抗CD33免疫细胞癌症疗法

相关申请的交叉引用

本申请要求享有2018年11月7日提交的美国临时申请号62/756,718、2018年11月14日提交的美国临时申请号62/767,388、2018年11月14日提交的美国临时申请号62/767,395、2019年3月29日提交的美国临时申请号62/826,643和2019年3月29日提交的美国临时申请号62/826,648的提交日期的权益。将每个先前申请的全部内容通过引用并入本文。

背景技术

嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法使用经基因修饰的T细胞来更特异性和有效地靶向和杀伤癌细胞。从血液中收集T细胞后，对细胞进行工程化，使其表面上包含CAR。可以使用CRISPR/Cas9基因编辑技术将CAR引入T细胞。将这些同种异体CAR T细胞注射入患者体内时，受体使T细胞能够杀伤癌细胞。

发明内容

急性髓细胞性白血病(AML)是一种由髓系祖细胞中积累的突变引起的血液肿瘤，可造成过度增殖和分化受阻，从而导致髓系母细胞在造血组织中积累。尽管最初对标准诱导化疗的反应很高，但大多数AML患者的复发较常见且预后较差(Talati和Sweet，2018)。近年来，很少有用于AML的新疗法获得批准。

CD33(也称为Siglec3、唾液酸结合Ig样凝集素3、gp67或p67)是治疗AML和其他白血病(例如T细胞白血病)的吸引关注的靶标。它在发病和复发时都在大多数AML母细胞和亚群(免疫表型定义的白血病干细胞)上表达(Haubner等人，2018)。据认为其表达仅限于正常单核细胞、粒细胞、造血祖细胞和免疫表型定义的造血干细胞群体中的一些细胞(Haubner等人，2018)。小鼠中CD33的敲除不会导致任何明显的表型(Brikman-Van der Linden等人，2003)。此外，该抗CD33抗体-药物缀合物吉妥单抗(gemtuzumab ozogmicin，GO)被批准用于AML人类患者中使用，并且具有可接受的安全性。但是，GO仅显示了总体存活率的适度提高(Talati和Sweet，2018)。靶向具有更强有效载荷的表达CD33的细胞(如抗CD33CAR-T细胞)相对于GO可能在AML中证明更高的疗效。此外，抗CD33CAR-T细胞代表了对其他表达CD33的恶性肿瘤的有效治疗选择。

本披露内容的一些方面提供了工程化T细胞，该工程化T细胞包含编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸，其中该CAR包含特异性结合CD33的胞外结构域。在一些实施例中，工程化T细胞包含被破坏的T细胞受体α链恒定区(TRAC)基因。例如，可以通过插入编码CAR的核酸来破坏TRAC基因。在一些实施例中，工程化T细胞包含被破坏的β-2-微球蛋白(β2M)基因。

在一些实施例中，该工程化T细胞进一步包含被破坏的CD33基因。

在一些实施例中，工程化T细胞包含被破坏的TRAC基因、被破坏的β2M基因、被破坏的CD33基因和编码包含抗CD33抗原结合片段的CAR的核酸。在一些实施例中，工程化T细胞包含被破坏的TRAC基因，其中该被破坏的TRAC基因包含编码CAR(该CAR包含抗CD33抗原结合片段)的核酸、被破坏的β2M基因和被破坏的CD33基因。在一些实施例中，该CAR包含(a)包含抗CD33抗原结合片段的胞外结构域，(b)CD8跨膜结构域，和(c)包含41BB共刺激结构域和CD3z共刺激结构域的胞内结构域。

在一些实施例中，该工程化T细胞包含：(i)被破坏的TRAC基因，其中该被破坏的TRAC基因包含编码CAR的核酸，所述CAR包含SEQ ID NO:104所示的氨基酸序列；以及(ii)被破坏的β2M基因。在一些实例中，此类工程化T细胞包含野生型CD33基因。

在一些实施例中，该工程化T细胞包含：(i)被破坏的TRAC基因，其中该被破坏的TRAC基因包含编码CAR的核酸，所述CAR包含SEQ ID NO:104所示的氨基酸序列；(ii)被破坏的β2M基因；以及被破坏的CD33基因。

在一些实施例中，该工程化T细胞包含：(i)被破坏的TRAC基因，其中该被破坏的TRAC基因包含编码CAR的核酸，其中该核酸序列与SEQ ID NO:56至少90％相同并且编码SEQID NO:104的CAR；以及(ii)被破坏的β2M基因。

在一些实施例中，该工程化T细胞包含：(i)被破坏的TRAC基因，其中该被破坏的TRAC基因包含编码CAR的核酸，其中该核酸序列与SEQ ID NO:56至少90％相同并且编码SEQID NO:104的CAR；(ii)被破坏的β2M基因；以及(iii)被破坏的CD33基因。

在一些实施例中，该工程化T细胞包含：(i)被破坏的TRAC基因，其中该被破坏的TRAC基因包含SEQ ID NO:55的核酸序列；以及(ii)被破坏的β2M基因。在一些实施例中，该工程化T细胞包含野生型CD33。

在一些实施例中，该工程化T细胞包含：(i)被破坏的TRAC基因，其中该被破坏的TRAC基因包含SEQ ID NO:55的核酸序列；(ii)被破坏的β2M基因；以及(iii)被破坏的CD33基因。

在一些实施例中，本披露提供了包含工程化T细胞的细胞群体，其中该工程化T细胞包含：(i)被破坏的TRAC基因，其中该被破坏的TRAC基因包含编码CAR的核酸，所述CAR包含(a)包含抗CD33抗原结合片段的胞外结构域，(b)CD8跨膜结构域，和(c)包含41BB共刺激结构域和CD3ζ信号传导结构域的胞内结构域；以及(ii)被破坏的β2M基因。在一些实例中，该工程化T细胞包含野生型CD33。

在一些实施例中，本披露提供了包含工程化T细胞的细胞群体，其中该工程化T细胞包含：(i)被破坏的TRAC基因，其中该被破坏的TRAC基因包含编码CAR的核酸，所述CAR包含(a)包含抗CD33抗原结合片段的胞外结构域，(b)CD8跨膜结构域，和(c)包含41BB共刺激结构域和CD3ζ信号传导结构域的胞内结构域；(ii)被破坏的β2M基因；以及(iii)被破坏的CD33基因。

在一些实施例中，本披露提供了包含工程化T细胞的细胞群体，其中该工程化T细胞包含：(i)被破坏的TRAC基因，其中该被破坏的TRAC基因包含编码CAR的核酸，所述CAR包含SEQ ID NO:104所示的氨基酸序列；以及(ii)被破坏的β2M基因。在一些实例中，该工程化T细胞包含野生型CD33。

在一些实施例中，本披露提供了包含工程化T细胞的细胞群体，其中该工程化T细胞包含：(i)被破坏的TRAC基因，其中该被破坏的TRAC基因包含编码CAR的核酸，所述CAR包含SEQ ID NO:104所示的氨基酸序列；(ii)被破坏的β2M基因；以及(iii)被破坏的CD33基因。

在一些实施例中，本披露提供了包含工程化T细胞的细胞群体，其中该工程化T细胞包含：(i)被破坏的TRAC基因，其中该被破坏的TRAC基因包含编码CAR的核酸，其中该核酸序列与SEQ ID NO:56至少90％相同并且编码SEQ ID NO:104的CAR；以及(ii)被破坏的β2M基因。在一些实例中，该工程化T细胞包含野生型CD33。

在一些实施例中，本披露提供了包含工程化T细胞的细胞群体，其中该工程化T细胞包含：(i)被破坏的TRAC基因，其中该被破坏的TRAC基因包含编码CAR的核酸，其中该核酸序列与SEQ ID NO:56至少90％相同并且编码SEQ ID NO:104的CAR；(ii)被破坏的β2M基因；以及(iii)被破坏的CD33基因。

在一些实施例中，本披露提供了包含工程化T细胞的细胞群体，其中该工程化T细胞包含：(i)被破坏的TRAC基因，其中该被破坏的TRAC基因包含SEQ ID NO:55的核酸序列；以及(ii)被破坏的β2M基因。在一些实例中，该工程化T细胞包含野生型CD33。

在一些实施例中，本披露提供了包含工程化T细胞的细胞群体，其中该工程化T细胞包含：(i)被破坏的TRAC基因，其中该被破坏的TRAC基因包含SEQ ID NO:55的核酸序列；(ii)被破坏的β2M基因；以及(iii)被破坏的CD33基因。

本文所述的任何工程化T细胞可以是人T细胞。

在一些实施例中，该CAR的胞外结构域包含抗CD33抗体。在一些实施例中，抗CD33抗体是抗CD33单链可变片段(scFv)。在一些实施例中，抗CD33 scFv包含SEQ ID NO:73、75、85、87、97或99中任一项的氨基酸序列。在一些实施例中，抗CD33 scFv包含重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，其中该含重链可变区包含SEQ ID NO:65、77或89中任一项的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:66、78或90中任一项的氨基酸序列。在一些实施例中，抗CD33 scFv包含VH，所述VH包含SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68和/或SEQ ID NO:69的CDR氨基酸序列；和/或抗CD33 scFv包含VL序列，该VL序列包含SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71和/或SEQ ID NO:72的CDR氨基酸序列。在一些实施例中，抗CD33 scFv包含VH，所述VH包含SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80和/或SEQ ID NO:81的CDR氨基酸序列；和/或抗CD33 scFv包含VL序列，该VL序列包含SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:83和/或SEQ ID NO:84的CDR氨基酸序列。在一些实施例中，抗CD33 scFv包含VH，所述VH包含SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92和/或SEQ ID NO:93的CDR氨基酸序列；和/或抗CD33 scFv包含VL序列，该VL序列包含SEQ IDNO:94、SEQ ID NO:95和/或SEQ ID NO:96的CDR氨基酸序列。

在一些实施例中，该CAR包含CD3ζ细胞质信号传导结构域。在一些实施例中，该CAR包含CD28共刺激结构域或41BB共刺激结构域。在特定实例中，本文披露的CAR包含抗CD33scFv、CD28共刺激结构域和CD3ζ细胞质信号传导结构域。在其他实例中，本文披露的CAR包含抗CD33 scFv，4-1BB共刺激结构域和CD3ζ细胞质信号传导结构域。

在一些实施例中，该TRAC基因包含SEQ ID NO:49、51、53、55、57、59、61、63、109、112、115或118中任一项的核苷酸序列，和/或其中CAR包含SEQ ID NO:50、52、54、56、58、60、62、64、110、113、116或119中任一项的核苷酸序列。在一些实施例中，所述被破坏的β2M基因包含至少一个选自SEQ ID NO:9-14中任一项的核苷酸序列。

在一些实施例中，T细胞包含野生型CD33基因。在一些实施例中，T细胞包含被破坏的CD33基因。

在一些实施例中，该被破坏的CD33基因包含AGTTCATGGTACTGGTTCC(SEQ ID NO:187)、AGTTCATGGTTCC(SEQ ID NO:188)、AGTTCATGTACTGGTTCC(SEQ ID NO:189)、AGTTCATGGTTTACTGGTTCC(SEQ ID NO:190)、AGTTCC、AGTACTGGTTCC(SEQ ID NO:191)、AGTTCATACTGGTTCC(SEQ ID NO:192)、AGTTCATGGTATACTGGTTCC(SEQ ID NO:193)和/或AGTTACTGGTTCC(SEQ ID NO:194)的核苷酸序列。

在一些实施例中，被破坏的CD33基因缺少包含AGTTCATGGTTACTGGTTCC(SEQ IDNO:186)的片段。

在一些实施例中，该被破坏的CD33基因包含AAATCCTGGCACT(SEQ ID NO:300)、AAATCCCTGGCACT(SEQ ID NO:301)、AAATCCTCATTCCCTGGCACT(SEQ ID NO:302)、AAATCCTCACCCTGGCACT(SEQ ID NO:304)、AAATCCTCCCCTGGCACT(SEQ ID NO:305)、AAATCCTCCCTGGCACT(SEQ ID NO:306)、AAATCCCCTGGCACT(SEQ ID NO:307)、ACATCCTCATTCCCTGGCACT(SEQ ID NO:308)、ACATCCTGGCACT(SEQ ID NO:309)、AAATCCTCTCCCTGGCACT(SEQ ID NO:310)、AAATCCTCATCTGGCACT(SEQ ID NO:311)、AAATCCT、AAACCCTGGCACT(SEQ ID NO:312)、AAATCCTCTGGCACT(SEQ ID NO:313)、AAATCCCCCTGGCACT(SEQ ID NO:314)、AAATCCTCACT(SEQ ID NO:315)、ACATCCCTGGCACT(SEQ ID NO:316)和/或AAAT的核苷酸序列。

在一些实施例中，被破坏的CD33基因缺少包含AAATCCTCATCCCTGGCACT(SEQ IDNO:299)的片段。

在一些实施例中，该被破坏的CD33基因缺少以下片段，该片段的3'区段包含AAATCCTCAT(SEQ ID NO:317)、AAATCCTCATCCCT(SEQ ID NO:318)、AAATCCTCATCCCTGG(SEQID NO:320)、AAATCCTCATC(SEQ ID NO:322)或AAATCCTCATCCCTGGCA(SEQ ID NO:324)的核苷酸序列。

在一些实施例中，被破坏的CD33基因缺少以下片段，该片段的5'区段包含CTCATCCCTGGCACT(SEQ ID NO:323)的核苷酸序列。

在一些方面，本文还提供了工程化T细胞(例如，包含编码抗CD33 CAR的核酸)群体，其中该群体的至少25％或至少50％的工程化T细胞表达CAR。例如，该群体的至少70％的工程化T细胞表达CAR。

在一些实施例中，该群体的至少25％的工程化T细胞在至少7天或至少14天的体外增殖后表达CAR。

在一些实施例中，该群体的至少50％的工程化T细胞不表达可检测水平的T细胞受体(TCR)蛋白。例如，该群体的至少90％的工程化T细胞可能不表达可检测水平的TCR蛋白。

在一些实施例中，该群体的至少50％的工程化T细胞不表达可检测水平的β2M蛋白。例如，该群体的至少70％的工程化T细胞可能不表达可检测水平的β2M蛋白。

在一些实施例中，该群体的至少20％的工程化T细胞不表达可检测水平的CD33蛋白。例如，该群体的至少50％的工程化T细胞可能不表达可检测水平的CD33蛋白。

在一些实施例中，当与表达CD33的癌细胞群体在体外共培养时，该群体的工程化T细胞诱导该群体的至少50％的癌细胞的细胞裂解。例如，该群体的工程化T细胞可以诱导该群体的至少70％、至少80％或至少90％的癌细胞的细胞裂解。在一些实施例中，当与癌细胞群体在体外共培养时，该群体的工程化T细胞分泌IFNγ。在一些实施例中，工程化T细胞与癌细胞的比率为1:1至2:1。这些癌细胞可以是例如白血病，如急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、急性髓细胞性白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)和慢性髓细胞性白血病(CML)。可靶向其他癌细胞。

在一些实施例中，该群体的工程化T细胞的增殖能力在对照细胞的增殖能力的10％以内。

本披露的其他方面提供了一种方法，该方法包括施用本文所述的工程化T细胞群体。在一些实施例中，在施用5-10天后，受试者的体重百分比在该受试者的初始体重的10％以内，其中该受试者的初始体重是施用时该受试者的体重。在一些实施例中，该受试者是人类受试者。在一些实施例中，受试者患有癌症。该癌症可以表达，例如，CD33。该癌症可以是，例如白血病，如ALL、AML、CLL和CML。

本披露的其他方面提供了一种产生工程化T细胞的方法，该方法包括(a)将RNA指导的核酸酶、靶向TRAC基因的gRNA和载体递送至T细胞，其中该载体包含供体模板，所述供体模板包含编码CAR的核酸，所述CAR包含特异结合CD33的胞外结构域的，其中编码该CAR的核酸的侧翼为TRAC基因的左和右同源臂，以及(b)产生工程化T细胞。在一些实施例中，该靶向TRAC基因的gRNA包含SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:19的核苷酸序列，或靶向SEQ ID NO:40的核苷酸序列。

在一些实施例中，该方法进一步包括将靶向β2M基因的gRNA递送至T细胞。在一些实施例中，该靶向β2M基因的gRNA包含SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21的核苷酸序列，或靶向SEQ ID NO:41的核苷酸序列。

在一些实施例中，该方法进一步包括将靶向CD33基因的gRNA递送至T细胞。在一些实施例中，该靶向CD33基因的gRNA包含表10中提供的核苷酸序列。

在一些实施例中，该RNA指导的核酸酶是Cas9核酸酶，任选地是酿脓链球菌(S.pyogenes)Cas9核酸酶。

在一些实施例中，该供体模板包含SEQ ID NO:49、51、53、55、57、59、61、63、109、112、115或118中任一项的核苷酸序列。

在一些实施例中，该CAR包含SEQ ID NO:50、52、54、56、58、60、62、64、110、113、116或119中任一项的核苷酸序列。

本披露的其他方面提供了用于减少受试者中的肿瘤体积的方法，该方法包括向患有癌症(例如白血病)的受试者施用本文所述的工程化T细胞群体。在一些实施例中，相对于基线对照，该受试者中该肿瘤的体积减少至少50％，任选地其中施用了该群体的1x10

附图说明

图1A包括流式细胞术图，描绘了在电穿孔后两周在用选定抗CD33 CAR构建体编辑的T细胞上抗CD33 CAR的表面表达。使用CTX-965b CAR转染导致表达抗CD33 CAR的T细胞的高比例。所有CAR T细胞也是TRAC-/β2M-(2KO)。

图1B包括流式细胞术图，描绘了在电穿孔后两周在用选定抗CD33 CAR构建体编辑的T细胞上抗CD33 CAR的表面表达。使用CTX-970 CAR和CTX-965b CAR转染导致表达抗CD33CAR的T细胞的高比例。所有CAR T细胞也是TRAC-/β2M-(2KO)。

图1C包括流式细胞术图，描绘了在电穿孔后一周在用选定抗CD33 CAR构建体编辑的T细胞上抗CD33 CAR的表面表达。使用CTX-981CAR、CTX-981b CAR、CTX-982CAR和CTX-982b CAR转染均导致表达抗CD33CAR的T细胞的高比例。所有CAR T细胞也是TRAC-/β2M-(2KO)。

图2A包括流式细胞术图，证明基因编辑对供体T细胞群体的影响。显示的是具有细胞表面TCR、β2M和抗CD33 CAR表达的经编辑的T细胞的比例。此外，还显示了CD4+和CD8+ T细胞的比例。值得注意的是，CTX-965b细胞在基因编辑后至少一周保持高水平的CD4/CD8表达。

图2B显示了TRAC-/β2M-T细胞中表达CAR的细胞的随时间变化的百分比。所有抗CD33 CAR-T细胞在两周时间中扩增。

图2C显示了TRAC-/β2M-/抗CD33 CAR+编辑的T细胞群体中CD4+和CD8+ T细胞随时间变化的百分比。上图显示了编辑后1周和2周，来自七个原代T细胞供体的CTX-965b CAR T细胞中的CD4+和CD8+细胞。下图显示了编辑后1周和2周，来自四个原代T细胞供体的CTX-970 CAR T细胞中的CD4+和CD8+细胞。

图2D显示了TRAC-/β2M-/抗CD33 CAR+ T细胞群体中CD4+和CD8+细胞随时间变化的百分比。具体而言，该图显示了在编辑后1周和2周，来自三个原代T细胞供体的CTX-982bCAR T细胞中的CD4+和CD8+细胞。

图3包括显示抗CD33 CAR-T细胞群体(CTX-965b)和对照T细胞群体(无RNP；TRAC-/β2M-)的细胞扩增的图。

图4包括显示在血液来源的不同细胞系中CD33的表面表达水平的图。左图显示THP-1(AML)和PBMC具有高CD33表面表达，右图显示在AML癌细胞系：MV4-11、THP-1和KG-1中CD33的高表面表达。右图还显示，以CD33基因敲除(MV4-11 CD33基因敲除)工程化的MV4-11细胞不表达CD33。

图5A-5D包括证明TRAC-/β2M-/抗CD33 CAR

图6A-6E包括证明TRAC-/β2M-/抗CD33 CAR

图7包括显示TRAC-/β2M-/抗CD33 CAR+ T细胞(CTX-965b CAR T细胞)在皮下THP-1AML癌小鼠体内模型中有效减少肿瘤体积的图。

图8包括显示TRAC-/β2M-/抗CD33 CAR+ T细胞(CTX-965b CAR T细胞)在皮下THP-1AML癌症小鼠体内模型中有效地减少得到确认的肿瘤(起始肿瘤体积约150mm

图9显示了通过靶向CD33的各种sgRNA进行基因编辑后，经编辑的CD8+(左图)和CD4+(右图)T细胞的百分比。

图10显示了在基因编辑后的第7天和第14天，存在和不存在CD33破坏的TRAC-/β2M-编辑的T细胞中表达CAR的细胞的百分比。显示了来自以下六种不同构建体之一的表达CAR的T细胞的数据：CTX-981(981)、CTX-981b(981b)、CTX-982(982)、CTX-982b(982b)、CTX-970(970)或CTX-965b(965b)。

图11显示TRAC-/β2M-编辑的T细胞和TRAC-/β2M-/CD33-/抗CD33CAR+编辑的T细胞中表达CAR的细胞的随时间变化的百分比。显示了来自以下三种不同构建体之一的表达CAR的CAR+ T细胞的数据：CTX-965b(965b)、CTX-970(970)或CTX-982b(982b)。黑色条＝7天；灰色条＝14天。

图12显示TRAC-/β2M-/抗CD33 CAR+编辑的T细胞群体和TRAC-/β2M-/CD33-/抗CD33 CAR+编辑的T细胞群体中CD4+和CD8+细胞的随时间变化的百分比。左图显示了编辑后1周和2周时CAR T细胞中的CD8+细胞。右图显示了编辑后1周和2周时CAR T细胞中的CD4+CD8+细胞。

图13显示TRAC-/β2M-/CD33-/抗CD33 CAR+ T细胞保留杀伤AML癌细胞的能力。左图显示了由单个原代T细胞供体产生的CAR+ T细胞对AML细胞的细胞裂解百分比。右图显示了由一个不同的原代T细胞供体产生的CAR+ T细胞对AML细胞的细胞裂解百分比。

图14证明2X KO(TRAC-/β2M-)抗CD33 CAR T细胞和3X KO(TRAC-/β2M-/CD33-)抗CD33 CAR T细胞能够以相似的水平诱导表达CD33的AML细胞(MV4-11；MV4-11)中的IFNγ分泌。由2个不同的原代T细胞供体产生的CAR T细胞在0.05:1至1:1的CAR T细胞:MV4-11细胞比率下有效地诱导IFNγ分泌。

图15证明2X KO(TRAC-/β2M-)抗CD33 CAR T细胞和3X KO(TRAC-/β2M-/CD33-)抗CD33 CAR T细胞能够诱导表达CD33的AML细胞(MV4-11；MV4-11)中的IL-2分泌。数据是由2个不同的原代T细胞供体产生的CAR T细胞的数据。

图16显示当以1:1的比率(CAR+ T细胞:靶细胞)接种时野生型MV4-11细胞(左图)或CD33敲除MV4-11细胞(CD33

图17显示当以0.25:1、0.5:1、1:1和2:1比率的CAR+ T细胞:CD33-/MV4-11细胞接种时，CD33敲除MV4-11细胞(CD33

图18显示响应于缺乏CD33的癌细胞(CD33 KO,MV4-11细胞)，2X KO(TRAC-/β2M-)抗CD33 CAR T细胞或3X KO(TRAC-/β2M-/CD33-)抗CD33 CAR T细胞中的IL-2分泌(左图)和IFNγ分泌(右图)。

图19A-19E包括证明TRAC-/β2M-/抗CD33 CAR

具体实施方式

本披露至少部分地基于以下发现：在急性髓细胞性白血病(AML)的小鼠模型中，抗CD33 CAR+ T细胞减少了肿瘤负荷并提高了中位存活率。还已经证明CD33在激活的T细胞上高表达，这些激活的T细胞可能容易受抗CD33 CAR+ T细胞的自身反应性杀伤的影响。通过使用本文提供的基因编辑方法破坏抗CD33 CAR+ T细胞中的内源性CD33基因，可以减少或消除这种自身反应性杀伤。因此，在一些方面，本披露提供了具有被破坏的内源性CD33基因的抗CD33 CAR+ T细胞。在其他方面，本披露提供了具有野生型内源性CD33基因的抗CD33CAR+ T细胞。

本披露的多个方面提供了具有或不具有被破坏的CD33基因的抗CD33CAR+ T细胞，产生这种抗CD33 CAR+ T细胞的方法，以及在受试者中使用这种抗CD33 CAR+ T细胞治疗癌症(例如，AML)的方法。用于制备本文披露的抗CD33 CAR+ T细胞的组分和方法(例如，用于基因编辑的CRISPR方法及其中使用的组分)也在本披露的范围内。

CD33癌症抗原

在一些实施例中，本披露的T细胞用设计用于靶向CD33的嵌合抗原受体(CAR)进行工程改造。CD33，也称为Siglec3，是在髓系谱系细胞(其已知与唾液酸结合)上表达的跨膜受体。由于CD33在癌细胞(例如，急性髓细胞性白血病)中表达，因此认为CD33代表靶向这些恶性肿瘤的细胞表面标志物。

因此，在一些实施例中，本披露的T细胞经工程化以表达包含抗CD33抗体(例如，抗CD33 scFv)的CAR。在一些实施例中，该抗CD33抗体是由SEQ ID NO:74、76、86、88、98或100中任一项的序列编码的抗CD33 scFv。在一些实施例中，该抗CD33抗体是包含SEQ ID NO:73、75、85、87、97或99中任一项的序列的抗CD33 scFv。在一些实施例中，该抗CD33抗体是包含VH的抗CD33 scFv，所述VH包含SEQ ID NO:65、77或89中任一项的氨基酸序列。在一些实施例中，该抗CD33抗体是包含VL的抗CD33 scFv，所述VL包含SEQ ID NO:66、78或90中任一项的氨基酸序列。在一些实施例中，包含抗CD33抗体的CAR由SEQ ID NO:50、52、54、56、58、60、62、64、110、113、116或119中任一项的序列编码。在一些实施例中，包含抗CD33抗体的CAR包含SEQ ID NO:101-108、111、114、117或120中任一项的序列。在一些实施例中，包含抗CD33抗体的CAR包含如US 9,359,442、US 9,587,019或US 5,773,001中所述的抗CD33抗体。

多基因编辑

在一些实施例中，本披露的工程化T细胞包括超过一个基因编辑，例如，在超过一个基因中。例如，经过工程化T细胞可包含被破坏的CD70基因、被破坏的T细胞受体α链恒定区(TRAC)基因、被破坏的β-2-微球蛋白(β2M)基因、被破坏的程序性细胞死亡-1(PD-1或PDCD1)基因、或两个或更多个前述被破坏的基因的任何组合。在一些实施例中，工程化T细胞包含被破坏的TRAC基因、被破坏的β2M基因和被破坏的CD70基因。在一些实施例中，工程化T细胞包含被破坏的TRAC基因、被破坏的β2M基因和被破坏的PD-1基因。在一些实施例中，工程化T细胞包含被破坏的TRAC基因、被破坏的β2M基因、被破坏的CD70基因和被破坏的PD-1基因。

应当理解，基因破坏包括通过基因编辑带来的基因修饰(例如，使用CRISPR/Cas基因编辑来插入或缺失一个或多个核苷酸)。如本文所用，术语“被破坏的基因”是指基因含有相对于野生型对应物的一个或多个突变(例如，插入、缺失或核苷酸取代等)以实质上减少或完全消除编码的基因产物的活性。该一个或多个突变可以位于非编码区，例如，启动子区，调节转录或翻译的调节区；或内含子区。可替代地，该一种或多种突变可以位于编码区(例如，外显子中)。在一些情况下，被破坏的基因不表达或以大大降低的水平表达编码蛋白。在其他情况下，被破坏的基因以突变形式表达编码的蛋白质，该蛋白质没有功能性或活性大大降低。在一些实施例中，被破坏的基因是不编码功能蛋白的基因。在一些实施例中，包含被破坏的基因的细胞不表达(例如，不在细胞表面表达)所述基因编码的可检测水平(例如，通过抗体，例如，通过流式细胞术)的蛋白质。不表达可检测水平的蛋白质的细胞可以称为敲除细胞。例如，如果使用特异性结合β2M蛋白的抗体在细胞表面不能检测到β2M蛋白，则具有β2M基因编辑的细胞可以认为是β2M敲除细胞。

在一些实施例中，可将被破坏的基因描述为包含相对于野生型对应物突变的片段。该突变的片段可以包含缺失、核苷酸取代、添加或其组合。在其他实施例中，可将被破坏的基因描述为缺失野生型对应物中存在的片段。在一些情况下，该缺失片段的5′端可以位于设计的指导RNA(如本文披露的那些)的靶标基因区域内(称为中靶序列)，并且该缺失片段的3′端可以超出靶标区域。可替代地，该缺失片段的3′端可以位于靶标区域内，而该缺失片段的5′端可以超出靶标区域。

在一些实施例中，本文提供了细胞群体，其中一定百分比的细胞已经被编辑(例如，β2M基因被编辑)，导致一定百分比的细胞不表达特定的基因和/或蛋白质。在一些实施例中，经基因编辑的细胞群体的至少50％(例如，50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或85％)的细胞是β2M敲除细胞。在一些实施例中，群体的至少50％的细胞(例如，T细胞)不表达可检测水平的β2M蛋白。在一些实施例中，经基因编辑的细胞群体的至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的细胞可以是β2M敲除细胞。

使用CRISPR-Cas基因编辑技术在细胞中产生基因组缺失(例如，以敲除细胞中的基因)的方法是已知的(Bauer DE等人Vis.Exp.[可视化实验]2015；95；e52118)。

TRAC基因编辑

在一些实施例中，工程化T细胞包含被破坏的TRAC基因。这种破坏导致TCR功能的丧失，并使工程化T细胞无同种异体反应性并适合于同种异体移植，从而最小化移植物抗宿主疾病的风险。在一些实施例中，消除内源性TRAC基因的表达以防止移植物抗宿主应答。在一些实施例中，靶向TRAC基因组区域的gRNA在TRAC基因中产生插缺(indel)，破坏mRNA或蛋白质的表达。在一些实施例中，通过靶向TRAC基因组区域的gRNA产生TRAC基因表达的破坏。在一些实施例中，通过将外源序列(例如，编码嵌合抗原受体的核酸)敲入TRAC基因(例如，使用腺相关病毒(AAV)载体和供体模板)来产生TRAC基因表达的破坏。在一些实施例中，通过gRNA和/或将外源序列(例如，编码嵌合抗原受体的核酸)敲入TRAC基因中(例如，使用AAV载体和供体模板)来产生TRAC基因中的基因组缺失。在一些实施例中，利用靶向TRAC基因组区域的gRNA，并将嵌合抗原受体(CAR)敲入TRAC基因，来产生TRAC基因表达的破坏。

可以如本文所提供用于在TRAC基因中产生基因组破坏的经修饰和未修饰的TRACgRNA序列的非限制性实例列在表4中(例如，SEQ ID NO:18和19)。还参见2018年5月11日提交的国际申请号PCT/US 2018/032334，其通过引用并入本文。可以使用位于第14号染色体上的TRAC基因序列(GRCh38：第14号染色体：22,547,506-22,552,154；Ensembl；ENSG00000277734)设计其他gRNA序列。

在一些实施例中，至少50％的工程化T细胞群体不表达可检测水平的T细胞受体(TCR)表面蛋白。例如，群体中至少55％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％可能不表达可检测水平的TCR表面蛋白。在一些实施例中，工程化T细胞群体的50％-100％、50％-90％、50％-80％、50％-70％、50％-60％、60％-100％、60％-90％、60％-80％、60％-70％、70％-100％、70％-90％、70％-80％、80％-100％、80％-90％或90％-100％不表达可检测水平的TCR表面蛋白。

在一些实施例中，将核糖核蛋白颗粒(RNP)递送至T细胞(例如原代T细胞)，所述核糖核蛋白颗粒包含RNA指导的核酸酶(例如，Cas核酸酶，例如Cas9核酸酶)和靶向TRAC基因(或任何其他目的基因)的gRNA。在其他实施例中，RNA指导的核酸酶和gRNA分开递送至T细胞。核糖核蛋白颗粒(RNP)只是与gRNA预复合/复合的受RNA指导的核酸酶(例如，Cas9)。

在一些实施例中，靶向TRAC基因组区域的gRNA在TRAC基因中产生插缺，所述TRAC基因包含选自表1中的以下序列的至少一个核苷酸序列：

表1.

在一些实施例中，相对于未修饰的T细胞，工程化T细胞包含TRAC基因中的缺失。在一些实施例中，相对于未修饰的T细胞，工程化T细胞包含TRAC基因中15-30个碱基对的缺失。在一些实施例中，相对于未修饰的T细胞，工程化T细胞包含在TRAC中基因中15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个碱基对的缺失。在一些实施例中，相对于未修饰的T细胞，工程化T细胞包含TRAC基因中超过30个碱基对的缺失。在一些实施例中，相对于未修饰的T细胞，工程化T细胞包含TRAC基因中20个碱基对的缺失。在一些实施例中，相对于未修饰的T细胞，工程化T细胞包含TRAC基因中AGAGCAACAGTGCTGTGGCC(SEQ ID NO:325)的缺失。在一些实施例中，相对于未修饰的T细胞，工程化T细胞包含TRAC基因中包含AGAGCAACAGTGCTGTGGCC(SEQ ID NO:325)的缺失。在一些实施例中，相对于未修饰的T细胞，工程化T细胞包含TRAC基因中SEQ ID NO:40的缺失。在一些实施例中，相对于未修饰的T细胞，工程化T细胞包含TRAC基因中包含SEQ ID NO:40的缺失。

β2M基因编辑

在一些实施例中，工程化T细胞包含被破坏的β2M基因。β2M是MHC I复合物的常见(不变)组分。通过基因编辑破坏其表达将阻止宿主抗治疗性同种异体T细胞应答，从而导致同种异体T细胞持久性增加。在一些实施例中，消除内源性β2M基因的表达以防止移植物抗宿主应答。

可以如本文所提供用于在β2M基因中产生基因组破坏的经修饰和未修饰的β2MgRNA序列的非限制性实例列在表4中(例如，SEQ ID NO:20和21)。还参见2018年5月11日提交的国际申请号PCT/US 2018/032334，其通过引用并入本文。可以使用位于第15号染色体上的β2M基因序列(GRCh38坐标：染色体15：44,711,477-44,718,877；Ensembl：ENSG00000166710)设计其他gRNA序列。

在一些实施例中，靶向β2M基因组区域的gRNA在β2M基因中产生插缺，破坏mRNA或蛋白质的表达。

在一些实施例中，工程化T细胞群体的至少50％的工程化T细胞不表达可检测水平的β2M表面蛋白。例如，群体的至少55％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的工程化T细胞可以不表达可检测水平的β2M表面蛋白。在一些实施例中，群体的50％-100％、50％-90％、50％-80％、50％-70％、50％-60％、60％-100％、60％-90％、60％-80％、60％-70％、70％-100％、70％-90％、70％-80％、80％-100％、80％-90％或90％-100％的工程化T细胞不表达可检测水平的β2M表面蛋白。

在一些实施例中，将核糖核蛋白颗粒(RNP)递送至T细胞(例如原代T细胞)，所述核糖核蛋白颗粒包含RNA指导的核酸酶(例如，Cas核酸酶，例如Cas9核酸酶)和靶向B2M基因(或任何其他目的基因)的gRNA。在其他实施例中，RNA指导的核酸酶和gRNA分开递送至T细胞。核糖核蛋白颗粒(RNP)只是与gRNA预复合/复合的受RNA指导的核酸酶(例如，Cas9)。

在一些实施例中，经编辑的β2M基因包含选自以下表2中序列的至少一个核苷酸序列:

表2.

CD33基因编辑

CD33(也称为Siglec3、唾液酸结合Ig样凝集素3、gp67或p67)是在髓系谱系细胞上表达的跨膜受体。CD33结合唾液酸，因此是凝集素SIGLEC家族的成员。通常认为它具有髓细胞特异性，但也可存在于一些淋巴细胞上，包括激活的T细胞(Hernandez-Caselles等人，2006)。

在一些实施例中，工程化T细胞包含被破坏的CD33基因。在一些实施例中，消除内源性CD33基因的表达以增强本披露的CAR T细胞的抗肿瘤功效并减少相残行为。在一些实施例中，靶向CD33基因组区域的gRNA在CD33基因中、周围或附近产生插缺，破坏CD33 mRNA和/或CD33蛋白的表达。

表10中列出了可如本文所提供用于在CD33基因中产生基因组破坏的经修饰和未经修饰的CD33 gRNA序列的非限制性实例，例如CD33-1 gRNA；UGGCUAUGGAUCCAAAUUUCguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcUUUU(SEQ ID NO:132)。在一些实例中，CD33-2或CD33-10指导RNA可用于在CD33基因中产生基因组破坏。在一些实例中，用于破坏CD33基因的指导RNA包含表10中列出的间隔子序列。可以使用位于第19号染色体上的CD33基因序列(GRCh38坐标：染色体19：51,225,064-51,243,860；Ensembl：ENSG 00000105383.14)设计其他gRNA序列。

在一些实施例中，工程化T细胞包含被破坏的CD33基因。在一些实施例中，工程化T细胞群体的至少20％的工程化T细胞不表达可检测水平的CD33表面蛋白。例如，群体的至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少群体中70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的工程化T细胞可能不表达可检测水平的CD33表面蛋白。在一些实施例中，群体的20％-75％、20-50％、30-50％、30％-75％、50％-100％、50％-90％、50％-80％、50％-70％、50％-60％、60％-100％、60％-90％、60％-80％、60％-70％、70％-100％、70％-90％、70％-80％、80％-100％、80％-90％或90％-100％的工程化T细胞不表达可检测水平的CD33表面蛋白。

在一些实施例中，将核糖核蛋白颗粒(RNP)递送至T细胞(例如原代T细胞)，所述核糖核蛋白颗粒包含RNA指导的核酸酶(例如，Cas核酸酶，例如Cas9核酸酶)和靶向CD33基因(或任何其他目的基因)的gRNA。在其他实施例中，RNA指导的核酸酶和gRNA分开递送至T细胞。核糖核蛋白颗粒(RNP)只是与gRNA预复合/复合的受RNA指导的核酸酶(例如，Cas9)。

在一些实施例中，该经编辑的CD33基因可包含突变片段，例如，经编辑的CD33基因包含表13-22(“基因编辑序列”列)中提供的一个或多个突变片段，例如，表14和/或表22中提供的突变片段。例如，CD33基因可包含相对于野生型对应物具有缺失的突变片段，例如，经编辑的CD33基因可包含GGATCCAAA-TTCTGGCTGC(SEQ ID NO:175)所示的核苷酸序列，其中单核苷酸缺失由短划线(-)表示。在另一实例中，经编辑的CD33基因可包含相对于野生型对应物具有插入的突变片段，例如GGATCCAAATTTTCTGGCTGC(SEQ ID NO:176)，其中以黑体字表示插入。在又一个实例中，CD33基因可包含相对于野生型对应物同时具有缺失和插入的突变片段，例如，相对于野生型对应物序列SEQ ID NO:174具有SEQ ID NO:175中所示的缺失和SEQ ID NO:176中所示的插入。

在一些实施例中，可以根据从野生型(或未编辑)基因中缺失的片段来描述经编辑的CD33基因。

例如，经编辑的CD33基因可缺少包含GGATCCAAATTTCTGGCTGC(SEQ ID NO:174)的片段或其部分，其可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个核苷酸。

例如，经编辑的CD33基因可缺少包含AGTTCATGGTTACTGGTTCC(SEQ ID NO:186)的片段或其部分，其可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个核苷酸。

例如，经编辑的CD33基因可缺少包含ACTCCCCAGTTCATGGTTAC(SEQ ID NO:196)的片段或其部分，其可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个核苷酸。

例如，经编辑的CD33基因可缺少包含AGCCATTATATCCAGGGACT(SEQ ID NO:207)的片段或其部分，其可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个核苷酸。

例如，经编辑的CD33基因可缺少包含TCAGTGACGGTACAGGAGGG(SEQ ID NO:220)的片段或其部分，其可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个核苷酸。

例如，经编辑的CD33基因可缺少包含AGGTGAAGTTCGCTGGAGCT(SEQ ID NO:243)的片段或其部分，其可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个核苷酸。

例如，经编辑的CD33基因可缺少包含AGTTCGCTGGAGCTGGTGTG(SEQ ID NO:263)的片段或其部分，其可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个核苷酸。

例如，经编辑的CD33基因可缺少包含ACTACTCACTCCTCGGTGCT(SEQ ID NO:268)的片段或其部分，其可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个核苷酸。

例如，经编辑的CD33基因可能缺少包含CCCGATCTTCTCCTGGTTGT(SEQ ID NO:285)的片段或其部分，其可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个核苷酸。

例如，经编辑的CD33基因可能缺少包含AAATCCTCATCCCTGGCACT(SEQ ID NO:299)的片段或其部分，其可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个核苷酸。

在一些实施例中，该经编辑的CD33基因可具有以下一个或多个特征：

(a)包含GGATCCAAATTCTGGCTGC(SEQ ID NO:175)、GGATCCAAATTTTCTGGCTGC(SEQID NO:176)、GGATCCTGGCTGC(SEQ ID NO:177)、GGATCCAATTCTGGCTGC(SEQ ID NO:178)、TCCTGGCTGC(SEQ ID NO:179)、GGATCTGGCTGC(SEQ ID NO:180)、GGATCC和/或GGATCCATTCTGGCTGC(SEQ ID NO:181)的核苷酸序列；

(b)缺少包含GGATCCAAATTTCTGGCTGC(SEQ ID NO:174)的片段；以及

(c)缺少以下片段，该片段的3'区段包含GGATCCAAATTTC(SEQ ID NO:182)、GGATCCAAATT(SEQ ID NO:183)或GGATCCAAATTT(SEQ ID NO:185)的核苷酸序列。

此类经编辑的CD33基因可使用包含SEQ ID NO:164的间隔子序列的指导RNA(例如，SEQ ID NO:142的gRNA)产生。

在一些实施例中，该经编辑的CD33基因可具有以下一个或多个特征：

(a)包含AGTTCATGGTACTGGTTCC(SEQ ID NO:187)、AGTTCATGGTTCC(SEQ ID NO:188)、AGTTCATGTACTGGTTCC(SEQ ID NO:189)、AGTTCATGGTTTACTGGTTCC(SEQ ID NO:190)、AGTTCC、AGTACTGGTTCC(SEQ ID NO:191)、AGTTCATACTGGTTCC(SEQ ID NO:192)、AGTTCATGGTATACTGGTTCC(SEQ ID NO:193)和/或AGTTACTGGTTCC(SEQ ID NO:194)的核苷酸序列；以及

(b)缺少包含AGTTCATGGTTACTGGTTCC(SEQ ID NO:186)的片段；

此类经编辑的CD33基因可使用包含SEQ ID NO:165的间隔子序列的指导RNA(例如，SEQ ID NO:143的gRNA)产生。

在一些实施例中，该经编辑的CD33基因可具有以下一个或多个特征：

(a)包含ACTCCCCAGTTTCATGGTTAC(SEQ ID NO:197)、ACTCCCCAGTCATGGTTAC(SEQID NO:198)、ACTCCCCATGGTTAC(SEQ ID NO:199)、ACTCCCCAGTTAC(SEQ ID NO:200)、ACTCATGGTTAC(SEQ ID NO:201)、ACTCCCCATCATGGTTAC(SEQ ID NO:202)、ACTCCCCATTCATGGTTAC(SEQ ID NO:203)、ACTCCCCAGTGTCATGGTTAC(SEQ ID NO:204)和/或ACTCCCCAGTCTCATGGTTAC(SEQ ID NO:205)的核苷酸序列；

(b)缺少包含ACTCCCCAGTTCATGGTTAC(SEQ ID NO:196)的片段；以及

(c)缺少以下片段，该片段的3'区段包含ACTCCCCAGTTCATGGTT(SEQ ID NO:206)的核苷酸序列。

此类经编辑的CD33基因可使用包含SEQ ID NO:166的间隔子序列的指导RNA(例如，SEQ ID NO:144的gRNA)产生。

在一些实施例中，该经编辑的CD33基因可具有以下一个或多个特征：

(a)包含AGCCATTATCCAGGGACT(SEQ ID NO:208)、AGCCAGGGACT(SEQ ID NO:209)、AGCCATTATTCCAGGGACT(SEQ ID NO:210)、AGTCCAGGGACT(SEQ ID NO:211)、AGCCATTATAATCCAGGGACT(SEQ ID NO:212)、AGCCATTATCCGGGGACT(SEQ ID NO:213)、AGCCATTATACAGGGACT(SEQ ID NO:214)、AGCCATTATTCCGGGGACT(SEQ ID NO:216)和/或AGCCATTATAATCCGGGGACT(SEQ ID NO:217)的核苷酸序列；

(b)缺少包含AGCCATTATATCCAGGGACT(SEQ ID NO:207)的片段；以及

(c)缺少以下片段，该片段的3′区段包含AGCCATTATATCCA(SEQ ID NO:218)或AGCCATTATA(SEQ ID NO:219)的核苷酸序列。

此类经编辑的CD33基因可使用包含SEQ ID NO:167的间隔子序列的指导RNA(例如，SEQ ID NO:145的gRNA)产生。

在一些实施例中，该经编辑的CD33基因可具有以下一个或多个特征：

(a)包含TCAGTGACAGGAGGG(SEQ ID NO:221)、TCAGTGACGTACAGGAGGG(SEQ ID NO:222)、TCAGGAGGG(SEQ ID NO:223)、TCAGTGACGGAGGG(SEQ ID NO:224)、TCAGTGACGGGAGGG(SEQ ID NO:226)、TCAGTGACGGTTACAGGAGGG(SEQ ID NO:227)、TCAGTGACGGACAGGAGGG(SEQID NO:228)、TCAGTGACGGGTACAGGAGGG(SEQ ID NO:229)、TCAGTACAGGAGGG(SEQ ID NO:230)、TCAGTGACTACAGGAGGG(SEQ ID NO:231)、TCAGTGACGGG(SEQ ID NO:232)、TCAGTGACGG(SEQ ID NO:233)、TCAGTGACGGCAGGAGGG(SEQ ID NO:234)、TCAGTGACGGAGGAGGG(SEQ IDNO:235)、TCAGTGATACAGGAGGG(SEQ ID NO:236)、TCAGTGTACAGGAGGG(SEQ ID NO:237)和/或TCATACAGGAGGG(SEQ ID NO:238)的核苷酸序列；

(b)缺少包含TCAGTGACGGTACAGGAGGG(SEQ ID NO:220)的片段；

(c)缺少以下片段，该片段的3'区段包含TCAGTGACGGTA(SEQ ID NO:239)或TCAGTGACG的核苷酸序列；以及

(d)缺少以下片段，该片段的5'区段包含GTGACGGTACAGGAGGG的核苷酸序列(SEQID NO:242)。

此类经编辑的CD33基因可使用包含SEQ ID NO:168的间隔子序列的指导RNA(例如，SEQ ID NO:146的gRNA)产生。

在一些实施例中，该经编辑的CD33基因可具有以下一个或多个特征：

(a)包含AGCTGGAGCT(SEQ ID NO:244)、AGGTGAAGCTGGAGCT(SEQ ID NO:245)、AGGTGAAGCT(SEQ ID NO:246)、AGGTGAAGTTGGAGCT(SEQ ID NO:247)、AGGTGAAGTCGCTGGAGCT(SEQ ID NO:248)、AGGTGGAGCT(SEQ ID NO:249)、AGGTGAAGCGCTGGAGCT(SEQ ID NO:250)、AGGTGACGCTGGAGCT(SEQ ID NO:252)和/或AGGTGAAGTTTCGCTGGAGCT(SEQ ID NO:253)的核苷酸序列；

(b)缺少包含AGGTGAAGTTCGCTGGAGCT(SEQ ID NO:243)的片段；

(c)缺少以下片段，该片段的3'区段包含AGGTGAAGTTCG(SEQ ID NO:256)、AGGTGAAGTTCGCTGGAG(SEQ ID NO:259)、AGGTGAAGTTCGCTGG(SEQ ID NO:260)或AGGTGAAGTT(SEQ ID NO:261)的核苷酸序列；以及

(d)缺少以下片段，该片段的5'区段包含GGTGAAGTTCGCTGGAGCT(SEQ ID NO:262)的核苷酸序列。

此类经编辑的CD33基因可使用包含SEQ ID NO:169的间隔子序列的指导RNA(例如，SEQ ID NO:147的gRNA)产生。

在一些实施例中，该经编辑的CD33基因可具有以下一个或多个特征：

(a)包含AGTTCGCTGGTGTG(SEQ ID NO:264)和/或AGTTCGCTGAGCTGGTGTG(SEQ IDNO:266)的核苷酸序列；

(b)缺少包含AGTTCGCTGGAGCTGGTGTG(SEQ ID NO:263)的片段；以及

(c)缺少以下片段，该片段的3'区段包含AGTTCGCTGG(SEQ ID NO:267)的核苷酸序列。

此类经编辑的CD33基因可使用包含SEQ ID NO:170的间隔子序列的指导RNA(例如，SEQ ID NO:148的gRNA)产生。

在一些实施例中，该经编辑的CD33基因可具有以下一个或多个特征：

(a)包含ACTACTCACTTCCTCGGTGCT(SEQ ID NO:269)、ACTACTCGGTGCT(SEQ ID NO:270)、ACTACTCATCCTCGGTGCT(SEQ ID NO:271)、ACTACT、ACTACTCACCCTCGGTGCT(SEQ ID NO:272)、ACTACTCCTCGGTGCT(SEQ ID NO:273)、ACTACTCACCTCGGTGCT(SEQ ID NO:275)、ACTACTCACTCGGTGCT(SEQ ID NO:276)、ACTACTCTCCTCGGTGCT(SEQ ID NO:277)、ACTACTTCCTCGGTGCT(SEQ ID NO:278)、ACTACTCACTTCGGTGCT(SEQ ID NO:279)和/或ACTATCCTCGGTGCT(SEQ ID NO:280)的核苷酸序列；

(b)缺少包含ACTACTCACTCCTCGGTGCT(SEQ ID NO:268)的片段；以及

(c)缺少以下片段，该片段的3′区段包含ACTACTCACT(SEQ ID NO:282)、ACTACTCACTCCTC(SEQ ID NO:283)或ACTACTCACTCCTCGGT(SEQ ID NO:284)的核苷酸序列。

此类经编辑的CD33基因可使用包含SEQ ID NO:171的间隔子序列的指导RNA(例如，SEQ ID NO:149的gRNA)产生。

在一些实施例中，该经编辑的CD33基因可具有以下一个或多个特征：

(a)包含CCCGATCTTCCTGGTTGT(SEQ ID NO:286)、CCCGATCCTGGTTGT(SEQ ID NO:287)、CCCGATCTGGTTGT(SEQ ID NO:288)、CCCTGGTTGT(SEQ ID NO:289)、CCCGATCTTCTGGTTGT(SEQ ID NO:290)、CCCGATCTTGGTTGT(SEQ ID NO:291)、CCCGATCTCCTGGTTGT(SEQ ID NO:292)、CCCGATCTTCCCTGGTTGT(SEQ ID NO:293)和/或CCCGAT的核苷酸序列；

(b)缺少包含CCCGATCTTCTCCTGGTTGT(SEQ ID NO:285)的片段；

(c)缺少以下片段，该片段的3′区段包含CCCGATCTTCT(SEQ ID NO:295)的核苷酸序列；以及

(d)缺少以下片段，该片段的5′区段包含TCCTGGTTGT(SEQ ID NO:298)的核苷酸序列。

此类经编辑的CD33基因可使用包含SEQ ID NO:172的间隔子序列的指导RNA(例如，SEQ ID NO:150的gRNA)产生。

在一些实施例中，该经编辑的CD33基因可具有以下一个或多个特征：

(a)包含AAATCCTGGCACT(SEQ ID NO:300)、AAATCCCTGGCACT(SEQ ID NO:301)、AAATCCTCATTCCCTGGCACT(SEQ ID NO:302)、AAATCCTCACCCTGGCACT(SEQ ID NO:304)、AAATCCTCCCCTGGCACT(SEQ ID NO:305)、AAATCCTCCCTGGCACT(SEQ ID NO:306)、AAATCCCCTGGCACT(SEQ ID NO:307)、ACATCCTCATTCCCTGGCACT(SEQ ID NO:308)、ACATCCTGGCACT(SEQ ID NO:309)、AAATCCTCTCCCTGGCACT(SEQ ID NO:310)、AAATCCTCATCTGGCACT(SEQ ID NO:311)、AAATCCT、AAACCCTGGCACT(SEQ ID NO:312)、AAATCCTCTGGCACT(SEQ ID NO:313)、AAATCCCCCTGGCACT(SEQ ID NO:314)、AAATCCTCACT(SEQ ID NO:315)、ACATCCCTGGCACT(SEQ ID NO:316)和/或AAAT的核苷酸序列；

(b)缺少包含AAATCCTCATCCCTGGCACT(SEQ ID NO:299)的片段；

(c)缺少以下片段，该片段的3′区段包含AAATCCTCAT(SEQ ID NO:317)、AAATCCTCATCCCT(SEQ ID NO:318)、AAATCCTCATCCCTGG(SEQ ID NO:320)、AAATCCTCATC(SEQID NO:322)或AAATCCTCATCCCTGGCA(SEQ ID NO:324)的核苷酸序列；以及

(d)缺少以下片段，该片段的5′区段包含CTCATCCCTGGCACT(SEQ ID NO:323)的核苷酸序列。

此类经编辑的CD33基因可使用包含SEQ ID NO:173的间隔子序列的指导RNA(例如，SEQ ID NO:151的gRNA)产生。

PD-1基因编辑

PD-1是在激活的T细胞中上调并用来抑制或终止T细胞应答的免疫检查点分子。通过基因编辑破坏PD-1可以导致受试者更持久和/或更有效的治疗性T细胞应答和/或减少免疫抑制。在一些实施例中，工程化T细胞包含被破坏的PD-1基因。在一些实施例中，消除内源性PD-1基因的表达以增强本披露的CAR T细胞的抗肿瘤功效。

可以如本文所提供用于在PD-1基因中产生基因组缺失的经修饰和未修饰的PD-1gRNA序列的非限制性实例列在表4中(例如，SEQ ID NO:22和23)。还参见2018年5月11日提交的国际申请号PCT/US 2018/032334，其通过引用并入本文。可以使用位于第2号染色体上的PD-1基因序列(GRCh38坐标：染色体2：241,849,881-241,858,908；Ensembl：ENSG00000188389)设计其他gRNA序列。

在一些实施例中，靶向PD-1基因组区域的gRNA在PD-1基因中产生插缺，破坏PD-1mRNA或蛋白质的表达。

在一些实施例中，工程化T细胞包含被破坏的PD-1基因。在一些实施例中，工程化T细胞群体的至少50％的工程化T细胞不表达可检测水平的PD-1表面蛋白。例如，群体的至少55％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的工程化T细胞可以不表达可检测水平的PD-1表面蛋白。在一些实施例中，群体的50％-100％、50％-90％、50％-80％、50％-70％、50％-60％、60％-100％、60％-90％、60％-80％、60％-70％、70％-100％、70％-90％、70％-80％、80％-100％、80％-90％或90％-100％的工程化T细胞不表达可检测水平的PD-1表面蛋白。

在一些实施例中，将核糖核蛋白颗粒(RNP)递送至T细胞(例如原代T细胞)，所述核糖核蛋白颗粒包含RNA指导的核酸酶(例如，Cas核酸酶，例如Cas9核酸酶)和靶向PD-1基因(或任何其他目的基因)的gRNA。在其他实施例中，RNA指导的核酸酶和gRNA分开递送至T细胞。核糖核蛋白颗粒(RNP)只是与gRNA预复合/复合的受RNA指导的核酸酶(例如，Cas9)。

CD70基因编辑

分化簇70(CD70)是肿瘤坏死因子超家族的成员，并且其表达限于激活的T和B淋巴细胞以及成熟的树突状细胞。还已经在血液肿瘤和癌上检测到CD70。CD70通过与其配体CD27相互作用而参与肿瘤细胞和调节性T细胞的存活。通过基因编辑破坏CD70可增加细胞的扩增并减少细胞的衰竭。在一些实施例中，工程化T细胞包含被破坏的CD70基因。在一些实施例中，消除内源性CD70基因的表达以增强本披露的CAR T细胞的抗肿瘤功效。在一些实施例中，靶向CD70基因组区域的gRNA在CD70基因中或周围产生插缺，破坏CD70 mRNA和/或蛋白质的表达。

可以如本文所提供用于在CD70基因中产生基因组基因破坏的经修饰和未修饰的CD70 gRNA序列的非限制性实例列在表4中(例如，SEQ ID NO:24-27)。还参见2019年5月10日提交的国际申请号PCT/IB 2019/000500，其通过引用并入本文。可以使用位于第19号染色体上的CD70基因序列(GRCh38坐标：染色体19：6,583,183-6,604,103；Ensembl：ENSG00000125726)设计其他gRNA序列。

在一些实施例中，工程化T细胞包含被破坏的CD70基因。在一些实施例中，工程化T细胞群体的至少50％的工程化T细胞不表达可检测水平的CD70表面蛋白。例如，群体的至少55％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的工程化T细胞可以不表达可检测水平的CD70表面蛋白。在一些实施例中，群体的50％-100％、50％-90％、50％-80％、50％-70％、50％-60％、60％-100％、60％-90％、60％-80％、60％-70％、70％-100％、70％-90％、70％-80％、80％-100％、80％-90％或90％-100％的工程化T细胞不表达可检测水平的CD70表面蛋白。

在一些实施例中，将核糖核蛋白颗粒(RNP)递送至T细胞(例如原代T细胞)，所述核糖核蛋白颗粒包含RNA指导的核酸酶(例如，Cas核酸酶，例如Cas9核酸酶)和靶向CD70基因(或任何其他目的基因)的gRNA。在其他实施例中，RNA指导的核酸酶和gRNA分开递送至T细胞。核糖核蛋白颗粒(RNP)只是与gRNA预复合/复合的受RNA指导的核酸酶(例如，Cas9)。

细胞表型

在一些实施例中，细胞群体内的一个或多个基因编辑导致如下表型，所述表型与细胞增殖能力、细胞耗尽、细胞生存力、细胞裂解能力(例如，增加细胞因子产生和/或释放)或它们的任何组合的改变关联。

在一些实施例中，相对于对照T细胞，本披露的工程化T细胞表现出至少20％更大的细胞增殖能力。例如，相对于对照细胞，工程化T细胞可以表现出至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％或至少90％更大的细胞增殖能力。在一些实施例中，相对于对照T细胞，本披露的工程化T细胞表现出20％-100％、20％-90％、20％-80％、20％-70％、20％-60％、20％-50％、30％-100％、30％-90％、30％-80％、30％-70％、30％-60％、30％-50％、40％-100％、40％-90％、40％-80％、40％-70％、40％-60％、40％-50％、50％-100％、50％-90％、50％-80％、50％-70％或50％-60％更大的细胞增殖能力。

在一些实施例中，相对于对照细胞，本披露的工程化T细胞表现出细胞生存力增加至少20％。例如，相对于对照细胞，本披露的工程化T细胞的细胞生存力可表现出增加至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％或至少90％。在一些实施例中，相对于对照细胞，本披露的工程化T细胞的细胞生存力表现出增加20％-100％、20％-90％、20％-80％、20％-70％、20％-60％、20％-50％、30％-100％、30％-90％、30％-80％、30％-70％、30％-60％、30％-50％、40％-100％、40％-90％、40％-80％、40％-70％、40％-60％、40％-50％、50％-100％、50％-90％、50％-80％、50％-70％或50％-60％。

在一些实施例中，相对于对照细胞，本披露的工程化T细胞表现出细胞裂解能力增加至少20％(多杀伤至少20％的靶细胞)。例如，相对于对照细胞，本披露的工程化T细胞的细胞裂解能力可表现出增加至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％或至少90％。在一些实施例中，相对于对照细胞，本披露的工程化T细胞的细胞裂解能力表现出增加20％-100％、20％-90％、20％-80％、20％-70％、20％-60％、20％-50％、30％-100％、30％-90％、30％-80％、30％-70％、30％-60％、30％-50％、40％-100％、40％-90％、40％-80％、40％-70％、40％-60％、40％-50％、50％-100％、50％-90％、50％-80％、50％-70％或50％-60％。例如，工程化T细胞分泌的细胞因子(例如，IL-2和/或IFN-γ)的水平比对照T细胞分泌的细胞因子水平大至少2倍(例如，至少3倍、至少4倍或至少5倍)。

在一些实施例中，对照T细胞是工程化T细胞(例如，经基因编辑的T细胞)。在一些实施例中，对照T细胞是工程化T细胞，其包含被破坏的TRAC基因，插入到TRAC基因中的编码CAR的核酸(例如抗CD33 CAR)和/或被破坏的β2M基因。在一些实施例中，对照T细胞是未经编辑的T细胞。

基因编辑方法

基因编辑(包括基因组编辑)是基因工程的一种类型，其中在DNA序列中，例如在靶细胞的基因组中插入、缺失和/或取代一个或多个核苷酸/一个或多个核酸。靶向基因编辑使得能够在靶细胞的基因组中的预选位点(例如，在靶基因或靶DNA序列中)实现插入、缺失和/或取代。当例如通过一个或多个核苷酸/一个或多个核酸的缺失、插入或取代来编辑内源基因的序列时，包含受影响序列的内源基因可能由于序列修饰而被敲除或敲低。因此，靶向编辑可用于破坏内源基因表达。“靶向整合”是指涉及在插入位点缺失或不缺失内源序列情况下，一个或多个外源序列的插入的过程。当存在包含外源序列的供体模板时，靶向整合可以由靶向基因编辑产生。

靶向编辑可以通过不依赖核酸酶的方法或依赖于核酸酶的方法来实现。在不依赖核酸酶的靶向编辑方法中，同源重组是由在外源多核苷酸侧翼的同源序列进行指导，所述外源多核苷酸通过宿主细胞的酶促机制引入内源序列中。外源多核苷酸可以在内源序列中引入核苷酸的缺失、插入或替换。

可替代地，依赖于核酸酶的方法可以通过特异性稀有切割核酸酶(例如，内切核酸酶)特异性引入双链断裂(DSB)来实现更高频率的靶向编辑。这种依赖核酸酶的靶向编辑还利用DNA修复机制，例如非同源末端连接(NHEJ)，它响应于DSB而发生。NHEJ修复DNA通常会导致少量内源核苷酸的随机插入或缺失(插缺)。与NHEJ介导的修复相比，修复也可以通过同源定向修复(HDR)进行。当存在包含侧翼是一对同源臂的外源遗传物质的供体模板时，可通过HDR将外源遗传物质引入基因组，这导致外源遗传物质的靶向整合。

能够引入特异性和靶向DSB的可用内切核酸酶包括但不限于锌指核酸酶(ZFN)、转录激活子样效应子核酸酶(TALEN)和RNA指导的CRISPR-Cas9核酸酶(CRISPR/Cas9；聚簇规则间隔短回文重复序列相关9)。此外，利用phiC31和Bxb1整合酶的DICE(双整合酶盒交换)系统也可以用于靶向整合。

ZFN是靶向核酸酶，包含与锌指DNA结合结构域(ZFBD)融合的核酸酶，ZFBD是通过一个或多个锌指以序列特异性方式结合DNA的多肽结构域。锌指是锌指结合结构域内约30个氨基酸的结构域，其结构通过锌离子的配位稳定。锌指的实例包括但不限于C2H2锌指、C3H锌指和C4锌指。设计的锌指结构域是自然界中不存在的结构域，其设计/组成主要来自于合理的标准，例如，取代规则和用于在存储现有ZFP设计信息和结合数据的数据库中处理信息的计算机算法的应用。参见，例如美国专利号6,140,081；6,453,242；和6,534,261；另参见WO 98/53058；WO 98/53059；WO 98/53060；WO 02/016536和WO 03/016496。选择的锌指结构域是在自然界中找不到的结构域，其产生主要来自经验过程，例如噬菌体展示、相互作用陷阱或杂交选择。ZFNs在美国专利号7,888,121和美国专利号7,972,854中更详细描述。ZFN的最广为人知的实例是FokI核酸酶与锌指DNA结合结构域的融合物。

TALEN是靶向核酸酶，其包含与TAL效应子DNA结合结构域融合的核酸酶。“转录激活子样效应子DNA结合结构域”，“TAL效应子DNA结合结构域”或“TALE DNA结合结构域”是TAL效应子蛋白的多肽结构域，其负责TAL效应子蛋白与DNA的结合。TAL效应子蛋白由黄杆菌属(Xanthomonas)的植物病原体在感染期间分泌。这些蛋白质进入植物细胞的核，通过其DNA结合结构域结合效应子特异性DNA序列，并通过其反式激活结构域激活这些序列上的基因转录。TAL效应子DNA结合结构域特异性取决于不完全的34个氨基酸重复的效应子可变数目，其在选择的称为重复可变二残基(RVD)的重复位置处包含多态性。在美国专利申请号2011/0145940中更详细地描述了TALEN。在本领域中最公认的TALEN实例是FokI核酸酶与TAL效应DNA结合结构域的融合多肽。

适用于如本文提供的用途的靶向核酸酶的其他实例包括但不限于Bxb1、phiC31、R4、PhiBT1和Wβ/SPBc/TP901-1，无论是单独使用还是组合使用。

靶向核酸酶的其他非限制性实例包括天然存在的核酸酶和重组核酸酶，例如CRISPR/Cas9、限制性内切核酸酶、大范围核酸酶归巢内切核酸酶等。

CRISPR-Cas9基因编辑

CRISPR-Cas9系统是原核生物中天然存在的防御机制，其已被重新用作用于基因编辑的RNA指导的DNA靶向平台。它依赖于DNA核酸酶Cas9和两个非编码RNA(crisprRNA(crRNA)和反式激活RNA(tracrRNA))来靶向DNA的切割。

crRNA通过典型地与靶DNA中的20个核苷酸(nt)序列的沃森-克里克碱基配对来驱动CRISPR-Cas9复合物的序列识别和特异性。改变crRNA中5′20nt的序列可将CRISPR-Cas9复合物靶向特定基因座。如果靶序列后面是特定的短DNA序列(序列为NGG)作为原型间隔子相邻基序(PAM)，CRISPR-Cas9复合物仅结合包含与crRNA的前20nt序列匹配的DNA序列，即单指导RNA(sgRNA)。

TracrRNA与crRNA的3′末端杂交形成RNA双链体结构，所述双链体结构与Cas9内切核酸酶结合形成催化活性的CRISPR-Cas9复合物，其然后可以切割靶DNA。

一旦CRISPR-Cas9复合物在靶位点与DNA结合，Cas9酶内的两个独立的核酸酶结构域各自切割PAM位点上游的DNA链之一，从而留下双链断裂(DSB)，在这里DNA的两条链以碱基对(平末端)终止。

CRISPR-Cas9复合物在特定靶位点处与DNA结合并形成位点特异性DSB之后，下一个关键步骤是修复DSB。细胞使用两种主要的DNA修复途径来修复DSB：非同源末端连接(NHEJ)和同源定向修复(HDR)。

NHEJ是一种稳健的修复机制，在包括非分裂细胞在内的大多数细胞类型中显现出高活性。NHEJ容易出错，并且通常会在DSB的位点导致在一个到几百个核苷酸之间的去除或添加，尽管此类修饰典型地<20nt。产生的插入和缺失(插缺)可以破坏基因的编码或非编码区域。可替代地，HDR使用内源性或外源性提供的长段同源供体DNA来以高保真度修复DSB。HDR仅在分裂的细胞中有效并且在大多数细胞类型中以相对较低的频率发生。在本披露的许多实施例中，NHEJ被作为自发的修复来利用。

在一些实施例中，尽管可以使用其他Cas9同源物，但是Cas9(CRISPR相关蛋白9)内切核酸酶来自酿脓链球菌。应当理解，如本文所提供的，可以使用野生型Cas9或可以使用Cas9的修饰版本(例如，Cas9的进化版本，或Cas9直向同源物或变体)。在一些实施例中，Cas9可以被另一种RNA指导的内切核酸酶诸如(II类CRISPR/Cas系统的)Cpf1取代。

指导RNA

本披露提供了靶向基因组的核酸，该靶向基因组的核酸可以将相关多肽(例如，定点多肽)的活性引导至靶核酸内的特定靶序列。靶向基因组的核酸可以是RNA。靶向基因组的RNA在本文中称为“指导RNA”或“gRNA”。指导RNA包含与目的靶核酸序列杂交的至少一个间隔子序列、和CRISPR重复序列。在II型系统中，gRNA还包含称为tracrRNA序列的第二RNA。在II型指导RNA(gRNA)中，CRISPR重复序列和tracrRNA序列彼此杂交形成双链体。在V型指导RNA(gRNA)中，crRNA形成双链体。在这两个系统中，双链体都结合定点多肽，使得指导RNA和定点多肽形成复合物。在一些实施例中，靶向基因组的核酸由于其与定点多肽的缔合而为复合物提供了靶特异性。因此，靶向基因组的核酸指导定点多肽的活性。

如本领域普通技术人员所理解的，每个指导RNA设计为包括与其基因组靶序列互补的间隔子序列。参见Jinek等人,Science[科学],337,816-821(2012)和Deltcheva等人,Nature[自然],471,602-607(2011)。

在一些实施例中，靶向基因组的核酸是双分子指导RNA。在一些实施例中，靶向基因组的核酸是单分子指导RNA。

双分子指导RNA包含两条链的RNA。第一条链在5'至3'方向上包含任选的间隔子延伸序列、间隔子序列和最小CRISPR重复序列。第二条链包含最小tracrRNA序列(与最小CRISPR重复序列互补)、3′tracrRNA序列和任选的tracrRNA延伸序列。

II型系统中的单分子指导RNA(sgRNA)在5'至3'方向上包含任选的间隔子延伸序列、间隔子序列、最小CRISPR重复序列、单分子指导接头、最小tracrRNA序列、3′tracrRNA序列和任选的tracrRNA延伸序列。任选的tracrRNA延伸序列可以包含为指导RNA贡献另外的功能(例如，稳定性)的元件。单分子向导接头将最小CRISPR重复序列和最小tracrRNA序列连接起来以形成发夹结构。任选的tracrRNA延伸包括一个或多个发夹。

V型系统中的单分子指导RNA(称为“sgRNA”或“gRNA”)在5'至3'方向上包含最小CRISPR重复序列和间隔子序列。

sgRNA可以在sgRNA序列的5′端包含20个核苷酸的间隔子序列。sgRNA可以在sgRNA序列的5′端包含少于20个核苷酸的间隔子序列。sgRNA可以在sgRNA序列的5′端包含超过20个核苷酸的间隔子序列。sgRNA可以在sgRNA序列的5′端包含17-30个核苷酸的可变长度的间隔子序列(参见表3)。

sgRNA可以在sgRNA序列的3′端不包含尿嘧啶。sgRNA可以在sgRNA序列的3′端包含一个或多个尿嘧啶。例如，sgRNA可以在sgRNA序列的3′端包含1个尿嘧啶(U)。sgRNA可以在sgRNA序列的3′端包含2个尿嘧啶(UU)。sgRNA可以在sgRNA序列的3′端包含3个尿嘧啶(UUU)。sgRNA可以在sgRNA序列的3′端包含4个尿嘧啶(UUUU)。sgRNA可以在sgRNA序列的3′端包含5个尿嘧啶(UUUUU)。sgRNA可以在sgRNA序列的3′端包含6个尿嘧啶(UUUUUU)。sgRNA可以在sgRNA序列的3′端包含7个尿嘧啶(UUUUUUU)。sgRNA可以在sgRNA序列的3′端包含8个尿嘧啶(UUUUUUUU)。

sgRNA可以是未经修饰的或经修饰的。例如，经修饰的sgRNA可以包含一个或多个2'-O-甲基硫代磷酸酯核苷酸。

表3.示例性sgRNA序列。

举例说明，用于CRISPR/Cas/Cpf1系统中的指导RNA或其他较小的RNA可以通过化学方法容易地合成，如下文所示和本领域所述。随着化学合成程序的不断发展，通过诸如高效液相色谱法(HPLC，其避免使用诸如PAGE等凝胶)等程序纯化此类RNA随着多核苷酸长度显著增加超过约一百个核苷酸而趋于更具挑战性。用于产生更大长度的RNA的一种方法是产生两个或更多个连接在一起的分子。更长的RNA(诸如编码Cas9或Cpf1内切核酸酶的那些)更容易酶促产生。如本领域所述，可以在RNA的化学合成和/或酶促生成期间或之后引入多种类型的RNA修饰，例如，增强稳定性、降低先天免疫应答的可能性或程度、和/或增强其他属性的修饰。

间隔子序列

gRNA包含间隔子序列。间隔子序列是定义目的靶核酸的靶序列(例如，DNA靶序列，如基因组靶序列)的序列(例如，20个核苷酸的序列)。在一些实施例中，间隔子序列是15至30个核苷酸。在一些实施例中，间隔子序列是15、16、17、18、19、29、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。在一些实施例中，间隔子序列是20个核苷酸。

“靶序列”与PAM序列相邻并且是通过RNA指导的核酸酶(例如，Cas9)修饰的序列。“靶核酸”是双链分子：一条链包含靶序列并且被称为“PAM链”，并且另一条互补链被称为“非PAM链”。本领域技术人员认识到，gRNA间隔子序列与位于目的靶核酸的非PAM链中的、靶序列的反向互补序列杂交。因此，gRNA间隔子序列是靶序列的RNA等同物。例如，如果靶序列是5′-AGAGCAACAGTGCTGTGGCC-3′(SEQ ID NO:325)，则gRNA间隔子序列是5'-AGAGCAACAGUGCUGUGGCC-3′(SEQ ID NO:19)。gRNA的间隔子经由杂交(即，碱基配对)以序列特异性方式与目的靶核酸相互作用。因此，间隔子的核苷酸序列根据目的靶核酸的靶序列而变化。

在本文的CRISPR/Cas系统中，将间隔子序列设计成与靶核酸的区域杂交，该区域位于该系统中使用的Cas9酶的PAM的5'。间隔子可以与靶序列完全匹配或可以有错配。每个Cas9酶都有特定的PAM序列，使得该酶识别靶DNA。例如，酿脓链球菌识别靶核酸中的包含序列5'-NRG-3'的PAM，其中R包含A或G，其中N是任何核苷酸并且N紧邻由间隔子序列靶向的靶核酸序列的3'。

在一些实施例中，靶核酸序列包含20个核苷酸。在一些实施例中，靶核酸包含小于20个核苷酸。在一些实施例中，靶核酸包含超过20个核苷酸。在一些实施例中，靶核酸包含至少：5、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30个或更多个核苷酸。在一些实施例中，靶核酸包含至多：5、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30个或更多个核苷酸。在一些实施例中，靶核酸序列包含紧邻PAM的第一核苷酸的5'的20个碱基。例如，在包含5'-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN

表4、表10和2018年5月11日提交的PCT/US 2018/032334提供了可按本文所述使用的gRNA的非限制性实例。

表4.gRNA序列/靶序列

*:2'-O-甲基硫代磷酸酯残基

嵌合抗原受体(CAR)T细胞

嵌合抗原受体是指人工免疫细胞受体，所述受体经工程化以识别并结合由肿瘤细胞表达的抗原。通常，CAR是为T细胞设计的，并且是T细胞受体(TCR)复合物的信号传导结构域与抗原识别结构域(例如，抗体的单链片段(scFv)或其他抗体片段)的嵌合体(Enblad等人,Human Gene Therapy[人类基因疗法].2015；26(8):498-505)。表达CAR的T细胞被称为CAR T细胞。CAR具有以非MHC限制的方式将T细胞特异性和反应性重定向至所选靶标的能力。非MHC限制性抗原识别赋予表达CAR的T细胞识别独立于抗原加工的抗原的能力，从而绕开了肿瘤逃逸的主要机制。此外，当在T细胞中表达时，CAR不会有利地与内源性T细胞受体(TCR)α和β链二聚。

有四代CAR，每代CAR含有不同组分。第一代CAR通过铰链结构域和跨膜结构域将抗体衍生的scFv与T细胞受体的CD3ζ(ζ或z)细胞内信号传导结构域连接。第二代CAR掺入了另外的结构域(例如CD28、4-1BB(41BB)或ICOS)以提供共刺激信号。第三代CAR含有两个与TCRCD3ζ链融合的共刺激结构域(costim.)。第三代共刺激结构域可以包括例如CD3ζ、CD27、CD28、4-1BB、ICOS或OX40的组合。在一些实施例中，CAR含有通常衍生自单链可变片段(scFv)、铰链的胞外结构域，跨膜结构域，以及具有一个(第一代)、两个(第二代)、或三个(第三代)衍生自CD3Z和/或共刺激分子的信号传导结构域的胞内结构域(例如，CD3ζ)(Maude等人,Blood.[血液]2015；125(26):4017-4023；Kakarla和Gottschalk,Cancer J.[癌症杂志]2014；20(2):151-155)。

CAR通常在功能特性上有所不同。T细胞受体的CD3ζ信号传导结构域(在参与时)会激活并诱导T细胞增殖，但可能导致无反应性(机体防御机制缺少反应，导致直接诱导外周淋巴细胞耐受性)。当淋巴细胞对特定抗原无反应时，它们被认为是无反应的。在第二代CAR中增加共刺激结构域改善了经修饰的T细胞的复制能力和持久性。用CD28或4-1BB CAR在体外观察到相似的抗肿瘤作用，但临床前体内研究表明4-1BB CAR可以产生优异的增殖和/或持久性。临床试验表明，这两种第二代CAR都能够在体内诱导大量T细胞增殖，但是含有4-1BB共刺激结构域的CAR显现可以持续更长的时间。第三代CAR组合了多个信号传导结构域(共刺激)以增强效能。

在一些实施例中，嵌合抗原受体是第一代CAR。在其他实施例中，嵌合抗原受体是第二代CAR。在还其他实施例中，嵌合抗原受体是第三代CAR。

在一些实施例中，CAR包含含有抗原结合结构域(例如抗体，如scFv)的细胞外(胞外)结构域、跨膜结构域、和细胞质(胞内)结构域。

胞外结构域

胞外结构域是CAR的暴露于细胞外液的区域，并且在一些实施例中，CAR包括抗原结合结构域，以及任选地信号肽、间隔子结构域、和/或铰链结构域。在一些情况下，该抗原结合结构域是抗体的片段。请参阅下面的讨论。

在一些实施例中，抗原结合结构域是单链可变片段(scFv)，其包括与短接头肽连接的免疫球蛋白的VL和VH。在一些实施例中，接头包括亲水性残基，即，多段甘氨酸和丝氨酸用于柔性，以及多段谷氨酸和赖氨酸用于增加溶解度。单链可变片段(scFv)实际上不是抗体的片段，而是免疫球蛋白的重链(VH)和轻链(VL)的可变区的融合蛋白，该融合蛋白与十到约25个氨基酸的短链接头肽连接。接头通常富含甘氨酸用于柔性、以及丝氨酸或苏氨酸用于溶解度，并且可以将VH的N-末端与VL的C-末端相连，反之亦然。尽管去除了恒定区并引入了接头，但此蛋白仍保留了原始免疫球蛋白的特异性。可用于产生抗CD33 scFv的VH和VL蛋白序列的非限制性实例可包括SEQ ID NO:65、77或89(VH)和SEQ ID NO:66、78或90(VL)的氨基酸序列。在一些实施例中，本披露的scFv是人源化的。在其他实施例中，scFv是完全人类的。在还其他实施例中，scFv是嵌合体(例如，小鼠和人序列的嵌合体)。在一些实施例中，scFv是抗CD33 scFv(特异性结合CD33)。可以如本文提供而使用的抗CD33 scFv蛋白的非限制性实例可以包括SEQ ID NO:54、68、75、82中任一项的氨基酸序列。可以使用其他scFv蛋白。

信号肽可以增强CAR结合的抗原特异性。信号肽可衍生自抗体(如但不限于CD8)、以及表位标签(如但不限于GST或FLAG)。信号肽的实例包括MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP(SEQID NO:162)和MALPVTALLLPLALLLHAARP(SEQ ID NO:121)。可以使用其他信号肽。

在一些实施例中，间隔子结构域或铰链结构域位于CAR的胞外结构域(包含抗原结合结构域)与跨膜结构域之间或者CAR的胞质结构域与跨膜结构域之间。间隔子结构域是起到将跨膜结构域连接至多肽链中的胞外结构域和/或胞质结构域的功能的任何寡肽或多肽。铰链结构域是起到向CAR或其结构域提供柔性或防止CAR或其结构域的空间位阻的作用的任何寡肽或多肽。在一些实施例中，间隔子结构域或铰链结构域可以包含多达300个氨基酸(例如，10至100个氨基酸或5至20个氨基酸)。在一些实施例中，一个或多个间隔子结构域可以包括在CAR的其他区域中。在一些实施例中，铰链结构域是CD8铰链结构域。可以使用其他铰链结构域。

跨膜结构域

跨膜结构域是跨过膜的疏水性α螺旋。跨膜结构域提供了CAR的稳定性。在一些实施例中，如本文提供的CAR的跨膜结构域是CD8跨膜结构域。在其他实施例中，跨膜结构域是CD28跨膜结构域。在还其他实施例中，跨膜结构域是CD8和CD28跨膜结构域的嵌合体。可以使用其他跨膜结构域。在一些实施例中，跨膜结构域是CD8a跨膜结构域：FVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNR(SEQ IDNO:125)。可以使用其他跨膜结构域。

在一些实施例中，跨膜结构域是包含以下氨基酸序列的CD8a跨膜结构域：IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLY(SEQ ID NO:163)。

胞内结构域

胞内结构域是受体的功能端。抗原识别后，受体聚簇，并且信号被传递到细胞。最常用的胞内结构域组分是CD3-ζ，该组件含有三(3)个基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)。这会在抗原结合后向T细胞传递激活信号。在许多情况下，CD3-ζ可能无法提供完全有效的激活信号，因此，使用了共刺激信号传导。例如，CD28和/或4-1BB可以与CD3-ζ(CD3ζ)一起使用，以传递增殖/存活信号。因此，在一些实施例中，如本文提供的CAR的共刺激分子是CD28共刺激分子。在其他实施例中，共刺激分子是4-1BB共刺激分子。在一些实施例中，CAR包括CD3ζ和CD28。在其他实施例中，CAR包括CD3-ζ和4-1BB。在仍其他实施例中，CAR包括CD3ζ、CD28、和4-1BB。表5提供了可以如本文所述使用的信号传导分子的实例。

表5.CAR组成成分的示例性序列。

示例性的CAR序列在下表26中提供。

表26.CAR组成

CAR结构：

CD8[信号肽]-抗CD33[scFV]-CD8[铰链]-CD8[tm]-CD28[共刺激结构域]-CD3z；或者

CD8[信号肽]-抗CD33[scFV]-CD8[铰链]-CD8[tm]-41BB[共刺激结构域]-CD3z

表27.供体组分

供体结构：TRAC[LHA]-EF1a[启动子]-CAR-聚A-TRAC[RHA]

抗体

抗体(以多种形式可互换使用)是一种免疫球蛋白分子，能够通过位于免疫球蛋白分子可变区中的至少一个抗原识别位点特异性结合至靶，例如碳水化合物、多核苷酸、脂质、多肽等。如本文所用，术语“抗体”不仅包括完整的(即，全长)单克隆抗体，还包括抗原结合片段(例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、单链可变片段(scFv)、其突变体，包含抗体部分的融合蛋白、人源化抗体、嵌合抗体、双抗体、线性抗体、单链抗体、单结构域抗体(例如，骆驼或美洲驼VHH抗体)、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和包含所需特异性抗原识别位点的免疫球蛋白分子的任何其他经修饰的构型(包括抗体的糖基化变体、抗体的氨基酸序列变体和共价修饰的抗体)。

典型的抗体分子包含通常与抗原结合有关的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。这些负责抗原结合的区域/残基可以使用本领域已知方法，从参考抗体(例如本文所述的抗CD33抗体)的VH/VL序列的氨基酸序列来鉴定。VH和VL区可以进一步细分为超变区(称为“互补决定区”(“CDR”))，穿插更保守区(称为“框架区”(“FR”))。每个VH和VL典型地由三个CDR和四个FR构成，以下列顺序从氨基末端到羧基末端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。可以使用本领域已知的方法，例如通过Kabat定义、Chothia定义、AbM定义和/或接触定义(所有这些在本领域中是众所周知的)来精确地鉴定框架区和CDR的程度。如本文所用，CDR可指通过本领域已知的任何方法定义的CDR。两种具有相同CDR的抗体是指两种抗体具有通过相同方法测定的该CDR的相同氨基酸序列。参见，例如，Kabat,E.A.等人,(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest[具有免疫学意义的蛋白质序列],第五版,美国卫生与公众服务部,NIH公开号91-3242,Chothia等人,(1989)Nature[自然]342:877；Chothia,C.等人,(1987)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]196:901-917；Al-lazikani等人,(1997)J.Molec.Biol.[分子生物学杂志]273:927-948；以及Almagro,J.Mol.Recognit.[分子识别杂志]17:132-143(2004)。另请参见hgmp.mrc.ac.uk和bioinf.org.uk/abs。

在一些实施例中，抗体是scFv，例如抗CD33 scFv。抗体包括任何类别的抗体，例如IgD、IgE、IgG、IgA或IgM(或其亚类)，并且抗体不必是任何特定类别。根据免疫球蛋白重链的恒定结构域的抗体氨基酸序列，免疫球蛋白可分为不同类别。免疫球蛋白有五个主要的类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且其中一些可以进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别被称为α、δ、ε、γ和μ。不同类别的免疫球蛋白的亚单元结构和三维构型是熟知的。

本文所用的抗体可以是鼠、大鼠、人或任何其他来源的抗体(包括嵌合或人源化抗体)。在一些实例中，抗体包含经修饰的恒定区，例如免疫学上惰性的恒定区，例如，不触发补体介导的裂解或不刺激抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。

在一些实施例中，本披露的抗体是人源化抗体。人源化抗体是指非人(例如，鼠)抗体的形式，其是特异性嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其抗原结合片段(所述片段包含衍生自非人免疫球蛋白的最小序列)。在大多数情况下，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自接受体互补决定区(CDR)的残基被来自非人物种(例如小鼠、大鼠、兔)(供体抗体)的具有希望的特异性、亲和力和能力的CDR残基替换。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基被相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在接受体抗体或导入的CDR或框架序列中均未发现的残基，但被包含在内以进一步完善和优化抗体性能。总体上，人源化抗体将包括至少一个、并且典型地两个可变结构域中的基本上全部，其中全部或基本上全部的CDR区相应于非人免疫球蛋白的那些，并且全部或基本上全部的FR区是人免疫球蛋白共有序列的那些。人源化抗体还任选地包括免疫球蛋白恒定区或结构域(Fc)的至少一部分，典型地是人免疫球蛋白的至少一部分。其他形式的人源化抗体具有相对于原始抗体改变的一个或多个CDR(一个、两个、三个、四个、五个或六个)，也称为一个或多个CDR“衍生自”来自原始抗体的一个或多个CDR。人源化抗体也可涉及亲和力成熟。

在一些实施例中，本披露的抗体是嵌合抗体，其可以包括来自人抗体的重恒定区和轻恒定区。嵌合抗体是指具有来自第一物种的可变区或可变区的一部分以及来自第二物种的恒定区的抗体。典型地，在这些嵌合抗体中，轻链和重链的可变区都模拟衍生自一个哺乳动物物种(例如，非人哺乳动物(例如小鼠、兔和大鼠))的抗体的可变区，而恒定部分与衍生自另一种哺乳动物(例如，人)的抗体中的序列同源。在一些实施例中，可以在可变区和/或恒定区中进行氨基酸修饰。

在一些实施例中，本披露的抗体特异性结合靶抗原，例如人CD33。“特异性结合”(在本文可互换使用)靶或表位的抗体是本领域众所周知的术语，并且确定这种特异性结合的方法也是本领域众所周知的。如果分子与特定靶抗原的反应比与备选靶抗原的反应更频繁、更迅速、更持久和/或更具有亲和力，则所述分子表现出“特异性结合”。如果抗体比其结合其他物质具有更大的亲和力、亲合力、更容易和/或更持久地结合靶抗原，则所述抗体“特异性结合”所述靶抗原。例如，特异性地(或优选地)与CD33表位结合的抗体是以下抗体，所述抗体相对于与其他CD33表位或非CD33表位结合，与该CD33表位以更大亲和力、亲合力、更容易和/或更持久地结合。通过阅读该定义还应理解，例如，特异性结合第一靶抗原的抗体可以或可以不特异性结合或不优先结合第二靶抗原。这样，“特异性结合”或“优先结合”并不一定要求(尽管可以包括)排他性结合。通常，但并非必须，提及结合是指优先结合。

在一些实施例中，抗体和CD33之间的平衡解离常数(K

同样在本披露的范围内的是本文披露的任何示例性抗CD33抗体的功能变体。相对于参考抗体，功能变体可以在VH和/或VL中或在一个或多个HC CDR和/或一个或多个VL CDR中包含一个或多个氨基酸残基变异，同时保持与参考抗体基本相似结合和生物学活性(例如，基本相似的结合亲和力、结合特异性、抑制活性，抗肿瘤活性或其组合)。

在一些实例中，与参考抗体(例如抗体A(VH：SEQ ID NO:65；VL：SEQ ID NO:66))的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3相比，本文披露的抗CD33抗体包含总共包含不超过10个氨基酸变异(例如，不超过9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸变异)的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3。“总共”是指所有三个VH CDR中氨基酸变异的总数在限定的范围内。可替代地或另外地，与参考抗体的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3相比，抗CD33抗体可包含总共包含不超过10个氨基酸变异(例如，不超过9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸变异)的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。

在一些实例中，本文披露的抗CD33抗体可以包含其中至少一个包含不超过5个氨基酸变异(例如，不超过4、3、2或1个氨基酸变异)的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3作为参考抗体(例如抗体A(VH：SEQ ID NO:65；VL：SEQ ID NO:66))的对应VH CDR。在特定实例中，抗体包含含有不超过5个氨基酸变异(例如，不超过4、3、2或1个氨基酸变异)的VH CDR3作为参考抗体(例如抗体A(VH：SEQ ID NO:65；VL：SEQ ID NO:66))的VH CDR3。可替代地或另外地，抗CD33抗体可包含其中至少一个包含不超过5个氨基酸变异(例如，不超过4、3、2或1个氨基酸变异)的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3作为参考抗体的对应VL CDR。在特定实例中，抗体包含含有不超过5个氨基酸变异(例如，不超过4、3、2或1个氨基酸变异)的VL CDR3作为参考抗体的VL CDR3。

在一些实例中，与参考抗体(例如抗体B(VH：SEQ ID NO:77；VL：SEQ ID NO:78))的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3相比，本文披露的抗CD33抗体包含总共包含不超过10个氨基酸变异(例如，不超过9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸变异)的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3。在一些实例中，本文披露的抗CD33抗体可以包含其中至少一个包含不超过5个氨基酸变异(例如，不超过4、3、2或1个氨基酸变异)的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3作为参考抗体(例如抗体B(VH：SEQ ID NO:77；VL：SEQ ID NO:78))的对应VH CDR。在特定实例中，抗体包含含有不超过5个氨基酸变异(例如，不超过4、3、2或1个氨基酸变异)的VH CDR3作为参考抗体(例如抗体B(VH：SEQ ID NO:77；VL：SEQ ID NO:78))的VH CDR3。

在一些实例中，与参考抗体(例如抗体C(VH：SEQ ID NO:89；VL：SEQ ID NO:90))的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3相比，本文披露的抗CD33抗体包含总共包含不超过10个氨基酸变异(例如，不超过9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸变异)的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3。在一些实例中，本文披露的抗CD33抗体可以包含其中至少一个包含不超过5个氨基酸变异(例如，不超过4、3、2或1个氨基酸变异)的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3作为参考抗体(例如抗体C(VH：SEQ ID NO:89；VL：SEQ ID NO:90))的对应VH CDR。在特定实例中，抗体包含含有不超过5个氨基酸变异(例如，不超过4、3、2或1个氨基酸变异)的VH CDR3作为参考抗体(例如抗体C(VH：SEQ ID NO:89；VL：SEQ ID NO:90))的VH CDR3。

在一些情况下，氨基酸残基变异可以是保守的氨基酸残基取代。如本文所用，“保守氨基酸取代”是指不改变进行氨基酸取代的蛋白质的相对电荷或大小特征的氨基酸取代。可以根据本领域的普通技术人员已知的用于改变多肽序列的方法来制备变体，例如改变多肽序列的方法在编译此类方法的以下参考文献中可以找到：例如，MolecularCloning:A Laboratory Manual[分子克隆：实验室手册]，J.Sambrook等人编辑，第二版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，1989，或Current Protocols in Molecular Biology[分子生物学的当前方案],F.M.Ausubel等编辑，约翰威利父子出版社(John Wiley&Sons,Inc.)，纽约。氨基酸的保守取代包括在以下组内的氨基酸之间进行的取代：((a)A→G,S；(b)R→K,H；(c)N→Q,H；(d)D→E,N；(e)C→S,A；(f)Q→N；(g)E→D,Q；(h)G→A；(i)H→N,Q；(j)I→L,V；(k)L→I,V；(l)K→R,H；(m)M→L,I,Y；(n)F→Y,M,L；(o)P→A；(p)S→T；(q)T→S；(r)W→Y,F；(s)Y→W,F；和(t)V→I,L。

在一些实施例中，本文披露的抗体可以包含与参考抗体(例如抗体A(VH：SEQ IDNO:65；VL：SEQ ID NO:66))的VH CDR总共至少80％(例如，85％、90％、95％或98％)相同的VH CDR。可替代地或另外地，抗体可以包含与参考抗体的VL CDR总共至少有80％(例如，85％、90％、95％或98％)相同的VL CDR。在一些实施例中，抗体可包含与参考抗体(例如，抗体A(VH：SEQ ID NO:65；VL：SEQ ID NO:66))的VH至少80％(例如，85％、90％、95％或98％)相同的VH和/或与参考抗体的VL可变区至少80％(例如，85％、90％、95％或98％)相同的VL。

供体模板

可以使用载体(例如AAV载体)将编码CAR的核酸递送至T细胞，所述T细胞包含在本文中所称的供体模板(也称为供体多核苷酸)。供体模板可以包含非同源序列，例如编码CAR的核酸，其侧翼是两个同源区域，以允许在目的基因组位置进行有效的HDR。可替代地，供体模板可以与DNA中的靶位置不具有同源区域，并且可以通过在靶位点切割后通过NHEJ依赖性末端连接而整合。

供体模板可以是单链和/或双链的DNA或RNA，并且可以线性或环状形式引入细胞中。如果以线性形式引入，则可以通过本领域技术人员已知的方法保护供体序列的末端(例如，以防止核酸外切降解)。例如，将一个或多个双脱氧核苷酸残基添加至线性分子的3'末端和/或将自身互补的寡核苷酸连接至一个或两个末端。参见，例如，Chang等人，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]84：4959-4963；Nehls等人(1996)Science[科学]272:886-889。保护外源多核苷酸免于降解的其他方法包括但不限于一个或多个末端氨基基团的添加和经修饰的核苷酸间键的使用，例如硫代磷酸酯、氨基磷酸酯和O-甲基核糖或脱氧核糖残基。

可以将供体模板作为载体分子的一部分引入细胞中，所述载体分子具有另外的序列，例如复制起点、启动子和编码抗生素抗性的基因。此外，供体模板可以作为裸露的核酸引入(作为与试剂(例如脂质体或泊洛沙姆)复合的核酸引入)，或可以通过病毒递送(例如，腺病毒、AAV、疱疹病毒、逆转录病毒、慢病毒和整合酶缺陷型慢病毒(IDLV))。

在一些实施例中，插入供体模板，使得其表达由整合位点处的内源启动子驱动，即驱动供体插入其中的内源基因表达的启动子。然而，在一些实施例中，供体模板包含外源启动子和/或增强子，例如组成型启动子、诱导型启动子或组织特异性启动子。在一些实施例中，外源启动子是包含SEQ ID NO:129的序列的EF1α启动子。可以使用其他启动子。

此外，外源序列还可包括转录或翻译调控序列，例如启动子、增强子、绝缘子、内部核糖体进入位点、编码2A肽的序列和/或聚腺苷酸化信号。

递送方法和构建体

可以使用载体系统递送核酸酶和/或供体模板，所述载体系统包括但不限于质粒载体、DNA小环、逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、痘病毒载体、疱疹病毒载体和腺相关病毒载体及其组合。

常规的基于病毒和非病毒的基因转移方法可用于将编码核酸酶和供体模板的核酸引入细胞(例如，T细胞)中。非病毒载体递送系统包括DNA质粒、DNA小环、裸核酸以及与递送媒介物诸如脂质体或泊洛沙姆复合的核酸。病毒载体递送系统包括DNA和RNA病毒，这些病毒在递送至细胞后具有附加型基因组或整合型基因组。

核酸的非病毒递送方法包括电穿孔、脂转染、显微注射、生物射弹、病毒体、脂质体、免疫脂质体、聚阳离子或脂质:核酸缀合物、裸DNA、裸RNA、带帽的RNA、人工病毒体和增强对DNA的吸收的试剂。使用例如Sonitron 2000系统(Rich-Mar公司)的超声操作也可用于递送核酸。

腺相关病毒递送

可以使用腺相关病毒(AAV)将编码CAR构建体的供体核酸递送至细胞。AAV是小病毒，其位点特异性整合到宿主基因组中，并且因此可以递送转基因，例如CAR。存在反向末端重复序列(ITR)，位于AAV基因组和/或目标转基因的侧翼，并用作复制起点。AAV基因组中还存在rep和cap蛋白，它们在转录时形成衣壳，所述衣壳封装了AAV基因组以递送到靶细胞中。这些衣壳上的表面受体会赋予AAV血清型，其决定衣壳主要结合哪个靶器官，并且因此决定AAV将最有效地感染哪些细胞。目前已知十二种人AAV血清型。在一些实施例中，AAV是AAV血清型6(AAV6)。

出于多种原因，腺相关病毒是用于基因治疗的最常用病毒之一。首先，AAV在施用于包括人在内的哺乳动物后不会引起免疫应答。第二，将AAV有效地递送至靶细胞，尤其是在考虑选择合适的AAV血清型时。最后，因为基因组可以在宿主细胞中持续存在而不整合，AAV具有感染分裂和非分裂细胞的能力。这种特性使它们成为基因治疗的理想候选。

同源定向修复(HDR)

通过同源定向修复(HDR)将编码CAR的供体核酸插入靶基因座。CRISPR Cas9酶切割靶基因座处的两条DNA链。然后发生HDR，以修复双链断裂(DSB)并插入供体DNA。为了使此正确发生，设计供体序列的侧翼残基与靶基因中DSB位点周围的序列(以下简称“同源臂”)互补。这些同源臂用作DSB修复的模板，并使HDR成为基本无错误的机制。同源定向修复(HDR)的速率是突变与切割位点之间的距离的函数，因此选择重叠或附近的靶位点很重要。模板可以包括同源区侧翼的额外序列或者可以含有与基因组序列不同的序列，从而可以进行序列编辑。

靶基因可以与受试者的免疫应答相关，其中永久缺失靶基因的至少一部分将调节免疫应答。例如，为了产生CAR T细胞，靶基因可以是TCRα恒定区(TRAC)。TRAC的破坏导致内源性TCR的功能丧失。

在一些实施例中，靶基因在安全港基因座中。

工程化T细胞

本披露的经工程化的(经基因编辑的)CAR T细胞可以是自体的(“自身”)或非自体的(“非自身的”，例如，同种异体的、同基因的或异基因的)。“自体”是指来自相同受试者的细胞。“同种异体的”是指与受试者相同物种的细胞，但是在遗传上不同于受试者中的细胞。在一些实施例中，T细胞获自哺乳动物。在一些实施例中，T细胞获自人。

T细胞可从多种来源获得，包括但不限于外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾脏组织、和肿瘤。在某些实施例中，可以使用本领域技术人员已知的许多技术，例如沉淀(例如，FICOLL

在一些实施例中，使用分离的T细胞群体。在一些实施例中，在分离外周血单核细胞(PBMC)之后，可以在激活、扩增和/或基因修饰之前或之后，将细胞毒性T细胞和辅助T淋巴细胞分类为幼稚、记忆和效应T细胞亚群。

T细胞的特定亚群(其表达以下一种或多种细胞表面标志物：TCRab、CD3、CD4、CD8、CD27 CD28、CD38 CD45RA、CD45RO、CD62L、CD127、CD122、CD95、CD197、CCR7、KLRG1、MCH-I蛋白和/或MCH-II蛋白)可以通过阳性或阴性选择技术进一步分离。在一些实施例中，通过阳性或阴性选择技术进一步分离T细胞的特定亚群，所述特定亚群表达选自由TCRab、CD4和/或CD8组成的组中的标志物中的一种或多种。在一些实施例中，工程化T细胞群体不表达或基本不表达一种或多种以下标志物：CD70、CD57、CD244、CD160、PD-1、CTLA4、HΜ3和LAG3。在一些实施例中，可以在基因工程化之前和/或基因工程化之后通过阳性或阴性选择来分离T细胞的亚群。

在一些实施例中，分离的T细胞群体表达一种或多种标志物，包括但不限于CD3+、CD4+、CD8+或其组合。在一些实施例中，从供体或受试者分离T细胞，并在进行基因编辑之前首先激活和刺激其体外增殖。

为了获得足够的治疗剂量的T细胞组合物，通常对T细胞进行一轮或多轮刺激、激活和/或扩增。通常可以使用，例如以下美国专利中所述的方法来激活和扩增T细胞：美国专利6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；和6,867,041。在一些实施例中，在将基因组编辑组合物引入T细胞之前，T细胞被激活并扩增约1天至约4天、约1天至约3天、约1天至约2天、约2天至约3天、约2天至约4天、约3天至约4天或约1天、约2天、约3天或约4天。

在一些实施例中，在将基因组编辑组合物引入T细胞之前，T细胞被激活并扩增约4小时、约6小时、约12小时、约18小时、约24小时、约36小时、约48小时、约60小时或约72小时。

在一些实施例中，在将基因编辑组合物引入T细胞的同时激活T细胞。

治疗方法和组合物

在一些实施例中，本文提供治疗癌症(例如白血病，例如急性髓细胞性白血病)的方法。可以如本文所述治疗的白血病的非限制性实例包括急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、急性髓细胞性白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)和慢性髓细胞性白血病(CML)。在一些实施例中，这些方法包括将本披露的CAR T细胞(例如抗CD33 CAR T细胞)递送给患有癌症(例如白血病)的受试者，所述癌症包括急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、急性髓细胞性白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)和慢性髓细胞性白血病(CML)。

施用步骤可包括通过引入的细胞至少部分定位在所希望位点(例如，肿瘤)的方法或途径将细胞(例如，工程化T细胞)放置(例如，移植)到受试者体内，从而产生所希望的一种或多种效果。工程化T细胞可以通过任何适当的途径施用，所述途径导致递送至受试者中的所需位置，在该位置中至少一部分植入的细胞或细胞组分保持活力。在施用于受试者后，细胞的活力期可以短至数小时(例如二十四小时)、几天，长达数年，或甚至受试者的寿命(即长期植入)。例如，在本文所述的一些方面，有效量的工程化T细胞是经由全身性施用途径(如腹膜内或静脉内途径)施用的。

受试者可以是期望对其进行诊断，治疗或疗法的任何受试者。在一些实施例中，受试者是哺乳动物。在一些实施例中，受试者是人。

供体是非正在治疗的受试者的个体。供体是非患者个体。在一些实施例中，供体是不患有或不怀疑患有要治疗的癌症的个体。在一些实施例中，可以使用多个供体，例如两个或更多个供体。

在一些实施例中，根据本文所述方法施用的工程化T细胞群体包含获自一个或多个供体的同种异体T细胞。“同种异体”是指从相同物种的一个或多个不同供体获得的细胞、细胞群体或包含细胞的生物学样品，其中一个或多个基因座处的基因与接受体(例如受试者)不同。例如，施用于受试者的工程化T细胞群体可以衍生自一个或多个不相关的供体，或衍生自一个或多个不同的同胞。在一些实施例中，可以使用同系细胞群体，例如从遗传上相同的供体(例如，相同的双胞胎)获得的那些。在一些实施例中，细胞是自体细胞；即，这些工程化T细胞是从受试者获得或分离并施用给相同受试者的，即，供体和接受体是相同的。

在一些实施例中，根据本文所述方法施用的工程化T细胞群体在受试者中不诱导毒性，例如，工程化T细胞不诱导非癌细胞的毒性。在一些实施例中，施用的工程化T细胞群体不触发补体介导的裂解，或不刺激抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。

有效量是指预防或减轻医学病症(例如，癌症)的至少一种或多种体征或症状所需的工程化T细胞群体的量，并且涉及足以提供所希望的效果(例如，治疗患有医学病症的受试者)的组合物的量。有效量还包括足以预防或延迟疾病症状的发展、改变疾病症状的进程(例如但不限于减慢疾病症状的进展)或逆转疾病症状的量。应当理解，对于任何给定的情况，本领域的普通技术人员可以使用常规实验来测定适当的有效量。

为了用于本文所述的各个方面，有效量的细胞(例如，工程化T细胞)包括至少10

施用模式包括注射、输注、滴注或摄取。注射包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、心室内、囊内、眶内、心内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、被膜下、蛛网膜下、脊柱内、脊髓内和胸骨内注射和输注。在一些实施例中，该途径是静脉内。

在一些实施例中，全身性施用工程化T细胞，这是指将细胞群体以不同于直接施用至靶部位、组织或器官的方式施用，而是使其进入受试者的循环系统，从而经受代谢和其他类似过程。

可以由熟练的临床医生确定包含用于治疗医学病症的组合物的治疗的功效。如果疾病(例如，癌症)的任何一种或所有体征或症状(举一个例子，以有益的方式改变功能性靶标的水平(例如，增加至少10％))或其他临床上可接受的症状或标志物得到改善或减轻，则该治疗被认为是“有效治疗”。功效还可以通过如通过住院治疗或需要医疗干预所评估的受试者恶化的失败(例如，疾病进展停止或至少减慢)来测量。测量这些指标的方法是本领域技术人员已知的和/或本文所述的。治疗包括对受试者疾病的任何治疗，包括：(1)抑制疾病，例如阻止或减缓症状的进展；或(2)减轻疾病，例如引起症状消退；以及(3)预防或降低症状发展的可能性。

其他实施例

本披露涉及以下实施例。在本节中，术语实施例缩写为‘E’，后跟序号。例如，E1等同于实施例1。

E1.一种工程化T细胞，该工程化T细胞包含编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸，其中该CAR包含特异性结合CD33的胞外结构域。

E2.如实施例1所述的工程化T细胞，该工程化T细胞进一步包含被破坏的T细胞受体α链恒定区(TRAC)基因。

E3.如实施例2所述的工程化T细胞，其中将编码该CAR的核酸插入该TRAC基因中。

E4.如实施例1-3中任一项所述的工程化T细胞，该工程化T细胞进一步包含被破坏的β-2-微球蛋白(β2M)基因。

E5.如实施例1-4中任一项所述的工程化T细胞，其中该CAR的胞外结构域包含抗CD33抗体。

E6.如实施例5所述的工程化T细胞，其中该抗CD33抗体是抗CD33单链可变片段(scFv)。

E7.如实施例6所述的工程化T细胞，其中该抗CD33 scFv包含与参考抗体相同的重链可变结构域(VH)互补决定区(CDR)和相同的轻链可变结构域(VL)CDR，其中该参考抗体包含：

(i)SEQ ID NO:65所示的VH和SEQ ID NO:66所示的VL，

(ii)SEQ ID NO:77所示的VH和SEQ ID NO:78所示的VL，或

(iii)SEQ ID NO:89所示的VH和SEQ ID NO:90所示的VL。

E8.如实施例7所述的工程化T细胞，其中该抗CD33 scFv包含与该参考抗体相同的VH和VL链。

E9.如实施例7所述的工程化T细胞，其中该抗CD33 scFv包含SEQ ID NO:73、75、85、87、97或99中任一项的氨基酸序列。

E10.如实施例1-9中任一项所述的工程化T细胞，其中该CAR进一步包含CD28共刺激结构域或41BB共刺激结构域。

E11.如实施例10所述的工程化T细胞，其中该CAR进一步包含CD3ζ细胞质信号传导结构域。

E12.如实施例3-11中任一项所述的工程化T细胞，其中该TRAC基因包含SEQ IDNO:49、51、53、55、57、59、61、63、109、112、115或118中任一项的核苷酸序列，且/或其中该CAR由SEQ ID NO:50、52、54、56、58、60、62、64、110、113、116或119中任一项的核苷酸序列编码。

E13.如实施例4-14中任一项所述的工程化T细胞，其中该被破坏的β2M基因包含至少一个选自SEQ ID NO:9-14中任一项的核苷酸序列。

E14.如实施例1-15中任一项所述的工程化T细胞，其中这些T细胞包含野生型CD33基因。

E15.如实施例1-15中任一项所述的工程化T细胞，其中这些T细胞进一步包含被破坏的CD33基因。

E16.如实施例17所述的工程化T细胞，其中被破坏的CD33基因包含AGTTCATGGTACTGGTTCC(SEQ ID NO:187)、AGTTCATGGTTCC(SEQ ID NO:188)、AGTTCATGTACTGGTTCC(SEQ ID NO:189)、AGTTCATGGTTTACTGGTTCC(SEQ ID NO:190)、AGTTCC、AGTACTGGTTCC(SEQ ID NO:191)、AGTTCATACTGGTTCC(SEQ ID NO:192)、AGTTCATGGTATACTGGTTCC(SEQ ID NO:193)和/或AGTTACTGGTTCC(SEQ ID NO:194)的核苷酸序列。

E17.如实施例17或实施例18所述的工程化T细胞，其中被破坏的CD33基因缺少包含AGTTCATGGTTACTGGTTCC(SEQ ID NO:186)的片段。

E18.如实施例17所述的工程化T细胞，其中被破坏的CD33基因包含AAATCCTGGCACT(SEQ ID NO:300)、AAATCCCTGGCACT(SEQ ID NO:301)、AAATCCTCATTCCCTGGCACT(SEQ IDNO:302)、AAATCCTCACCCTGGCACT(SEQ ID NO:304)、AAATCCTCCCCTGGCACT(SEQ ID NO:305)、AAATCCTCCCTGGCACT(SEQ ID NO:306)、AAATCCCCTGGCACT(SEQ ID NO:307)、ACATCCTCATTCCCTGGCACT(SEQ ID NO:308)、ACATCCTGGCACT(SEQ ID NO:309)、AAATCCTCTCCCTGGCACT(SEQ ID NO:310)、AAATCCTCATCTGGCACT(SEQ ID NO:311)、AAATCCT、AAACCCTGGCACT(SEQ ID NO:312)、AAATCCTCTGGCACT(SEQ ID NO:313)、AAATCCCCCTGGCACT(SEQ ID NO:314)、AAATCCTCACT(SEQ ID NO:315)、ACATCCCTGGCACT(SEQ ID NO:316)和/或AAAT的核苷酸序列。

E19.如实施例20所述的工程化T细胞，其中被破坏的CD33基因缺少包含AAATCCTCATCCCTGGCACT(SEQ ID NO:299)的片段。

E20.如实施例20或实施例21所述的工程化T细胞，其中该被破坏的CD33基因缺少以下片段，该片段的3’区段包含AAATCCTCAT(SEQ ID NO:317)、AAATCCTCATCCCT(SEQ IDNO:318)、AAATCCTCATCCCTGG(SEQ ID NO:320)、AAATCCTCATC(SEQ ID NO:322)或AAATCCTCATCCCTGGCA(SEQ ID NO:324)的核苷酸序列。

E21.如实施例20-22中任一项所述的工程化T细胞，其中该被破坏的CD33基因缺少以下片段，该片段的5’区段包含CTCATCCCTGGCACT(SEQ ID NO:323)的核苷酸序列。

E22.一个包含如实施例1-21中任一项所述的工程化T细胞的工程化T细胞群体，其中该群体的至少25％或至少50％的工程化T细胞表达CAR。

E23.如实施例22所述的群体，其中该群体的至少70％的工程化T细胞表达CAR。

E24.如实施例22所述的群体，其中该群体的至少25％的工程化T细胞在至少7天或至少14天的体外增殖后表达CAR。

E25.如实施例22-24中任一项所述的群体，其中该群体的至少50％的工程化T细胞不表达可检测水平的T细胞受体(TCR)蛋白。

E26.如实施例25所述的群体，其中该群体的至少90％的工程化T细胞不表达可检测水平的TCR蛋白。

E27.如实施例22-26中任一项所述的群体，其中该群体的至少50％的工程化T细胞不表达可检测水平的β2M蛋白。

E28.如实施例27所述的群体，其中该群体的至少70％的工程化T细胞不表达可检测水平的β2M蛋白。

E29.如实施例22-28中任一项所述的群体，其中该群体的至少20％的工程化T细胞不表达可检测水平的CD33蛋白。

E30.如实施例29所述的群体，其中该群体的至少50％的工程化T细胞不表达可检测水平的CD33蛋白。

E31.如实施例22-30中任一项所述的群体，其中当与表达CD33的癌细胞群体在体外共培养时，该群体的工程化T细胞诱导该群体的至少10％、至少25％或至少50％的癌细胞的细胞裂解。

E32.如实施例31所述的群体，其中当与表达CD33的癌细胞群体在体外共培养时，该群体的工程化T细胞诱导该癌细胞群体的至少70％、至少80％或至少90％的细胞裂解。

E33.如实施例31或实施例32所述的群体，其中当与癌细胞群体在体外共培养时，该群体的工程化T细胞分泌IFNγ。

E34.如实施例31-33中任一项所述的群体，其中工程化T细胞与癌细胞的比率为1:1至2:1。

E35.如实施例31-34中任一项所述的群体，其中这些癌细胞包含白血病。

E36.如实施例31-34中任一项所述的群体，其中这些癌细胞包括急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、急性髓细胞性白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)和慢性髓细胞性白血病(CML)。

E37.一种方法，该方法包括向受试者施用如实施例22-36中任一项所述的工程化T细胞群体。

E38.如实施例37所述的方法，其中该受试者是人类受试者。

E39.如实施例37或38所述的方法，其中该受试者患有癌症。

E40.如实施例39所述的方法，其中该癌症是白血病，任选地是急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、急性髓细胞性白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)和慢性髓细胞性白血病(CML)。

E41.如实施例39或实施例40所述的方法，其中该癌症包括表达CD33的癌细胞。

E42.如实施例39-41中任一项所述的方法，其中向受试者施用该工程化T细胞群体导致癌性肿瘤体积相对于基线对照的减小。

E43.一种产生工程化T细胞的方法，该方法包括

(a)向T细胞递送

(i)RNA指导的核酸酶，

(ii)靶向TRAC基因的gRNA，和

(iii)包含供体模板的载体，其中该供体模板包含编码CAR的核酸，所述CAR包含特异性结合CD33的胞外结构域；以及

(b)产生具有被破坏的TRAC基因并表达该CAR的工程化T细胞。

E44.如实施例43所述的方法，其中靶向该TRAC基因的gRNA包含SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:19的核苷酸序列，或靶向SEQ ID NO:40的核苷酸序列。

E45.如实施例43或44所述的方法，其中编码该CAR的核酸的侧翼为TRAC基因的左和右同源臂。

E46.如实施例43-45中任一项所述的方法，该方法进一步包括将靶向该β2M基因的gRNA递送至T细胞。

E47.如实施例46所述的方法，其中靶向该β2M基因的gRNA包含SEQ ID NO:20或SEQID NO:21的核苷酸序列，或靶向SEQ ID NO:41的核苷酸序列。

E48.如实施例43-47中任一项所述的方法，其中该RNA指导的核酸酶是Cas9核酸酶，任选地是酿脓链球菌Cas9核酸酶。

E49.如实施例43-48中任一项所述的方法，该方法进一步包括将靶向该CD33基因的gRNA递送至T细胞。

E50.如实施例49所述的方法，其中靶向该CD33基因的gRNA包含表10中提供的核苷酸序列。

E51.如实施例43-50中任一项所述的方法，其中该CAR的胞外结构域是抗CD33抗体。

E52.如实施例51所述的方法，其中该抗CD33抗体是抗CD33单链可变片段(scFv)。

E53.如实施例52所述的方法，其中该抗CD33 scFv包含与参考抗体相同的重链可变结构域(VH)互补决定区(CDR)和相同的轻链可变结构域(VL)CDR，其中该参考抗体包含(i)SEQ ID NO:65所示的VH和SEQ ID NO:66所示的VL，(ii)SEQ ID NO:77所示的VH和SEQID NO:78所示的VL，或(iii)SEQ ID NO:89所示的VH和SEQ ID NO:90所示的VL。

E54.如实施例52所述的方法，其中该抗CD33 scFv包含与该参考抗体相同的VH和VL链。

E55.如实施例54所述的方法，其中该抗CD33 scFv包含SEQ ID NO:73、75、85、87、97或99中任一项的氨基酸序列。

E56.如实施例43-55中任一项所述的方法，其中该CAR包含CD28共刺激结构域或41BB共刺激结构域。

E57.如实施例56所述的方法，其中该CAR进一步包含CD3ζ细胞质信号传导结构域。

E58.如实施例43-57中任一项所述的方法，其中该供体模板包含SEQ ID NO:49、51、53、55、57、59、61、63、109、112、115或118中任一项的核苷酸序列。

E59.如实施例43-58中任一项所述的方法，其中该CAR由SEQ ID NO:50、52、54、56、58、60、62、64、110、113、116或119中任一项的核苷酸序列编码。

E60.一种用于在患有癌症的受试者中减少肿瘤体积的方法，该方法包括向所述受试者施用如实施例22-36中任一项所述的工程化T细胞群体。

E61.如实施例60所述的方法，其中相对于基线对照，该受试者中该肿瘤的体积减少至少50％，任选地其中施用了该群体的1x10

E62.一种包含工程化T细胞的细胞群体，其中该工程化T细胞包含：

(i)被破坏的TRAC基因；

(ii)被破坏的β2M基因；以及

(iii)编码包含抗CD33抗原结合片段的CAR的核酸。

E63.如实施例62所述的细胞群体，其中该CAR包含(a)包含抗CD33抗原结合片段的胞外结构域，(b)CD8跨膜结构域，和(c)包含41BB共刺激结构域和CD3ζ共刺激结构域的胞内结构域。

E64.如实施例62或实施例63所述的细胞群体，其中该被破坏的TRAC基因包含编码该CAR的核酸。

E65.如实施例62-64中任一项所述的细胞群体，该细胞群体进一步包含被破坏的CD33基因。

E66.一种包含工程化T细胞的细胞群体，其中该工程化T细胞包含：

(i)被破坏的TRAC基因，其中该被破坏的TRAC基因包含编码CAR的核酸，所述CAR包含(a)包含抗CD33抗原结合片段的胞外结构域，(b)CD8跨膜结构域，和(c)包含41BB共刺激结构域和CD3ζ信号传导结构域的胞内结构域；以及

(ii)被破坏的β2M基因。

E67.如实施例63所述的细胞群体，该细胞群体进一步包含被破坏的CD33基因。

E68.一种包含工程化T细胞的细胞群体，其中该工程化T细胞包含：

(i)被破坏的TRAC基因，其中该被破坏的TRAC基因包含编码CAR的核酸，所述CAR包含SEQ ID NO:104所示的氨基酸序列；以及

(ii)被破坏的β2M基因。

E69.如实施例68所述的细胞群体，该细胞群体进一步包含被破坏的CD33基因。

E70.一种包含工程化T细胞的细胞群体，其中该工程化T细胞包含：

(i)被破坏的TRAC基因，其中该被破坏的TRAC基因包含编码CAR的核酸，其中该核酸序列与SEQ ID NO:56至少90％相同并且编码SEQ ID NO:104的CAR；以及

(ii)被破坏的β2M基因。

E71.如实施例70所述的细胞群体，该细胞群体进一步包含被破坏的CD33基因。

E72.一种包含工程化T细胞的细胞群体，其中该工程化T细胞包含：

(i)被破坏的TRAC基因，其中该被破坏的TRAC基因包含SEQ ID NO:55的核酸序列；以及

(ii)被破坏的β2M基因。

E73.如实施例72所述的细胞群体，该细胞群体进一步包含被破坏的CD33基因。

E74.一种工程化T细胞，该工程化T细胞包含：

(i)被破坏的TRAC基因；

(ii)被破坏的β2M基因；以及

(iii)编码包含抗CD33抗原结合片段的CAR的核酸。

E75.如实施例74所述的工程化T细胞，其中该CAR包含(a)包含抗CD33抗原结合片段的胞外结构域，(b)CD8跨膜结构域，和(c)包含41BB共刺激结构域和CD3ζ共刺激结构域的胞内结构域。

E76.如实施例74或实施例75所述的工程化T细胞，其中该被破坏的TRAC基因包含编码该CAR的核酸。

E77.如实施例74-76中任一项所述的工程化T细胞，进一步包含被破坏的CD33基因。

E78.一种工程化T细胞，该工程化T细胞包含：

(i)被破坏的TRAC基因，其中该被破坏的TRAC基因包含编码CAR的核酸，所述CAR包含(a)包含抗CD33抗原结合片段的胞外结构域，(b)CD8跨膜结构域，和(c)包含41BB共刺激结构域和CD3ζ信号传导结构域的胞内结构域；以及

(ii)被破坏的β2M基因。

E79.如实施例75所述的工程化T细胞，该工程化T细胞进一步包含被破坏的CD33基因。

E80.一种工程化T细胞，该工程化T细胞包含：

(i)被破坏的TRAC基因，其中该被破坏的TRAC基因包含编码CAR的核酸，所述CAR包含SEQ ID NO:104所示的氨基酸序列；以及

(ii)被破坏的β2M基因。

E81.如实施例77所述的工程化T细胞，该工程化T细胞进一步包含被破坏的CD33基因。

E82.一种工程化T细胞，该工程化T细胞包含：

(i)被破坏的TRAC基因，其中该被破坏的TRAC基因包含编码CAR的核酸，其中该核酸序列与SEQ ID NO:56至少90％相同并且编码SEQ ID NO:104的CAR；以及

(ii)被破坏的β2M基因。

E83.如实施例82所述的工程化T细胞，该工程化T细胞进一步包含被破坏的CD33基因。

E84.一种工程化T细胞，该工程化T细胞包含：

(i)被破坏的TRAC基因，其中该被破坏的TRAC基因包含SEQ ID NO:55的核酸序列；以及

(ii)被破坏的β2M基因。

E85.如实施例84所述的工程化T细胞，该工程化T细胞进一步包含被破坏的CD33基因。

E86.如实施例1-21和74-85中任一项所述的工程化T细胞，其中该T细胞是人T细胞。

E87.一种在受试者中治疗癌症的方法，该方法包括向该受试者施用如实施例62-73中任一项所述的细胞群体。

E88.如实施例87所述的方法，其中该癌症是白血病，任选地是急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、急性髓细胞性白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)和慢性髓细胞性白血病(CML)。

E89.如实施例87或实施例88所述的方法，其中该癌症包括表达CD33的细胞。

E90.一种工程化T细胞，该工程化T细胞通过如实施例43-59中任一项所述的方法产生。

E91.一个细胞群体，该细胞群体通过如实施例43-59中任一项所述的方法产生。

E92.如实施例1-21中任一项所述的工程化T细胞，其中该CAR包含SEQ ID NO:104、105、107、111、114、117或120的氨基酸序列。

E93.如实施例1-21中任一项所述的工程化T细胞，其中该CAR包含SEQ ID NO:104的氨基酸序列。

E94.如实施例1-21中任一项所述的工程化T细胞，其中该经编辑的CD33基因包含GGATCCAAATTCTGGCTGC(SEQ ID NO:175)、GGATCCAAATTTTCTGGCTGC(SEQ ID NO:176)、GGATCCTGGCTGC(SEQ ID NO:177)、GGATCCAATTCTGGCTGC(SEQ ID NO:178)、TCCTGGCTGC(SEQID NO:179)、GGATCTGGCTGC(SEQ ID NO:180)、GGATCC和/或GGATCCATTCTGGCTGC(SEQ IDNO:181)的核苷酸序列。

E95.如实施例1-21中任一项所述的工程化T细胞，其中该经编辑的CD33基因缺少包含GGATCCAAATTTCTGGCTGC(SEQ ID NO:174)的片段。

E96.如实施例1-21中任一项所述的工程化T细胞，其中该经编辑的CD33基因缺少以下片段，该片段的3′区段包含GGATCCAAATTTC(SEQ ID NO:182)、GGATCCAAATT(SEQ IDNO:183)或GGATCCAAATTT(SEQ ID NO:185)的核苷酸序列。

E97.如实施例1-21中任一项所述的工程化T细胞，其中该经编辑的CD33基因包含ACTCCCCAGTTTCATGGTTAC(SEQ ID NO:197)、ACTCCCCAGTCATGGTTAC(SEQ ID NO:198)、ACTCCCCATGGTTAC(SEQ ID NO:199)、ACTCCCCAGTTAC(SEQ ID NO:200)、ACTCATGGTTAC(SEQID NO:201)、ACTCCCCATCATGGTTAC(SEQ ID NO:202)、ACTCCCCATTCATGGTTAC(SEQ ID NO:203)、ACTCCCCAGTGTCATGGTTAC(SEQ ID NO:204)和/或ACTCCCCAGTCTCATGGTTAC(SEQ IDNO:205)的核苷酸序列。

E98.如实施例1-21中任一项所述的工程化T细胞，其中该经编辑的CD33基因缺少包含ACTCCCCAGTTCATGGTTAC(SEQ ID NO:196)的片段。

E99.如实施例1-21中任一项所述的工程化T细胞，其中该经编辑的CD33基因缺少以下片段，该片段的3′区段包含ACTCCCCAGTTCATGGTT(SEQ ID NO:206)的核苷酸序列。

E100.如实施例1-21中任一项所述的工程化T细胞，其中该经编辑的CD33基因包含AGCCATTATCCAGGGACT(SEQ ID NO:208)、AGCCAGGGACT(SEQ ID NO:209)、AGCCATTATTCCAGGGACT(SEQ ID NO:210)、AGTCCAGGGACT(SEQ ID NO:211)、AGCCATTATAATCCAGGGACT(SEQ ID NO:212)、AGCCATTATCCGGGGACT(SEQ ID NO:213)、AGCCATTATACAGGGACT(SEQ ID NO:214)、AGCCATTATTCCGGGGACT(SEQ ID NO:216)和/或AGCCATTATAATCCGGGGACT(SEQ ID NO:217)的核苷酸序列。

E101.如实施例1-21中任一项所述的工程化T细胞，其中该经编辑的CD33基因缺少包含AGCCATTATATCCAGGGACT(SEQ ID NO:207)的片段。

E102.如实施例1-21中任一项所述的工程化T细胞，其中该经编辑的CD33基因缺少以下片段，该片段的3′区段包含AGCCATTATATCCA(SEQ ID NO:218)或AGCCATTATA(SEQ IDNO:219)的核苷酸序列。

E103.如实施例1-21中任一项所述的工程化T细胞，其中该经编辑的CD33基因包含TCAGTGACAGGAGGG(SEQ ID NO:221)、TCAGTGACGTACAGGAGGG(SEQ ID NO:222)、TCAGGAGGG(SEQ ID NO:223)、TCAGTGACGGAGGG(SEQ ID NO:224)、TCAGTGACGGGAGGG(SEQ ID NO:226)、TCAGTGACGGTTACAGGAGGG(SEQ ID NO:227)、TCAGTGACGGACAGGAGGG(SEQ ID NO:228)、TCAGTGACGGGTACAGGAGGG(SEQ ID NO:229)、TCAGTACAGGAGGG(SEQ ID NO:230)、TCAGTGACTACAGGAGGG(SEQ ID NO:231)、TCAGTGACGGG(SEQ ID NO:232)、TCAGTGACGG(SEQID NO:233)、TCAGTGACGGCAGGAGGG(SEQ ID NO:234)、TCAGTGACGGAGGAGGG(SEQ ID NO:235)、TCAGTGATACAGGAGGG(SEQ ID NO:236)、TCAGTGTACAGGAGGG(SEQ ID NO:237)和/或TCATACAGGAGGG(SEQ ID NO:238)的核苷酸序列。

E104.如实施例1-21中任一项所述的工程化T细胞，其中该经编辑的CD33基因缺少包含TCAGTGACGGTACAGGAGGG(SEQ ID NO:220)的片段。

E105.如实施例1-21中任一项所述的工程化T细胞，其中该经编辑的CD33基因缺少以下片段，该片段的3′区段包含TCAGTGACGGTA(SEQ ID NO:239)或TCAGTGACG的核苷酸序列。

E106.如实施例1-21中任一项所述的工程化T细胞，其中该经编辑的CD33基因缺少以下片段，该片段的5′区段包含GTGACGGTACAGGAGGG(SEQ ID NO:242)的核苷酸序列。

E107.如实施例1-21中任一项所述的工程化T细胞，其中该经编辑的CD33基因包含AGCTGGAGCT(SEQ ID NO:244)、AGGTGAAGCTGGAGCT(SEQ ID NO:245)、AGGTGAAGCT(SEQ IDNO:246)、AGGTGAAGTTGGAGCT(SEQ ID NO:247)、AGGTGAAGTCGCTGGAGCT(SEQ ID NO:248)、AGGTGGAGCT(SEQ ID NO:249)、AGGTGAAGCGCTGGAGCT(SEQ ID NO:250)、AGGTGACGCTGGAGCT(SEQ ID NO:252)和/或AGGTGAAGTTTCGCTGGAGCT(SEQ ID NO:253)的核苷酸序列。

E108.如实施例1-21中任一项所述的工程化T细胞，其中该经编辑的CD33基因缺少包含AGGTGAAGTTCGCTGGAGCT(SEQ ID NO:243)的片段。

E109.如实施例1-21中任一项所述的工程化T细胞，其中该经编辑的CD33基因缺少以下片段，该片段的3'区段包含AGGTGAAGTTCG(SEQ ID NO:256)、AGGTGAAGTTCGCTGGAG(SEQID NO:259)、AGGTGAAGTTCGCTGG(SEQ ID NO:260)或AGGTGAAGTT(SEQ ID NO:261)的核苷酸序列。

E110.如实施例1-21中任一项所述的工程化T细胞，其中该经编辑的CD33基因缺少以下片段，该片段的5′区段包含GGTGAAGTTCGCTGGAGCT(SEQ ID NO:262)的核苷酸序列。

E111.如实施例1-21中任一项所述的工程化T细胞，其中该经编辑的CD33基因包含AGTTCGCTGGTGTG(SEQ ID NO:264)和/或AGTTCGCTGAGCTGGTGTG(SEQ ID NO:266)的核苷酸序列。

E112.如实施例1-21中任一项所述的工程化T细胞，其中该经编辑的CD33基因缺少包含AGTTCGCTGGAGCTGGTGTG(SEQ ID NO:263)的片段。

E113.如实施例1-21中任一项所述的工程化T细胞，其中该经编辑的CD33基因缺少以下片段，该片段的3′区段包含AGTTCGCTGG(SEQ ID NO:267)的核苷酸序列。

E114.如实施例1-21中任一项所述的工程化T细胞，其中该经编辑的CD33基因包含ACTACTCACTTCCTCGGTGCT(SEQ ID NO:269)、ACTACTCGGTGCT(SEQ ID NO:270)、ACTACTCATCCTCGGTGCT(SEQ ID NO:271)、ACTACT、ACTACTCACCCTCGGTGCT(SEQ ID NO:272)、ACTACTCCTCGGTGCT(SEQ ID NO:273)、ACTACTCACCTCGGTGCT(SEQ ID NO:275)、ACTACTCACTCGGTGCT(SEQ ID NO:276)、ACTACTCTCCTCGGTGCT(SEQ ID NO:277)、ACTACTTCCTCGGTGCT(SEQ ID NO:278)、ACTACTCACTTCGGTGCT(SEQ ID NO:279)和/或ACTATCCTCGGTGCT(SEQ ID NO:280)的核苷酸序列。

E115.如实施例1-21中任一项所述的工程化T细胞，其中该经编辑的CD33基因缺少包含ACTACTCACTCCTCGGTGCT(SEQ ID NO:268)的片段。

E116.如实施例1-21中任一项所述的工程化T细胞，其中该经编辑的CD33基因缺少以下片段，该片段的3′区段包含ACTACTCACT(SEQ ID NO:282)、ACTACTCACTCCTC(SEQ IDNO:283)或ACTACTCACTCCTCGGT(SEQ ID NO:284)的核苷酸序列。

E117.如实施例1-21中任一项所述的工程化T细胞，其中该经编辑的CD33基因包含CCCGATCTTCCTGGTTGT(SEQ ID NO:286)、CCCGATCCTGGTTGT(SEQ ID NO:287)、CCCGATCTGGTTGT(SEQ ID NO:288)、CCCTGGTTGT(SEQ ID NO:289)、CCCGATCTTCTGGTTGT(SEQID NO:290)、CCCGATCTTGGTTGT(SEQ ID NO:291)、CCCGATCTCCTGGTTGT(SEQ ID NO:292)、CCCGATCTTCCCTGGTTGT(SEQ ID NO:293)和/或CCCGAT的核苷酸序列。

E118.如实施例1-21中任一项所述的工程化T细胞，其中该经编辑的CD33基因缺少包含CCCGATCTTCTCCTGGTTGT(SEQ ID NO:285)的片段。

E119.如实施例1-21中任一项所述的工程化T细胞，其中该经编辑的CD33基因缺少一下片段，该片段的3′区段包含CCCGATCTTCT(SEQ ID NO:295)的核苷酸序列。

E120.如实施例1-21中任一项所述的工程化T细胞，其中该经编辑的CD33基因缺少以下片段，该片段的5′区段包含TCCTGGTTGT(SEQ ID NO:298)的核苷酸序列。

实例

本实例描述了缺少T细胞受体(TCR)基因(在TCRα恒定(TRAC)区域编辑的基因)、β2-微球蛋白(β2M)基因的表达并且表达靶向CD33和CD33

表6.

用Cas9:gRNA-RNP复合物电穿孔激活原代人T细胞，并感染含有与TRAC基因座同源的抗CD33 CAR供体模板的腺相关腺病毒载体(AAV)，以产生TRAC

电穿孔后大约一(1)周，通过流式细胞术分析了经基因编辑的T细胞，以评估表达抗CD33 CAR的细胞群体的百分比。细胞表面抗CD33 CAR的标记通过缀合至生物素的CD33蛋白(Acro生物系统公司(AcroBiosystems))和链霉亲和素-APC二级试剂的组合进行(图1A、图1B和图1C)。对照细胞，包括未经RNP处理的T细胞(例如‘无RNP’)和具有TRAC和B2M基因破坏但无CAR插入的T细胞(例如TRAC-/B2M-或‘TB-’)，显示无预期的抗CD33 CAR表面蛋白的表达。相比之下，某些由TRAC和B2M基因破坏产生的T细胞和CAR构建体确实导致了表达抗CD33 CAR的群体的高百分比。用CTX-965b、CTX-969或CTX-970 CAR构建体产生的T细胞也是如此。然而，并不是所有用CAR构建体制备的T细胞都有CAR表达。例如，与对照组相比，用CTX-964、CTX-964b、CTX-965、CTX 970b或CTX-969b CAR构建体产生的T细胞证明表达CAR的T细胞没有增加(表8；图1A和图1B)。令人惊讶的是，对于具有给定scFv的CAR T细胞，所使用的共刺激结构域(例如CD28与41BB)对CAR表达阳性的T细胞的百分比有影响。例如，虽然CTX-965b和CTX-965CAR构建体具有相同的scFv，但具有4-1BB共刺激结构域的CTX-965b构建体产生的CAR阳性细胞明显多于具有CD28共刺激结构域的CTX-965构建体(图1A)。此外，scFv的取向对表达CAR的细胞的相对数量也有影响。例如，尽管CTX-964由与CTX-965相同的VH和VL结构域组成，但其基本上不产生具有CAR表达的细胞。实际上，通过转变CAR共刺激结构域(例如，CTX-964与CTX-964b相比)并没有改变这一结果。

用CTX-981、CTX-981b、CTX-982和CTX-982b产生了另外的TRAC

在评估CAR表达的12种CAR构建体中，以下实例中选择了3种进行进一步分析：

TRAC-/β2M-/抗CD33CAR+

为了证明无论使用哪种人供体来生成经基因编辑的T细胞，都可以实现CAR表达，根据以上基因编辑方案，使用了来自另外两个原代T细胞供体的CTX-965b CAR构建体制备了抗CD33 CAR-T细胞(例如，产生称为CTX-965b CAR T细胞的TRAC-/B2M-/抗CD33 CAR+ T细胞)。电穿孔后约一(1)周，通过流式细胞术分析细胞以评估TRAC(使用PE-抗人TCRαβ，克隆BW242/412，来自美天旎生物技术公司(Miltenyi Biotech)，奥本(Auburn)，加利福尼亚州)、β2M(使用PE-Cy7-抗人β2M，克隆2M2，来自生物传奇公司(Biolegend))、CD4(使用APC-Cy7-抗人CD4，克隆RPA-T4，来自生物传奇公司)、CD8(使用太平洋蓝(Pacific Blue)抗人CD8，克隆SK1，来自生物传奇公司)和抗CD33 CAR(使用缀合至生物素的CD33蛋白(Acro生物系统公司)和链霉亲和素-APC)在经编辑的细胞群体的细胞表面上的表达水平(图2A)。对于用CTX-965b编辑的细胞，高比例的该群体具有阳性抗CD33 CAR表达和耗竭的TCR和β2M表达。对于两种供体来源都可以观察到相当的CAR表达，这表明即使改变了衍生T细胞的供体，也可以实现有效的基因编辑。此外，发现TRAC

以下抗体用于流式细胞术(表7)：

表7.

CTX-965b CAR-T细胞总共由7个T细胞供体产生。此外，用CTX-970CAR和CTX-982bCAR从4个T细胞供体产生TRAC-/B2M-/抗CD33 CAR+T细胞(也称为CTX-970 CAR T细胞和CTX-982b CAR T细胞)。

除了CAR表达外，还分析了经编辑的T细胞群体中由于CRISPR/Cas9破坏基因而有耗竭的TCRαβ和β2M表面表达的细胞的百分比(表8)。如上所述，在电穿孔后约一(1)周，处理细胞以进行流式细胞术以评估经编辑的细胞群体的细胞表面上的抗CD33 CAR表达水平。还如上所述通过用抗体染色细胞来评估TCRαβ和β2M表达。高百分比的经编辑的细胞证明TCRαβ和β2M表面表达的耗竭(表8)。此外，取决于所用的CAR构建体，高百分比的经编辑的细胞对抗CD33 CAR的表达呈阳性。这些数据表明，可以用CRISPR/Cas9编辑来自健康供体的T细胞，以产生TRAC和B2M破坏以及基因插入，从而表达抗CD33 CAR。

表8.TCR

令人意外的是，相对于电穿孔/rAAV感染后1周分析的细胞，在培养2周时表达抗CD33-CAR的细胞比率增加。对于从不同供体获得并用不同CAR构建体转染的T细胞群体，这种趋势是一致的：CTX-965b(6个供体)、CTX-970(4个供体)或CTX-982b(3个供体)(图2B)。

T细胞比例测定。在编辑后1周和2周(即7天和14天)，使用表7中列出的CD4

CD33在激活的培养T细胞上表达(图4，左图)。此外，与CD8

抗CD33 CAR-T培养物中CAR

然后将CTX-965b基因编辑的T细胞体外扩增两周，以证明经基因编辑的T细胞可与对照细胞(TRAC

TRAC-/β2M-/抗CD33 CAR+ T细胞(例如：CTX-965b CAR T细胞或CTX-970 CAR T细胞)如实例1所述产生。经基因编辑的CAR T细胞群体由多个T细胞供体产生。类似地产生TCR+ T细胞和TRAC-/β2M-T细胞的群体以用作对照。

通过转染制备经编辑的T细胞后，使用基于流式细胞术的细胞毒性测定验证CAR T细胞的功能活性。将CAR T细胞或对照T细胞(TCR+ T细胞和TCR-B2M-T细胞)与表达CD33的癌细胞系共培养。测试了三种不同的人AML衍生细胞系(称为“靶细胞”)：THP-1(ATCC TIB-202)、KG-1(ATCC CCL-246)或MV4-11(ATCC CRL-9591)。靶细胞用5μM efluor670(eBiosciences公司)标记，洗涤并与CTX-965b CAR T细胞(TRAC-/B2M-/抗CD33 CAR+)或CTX-970 CAR T细胞(TRAC-/B2M-/抗CD33 CAR+)以不同比率(T细胞:靶细胞0.05:1至1:1)一起在共培养物中进行孵育。将靶细胞以50,000个细胞/孔接种在96孔U型底板中。将共培养物孵育过夜。第二天，将孔洗涤，并用200μL含有1:500稀释的5mg/mL DAPI的培养基(分子探针公司(Molecular Probes))替换培养基。然后将25μL CountBright珠(生命科技公司(Life Technologies))添加到每个孔中，并通过流式细胞术分析细胞培养物的细胞活力(即，对DAPI染色阴性的活细胞)。

然后使用以下公式确定靶细胞(例如，THP-1、KG-1或MV4-11)的细胞裂解百分比：

细胞裂解百分比＝(1-((测试样品中靶细胞的总数量)÷(对照样品中靶细胞的总数量))X100；

其中测试样品是与以下细胞共培养的靶细胞(例如THP-1细胞)：1)CTX-965b CART细胞；2)CTX-970 CAR T细胞；3)TRAC

对照样品是未共培养的单独靶细胞。

CTX-965b CAR T细胞在所测试的CTX-965b T细胞与THP-1细胞的所有比率下均有效杀伤THP-1细胞(即诱导细胞毒性)(图5A)。CTX-965b CAR T细胞还有效杀伤其他AML癌细胞(KG-1和MV4-11)(图5C和图5D)。此外，另一种抗CD33 CAR CTX-970也有效杀伤所有测试的AML癌细胞系(图5B-图5D)。这些数据证明，如本文所述的抗CD33 CAR T细胞诱导表达CD33的AML细胞系的强效细胞裂解。即使当同种异体CAR-T细胞群体是从不同供体来源产生时，这些结果也是可再现的(图5A)。

细胞因子释放测定。在THP-1、KG-1或MV4-11靶细胞存在下，测试TRAC-/B2M-/抗CD33 CAR+ T细胞(如CTX-965b CAR T细胞和CTX-970CAR T细胞)诱导细胞因子分泌/释放的功能，并与对照T细胞(如TCR

细胞因子依赖性。为了确定基因编辑是否导致不需要的脱靶编辑，从而可能产生具有不良特性(例如不受控制的细胞生长)的细胞，评估了TRAC

如上所述使用CRISPR/Cas9和AAV6(参见例如实例1)来产生缺少TCR和β2M的表达但伴随插入TRAC基因座中的靶向CD33的CAR构建体(CTX-965b；SEQ ID NO:56(核酸)；SEQID NO:104(氨基酸))的表达的人T细胞。首先用2种不同的Cas9:sgRNA RNP复合物电穿孔激活的T细胞，一种包含靶向TRAC的sgRNA(SEQ ID NO:28)，另一种包含靶向β2M的sgRNA(SEQID NO:30)。TRAC基因座处的DNA双链断裂通过同源定向修复，使用AAV6-递送的DNA模板((SEQ ID NO:55)(编码包含SEQ ID NO:104氨基酸序列的抗CD33 CAR CTX-965b))进行修复，所述供体模板含有嵌合抗原受体盒(基因表达的-/+调控元件)侧翼的TRAC基因座的右和左同源臂。所得修饰的T细胞是2X KO(TRAC-/β2M-)，抗CD33 CAR+T细胞(CTX-965b T细胞)。

小肿瘤模型中的治疗

使用转化药物开发有限责任公司(Translational Drug Development,LLC)(斯科茨代尔，亚利桑那州)采用的方法，在NOG小鼠中评估了经修饰的抗CD33 CAR+ T细胞(2X KO(TRAC-/β2M-)，抗CD33 CAR+ T细胞)改善由CD33+肾癌细胞系引起的疾病的能力。简言之，开始研究前5-7天12只5-8周龄雌性CIEA NOG(NOD.Cg-Prkdc

表9.治疗组

*对于大肿瘤模型中的第3组，N＝5

从治疗开始日起每周3次测量肿瘤体积。到第5天，所有接受抗CD33CAR+ T细胞治疗的动物(治疗组2和3)开始显示出肿瘤体积的减小。到第6-8天，与未治疗的动物(治疗组1)相比，用抗CD33 CAR T细胞治疗的动物(治疗组2和3)证明肿瘤生长显著减少(图7)。这些数据证明，同种异体抗CD33 CAR+ T细胞可以在体内快速有效地减少CD33+AML的生长和扩增。通过同种异体抗CD33 CAR+ T细胞治疗，CD33+AML肿瘤完全消退，并持续了整个研究时间。对于第2组，所有小鼠在第22天的肿瘤均为0mm3，对于第3组，是在第24天。

大肿瘤模型中的治疗

使用转化药物开发有限责任公司(斯科茨代尔，亚利桑那州)采用的方法，在NOG小鼠中评估了经修饰的抗CD33 CAR+ T细胞(2X KO(TRAC-/β2M-)，抗CD33 CAR+ T细胞)减少由CD33+肾癌细胞系引起的大肿瘤的能力。简言之，开始研究前5-7天12只5-8周龄雌性小鼠CIEA NOG(NOD.Cg-Prkdc

在第1天，根据表9，治疗组2和3接受单次静脉内抗CD33 CAR+ T细胞给药。从治疗开始之日起每周测量3次肿瘤体积。到第5天，所有用抗CD33 CAR+ T细胞治疗的小鼠(治疗组2和3)开始显示出肿瘤体积的初始减小(图8)。在接受中等剂量的CAR-T细胞的大多数动物中，这种减小一直持续到研究的第30天。接受高剂量抗CD33 CAR+ T细胞的第3组中的肿瘤生长大大延迟。事实上，在接受高剂量抗CD33 CAR T细胞治疗的5只动物中，有2只从施用CAR+ T细胞到观察期结束(第73天)显示肿瘤生长较低甚至没有。具体而言，一只动物在第73天有较低的肿瘤体积，为157mm

本实例描述了使用CRISPR/Cas9基因编辑在离体原代人T细胞中有效编辑CD33基因，以消除抗CD33 CAR+ T细胞中的自身反应性风险。CD33基因的包含CD33基因前两个蛋白质编码外显子(外显子2和3)的基因组区段被用作gRNA设计软件的输入。希望的gRNA是在编码序列中引入插入或缺失，从而产生框外突变或过早终止密码子，从而损害基因表达(即，产生框外/功能丧失等位基因，称为“CD33敲除”)。基于脱靶基因编辑的预测的低风险，选择了靶向CD33基因的十(10)个计算机鉴定的gRNA间隔子序列(SEQ ID NO:132-141)。如表10所示，合成并特别修饰了gRNA。尽管表10中的gRNA已通过2'-O-甲基硫代磷酸酯修饰进行了修饰，但也可以使用未修饰的gRNA或具有其他修饰的gRNA。

表10.CD33 gRNA序列和靶序列

用核糖核蛋白颗粒(RNP)转染(电穿孔)原代人T细胞，所述核糖核蛋白颗粒包含Cas9核酸酶和靶向CD33基因的合成的经修饰sgRNA(表10中的序列)或对照(无Cas9，无gRNA)。转染后4-6天，用流式细胞术(一级抗体：抗人CD33抗体，生物传奇公司目录号366608)评估细胞表面CD33的表达水平。对于所测试的部分gRNA，几乎所有的T细胞的表面CD33表达丧失，表明基因破坏(即CD33阴性)(例如，如图9所示的CTX33-2、CTX33-5和CTX33-10)

如表11所示，通过TIDE分析进一步测试了三(3)个gRNA。其中，两(2)个gRNA实现了高效编辑，编辑频率高于97％。

表11.经基因编辑的T细胞中的CD33 gRNA间隔子序列、切割效率和CD33表面蛋白表达。

最初的实验使用表现出蛋白表达的最高插缺率％和敲低率％的指导物进行。

T细胞中脱靶和中靶概况分析。

表12的CD33 gRNA的同源性依赖性评估表明，CD33-2(SEQ ID NO:165)的平均中靶插缺频率为88％，并且没有插缺频率大于0.2％的脱靶位点。相比之下，具有大于90％的较高平均中靶插缺频率的其他CD33 gRNA(例如CD33-5、CD33-8和CD33-10)产生许多>1％的脱靶插缺并被去优先化。该分析通过杂交捕获组合下一代测序完成，从用表12中列出的十种指导物中的每一种编辑的T细胞基因开始。由两个不同的供体T细胞(称为1和2)产生经编辑细胞的两个细胞群体，并用于该测定。脱靶数据指导了对该特定CD33 gRNA(CD33-2)的选择，以进行进一步分析。

表12.在经基因编辑的T细胞中CD33中靶基因组编辑效率和脱靶编辑结果。

T细胞中中靶插缺概况的分析。

用于量化脱靶编辑的数据也用于量化和总结针对表12中列出的所有CD33指导物的最常见中靶插缺。该数据是由两个供体(称为1和2)中CD33基因座的杂交捕获与下一代测序相组合而产生的。

基因编辑后，CRISPR/Cas9基因编辑产生CD33

为了从杂交捕获数据中对单个序列进行量化，选择并考虑跨CD33中靶位点(切割位点的上游和下游20bp)对齐序列读数以进行插缺序列量化。从选定的读段中，每个推定切割位点上游和下游10bp以内的序列(PAM上游约3bp)(Jinek等人，Science[科学]2012)被量化为中靶非同源末端连接编辑的代表性区域(NHEJ)。这些中靶基因编辑序列的数据在下表中给出，这些序列的频率代表在每个切割位点上游和下游20bp之内跨越中靶位点的所有序列的百分比。在表13-22中相对于中靶参考序列显示了针对每种指导物的插缺。参比序列以切割位点为中心，任一方向的10bp，PAM的3′末端4bp。

实例5.用CD33敲除稳定CAR表达和CD4/CD8细胞群体。

这个实例描述了使用CRISPR/Cas9基因编辑对离体原代人T细胞中CD33基因进行编辑的令人惊奇的有益效果。如上所述使用CRISPR/Cas9和AAV6(例如，参见实例1-3)来产生缺少TCR、β2M和CD33表达但伴随TRAC基因座(使用靶向CD33的CAR构建体)的表达的人T细胞。

首先用3种不同的Cas9:sgRNA-RNP复合物电穿孔激活的T细胞，一种含有靶向TRAC基因座的sgRNA(SEQ ID NO:28)，第二种含有靶向β2M基因座的sgRNA(SEQ ID NO:30)，第三种含有靶向CD33的sgRNA(CD33-10:SEQ ID NO:151)。TRAC基因座处的DNA双链断裂通过同源性定向修复，使用AAV6递送的DNA模板(例如，SEQ ID NO:49、51、53、55、57、59、61、63、109、112、115或118)(编码包含以下氨基酸序列的抗CD33 CAR：SEQ ID NO:101、102、103、104、105、106、107、108、111、114、117、120)进行修复。抗CD33 CAR构建体由右和左同源臂组成，分别对应于嵌合抗原受体盒(用于基因表达的-/+调控元件)侧翼的TRAC基因座。得到的修饰T细胞是3X KO(TRAC-/β2M-/CD33-)，抗CD33 CAR+T细胞。将3X KO抗CD33 CAR T细胞与如上所述产生的2X KO(TRAC-/β2M-)抗CD33 CAR T细胞进行比较。

如实例2中所述评估抗CD33 CAR表达和CD4/CD8细胞群体。

如实例1中所述，TRAC-/B2M-/CAR+(2X KO，CAR+)编辑的T细胞证明CAR+的细胞的百分比随时间的增加(图2B)。为了评估敲除CD33是否能稳定CAR+ T细胞群体，用6种不同的CAR构建体(CTX-981、CTX-981b、CTX-982、CTX-982b、CTX-970、CTX-965b)编辑T细胞并评估CD33 KO稳定CAR表达的能力。图10显示对于用2X KO(TRAC-/β2M-)和抗CD33 CAR编辑的T细胞，CAR表达阳性的细胞百分比在7至14天之间增加。然而，对于用3X KO(TRAC-/β2M-/CD33-)和抗CD33 CAR编辑的T细胞，在7到14天之间没有观察到表达CAR的细胞的百分比增加。

使用由3个不同的原代T细胞供体产生的抗CD33 CAR T细胞重复了该研究。2X KO抗CD33 CAR T细胞(CTX-965b、CTX-970和CTX-982b)再次显示CAR+细胞的比例在7天至14天之间增加，而这在3X KO，抗CD33CAR+(TRAC-/β2M-/CD33-/CAR+)T细胞中未观察到(图11)。3KO CAR+ T细胞反而在第7天和第14天保持了相似的CAR表达水平。

这些结果证明，敲除经编辑以表达抗CD33 CAR的T细胞中的CD33基因可防止经编辑的CAR+细胞部分的扩增。经编辑的T细胞群体中表达CAR的细胞的这种稳定化使得能够产生可再现的CAR T细胞产物。

CD4和CD8 T细胞的比例通过CD33敲除稳定。

以前，编辑为2X KO(TRAC-/β2M-)和抗CD33 CAR+的T细胞在7到14天之间显示出CD4+ T细胞比例的减少和CD8+ T细胞比例的增加(图2C)。为了确定CD33基因敲除对CD4和CD8细胞比率的影响，在第7天和第14天用流式细胞术评估3X KO(TRAC-/β2M-/CD33-)，抗CD33 CAR+ T细胞。用不同的CAR构建体(CTX-981、CTX-981b、CTX-982、CTX-982b、CTX-970、CTX-965b)编辑细胞，测定CD4+和CD8+ T细胞的比例。对编辑为2X KO(TRAC-/β2M-)和抗CD33 CAR+的T细胞进行相同的测量。在第7天和第14天之间，2X KO CAR+ T细胞再次观察到CD4+ T细胞的增加和CD8+细胞的减少，而3X KO CAR+ T细胞没有观察到这种变化(图12)。特别地，用CTX-982b、CTX-970或CTX-965b CAR构建体编辑的3X KO CAR+ T细胞证明CD4+和CD8+细胞的比例几乎没有变化。这些数据证明敲除CD33可随着时间的推移稳定经编辑的T细胞群体中CD4+ T细胞与CD8+T细胞的比率。

3X KO(TRAC-/β2M-/CD33-)，抗CD33 CAR+ T细胞的靶细胞杀伤及细胞因子分泌

2X KO(TRAC-/B2M-)CAR+ T细胞杀伤癌细胞的能力如上述实例2所述进行评估。同样，也对3X KO(TRAC-/B2M-/CD33-)CAR+ T细胞清除CD33+肿瘤细胞的能力进行测定。这如上所述进行，其中将CAR+ T细胞与表达CD33的

在靶细胞存在的情况下，根据实例2中描述的程序评估TRAC-/B2M-/抗CD33 CAR+T细胞(例如：CTX-965b CAR T细胞和CTX-970 CAR T细胞)诱导细胞因子分泌的功能能力。为了测量细胞因子的释放，将3X KO CAR+ T细胞与表达CD33的MV4-11靶细胞以0.05:1至1:1的抗CD33CAR-T与MV411的比率共培养24小时。收集上清液培养基，并按照制造商的说明(RD系统公司)，使用IFNγ或IL-2ELISA测定(RD系统公司)对存在于上清液中的细胞因子(例如IFNγ和IL-2)进行定量。将3X KO CAR+T细胞产生的细胞因子与2X KO(TRAC-/β2M-)CAR+ T细胞和对照T细胞(例如TRAC+ T细胞和TRAC-/β2M-T细胞)产生的细胞因子进行比较。IFNγ产生的量化表明，对于测试的每种CAR构建体，与对照T细胞相比，3X KO CAR+ T细胞诱导高水平的IFNγ产生，并且相对于2X KO CAR+ T细胞，IFNγ产生的水平相当(图14)。因此，CD33敲除显现并未改变CAR+T细胞分泌IFNγ的能力。类似地，评估了CAR+ T细胞响应于靶细胞刺激而产生IL-2的能力。IL-2的产生水平取决于用于产生T细胞的CAR构建体。相对于对照T细胞，使用CTX-965b CAR产生的抗CD33 CAR+ T细胞产生高水平的IL-2，而使用CTX-970或CTX-982b CAR构建体产生的IL-2的水平仅略高于对照T细胞(图15)。对于2X KOCAR+ T细胞和3X KO CAR+T细胞都观察到用CTX-970或CTX-982b CAR构建体产生的T细胞的低IL-2产生，这表明CD33敲除不能挽救IL-2的产生。然而，对于用CTX-965b CAR产生的T细胞，具有3X KO(TRAC-/β2M-/CD33-)的T细胞比仅具有2X KO(TRAC-/β2M-)的T细胞产生更高水平的IL-2。

实例6.抗CD33 CAR+ T细胞的选择性。

本实例描述缺乏CD33的癌细胞系的产生及使用该细胞系来评估经基因编辑的CAR+ T细胞实现选择性杀伤表达CD33的靶细胞的能力。

CD33 KO MV4-11 AML细胞系的产生

为了产生缺乏CD33的癌细胞系，将MV4-11细胞用Cas9:靶向CD33的sgRNA(CD33-10；SEQ ID NO:151)电穿孔。将细胞以每孔约1个细胞铺板，并使其扩增三周。然后使用流式细胞术测试了几个克隆系的CD33表面表达，并且抗CD33抗体(PE-抗人CD33，生物传奇公司目录号366608)野生型MV4-11(WT MV4-11)具有高水平的表面CD33，而其中一种特定的克隆系证明在背景以上没有CD33染色。该克隆系(称为CD33 KO MV4-11细胞)随后用于评估抗CD33 CAR+ T细胞对CD33的选择性杀伤作用。

通过在WT MV4-11或CD33 KO MV4-11存在下测量靶细胞裂解和细胞因子产生来评估抗CD33 CAR+ T细胞的选择性杀伤。被定义为选择性的CAR+ T细胞是那些在表达CD33的WT MV4-11细胞存在下诱导细胞裂解和细胞因子产生，但在CD33 KO MV4-11存在下则表现无应答的细胞。该结果表明抗CD33 CAR+ T细胞需要识别靶细胞表面上的CD33抗原以介导细胞杀伤。如实例2所述，通过测量靶细胞裂解和CAR+ T细胞细胞因子产生来评估选择性杀伤。测量了用三种不同的CAR构建体(CTX-965b、CTX-970和CTX-982b)产生的CAR+ T细胞以及2X KO CAR+ T细胞和3X KO CAR+T细胞的选择性。因此，当与WT MV4-11或CD33 KO MV4-11细胞在CAR+ T细胞:靶细胞比率1:1下共培养24小时的情况下，评估了6个CAR+ T细胞的选择性靶细胞裂解和细胞因子产生。评估的CAR+ T细胞如下：

2X KO CAR+ T细胞和3X KO CAR+ T细胞均实现了WT MV4-11靶细胞的几乎完全杀伤(图16，左图)。相比之下，对于对照组(例如，单独的MV4-11或与无RNP T细胞、TRAC-/B2M-T细胞或TRAC-/B2M-/CD33-T细胞共培养的MV4-11)，未观察到WT MV4-11的杀伤。还评估了CAR+ T细胞杀伤CD33 KO MV4-11细胞的能力。与对照组相比，用CTX-965b CAR或CTX-970CAR产生的CAR+ T细胞诱导可忽略的至较低的细胞杀伤水平(图16，右图)。对于2X KO CAR+和3X KO CAR+ T细胞也是如此。相比之下，用CTX-982b CAR生成的2X KO CAR+和3X KO CAR+ T细胞均以高于60％的水平诱导CD33 KO MV4-11细胞的杀伤。总之，这些结果表明，用CTX-965b或CTX-970 CAR产生的2X KO或3X KO抗CD33 CAR+ T细胞具有杀伤表达CD33的靶细胞的选择性，而用CAR-982b产生的T细胞则不具有选择性，并诱导对缺乏CD33表达的细胞(即脱靶细胞)的不希望的杀伤。

为了确定在高CAR+ T细胞与癌细胞比率下是否能维持表达CTX-965b CAR或CTX-970 CAR的CAR+ T细胞的选择性杀伤，我们评估了一系列比率。将CAR+ T细胞与CD33 KOMV4-11细胞以0.25:1至2:1的比率共培养。尽管使用CTX-965CAR或CTX-970 CAR生成的CAR+T细胞即使在所测试的最高比率下也证明较低或可忽略的细胞裂解水平，但使用CTX-982bCAR生成的CAR+ T细胞却在所测试的所有比率下都诱导了高水平的细胞杀伤(图17)。这些结果证明，相对于癌细胞，即使以高丰度培养，CTX-965或CTX-970 CAR T细胞也具有选择性，而在所测试的任何接种比率下，CTX-982b CAR T细胞都不具有选择性。

为了提供另外的选择性测量，我们评估了在CD33 KO MV4-11细胞存在下CAR+ T细胞产生的细胞因子。假设CAR+ T细胞在识别靶细胞上的抗原时产生细胞因子，则预期选择性CAR+ T细胞仅在存在表达CAR特异性抗原的靶细胞时产生细胞因子。假定具有CTX-965CAR或CTX-970 CAR的CAR+ T细胞对诱导表达CD33的靶细胞的裂解具有选择性(图16)，则预期它们仅在存在表达CD33的靶细胞且不存在缺乏CD33的细胞的情况下才会产生细胞因子。为了确定是否如此，将CAR+ T细胞与CD33 KO MV4-11细胞共培养，并如实例2中所述通过ELISA测量上清液中的IL-2和IFNγ。有趣的是，当与CD33 KO MV4-11细胞共培养时，没有一个CAR+ T细胞产生IL-2(图18，左图)。即使对于如上所述被鉴定为非选择性杀手的CTX-982b CAR T细胞也是如此。然而，当与CD33 KO MV4-11细胞一起孵育时，CTX-982b CART细胞诱导显著水平的IFNγ(图18，右图)。这对于用CTX-982b CAR制备的2X KO CAR+和3XKO CAR+ T细胞都是如此。相比之下，将用CTX-965或CTX-970 CAR制备的2X KO CAR+和3XKO CAR+ T细胞与CD33 KO MV4-11细胞一起孵育时不诱导IFNγ。缺乏CD33的细胞中IFNγ产生的这些差异证实了以下结论：CTX-982b CAR产生的CAR+ T细胞是非选择性的，用CTX-965或CTX-970 CAR产生的CAR+ T细胞仅在表达CD33的靶细胞或癌细胞存在时才能实现选择性激活和杀伤。

实例7.抗CD33 CAR T细胞的体内作用。

本实例描述了为评估抗CD33 CAR+ T细胞在急性髓细胞性白血病(AML)动物模型(MV-4-11NSG模型)中的治疗效果而进行的研究。

制备了MV-4-11人AML衍生细胞系以表达萤光素酶和mCherry(MV-4-11-Luc-mCh-Puro)基因，以进行体内成像研究。生物发光成像(BLI)与肿瘤负荷量相关，因此定量BLI以评估肿瘤负荷。为了测量BLI，在使用IVIS S5 Lumina(珀金埃尔默公司(Perkin Elmer))测量萤光素酶之前给小鼠注射萤光素。第0天，将MV-4-11-Luc-mCh-Puro细胞注射到5-6周龄雌性NSG小鼠(杰克逊实验室(Jackson Laboratory))(2x10

相对于未经治疗的小鼠，所有三种剂量都降低了肿瘤负荷(图19A)，延缓了肿瘤生长的发作，并导致小鼠存活率的增加(图19B和表23)。

表23.AML小鼠的中位存活期。

在AML的MV-4-11NSG小鼠模型中，进行了附加研究以评估抗CD33CAR+ T细胞加或不加CD33基因敲除(CD33-2指导物)的治疗效果。在这些研究中，以3x10

表24.AML小鼠的中位存活期。

与CTX-970组相比，CTX-965b组在第33天检测到的较低发光测量表明，在肿瘤负荷控制方面，CTX-965b CAR+ T细胞(具有或不具有CD33敲除)显现更有效(图19E和表25)。

表25.第33天检测的发光测量的统计分析。

总之，这些结果证明抗CD33 CAR+ T细胞对AML小鼠模型有治疗作用。具有或不具有CD33基因敲除的抗CD33 CAR+ T细胞均可提供这种治疗效果。

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