys Gln Val Lys Asp His Glu Asp Ser Ser Leu Gln Trp Ser Asn
50 55 60
Pro Ala Gln Gln Thr Leu Tyr Phe Gly Glu Lys Arg Ala Leu Arg Asp
65 70 75 80
Asn Arg Ile Gln Leu Val Thr Ser Thr Pro His Glu Leu Ser Ile Ser
85 90 95
Ile Ser Asn Val Ala Leu Ala Asp Glu Gly Glu Tyr Thr Cys Ser Ile
100 105 110
Phe Thr Met Pro Val Arg Thr Ala Lys Ser Leu Val Thr Val Leu Gly
115 120 125
Ile Pro Gln Lys Pro Ile Ile Thr Gly Tyr Lys Ser Ser Leu Arg Glu
130 135 140
Lys Asp Thr Ala Thr Leu Asn Cys Gln Ser Ser Gly Ser Lys Pro Ala
145 150 155 160
Ala Arg Leu Thr Trp Arg Lys Gly Asp Gln Glu Leu His Gly Glu Pro
165 170 175
Thr Arg Ile Gln Glu Asp Pro Asn Gly Lys Thr Phe Thr Val Ser Ser
180 185 190
Ser Val Thr Phe Gln Val Thr Arg Glu Asp Asp Gly Ala Ser Ile Val
195 200 205
Cys Ser Val Asn His Glu Ser Leu Lys Gly Ala Asp Arg Ser Thr Ser
210 215 220
Gln Arg Ile Glu Val Leu Tyr Thr Pro Thr Ala Met Ile Arg Pro Asp
225 230 235 240
Pro Pro His Pro Arg Glu Gly Gln Lys Leu Leu Leu His Cys Glu Gly
245 250 255
Arg Gly Asn Pro Val Pro Gln Gln Tyr Leu Trp Glu Lys Glu Gly Ser
260 265 270
Val Pro Pro Leu Lys Met Thr Gln Glu Ser Ala Leu Ile Phe Pro Phe
275 280 285
Leu Asn Lys Ser Asp Ser Gly Thr Tyr Gly Cys Thr Ala Thr Ser Asn
290 295 300
Met Gly Ser Tyr Lys Ala Tyr Tyr Thr Leu Asn Val Asn Asp Pro Ser
305 310 315 320
Pro Val Pro Ser Ser Ser Ser Thr Tyr His Gly Thr Leu Glu Val Leu
325 330 335
Phe Gln Gly Pro Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly
340 345 350
Leu Val Gln Pro Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr
355 360 365
Glu Glu His Leu Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys
370 375 380
Lys Phe Glu Leu Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp
385 390 395 400
Gly Asp Val Lys Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala
405 410 415
Asp Lys His Asn Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile
420 425 430
Ser Met Leu Glu Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg
435 440 445
Ile Ala Tyr Ser Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser
450 455 460
Lys Leu Pro Glu Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys
465 470 475 480
Thr Tyr Leu Asn Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr
485 490 495
Asp Ala Leu Asp Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala
500 505 510
Phe Pro Lys Leu Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln
515 520 525
Ile Asp Lys Tyr Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln
530 535 540
Gly Trp Gln Ala Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp
545 550 555 560
<210> 65
<211> 1677
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：包括信号序列的mCADM3-GST的碱基序列
<400> 65
atgggggccc cttccgccct gcccctgctc ctgctcctcg cctgctcctg ggcgcccggc 60
ggggccaatc tttcccagga cgatagccag ccctggacat ctgatgaaac agttgtggct 120
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cagcagtacg tgtgggtaaa ggaaggcagt gagccacccc tcaagatgac ccaagagagt 840
gctctcatct tccccttttt gaataagagt gacagtggca cttatggctg tacagccaca 900
agcaacatgg gcagctatac agcctacttc accctcaatg tcaacgaccc cagtccagtg 960
ccctcgtcct ccagtaccta ccacggtacc ctggaagttc tgttccaggg gcccatgtcc 1020
cctatactag gttattggaa aattaagggc cttgtgcaac ccactcgact tcttttggaa 1080
tatcttgaag aaaaatatga agagcatttg tatgagcgcg atgaaggtga taaatggcga 1140
aacaaaaagt ttgaattggg tttggagttt cccaatcttc cttattatat tgatggtgat 1200
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agatacggtg tttcgagaat tgcatatagt aaagactttg aaactctcaa agttgatttt 1380
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ttaaatggtg atcatgtaac ccatcctgac ttcatgttgt atgacgctct tgatgttgtt 1500
ttatacatgg acccaatgtg cctggatgcg ttcccaaaat tagtttgttt taaaaaacgt 1560
attgaagcta tcccacaaat tgataagtac ttgaaatcca gcaagtatat agcatggcct 1620
ttgcagggct ggcaagccac gtttggtggt ggcgaccatc ctccaaaatc ggattga 1677
<210> 66
<211> 558
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：包括信号序列的mCADM3-GST的氨基酸序列
<400> 66
Met Gly Ala Pro Ser Ala Leu Pro Leu Leu Leu Leu Leu Ala Cys Ser
1 5 10 15
Trp Ala Pro Gly Gly Ala Asn Leu Ser Gln Asp Asp Ser Gln Pro Trp
20 25 30
Thr Ser Asp Glu Thr Val Val Ala Gly Gly Thr Val Val Leu Lys Cys
35 40 45
Gln Val Lys Asp His Glu Asp Ser Ser Leu Gln Trp Ser Asn Pro Ala
50 55 60
Gln Gln Thr Leu Tyr Phe Gly Glu Lys Arg Ala Leu Arg Asp Asn Arg
65 70 75 80
Ile Gln Leu Val Ser Ser Thr Pro His Glu Leu Ser Ile Ser Ile Ser
85 90 95
Asn Val Ala Leu Ala Asp Glu Gly Glu Tyr Thr Cys Ser Ile Phe Thr
100 105 110
Met Pro Val Arg Thr Ala Lys Ser Leu Val Thr Val Leu Gly Ile Pro
115 120 125
Gln Lys Pro Ile Ile Thr Gly Tyr Lys Ser Ser Leu Arg Glu Lys Glu
130 135 140
Thr Ala Thr Leu Asn Cys Gln Ser Ser Gly Ser Lys Pro Ala Ala Gln
145 150 155 160
Leu Thr Trp Arg Lys Gly Asp Gln Glu Leu His Gly Asp Gln Thr Arg
165 170 175
Ile Gln Glu Asp Pro Asn Gly Lys Thr Phe Thr Val Ser Ser Ser Val
180 185 190
Ser Phe Gln Val Thr Arg Glu Asp Asp Gly Ala Asn Ile Val Cys Ser
195 200 205
Val Asn His Glu Ser Leu Lys Gly Ala Asp Arg Ser Thr Ser Gln Arg
210 215 220
Ile Glu Val Leu Tyr Thr Pro Thr Ala Met Ile Arg Pro Glu Pro Ala
225 230 235 240
His Pro Arg Glu Gly Gln Lys Leu Leu Leu His Cys Glu Gly Arg Gly
245 250 255
Asn Pro Val Pro Gln Gln Tyr Val Trp Val Lys Glu Gly Ser Glu Pro
260 265 270
Pro Leu Lys Met Thr Gln Glu Ser Ala Leu Ile Phe Pro Phe Leu Asn
275 280 285
Lys Ser Asp Ser Gly Thr Tyr Gly Cys Thr Ala Thr Ser Asn Met Gly
290 295 300
Ser Tyr Thr Ala Tyr Phe Thr Leu Asn Val Asn Asp Pro Ser Pro Val
305 310 315 320
Pro Ser Ser Ser Ser Thr Tyr His Gly Thr Leu Glu Val Leu Phe Gln
325 330 335
Gly Pro Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val
340 345 350
Gln Pro Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu
355 360 365
His Leu Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe
370 375 380
Glu Leu Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp
385 390 395 400
Val Lys Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys
405 410 415
His Asn Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met
420 425 430
Leu Glu Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala
435 440 445
Tyr Ser Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu
450 455 460
Pro Glu Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr
465 470 475 480
Leu Asn Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala
485 490 495
Leu Asp Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro
500 505 510
Lys Leu Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp
515 520 525
Lys Tyr Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp
530 535 540
Gln Ala Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp
545 550 555
<210> 67
<211> 372
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：不包括信号序列的iCADM3_3R1-L8_01的VHH的碱基序列
<400> 67
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actgttagtt cc 372
<210> 68
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：不包括信号序列的iCADM3_3R1-L8_01的VHH的氨基酸序列
<400> 68
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Arg Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Asp Tyr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Ala
50 55 60
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65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Pro Ala Ser Arg Arg Pro Ser Trp Asp Ala Asp Gly Tyr Asp
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Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 69
<211> 372
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：不包括信号序列的iCADM3_3R1-L8_02的VHH的碱基序列
<400> 69
caagtccaac ttgtccaaag tggcggtggg ttggtccagc ccggcggttc tttgaggttg 60
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<210> 70
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：不包括信号序列的iCADM3_3R1-L8_02的VHH的氨基酸序列
<400> 70
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Arg Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Asp Tyr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Ala
50 55 60
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65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Pro Ala Ser Arg Arg Pro Ser Trp Asp Ala Asp Gly Tyr Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 71
<211> 372
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：不包括信号序列的iCADM3_3R1-L8_03的VHH的碱基序列
<400> 71
caagttcaac ttgtagagtc tggaggcggt ctggttcaac ctggtgggtc cctccgcctt 60
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accgtttcat ca 372
<210> 72
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：不包括信号序列的iCADM3_3R1-L8_03的VHH的氨基酸序列
<400> 72
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Arg Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Asp Tyr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Ala
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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<210> 73
<211> 372
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：不包括信号序列的iCADM3_3R1-L8_04的VHH的碱基序列
<400> 73
caggttcagt tggttgagag cggtggtggt ctggtacagc ccggcggtag cttgcgactt 60
tcctgtgcag ccagtggtcg gacattttct aactatgccc gaggctggtt tcgccaggcc 120
cccggaaagg aacgtgagtt cgttgcagct atagattact ccggaggatc aaccaattat 180
gccgattctg caaaaggacg ctttaccatc tcccgtgaca atagtaaaaa taccgtgtac 240
ttgcaaatga acagcttgag ggcagaggat accgctgttt attactgcgc cgctcccgct 300
agtcgcaggc catcctggga cgcagatggg tatgattact ggggccaagg caccctcgta 360
actgtttcct cc 372
<210> 74
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：不包括信号序列的iCADM3_3R1-L8_04的VHH的氨基酸序列
<400> 74
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Arg Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Asp Tyr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Ala
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Pro Ala Ser Arg Arg Pro Ser Trp Asp Ala Asp Gly Tyr Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 75
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：不包括信号序列的iCADM3_3R1-L11_01的VHH的碱基序列
<400> 75
gaggtccaac ttgtagagtc tggaggggga ttgattcaac ccggcgggag tcttagactt 60
agctgtgccg catcagggag cacagtgtca ttcaatgcta tggggtggta tagacaagca 120
cctgggaaag gtcttggtct ggtagccgtc atcacttctg gtgggtacac caattatgcc 180
gacagcgtca aaggccgttt taccattagt cgtgacaaca gcaagaatac cctctttctg 240
caaatgaaca gccttagagc tgaagacaca gccgtatact attgtaatgc cgagggggta 300
tattcagact atgttattat gaattattgg ggtcaaggca ctctcgttac cgtaagttca 360
<210> 76
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：不包括信号序列的iCADM3_3R1-L11_01的VHH的氨基酸序列
<400> 76
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Val Ser Phe Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gly Leu Val
35 40 45
Ala Val Ile Thr Ser Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn
85 90 95
Ala Glu Gly Val Tyr Ser Asp Tyr Val Ile Met Asn Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 77
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：不包括信号序列的iCADM3_3R1-L11_02的VHH的碱基序列
<400> 77
gaggtacagt tggtggagag tggtggcgga ttgatccaac caggggggag cctgcgactc 60
tcctgtgctg ccagcggatc tacagtctct tttaatgcca tgggttggta tcgacaggct 120
ccaggtaaag gacgggtttt ggtcgcagta attactagcg gaggatacac aaactacgca 180
gactctgtca aggggcggtt tacaatatct cgggataact ccaagaacac cgtctatctt 240
caaatgaata gtttgcgggc cgaagatact gctgtctatt actgcaatgc tgaaggtgtg 300
tattccgatt atgttataat gaactattgg ggccagggca ccctggtcac agttagcagc 360
<210> 78
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：不包括信号序列的iCADM3_3R1-L11_02的VHH的氨基酸序列
<400> 78
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Val Ser Phe Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Val Leu Val
35 40 45
Ala Val Ile Thr Ser Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn
85 90 95
Ala Glu Gly Val Tyr Ser Asp Tyr Val Ile Met Asn Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 79
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：不包括信号序列的iCADM3_3R1-L11_03的VHH的碱基序列
<400> 79
gaagttcagt tggtagaatc cgggggaggt ttgattcaac ccggtgggag ccttagattg 60
agctgtgcag ccagcggctc aaccgtatct tttaacgcta tgggttggta tcggcaagcc 120
ccaggcaaac aaaggggttt ggtcagcgtc attaccagtg gtggttacac aaactacgca 180
gattcagtta agggccgctt cacaatctcc cgcgacaatt ccaaaaacac tgtgtatttg 240
caaatgaata gcttgagggc tgaagacaca gcagtatatt actgcaatgc tgagggtgta 300
tattctgact acgtaatcat gaactactgg ggacaaggca ctctggtgac cgtgagtagt 360
<210> 80
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：不包括信号序列的iCADM3_3R1-L11_03的VHH的氨基酸序列
<400> 80
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Val Ser Phe Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Gly Leu Val
35 40 45
Ser Val Ile Thr Ser Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn
85 90 95
Ala Glu Gly Val Tyr Ser Asp Tyr Val Ile Met Asn Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 81
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：不包括信号序列的iCADM3_3R1-L11_04的VHH的碱基序列
<400> 81
gaagtccaac tggtagagag cggtgggggc cttattcagg caggaggctc tcttcgtctt 60
tcttgcgccg ccagcggcag tatcgttagc tttaatgcca tgggttggta tcgacaggcc 120
cctgggaaac aaagggggtt ggtcgcagta ataaccagtg gagggtacac caattatgca 180
gattctgtca agggaagatt caccatatca agggacaaca gtaagaacac attgtttctt 240
caaatgaata gtttgcgtgc agaagacaca gcagtgtact attgtaacgc tgagggcgtg 300
tactccgact atgttattat gaattactgg ggtcaaggta cactggtcac agttagcagc 360
<210> 82
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：不包括信号序列的iCADM3_3R1-L11_04的VHH的氨基酸序列
<400> 82
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Val Ser Phe Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Gly Leu Val
35 40 45
Ala Val Ile Thr Ser Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn
85 90 95
Ala Glu Gly Val Tyr Ser Asp Tyr Val Ile Met Asn Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 83
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：不包括信号序列的iCADM3_3R1-L11_05的VHH的碱基序列
<400> 83
gaggttcagc tcgtagaaag tggggggggc ctgatacagc caggcgggag ccttagattg 60
agttgtgccg catccgggtc catattttca tttaacgcca tgggttggta cagacaagca 120
ccaggcaaag ggcgcgtatt ggtagctgtt atcaccagtg gtgggtacac aaactacgcc 180
gatagtgtta aagggcgatt tacaatatcc agagacaatt ccaaaaatac cgtttacctc 240
caaatgaata gccttagagc tgaggacact gctgtatact attgcaacgc tgagggcgta 300
tactccgatt acgtgataat gaactactgg ggccaaggca ctctggtcac cgtgtcatcc 360
<210> 84
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：不包括信号序列的iCADM3_3R1-L11_05的VHH的氨基酸序列
<400> 84
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Phe Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Val Leu Val
35 40 45
Ala Val Ile Thr Ser Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn
85 90 95
Ala Glu Gly Val Tyr Ser Asp Tyr Val Ile Met Asn Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 85
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：不包括信号序列的iCADM3_3R1-L11_06的VHH的碱基序列
<400> 85
caggttcaac tcgttgaatc tggtggaggg ttggtccagg cagggggcag tttgagactg 60
agctgcgccg catccggctc tattttctca tttaacgcca tggggtggta tcgacaggca 120
ccaggtaagc aacgcggtct cgttgcagtg ataaccagtg ggggctatac aaactatgct 180
gatagtgtta aaggcaggtt caccatcagt cgggacaaca gcaagaacac cgtcttcttg 240
caaatgaatt ctcttagagc tgaagatact gctgtatatt attgcaacgc cgagggtgtg 300
tattccgatt acgtgataat gaactactgg gggcagggga cacttgtgac cgttagttca 360
<210> 86
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：不包括信号序列的iCADM3_3R1-L11_06的VHH的氨基酸序列
<400> 86
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Phe Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Gly Leu Val
35 40 45
Ala Val Ile Thr Ser Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Phe Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn
85 90 95
Ala Glu Gly Val Tyr Ser Asp Tyr Val Ile Met Asn Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 87
<211> 375
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：不包括信号序列的CADM 3219的VH的碱基序列
<400> 87
caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60
tcctgcaagg cctctggata cagcttcacc ggctactata tacactgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag gacttgagtg gatgggacgg atcaacccta acagtggtgg cacaacttat 180
gcaccgaagt ttcagggcag gttcaccatg accagagaca cgtccacgac cacagtgtac 240
ttggaactga gcggcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagttctg 300
gaacgacagg gcaggccctt cgaggctgat gcttttgata tctggggcca agggacaatg 360
gtcaccgtct cttca 375
<210> 88
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：不包括信号序列的CADM 3219的VH的氨基酸序列
<400> 88
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Thr Tyr Ala Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Phe Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Thr Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Leu Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Leu Glu Arg Gln Gly Arg Pro Phe Glu Ala Asp Ala Phe
100 105 110
Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 89
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：CADM3219的HCDR1的氨基酸序列
<400> 89
Gly Tyr Tyr Ile His
1 5
<210> 90
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：CADM3219的HCDR2的氨基酸序列
<400> 90
Arg Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Thr Tyr Ala Pro Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 91
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：CADM3219的HCDR3的氨基酸序列
<400> 91
Val Leu Glu Arg Gln Gly Arg Pro Phe Glu Ala Asp Ala Phe Asp Ile
1 5 10 15
<210> 92
<211> 327
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：不包括信号序列的CADM3219的VL的碱基序列
<400> 92
gaaatagtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcacctcc gtggacgttc 300
ggccaaggga ccaaggtgga aataaaa 327
<210> 93
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：不包括信号序列的CADM3219的VL的氨基酸序列
<400> 93
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 94
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：CADM3219的LCDR1的氨基酸序列
<400> 94
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 95
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：CADM3219的LCDR2的氨基酸序列
<400> 95
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr
1 5
<210> 96
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：CADM3219的LCDR3的氨基酸序列
<400> 96
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Pro Trp Thr
1 5 10
<210> 97
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：不包括信号序列的CADM3301的VH的碱基序列
<400> 97
cagatgcagc tggtgcaatc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggagg caccttcaac aactatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggg aatattcctc tttctggaac accaaagtac 180
gcacagaagt ttcagggcag aatcacgatg accgcggaca aatccacgag cacagagtac 240
atggaactga gcagcctgac atctgaggac acggccgtat actactgtgc gagagatacc 300
ccgagtggct acaattcccc ctactactat aaaggaatgg acgtctgggg ccaagggacc 360
atggtcaccg tctcttca 378
<210> 98
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：不包括信号序列的CADM3301的VH的氨基酸序列
<400> 98
Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Asn Asn Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Asn Ile Pro Leu Ser Gly Thr Pro Lys Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Ile Thr Met Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Glu Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Thr Pro Ser Gly Tyr Asn Ser Pro Tyr Tyr Tyr Lys Gly
100 105 110
Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 99
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：CADM3301的HCDR1的氨基酸序列
<400> 99
Asn Tyr Ala Ile Ser
1 5
<210> 100
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：CADM3301的HCDR2的氨基酸序列
<400> 100
Gly Asn Ile Pro Leu Ser Gly Thr Pro Lys Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 101
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：CADM3301的HCDR3的氨基酸序列
<400> 101
Asp Thr Pro Ser Gly Tyr Asn Ser Pro Tyr Tyr Tyr Lys Gly Met Asp
1 5 10 15
Val
<210> 102
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：不包括信号序列的CADM3309的VH的碱基序列
<400> 102
gaggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag atgaagaagc ctgggtcctc ggtgaagctc 60
tcctgcaaat tttctggagg cgacttcagg agttatccta tcagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggcggc atcatcccga tttttagtcg agtaaactat 180
gcacagagat tcctgggcag aatcacgatt accgcggacg aatccacgag cacagcctac 240
atggaattga gaagcctgac gtctgacgac acggccgtct attactgtgc gacagatacc 300
ccgagtggct acaactcccc ctactactat aaaggaatgg acgtctgggg ccaggggacc 360
ctggtcaccg tctcctca 378
<210> 103
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：不包括信号序列的CADM3309的VH的氨基酸序列
<400> 103
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Met Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Phe Ser Gly Gly Asp Phe Arg Ser Tyr
20 25 30
Pro Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Ser Arg Val Asn Tyr Ala Gln Arg Phe
50 55 60
Leu Gly Arg Ile Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Asp Thr Pro Ser Gly Tyr Asn Ser Pro Tyr Tyr Tyr Lys Gly
100 105 110
Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 104
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：CADM3309的HCDR1的氨基酸序列
<400> 104
Ser Tyr Pro Ile Ser
1 5
<210> 105
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：CADM3309的HCDR2的氨基酸序列
<400> 105
Gly Ile Ile Pro Ile Phe Ser Arg Val Asn Tyr Ala Gln Arg Phe Leu
1 5 10 15
Gly
<210> 106
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：CADM3309的HCDR3的氨基酸序列
<400> 106
Asp Thr Pro Ser Gly Tyr Asn Ser Pro Tyr Tyr Tyr Lys Gly Met Asp
1 5 10 15
Val
<210> 107
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：不包括信号序列的CADM3312的VH的碱基序列
<400> 107
cagctgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60
acctgcagtg tctctggtgg ctccatcaga ggacactatt ggagttggat ccggcagccc 120
ccagggaagg gactggagtg gatgggttac atcaaccaca ttgggagcgc cgcctacaac 180
ccctccctca agagtcgagt caccatatca gtagacacgt ccaagaacca gttctccctg 240
aagctgagct ctgtgaccgc cgcagacacg gccgtgtatt actgtgcgag aatggggcca 300
tggtgggagc ttgactactg gggccaggga accctggtca ccgtctcctc a 351
<210> 108
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：不包括信号序列的CADM3312的VH的氨基酸序列
<400> 108
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Ser Gly Gly Ser Ile Arg Gly His
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn His Ile Gly Ser Ala Ala Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Met Gly Pro Trp Trp Glu Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 109
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：CADM3312的HCDR1的氨基酸序列
<400> 109
Gly His Tyr Trp Ser
1 5
<210> 110
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：CADM3312的HCDR2的氨基酸序列
<400> 110
Tyr Ile Asn His Ile Gly Ser Ala Ala Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 111
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：CADM3312的HCDR3的氨基酸序列
<400> 111
Met Gly Pro Trp Trp Glu Leu Asp Tyr
1 5
<210> 112
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：不包括信号序列的CADM3314的VH的碱基序列
<400> 112
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctggggggtc cctgagactt 60
tcctgtgcag cgtctggatt cagtttcaat aatcatggca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtgacattt atccggtttg atggaagtag taaatactat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa caccgtgtat 240
ctggaaatga acagcctgag agcagaggac acgggtgtgt attactgtgt gaatacgcca 300
aggggttggt ccttcgatat ctggggccgt ggcaccctgg tcactgtctc ctca 354
<210> 113
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：不包括信号序列的CADM3314的VH的氨基酸序列
<400> 113
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Asn Asn His
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Thr Phe Ile Arg Phe Asp Gly Ser Ser Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Asn Thr Pro Arg Gly Trp Ser Phe Asp Ile Trp Gly Arg Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 114
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：CADM3314的HCDR1的氨基酸序列
<400> 114
Asn His Gly Met His
1 5
<210> 115
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：CADM3314的HCDR2的氨基酸序列
<400> 115
Phe Ile Arg Phe Asp Gly Ser Ser Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 116
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：CADM3314的HCDR3的氨基酸序列
<400> 116
Thr Pro Arg Gly Trp Ser Phe Asp Ile
1 5
<210> 117
<211> 384
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：不包括信号序列的CADM3316的VH的碱基序列
<400> 117
gaggtgcagc tggtggagac tgggggagcc ttggtacagc ctggggggtc cctaagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctattcca tgaactgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg gctctcaggt attagtggtg gtgcttttag cacacactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agctgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagtaggt 300
cggttgagtg ggagctacaa cagatactac tactactacg gtatggacgt ctggggccaa 360
gggaccctgg tcaccgtctc ctca 384
<210> 118
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：不包括信号序列的CADM3316的VH的氨基酸序列
<400> 118
Glu Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Ala Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Gly Gly Ala Phe Ser Thr His Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Gly Arg Leu Ser Gly Ser Tyr Asn Arg Tyr Tyr Tyr Tyr
100 105 110
Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 119
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：CADM3316的HCDR1的氨基酸序列
<400> 119
Ser Tyr Ser Met Asn
1 5
<210> 120
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：CADM3316的HCDR2的氨基酸序列
<400> 120
Gly Ile Ser Gly Gly Ala Phe Ser Thr His Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 121
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：CADM3316的HCDR3的氨基酸序列
<400> 121
Val Gly Arg Leu Ser Gly Ser Tyr Asn Arg Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly
1 5 10 15
Met Asp Val
<210> 122
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：不包括信号序列的CADM3349的VH的碱基序列
<400> 122
caggtgcagc tacagcagtg gggcggaggt ctgttgacgc cttcggagac cctgtccctc 60
agctgcgatg tctctggtgg ggccttcact aattaccact ggacctggat ccgccagccc 120
ccaggaaagg gactggaatg gattggagaa atctttcata ctgggaccac caactacaac 180
ccgtccctcc agggtcgagt cgccatgtct attgacacca ccaagcggca gttcttcctg 240
aggctgacgt ctctgaccgc cgcggacacg gctgtatatt actgtgcgag agttggtaaa 300
tatggctggt acgtaggtga cttttggggc cagggaacca cggtcaccgt ctcctca 357
<210> 123
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：不包括信号序列的CADM3349的VH的氨基酸序列
<400> 123
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Gly Gly Leu Leu Thr Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Ser Cys Asp Val Ser Gly Gly Ala Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
His Trp Thr Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Phe His Thr Gly Thr Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Gln
50 55 60
Gly Arg Val Ala Met Ser Ile Asp Thr Thr Lys Arg Gln Phe Phe Leu
65 70 75 80
Arg Leu Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Val Gly Lys Tyr Gly Trp Tyr Val Gly Asp Phe Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 124
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：CADM3349的HCDR1的氨基酸序列
<400> 124
Asn Tyr His Trp Thr
1 5
<210> 125
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：CADM3349的HCDR2的氨基酸序列
<400> 125
Glu Ile Phe His Thr Gly Thr Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Gln Gly
1 5 10 15
<210> 126
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：CADM3349的HCDR3的氨基酸序列
<400> 126
Val Gly Lys Tyr Gly Trp Tyr Val Gly Asp Phe
1 5 10
<210> 127
<211> 372
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：不包括信号序列的CADM3351的VH的碱基序列
<400> 127
gaagtgcagc tgttgcagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggagggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctccggact catcttcagt gaccactaca tggactgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg gactggagtg ggtcggctct attagaaata aacgtaacgg tggctccaca 180
gaatacgccg cctctgtgaa aggcagattc agcatctcaa gagatgattc aaagaattca 240
ctgtatctgc aaatgaacag cctgaaaacc gaggacacgg ccatgtattt ctgtgccaca 300
acgcgtactg gttatcaagg cttctacggc atggacgtct ggggccaagg gaccacggtc 360
accgtctcct ca 372
<210> 128
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：不包括信号序列的CADM3351的VH的氨基酸序列
<400> 128
Glu Val Gln Leu Leu Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Ile Phe Ser Asp His
20 25 30
Tyr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Ser Ile Arg Asn Lys Arg Asn Gly Gly Ser Thr Glu Tyr Ala Ala
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Ser Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr
85 90 95
Phe Cys Ala Thr Thr Arg Thr Gly Tyr Gln Gly Phe Tyr Gly Met Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 129
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：CADM3351的HCDR1的氨基酸序列
<400> 129
Asp His Tyr Met Asp
1 5
<210> 130
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：CADM3351的HCDR2的氨基酸序列
<400> 130
Ser Ile Arg Asn Lys Arg Asn Gly Gly Ser Thr Glu Tyr Ala Ala Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 131
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：CADM3351的HCDR3的氨基酸序列
<400> 131
Thr Arg Thr Gly Tyr Gln Gly Phe Tyr Gly Met Asp Val
1 5 10
<210> 132
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：不包括信号序列的CADM3301、CADM3309、CADM3312、CADM3314、CADM3316、CADM3349和CADM3351的VL的碱基序列
<400> 132
gaaatagtgt tgacgcagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag cctggtacca acagaaacct 120
ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 180
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240
gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtagcaact ggcctccgac gttcggccaa 300
gggaccaagg tggaaatcaa a 321
<210> 133
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：不包括信号序列的CADM3301、CADM3309、CADM3312、CADM3314、CADM3316、CADM3349和CADM3351的VL的氨基酸序列
<400> 133
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 134
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：CADM3301、CADM3309、CADM3312、CADM3314、CADM3316、CADM3349和 CADM3351的LCDR1的氨基酸序列
<400> 134
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 135
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：CADM3301、CADM3309、CADM3312、CADM3314、CADM3316、CADM3349和 CADM3351的LCDR2的氨基酸序列
<400> 135
Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr
1 5
<210> 136
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：CADM3301、CADM3309、CADM3312、CADM3314、CADM3316、CADM3349和 CADM3351的LCDR3的氨基酸序列
<400> 136
Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro Thr
1 5
<210> 137
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：不包括信号序列的CADM3402的VH的碱基序列
<400> 137
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc cgggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcaa cctctggatt caggttcagt atgtatggca tgcactgggt ccgccagtct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagtt atttatagcg gtggaaacac agactacgca 180
gactccgtga agggccgatt cacaatctcc agagacaatt ccaagaacac ggtgtatctt 240
caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gccgtgtatt actgtgcgag tcgtcgagta 300
gttccaggtg ttatagacta ctttgactcc tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc 360
tca 363
<210> 138
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：不包括信号序列的CADM3402的VH的氨基酸序列
<400> 138
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Arg Phe Ser Met Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Val Ile Tyr Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ser Arg Arg Val Val Pro Gly Val Ile Asp Tyr Phe Asp Ser Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 139
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：CADM3402的HCDR1的氨基酸序列
<400> 139
Met Tyr Gly Met His
1 5
<210> 140
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：CADM3402的HCDR2的氨基酸序列
<400> 140
Val Ile Tyr Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
1 5 10 15
<210> 141
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：CADM3402的HCDR3的氨基酸序列
<400> 141
Arg Arg Val Val Pro Gly Val Ile Asp Tyr Phe Asp Ser
1 5 10
<210> 142
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：不包括信号序列的CADM3404的VH的碱基序列
<400> 142
gaggtgcagc tggtggagac cggggggggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cgccttcagt aactatggca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtctcagtt atttatagcg gtggaaacac agactacgca 180
gactccgtga agggccgatt cacaatctcc agagacaatt ccaagaacac ggtgtatctt 240
caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gccgtgtatt actgtgcgag tcgtcgagta 300
gttccaggtg ttatagacta ctttgactcc tggggccagg gaaccctggt cactgtctcc 360
tca 363
<210> 143
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：不包括信号序列的CADM3404的VH的氨基酸序列
<400> 143
Glu Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Val Ile Tyr Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ser Arg Arg Val Val Pro Gly Val Ile Asp Tyr Phe Asp Ser Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 144
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：CADM3404的HCDR1的氨基酸序列
<400> 144
Asn Tyr Gly Met His
1 5
<210> 145
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：CADM3404的HCDR2的氨基酸序列
<400> 145
Val Ile Tyr Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
1 5 10 15
<210> 146
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：CADM3404的HCDR3的氨基酸序列
<400> 146
Arg Arg Val Val Pro Gly Val Ile Asp Tyr Phe Asp Ser
1 5 10
<210> 147
<211> 390
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：不包括信号序列的CADM3432的VH的碱基序列
<400> 147
caggtacagc tgcagcagtc aggtccagga ctggtgaagg cctcgcagac cctctcactc 60
acctgtgcca tctccgggga cagtgtctct agcaggagtg ctgcttggga ctggataagg 120
cagtccccat cgagaggcct tgagtggctg ggaaggacat actacaggtc cacgtggtat 180
aatgactatg catcatctgt gagaagtcga ataagcatca accccgacac atccaagaac 240
cagttctccc tgcagctgaa ctctgtgact cccgaggaca cggctgtata ttattgtgtg 300
agagcaaata ggaagcttcc agcacctgga cagcactttt attatggtat ggacgtctgg 360
ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctca 390
<210> 148
<211> 130
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：不包括信号序列的CADM3432的VH的氨基酸序列
<400> 148
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Ala Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Arg
20 25 30
Ser Ala Ala Trp Asp Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Thr Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala
50 55 60
Ser Ser Val Arg Ser Arg Ile Ser Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn
65 70 75 80
Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val
85 90 95
Tyr Tyr Cys Val Arg Ala Asn Arg Lys Leu Pro Ala Pro Gly Gln His
100 105 110
Phe Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val
115 120 125
Ser Ser
130
<210> 149
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：CADM3432的HCDR1的氨基酸序列
<400> 149
Ser Arg Ser Ala Ala Trp Asp
1 5
<210> 150
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：CADM3432的HCDR2的氨基酸序列
<400> 150
Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Thr Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala Ser Ser Val
1 5 10 15
Arg Ser
<210> 151
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：CADM3432的HCDR3的氨基酸序列
<400> 151
Ala Asn Arg Lys Leu Pro Ala Pro Gly Gln His Phe Tyr Tyr Gly Met
1 5 10 15
Asp Val
<210> 152
<211> 390
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：不包括信号序列的CADM3448的VH的碱基序列
<400> 152
caggtacagc tgcagcagtc aggtccagga ctggtgaagc ccgcgcagac cctctcactc 60
acctgtgcca tctccggaga cagtgtctcc agcaacagtg ttgcttggaa ctgggtcagg 120
cagtccccat cgagaggcct tgagtggctg ggaaggacat attacaggtc ccagtggtat 180
aacgattatg caggatctgt gagaagtcga ataaccatca gcgcagacac atctaagaac 240
cagttctccc tgcaactgaa ctctgtgact cccgaggaca cggctcttta ttattgtgtg 300
agagcaaata ggaagcttcc agcacctgga cagcactttt attatggtat ggacgtctgg 360
ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctca 390
<210> 153
<211> 130
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：不包括信号序列的CADM3448的VH的氨基酸序列
<400> 153
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ala Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Ser Val Ala Trp Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Gln Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala
50 55 60
Gly Ser Val Arg Ser Arg Ile Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn
65 70 75 80
Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Leu
85 90 95
Tyr Tyr Cys Val Arg Ala Asn Arg Lys Leu Pro Ala Pro Gly Gln His
100 105 110
Phe Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val
115 120 125
Ser Ser
130
<210> 154
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：CADM3448的HCDR1的氨基酸序列
<400> 154
Ser Asn Ser Val Ala Trp Asn
1 5
<210> 155
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：CADM3448的HCDR2的氨基酸序列
<400> 155
Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Gln Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala Gly Ser Val
1 5 10 15
Arg Ser
<210> 156
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：CADM3448的HCDR3的氨基酸序列
<400> 156
Ala Asn Arg Lys Leu Pro Ala Pro Gly Gln His Phe Tyr Tyr Gly Met
1 5 10 15
Asp Val
<210> 157
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：不包括信号序列的CADM3458的VH的碱基序列
<400> 157
gaggtgcagc tggtggagtc cgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agatatggca tacactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atttatagcg gtggaaacac agactacgca 180
gactccgtga agggccgatt cacaatctcc agagacaatt ccaagaacac ggtgtatctt 240
caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gccgtgtatt actgtgcgag tcgtcgagta 300
gttccaggtg ttatagacta ctttgactcc tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc 360
tca 363
<210> 158
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：不包括信号序列的CADM3458的VH的氨基酸序列
<400> 158
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Gly Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Tyr Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ser Arg Arg Val Val Pro Gly Val Ile Asp Tyr Phe Asp Ser Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 159
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：CADM3458的HCDR1的氨基酸序列
<400> 159
Arg Tyr Gly Ile His
1 5
<210> 160
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：CADM3458的HCDR2的氨基酸序列
<400> 160
Val Ile Tyr Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
1 5 10 15
<210> 161
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：CADM3458的HCDR3的氨基酸序列
<400> 161
Arg Arg Val Val Pro Gly Val Ile Asp Tyr Phe Asp Ser
1 5 10
<210> 162
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：不包括信号序列的CADM3402、CADM3404、CADM3432、CADM3448和 CADM3458的VL的碱基序列
<400> 162
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240
gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacagta cccctcgaac gttcggccaa 300
gggaccaagg tggaaatcaa a 321
<210> 163
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：不包括信号序列的CADM3402、CADM3404、CADM3432、CADM3448和 CADM3458的VL的氨基酸序列
<400> 163
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 164
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：CADM3402、CADM3404、CADM3432、CADM3448和 CADM3458的LCDR1的氨基酸序列
<400> 164
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 165
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：CADM3402、CADM3404、CADM3432、CADM3448和 CADM3458的LCDR2的氨基酸序列
<400> 165
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
<210> 166
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：CADM3402、CADM3404、CADM3432、CADM3448和 CADM3458的LCDR3的氨基酸序列
<400> 166
Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Arg Thr
1 5
<210> 167
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：不包括信号序列的CADM3501的VH的碱基序列
<400> 167
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttagttcagc ctgggggggc cctgagactc 60
tcctgttcag cctccggatt caccttcagt gggtactgga tgcactgggt ccgccaagct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtgtcacaa attagtagta gtggtactat catagactcc 180
gcagactttg tgaagggccg attcgccgtc tccagggaca acgccaagga cttattgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgatgac acggccgtct attactgtgc gagggggcca 300
ctggcgaaga atggttttga catttggggc caagggacaa tggtcaccgt ctcttca 357
<210> 168
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：不包括信号序列的CADM3501的VH的氨基酸序列
<400> 168
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ala Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gln Ile Ser Ser Ser Gly Thr Ile Ile Asp Ser Ala Asp Phe Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ala Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asp Leu Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Pro Leu Ala Lys Asn Gly Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 169
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：CADM3501的HCDR1的氨基酸序列
<400> 169
Gly Tyr Trp Met His
1 5
<210> 170
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：CADM3501的HCDR2的氨基酸序列
<400> 170
Gln Ile Ser Ser Ser Gly Thr Ile Ile Asp Ser Ala Asp Phe Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 171
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：CADM3501的HCDR3的氨基酸序列
<400> 171
Gly Pro Leu Ala Lys Asn Gly Phe Asp Ile
1 5 10
<210> 172
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：不包括信号序列的CADM3501的VL的碱基序列
<400> 172
gacatcgtga tgacccagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 60
atcaactgca agtccagcca gagtgtttta tacagctcca acaataagaa ctacttagct 120
tggtaccagc agaaaccagg acagcctcct aagctgctca tttactgggc atctacccgg 180
gaatccgggg tccctgaccg attcagtggc agcgggtctg ggacagattt cactctcacc 240
atcagcagcc tgcaggctga agatgtggca gtttattact gtcagcaata ttatagtact 300
ccgtacactt ttggccaggg gaccaagctg gagatcaaa 339
<210> 173
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：不包括信号序列的CADM3501的VL的氨基酸序列
<400> 173
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Ser Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 174
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：CADM3501的LCDR1的氨基酸序列
<400> 174
Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 175
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：CADM3501的LCDR2的氨基酸序列
<400> 175
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1 5
<210> 176
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：CADM3501的LCDR3的氨基酸序列
<400> 176
Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 177
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：不包括信号序列的iCADM3_3R1-L8_00的VHH的氨基酸序列
<400> 177
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Arg Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Asp Tyr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Ala
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Pro Ala Ser Arg Arg Pro Ser Trp Asp Ala Asp Gly Tyr Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 178
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：不包括信号序列的iCADM3_3R1-L11_00的VHH的氨基酸序列
<400> 178
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Phe Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Val Ile Thr Ser Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Glu Gly Val Tyr Ser Asp Tyr Val Ile Met Asn Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
- 抗-L1细胞粘附分子抗体或其抗原结合片段及包含其的嵌合抗原受体
- 采用与C1灭活因子结合的抗体、与C反应蛋白结合的抗体和/或与补体成分C4结合的抗体诊断和治疗癌症的方法