一种硝化细菌干粉菌剂制备及保藏方法

技术领域

本发明属于污水处理领域，具体涉及一种硝化细菌干粉菌剂制备及保藏方法。

背景技术

生物菌剂包括液态和固态两种，其保藏方法也包括液体和固体两种。能够产生孢子的异养微生物可以在分生孢子阶段，处理成休止细胞制备成干粉菌剂并进行保藏，对菌体的活性影响较小。而对于硝化细菌这种自养微生物来说，因为没有孢子，因此在制备成干粉过程中，菌体的活性会降低甚至消失，特别是在保藏过程中也会随着时间延长菌体活性降低甚至丧失。目前的硝化菌剂或者菌株大都是液体，常用的保藏方法就是常温液体或者超低温冷冻保藏，常温液体保藏的菌体保藏周期短，低温冷冻保藏的菌体额外还增加了成本，而且应用过程中长距离保存和运输也不方便。

硝化细菌目前多采用直接超低温液体冷冻保藏，保藏活性较好，但是成本高，而且保藏后的菌体不方便运输。CN106554921A公开了一种硝化细菌的保藏方法，是在硝化细菌培养过程中投加生长促进剂，培养至进入生长稳定期后，收集菌体，与保藏营养液混合，控制含水率为40%-80%，添加保藏剂，低温冷冻保藏。CN108486019A公开了一种亚硝化菌的保藏方法，包括（1）配置保护剂：在90~120份无菌水中加入2~4份谷氨酸钠、18~25份磷酸三钠和1~3份半胱氨酸，混合均匀得到保护剂；（2）加入菌体；（3）冷冻保藏。上述方法均采用低温冷冻保藏，温度较低，导致保藏成本较高，而且保藏后的菌体不方便运输。CN103880168A公开了一种好氧硝化颗粒污泥长期保存及活性恢复方法，保藏后7天恢复正常处理能力，但是该发明只能针对好氧颗粒污泥，且保藏时间为180天，不适宜长期保藏。

为了确保制备干粉过程中菌体的活性，可以采用添加保护剂的方式。CN106635803A公开了一种厌氧氨氧化菌干粉菌剂制备与保藏方法，主要运用海藻酸钠作为保护剂，抽真空在60℃条件下干燥获得厌氧氨氧化干粉菌剂，并在4℃下保存30天后活性恢复至41%。CN107557302A公开了以二甲基亚砜和甘油作为混合保护剂抽真空在-92℃下干燥获得厌氧氨氧化干粉菌剂，并在4℃下保存75天后，活性恢复率达到65.8%。上述专利以干粉形式保藏的厌氧氨氧化菌，活性恢复率较低，而且保藏周期短。但是，这些保护剂用于自养硝化细菌干粉的制备，效果不太理想。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种硝化细菌干粉菌剂制备及保藏方法，本发明方法实现了采用真空烘干进行硝化细菌干粉制备和室温保藏，所制备干粉菌剂便于运输和使用，长期保藏后的菌体活性恢复快，活性恢复率高。

本发明第一方面提供一种硝化细菌干粉菌剂的制备方法，主要包括以下步骤：

（1）将硝化细菌悬液脱水至含水率高于80%，制备成硝化细菌浓缩液A，添加海藻酸钠，曝气条件下进行反应；

（2）将步骤（1）混合物脱水至含水率60%-80%，制备成硝化细菌浓缩液B，然后添加糖酯类物质，混合并进行氮气吹扫；

（3）将步骤（2）得到的混合物脱水至含水率低于50%，制备成硝化细菌浓缩液C，进行真空干燥，得到硝化细菌干粉菌剂。

本发明中，步骤（1）所述硝化细菌悬液可以是本领域常规方法培养获得的，其基质为氨氮。

本发明中，步骤（1）优选将硝化细菌悬液脱水至含水率为85%-95%，制备成硝化细菌浓缩液A。

本发明中，步骤（1）优选添加质量分数为0.1%-1%的海藻酸钠溶液。海藻酸钠与硝化细菌浓缩液A的质量比为1:1000-10000。

本发明中，步骤（1）曝气条件是通入空气，曝气时间为6-24h。

本发明中，步骤（2）所述的糖酯类物质包括鼠李糖酯、海藻糖脂、槐糖脂和蔗糖酯等中的至少一种，优选海藻糖酯。

本发明中，步骤（2）所述糖酯类物质添加量占硝化细菌浓缩液B质量的0.1%-0.5%。

本发明中，步骤（2）混合过程中进行氮气吹扫，吹扫时间为30min-180min。

本发明中，步骤（3）得到的混合物脱水至含水率为30%-50%。

本发明中，进一步地，在步骤（3）硝化细菌浓缩液C中加入透明质酸或/和透明质酸钠，透明质酸或/和透明质酸钠与硝化细菌浓缩液C的质量比为1:1000-10000。优选添加质量分数为0.1%-1%的透明质酸溶液或/和透明质酸钠溶液。

本发明中，步骤（3）真空干燥在压力为1-2kPa、温度为40-60℃条件下进行。

本发明中，所述的脱水采用重力沉降、离心或过滤等方式。

本发明中，所述的含水率是指硝化细菌浓缩液所含水分重量占浓缩液总重量的百分比。

本发明第二方面提供一种硝化细菌的保藏方法，将硝化细菌悬液按照上述方法制备成干粉菌剂，真空包装，室温保存备用，一般可以保藏1-2年。

本发明的有益效果如下：

本发明在硝化细菌真空干燥前，通过在不同制备阶段分别添加海藻酸钠、糖酯类物质，并结合不同含水率、通气条件，可以提升菌体细胞在真空烘干过程中的耐受能力，对细胞形成由内而外的完整保护，避免了真空和温度对细胞壁、酶、蛋白和水分的破坏，所制备的干粉菌剂在室温就能够实现长期保藏。

本发明在真空烘干前，脱水至含水率低于50%时进一步添加透明质酸（钠），进一步提升了干粉菌剂在真空烘干过程中的耐受性，提高了细胞存活率。

本发明干粉制备方法及其保藏方法，可以保护菌体在长期室温保存过程中不丧失活性，保藏时间长，活性恢复快。采用真空烘干的方法，显著降低保藏成本，制备的干粉硝化细菌便于保藏，保藏后的菌体活性高还方便运输使用。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明方法和效果作进一步详细说明。实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

以下实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均可从生化试剂商店购买得到。

本发明实施例中，氨氮浓度采用GB7478-87《水质铵的测定-蒸镏和滴定法》测定；细胞存活率=（细胞总数-死亡细胞数）÷细胞总数×100%，采用贝克曼的流式细胞仪CytoFLEX测试。

实施例1

（1）将硝化细菌悬液经重力沉降后弃上清液，获得含水率85%的硝化细菌浓缩液A，然后添加质量分数为0.1%的海藻酸钠溶液，海藻酸钠与硝化细菌浓缩液A的质量比为1:1000，通入空气曝气8h。

（2）将步骤（1）混合物采用过滤方式脱水至含水率60%，制备成硝化细菌浓缩液B，然后添加海藻糖酯，添加量占硝化细菌浓缩液B的质量的0.1%，混合过程中氮气吹扫60min。

（3）将步骤（2）得到的混合物离心脱水至含水率为30%，制备成硝化细菌浓缩液C，在压力为1kPa、温度为40℃条件下进行真空干燥，得到硝化细菌干粉菌剂。将获得的硝化细菌干粉与步骤（1）等量硝化细菌悬液相比，微生物数量相当，细胞存活率为75%。

将上述干粉菌剂真空包装后置于室温保藏，室温保藏12个月后取出用缓冲溶液洗净后加入到250mL反应器中进行曝气活化，20天后氨氮去除率由开始的9%提高到90%以上，说明本发明方法制备的硝化细菌干粉制剂活性恢复快。

实施例2

（1）将硝化细菌悬液经重力沉降后弃上清液，获得含水率90%的硝化细菌浓缩液A，然后添加质量分数为0.5%的海藻酸钠溶液，海藻酸钠与硝化细菌浓缩液A的质量比为1:5000，通入空气曝气16h。

（2）将步骤（1）混合物采用过滤方式脱水至含水率70%，制备成硝化细菌浓缩液B，然后添加鼠李糖酯，添加量占硝化细菌浓缩液B的质量的0.5%，混合过程中氮气吹扫120min。

（3）将步骤（2）得到的混合物离心脱水至含水率为40%，制备成硝化细菌浓缩液C，在压力为1.5kPa、温度为45℃条件下进行真空干燥，得到硝化细菌干粉菌剂。将获得的硝化细菌干粉与步骤（1）等量硝化细菌悬液相比，微生物数量相当，细胞存活率为73%。

将上述干粉菌剂真空包装后置于室温保藏，室温保藏12个月后取出用缓冲溶液洗净后加入到250mL反应器中进行曝气活化，22天后氨氮去除率由开始的8%提高到90%以上，说明本发明方法制备的硝化细菌干粉制剂活性恢复快。

实施例3

（1）将硝化细菌悬液经重力沉降后弃上清液，获得含水率90%的硝化细菌浓缩液A，然后添加质量分数为0.5%的海藻酸钠溶液，海藻酸钠与硝化细菌浓缩液A的质量比为1:5000，通入空气曝气16h。

（2）将步骤（1）混合物采用过滤方式脱水至含水率80%，制备成硝化细菌浓缩液B，然后添加蔗糖酯，添加量占硝化细菌浓缩液B的质量的1%，混合过程中氮气吹扫180min。

（3）将步骤（2）得到的混合物离心脱水至含水率为50%，制备成硝化细菌浓缩液C，在压力为2kPa、温度为55℃条件下进行真空干燥，得到硝化细菌干粉菌剂。将获得的硝化细菌干粉与步骤（1）等量硝化细菌悬液相比，微生物数量相当，细胞存活率为71%。

将上述干粉菌剂真空包装后室温保藏，12个月后取出用缓冲溶液洗净后加入到250mL反应器中进行曝气活化，25天后氨氮去除率由开始的7%提高到90%以上，说明本发明方法制备的硝化细菌干粉制剂活性恢复快。

实施例4

制备方法和过程同实施例1，不同在于步骤（3）制备成硝化细菌浓缩液C，然后添加质量分数为0.1%的透明质酸，添加的透明质酸与硝化细菌浓缩液C的质量比为1:1000，搅拌条件下混合均匀后进行真空干燥。

将获得的硝化细菌干粉与制备干粉前等量硝化细菌悬液相比，微生物数量相当，细胞存活率为85%。将上述干粉菌剂真空包装后置于室温保藏，室温保藏18个月后取出用缓冲溶液洗净后加入到250mL反应器中进行曝气活化，17天后氨氮去除率由开始的11%提高到90%以上，进一步提升了活性恢复效果。

实施例5

制备方法和过程同实施例2，不同在于步骤（3）制备成硝化细菌浓缩液C，然后添加质量分数为0.5%的透明质酸，添加的透明质酸与硝化细菌浓缩液C的质量比为1:5000，搅拌条件下混合均匀后进行真空干燥。

将获得的硝化细菌干粉与制备干粉前等量硝化细菌悬液相比，微生物数量相当，细胞存活率为83%。将上述干粉菌剂真空包装后置于室温保藏，室温保藏18个月后取出用缓冲溶液洗净后加入到250mL反应器中进行曝气活化，20天后氨氮去除率由开始的10%提高到90%以上，进一步提升了活性恢复效果。

实施例6

制备方法和过程同实施例4，不同在于采用透明质酸钠代替透明质酸。将获得的硝化细菌干粉与制备干粉前等量硝化细菌悬液相比，微生物数量相当，细胞存活率为84%。将干粉菌剂真空包装后置于室温保藏，室温保藏18个月后取出用缓冲溶液洗净后加入到250mL反应器中进行曝气活化，18天后氨氮去除率由开始的11%提高到90%以上。

实施例7

制备方法和过程同实施例5，不同在于采用透明质酸钠代替透明质酸。将获得的硝化细菌干粉与制备干粉前等量硝化细菌悬液相比，微生物数量相当，细胞存活率为82%。将干粉菌剂真空包装后置于室温保藏，室温保藏12个月后取出用缓冲溶液洗净后加入到250mL反应器中进行曝气活化，21天后氨氮去除率由开始的10%提高到90%以上。

比较例1

制备方法和过程同实施例1，不同在于在步骤（1）和步骤（2）中均使用海藻酸钠。将获得的硝化细菌干粉与制备干粉前等量硝化细菌悬液相比，细胞存活率只有30%。室温保藏6个月后取出用缓冲溶液洗净后加入到250mL反应器中进行曝气活化，20天后氨氮去除率由开始的3%只提高到30%。由此可见，硝化细菌干粉菌剂制备过程中，只添加海藻酸钠效果不理想。

比较例2

制备方法和过程同实施例1，不同的是在步骤（1）和步骤（2）中均使用糖酯类物质。将获得的硝化细菌干粉与制备干粉前等量的硝化细菌悬液相比，细胞存活率只有40%。室温保藏1年后取出用缓冲溶液洗净后加入到250mL反应器中进行曝气活化，20天后氨氮去除率由开始的 4%只提高到40%。由此可见，硝化细菌干粉菌剂制备过程中，只添加糖酯类物质，效果不理想。

比较例3

制备方法和过程同实施例1，所不同的是步骤（1）、（2）脱水率均为85%。将获得的硝化细菌干粉与制备干粉前等量的硝化细菌悬液相比，细胞存活率只有59%。室温保藏1年后取出用缓冲溶液洗净后加入到250mL反应器中进行曝气活化，20天后氨氮去除率由开始的6%只提高到55%。

比较例4

制备方法和过程同实施例1，所不同的是每个步骤脱水率均为40%。将获得的硝化细菌干粉与制备干粉前等量的硝化细菌悬液相比，细胞存活率只有49%。室温保藏1年后取出用缓冲溶液洗净后加入到250mL反应器中进行曝气活化，20天后氨氮去除率由开始的5%只提高到45%。

比较例5

制备方法和过程同实施例1，所不同的是步骤（1）、（2）均通入空气。将获得的硝化细菌干粉与制备干粉前等量的硝化细菌悬液相比，细胞存活率只有59%。

比较例6

制备方法和过程同实施例1，所不同的是步骤（1）、（2）均通入氮气。将获得的硝化细菌干粉与制备干粉前等量的硝化细菌悬液相比，细胞存活率只有53%。