一种铁基纳米酶水凝胶的制备方法及应用

技术领域

本发明涉及纳米材料模拟酶技术领域，具体涉及一种铁基纳米酶水凝胶及其制备方法和抗菌应用。

背景技术

纳米酶是一类具有天然酶催化活性的纳米材料，其催化活性来自于纳米酶自身所具有的特殊纳米结构，无需额外引入催化功能基团或者天然酶。纳米酶的发展为开发新的抗菌途径和方法提供了契机，因为纳米酶具有调节活性氧物质(ROS)自由基水平的能力，打破ROS平衡，进而破坏细胞膜或生物膜的完整性，降解核酸，使多种蛋白质失活，最终引发细菌形态发生剧烈变化并导致死亡，这与传统抗生素在抗菌机理上有着本质性的不同，从而避免了细菌耐药性的产生。

然而，几乎所有的纳米酶都不能有效地与细菌相互作用，并且ROS具有固有的短寿命(小于200ns)和扩散距离(约20nm)的缺点。因此，亟需解决这些问题来促进纳米酶在抗菌领域的应用。水凝胶因其独特的物理化学特性引起了生物医学界的广泛关注。水凝胶表面带正电荷且具有大孔结构，能够有效捕获细菌、固定活性氧物质。水凝胶还具有良好的生物相容性和生物降解性，并且可以吸收和保留大量的水，提供一个潮湿的环境。基于这些独特的特性，一些具有抗菌特性的水凝胶已被用于治愈伤口。另外，铁基纳米酶具有类过氧化物酶(POD)活性，可诱导过氧化氢羟基自由基，破坏细菌完整性。因此，通过原位自由基聚合法制备水凝胶将铁基纳米酶包覆，可以在ROS破坏范围内捕获和限制细菌，最终杀死细菌。

发明内容

基于上述现有技术的需要，本发明的目的之一在于提供一种铁基纳米酶水凝胶的制备方法；本发明的目的之二在于提供铁基纳米酶水凝胶的抗菌应用。为实现上述发明目的，经研究，本发明提供如下技术方案：

本发明首先提供了一种铁基纳米酶水凝胶的制备方法，包括：

1)依次将N-异丙烯基丙烯酰胺(NIPAAM)、丙烯酰胺(AAM)、N-(3-二甲基氨基丙基)甲基丙烯酰胺(DMPA)和N,N-亚甲基双丙烯酰胺(MBA)加入到去离子水中，超声至完全溶解，得到混合溶液I；

2)将铁基纳米酶分散于去离子水中缓慢滴加到溶液I中，继续超声至分散均匀，得到分散液II；

3)将四甲基乙二胺(TMEDA)和过硫酸铵[(NH

4)待水凝胶成型后将其转入超纯水浸泡，洗掉残留的TMEDA及(NH

5)将水凝胶在液氮中萃取两三次，放入冷冻干燥机中冻干，最终得到具有大孔结构的铁基纳米酶水凝胶。

具体地：水凝胶采用原位自由基聚合法制备，通过试验验证每一组分最佳加入量及铁基纳米酶分散液的最佳滴加速度，在避免浪费的同时保证水凝胶成型。另外，对于交联剂TMEDA的加入量要严格控制，过多会造成孔结构致密狭小，量少则水凝胶成型困难无法进行下一步操作。

a.铁基纳米酶：

铁基纳米酶表面的大量铁原子中Fe

b.利用原位自由基聚合法制备铁基纳米酶水凝胶：

依次将NIPAAM、AAM、DMPA和MBA加入到去离子水中，超声至完全溶解，得到混合溶液I，将铁基纳米酶分散于去离子水中缓慢滴加到溶液I中，继续超声至分散均匀，得到分散液II，一定体积的TMEDA和(NH

在根据本发明的一个实施方案中，步骤1)中，NIPAAM、AAM、DMPA、MBA与去离子水的质量比分别为1:15～20、1:50～55、1:50～55、1:150～155。

在根据本发明的一个实施方案中，步骤2)中，铁基纳米酶分散液的质量分数为0.1％～2.0％。

在根据本发明的一个实施方案中，步骤2)中，铁基纳米酶分散液滴加速度为10～100μL/s。

在根据本发明的一个实施方案中，步骤3)中，(NH

在根据本发明的一个实施方案中，步骤3)中，(NH

在根据本发明的一个实施方案中，步骤3)中，分散液II与TMEDA的体积比为1:0.002～0.02。

在根据本发明的一个实施方案中，步骤3)中，分散液II与(NH

本发明还提供了根据上述的制备方法制备得到的铁基纳米酶水凝胶。

本发明还提供了上述铁基纳米酶水凝胶在制备医疗器械、体内植入物或抗细菌感染的敷料中的应用；优选地，所述抗细菌感染的敷料为抗感染凝胶。

在根据本发明的一个实施方案中，所述抗感染的敷料为用于治疗致病菌感染，所述致病菌选自金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、铜绿假单胞菌、大肠杆菌、变形杆菌、痢疾志贺菌和伤寒沙门杆菌中的任一种或多种。

本发明的有益效果在于：

本发明制备水凝胶的通过其大孔结构和正电性能够有效地捕获细菌，通过铁基纳米酶的类过氧化物酶活性，催化微量过氧化氢生成对细胞膜或生物膜有强烈破坏作用的羟基自由基，从而杀死细菌，并有效避免耐药菌的产生。同时铁基纳米酶水凝胶可移除死细菌，达到无炎症产生及快速愈合伤口的作用。

通过原位自由基聚合法制备的水凝胶将铁基纳米酶包覆，得到一种新的纳米酶水凝胶。体外抗菌活性检测结果显示，本发明制备的铁基纳米酶水凝胶能够很好地抑制及杀死革兰阳性菌和革兰氏阴性菌，更为重要的是，通过小鼠实验研究结果显示，该水凝胶能够更快地使细菌感染的伤口愈合，无炎症出现，无细胞毒性产生。因此，本发明合成的铁基纳米酶水凝胶有望供临床抗菌应用，从而为临床抗微生物治疗提供更多高效、安全的方法，有助于解决日趋严重的耐药性、顽固的致病性微生物以及新出现的有害微生物等临床治疗问题。本发明制备的铁基纳米酶水凝胶，操作简便，易于批量生产。

附图说明

图1是本发明实施例1所制备得到的铁基纳米酶、水凝胶、铁基纳米酶水凝胶的扫描电镜。

图2是本发明实施例1所制备得到的铁基纳米酶水凝胶X射线衍射谱图与红外光谱图。

图3是本发明实施例1所制备得到的铁基纳米酶水凝胶的Zeta电位图。

图4是本发明实施例1所制备得到的铁基纳米酶水凝胶体外对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑制效果图。

图5是本发明实施例1所制备得到的铁基纳米酶水凝胶处理小白鼠金黄色葡萄球菌感染的伤口愈合情况。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面结合附图和具体的实施方式对本发明作进一步详细的说明。所述实施例的示例在附图中示出。应理解，在下述本发明的实施方式中描述的具体的实施例仅作为本发明的具体实施方式的示例性说明，旨在用于解释本发明，而不构成对本发明的限制。

实施例1、铁基纳米酶水凝胶的制备

将60mg NIPAAM、20mg AAM、20mg DMPA和6mg MBA溶解于1mL去离子水中，超声10min至完全溶解，得到溶液I；将制备得到的磷酸铁纳米酶分散于0.1mL去离子水后加入到溶液I中，继续超声至分散均匀，得到分散液II；将20μL TMEDA和20μL 10％的(NH

实施例2、铁基纳米酶水凝胶的表征

(1)电镜分析(SEM)

采用扫描电子显微镜(JSM7500F)对本实例制备得到的水凝胶、铁基纳米酶、铁基纳米酶水凝胶进行形貌观察分析，结果如图1所示：

图1中a为水凝胶的形貌扫描电镜照片，可以观察到水凝胶的多孔网状结构，孔径约为2-4μm。图1中b为铁基纳米酶的形貌扫描电镜照片，可以观察到铁基纳米酶的类球状结构。图1中c为铁基纳米酶水凝胶的形貌扫描电镜照片，可以观察到铁基纳米酶被成功包覆于水凝胶中。

(2)XRD和FT-IR分析

采用X射线衍射仪(ULTIMALV)和傅里叶红外光谱仪(Nicolet iS50)对本实例所制备的铁基纳米酶水凝胶进行晶体结构和官能团的表征，结果如图2所示：

图2中a铁基纳米酶的XRD图中的衍射峰可以看出，制备的铁基纳米酶为无定形晶型。图2中b可以看出铁基纳米酶在1036cm

(3)Zeta电位分析

采用电位分析仪对实施例1所制备的铁基纳米酶水凝胶进行电位分析，结果如图3所示：

图3是铁基纳米酶、水凝胶及铁基纳米酶水凝胶的Zeta电位图，可以看出水凝胶带正电，约+39mV，铁基纳米酶带负电，约-33mV，铁基纳米酶大孔水凝胶带正电，约+20mV。因此，实施例1所制备的铁基纳米酶水凝胶可以有效地捕获带负电的细菌。

实施例3、铁基纳米酶水凝胶抗菌实验

(1)一级种子液的制备：分别取实验室冻存的革兰氏阳性菌—金黄色葡萄球菌(S.aureus ATCC 6538)及革兰氏阴性菌—大肠杆菌(E.coli ATCC 8739)各100μL于100mLLB肉汤(海博生物)液体培养基中，恒温振荡培养14h(37℃，120rpm)，得到一级种子液，菌种均购买于上海鲁微科技有限公司。

(2)二级种子液的制备：从(1)得到的一级种子液中各取100μL分别转接于新的100mL LB液体培养基中，根据细菌溶液在600nm处的吸光度(OD

(3)抗菌母液的制备：称取(吸取)适量水凝胶、铁基纳米酶、H

(4)平板菌落计数法统计细菌存活率：将(3)中添加不同材料组分的菌悬液进行梯度稀释，含有大肠杆菌的菌悬液梯度稀释五个浓度，为10

实施例4、体外铁基纳米酶水凝胶对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌存活率的影响

本实施例PBS、水凝胶、磷酸铁纳米酶、H

实施例5、小白鼠伤口处理和愈合试验

本实施例中使用PBS、水凝胶、磷酸铁纳米酶、H

如图5所示，本发明提供的磷酸铁纳米酶+H

本发明通过原位自由基聚合法制备得到铁基纳米酶水凝胶，具有类过氧化物酶活性，在H

最后说明的是，以上实施例仅用于说明本发明的技术方案，并不构成对本发明内容的限制。尽管通过上述实施例已经对本发明做了较为详细的列举，但本领域技术人员仍然可以根据发明内容部分和实施例部分所描述的技术内容，在形式上和细节上对其做出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。