新型活性杀生物物质及其生产工艺

相关应用

本申请要求优先于2019年5月16日提交的美国专利申请第16/413,637号，标题为“新型活性杀生物物质及其生产工艺”，其全部内容并入本文。

发明领域

本发明涉及新型活性物质及其生产方法。这些活性物质主要可用于杀生物产品、植物保护产品、医疗器械和药理用途。本文所述活性物质通过缩合反应获得。通过满足有关抗菌功效、人类健康和环境危害的现代监管要求，本发明的主题在技术应用方面具有商业可行性。

发明背景

1940年，美国专利号2,325,586为聚合物胍及其作为生物杀灭活性物质的应用领域的发展奠定了基础。这些聚合胍盐是由含有两个氨基和至少一个自由氢原子的有机化合物的聚合缩合反应形成的。卤化氰、单体胍、胍酸酯、双氰胺和异氰酸酯二卤化物可被视为形成本文所述聚合物化合物的单体。由于此处描述了缩合反应，因此必须在无水条件下才能获得良好的产率。从美国专利号2,325,586和2,336,605的相关示例中可以明显看出，对于乙醇中己二胺(HMDA)和溴化氰的聚合反应，不仅必须使用绝对溶剂，而且所需溶剂量非常高。聚合在回流条件下进行25小时，这降低了整个过程的效率。

在所有已知的聚合胍中，只有聚六亚甲基双胍(PHMB)作为一种活性物质具有相关性。这种物质在1950年的专利中首次被详细描述。今天，PHMB通常被称为聚己酰胺、Vantocil或简单地称为具有不同分子量的PHMB。

此外，已知许多聚合物胍，其可通过使用不同的二胺和多胺来制备，例如从EP专利号0439698和0439699已知的无支链C6-C12亚烷基二胺。

在WO 1999/054291中，描述了聚六亚甲基胍(PHMG)的生产工艺。PHMG可用作杀生产品的活性物质。PHMG是通过胍与亚烷基二胺(尤其是己二胺)缩聚制备的。根据WO 2001/085676 A1，已知聚合物胍，其通过胍和氧亚烷基二胺的缩合反应制备。为了制备这种聚合物，盐酸胍溶解在三甘醇二胺中。经测定，其分子量高达3000Da。

根据WO2006/047800 A1，已知聚合物缩合产物，其通过胍与亚烷基二胺和氧亚烷基二胺反应形成。根据其权利要求，缩合产物的特征在于烷基二胺和/或氧烷基二胺的氨基为末端。

由于社会的变化和活性物质需要满足的最新要求，该领域的大多数发明失去了相关性。2010年，一个从事化学和生物杀灭产品业务的协会表示，需要在该领域开发新的活性物质(AS)：“然而，尽管应用数量不断增加，但随着生物杀灭剂产品指令的实施，欧盟(EU)可用的生物杀灭剂化学物质(即活性物质)的数量正在减少。[...]欧盟(EU)正在采取新的监管举措，推动使用更环保的化学品，或在广泛的产品和应用中使用。”见：埃莉娜·科克宁、蒂姆·赫沃宁和卡特里娜·诺德斯特伦。“新型杀生物活性物质：从行业角度看欧盟(EU)的需求和挑战。”商业化学杂志7.2(2010)。

图的简要说明

图1显示了不同浓度的新型活性杀生物剂的微生物降解特性(呼吸速率与时间的关系)。

图2显示了不同浓度的新型活性杀生物剂的微生物降解特性(细菌数量与时间的关系)。

图3显示了生物细胞内的CALUX测定机制。

发明概要

一种实施方案涉及一种物质，其包含端盖氨基化合物，该端盖氨基化合物包含氨基化合物和端盖剂的至少一部分，其中该端盖剂的至少一部分不包含伯烷基胺基，并且其中该物质显示出比不含端盖剂时更少的细胞毒性。

一种实施方案涉及一种物质，其包含端盖氨基化合物，该端盖氨基化合物包含氨基化合物和端盖剂的至少一部分，其中该端盖剂的至少一部分不包含伯烷基胺基，并且其中该物质不显示通过Cytotox CALUX分析测得的活性。

一个实施方案涉及由包含氧亚烷基二胺、亚烷基二胺、胍或其盐和封端剂的反应物反应形成的产物，该反应包括第一步和第二步，其中第一步和第二步中反应物的摩尔组成不同，此外，其中，通过Cytotox CALUX分析测得的产物的细胞毒性低于仅在反应的第一步中形成的比较产物的细胞毒性。

一个实施方案涉及由包含氧亚烷基二胺、亚烷基二胺、胍或其盐和封端剂的反应物反应形成的产物，该反应包括第一步和第二步，其中第一步和第二步中反应物的摩尔组成不同，此外，其中产品具有小于0.3ng TBT eq./g样品的细胞毒性，如通过Cytotox CALUX分析测得的。

一种实施方案涉及一种方法，该方法包括通过使氨基化合物与至少一部分末端封端剂反应来形成包含末端封端氨基化合物的产物，其中该产物不表现出通过细胞毒素钙离子分析测得的Cytotox CALUX。

一种实施方案涉及一种方法，该方法包括通过反应物的反应形成产物，反应物包括氧亚烷基二胺、亚烷基二胺、胍或其盐以及封端剂，反应包括第一步和第二步，其中第一步和第二步中反应物的摩尔组成不同，此外，其中，通过CytotoxCALUX分析测得的产物的细胞毒性低于仅在反应的第一步中形成的比较产物的细胞毒性。

一种实施方案涉及一种方法，该方法包括通过反应物的反应形成产物，反应物包括氧亚烷基二胺、亚烷基二胺、胍或其盐以及封端剂，该反应包括第一步和第二步，其中，第一步和第二步中反应物的摩尔组成不同，进一步，其中聚合物产品的细胞毒性(CytotoxCALUX)小于0.3ng TBT eq./g样品，如通过细胞毒素钙试金测定所测得。

在一个实施方案中，该物质进一步表现出通过类固醇生成ERα CALUX测定测得的无活性。

在一个实施方案中，该物质进一步表现出通过AR-CALUX分析测得的无活性。

在一个实施方案中，该物质进一步显示出通过抗ERrα-CALUX分析测得的无活性。

在一个实施方案中，该物质进一步表现出通过类固醇生成AR-CALUX分析测得的无活性。

在一个实施方案中，该物质进一步表现出通过抗AR CALUX测定测得的无活性。

在一个实施方案中，该物质进一步表现出通过TRβ CALUX测定所测得的无活性。

在一个实施方案中，该物质进一步显示出通过抗TRβ CALUX测定测得的无活性。

在一个实施方案中，通过TTR-TRβ-CALUX分析测得的物质进一步显示无活性。

在一个实施方案中，该物质进一步表现出通过TPO分析测得的无活性。

在一个实施例中，氨基化合物包含连接剂。

在一个实施例中，氨基化合物包含有机氨基化合物和连接剂。

在一个实施例中，有机氨基化合物包括第一有机胺化合物和第二有机胺化合物，其中第一有机胺化合物和第二有机胺化合物不同。

在实施例中，第一有机胺化合物包含亚烷基二胺，第二有机胺化合物包含氧亚烷基二胺，连接剂包含胍或其盐，封端剂包含胍或其盐。

在一个实施例中，亚烷基二胺包含己二胺，氧亚烷基二胺包含三甘醇二胺，连接剂和封端剂包含盐酸胍。

在一个实施例中，氧亚烷基二胺包含式化合物：

NH

其中n是介于2和5之间的整数。

在一个实施例中，亚烷基二胺包含式化合物：

NH

其中n是介于2和10之间的整数。

在一个实施例中，该盐包含胍的盐酸盐。

在一个实施例中，氧烷二胺包含三甘醇二胺、聚氧丙烯二胺和/或聚氧乙烯二胺。

在一个实施例中，超过50％(按重量计)的产物在产物的末端位置具有胍。

在一个实施例中，超过90％(按重量计)的产物在产物的末端位置具有胍。

在一个实施方案中，该产品具有杀菌活性和酵母活性。

在一个实施方案中，在反应的第一步和第二步中添加胍或其盐。

在一个实施例中，封端剂包含胍或其盐。

在一个实施例中，产品的C与N比(C/N)大于2。

在一个实施例中，该产品是可微生物降解的。

在实施例中，在第一步骤期间，氧亚烷基二胺、亚烷基二胺和胍或其盐以化学计量比存在。

在实施例中，在第一步骤期间，氧亚烷基二胺、亚烷基二胺和胍或其盐处于非化学计量比，其中胍或其盐超过化学计量比。

在实施例中，在第二步骤期间，氧亚烷基二胺、亚烷基二胺、胍或其盐以及封端剂处于非化学计量比，其中胍或其盐以及封端剂的总量超过化学计量比。

详细说明

除一份提及的出版物外，所述聚合物胍均不具有作为活性物质(AS)的相关市场意义。对于用于生物杀灭产品(BP)和其他应用(如用于植物保护或医疗产品)的现代活性物质的要求，它们缺乏合适的物质概况。如今，大多数出版物关注的不仅是抗菌功效，而且还有人类毒理学、内分泌干扰(ED)特性、生态毒理学效应和生物降解行为。

几乎没有任何出版物提及内分泌干扰特性、其生态毒理学特征或生物降解行为，因为在其出版时，这些参数不是公众和监管机构关注的焦点，因此，大多数聚合物胍不再适用于实际技术应用。

《联邦杀虫剂、杀真菌剂和灭鼠剂法案》(FIFRA)是一部美国联邦法律，它建立了美国的基本法规体系，以保护专业用户、消费者和环境。它由美国环境保护署(EPA)管理和监管。

欧盟(EU)于2013年9月实施了第528/2012号杀生物产品法规(BPR)。它由欧洲化学局(ECHA)管理和监管。其目的是保护居住在欧盟(EU)的人民以及环境免受《BPR》规定的杀生物剂和其他活性物质的负面影响。

BPR和FIFRA不仅为其有效性范围设定了基调，也为全球其他没有自己监管机构的国家设定了基调。

本发明的目的是生产优于现有聚合物胍的活性物质。先前公布的活性物质的优势来源于无明显的内分泌干扰特性，以及较低的哺乳动物和水生生物毒性和较快的生物降解过程，再加上同等或更高的抗菌功效。只有通过创造具有所有这些性质的良好组合的活性物质，才能根据最新立法制造商业相关活性物质，用于生物杀灭产品和其他应用。

为了使胺化合物达到所需的性质(目前活性物质必须具备这种性质)，可以使用封端剂来改变末端功能，这可能对胺化合物的行为产生重大影响。作为封端剂，所有化合物都可以使用，它们能够取代末端氨基。

对于缩聚产物的合成，可以使用氨基化合物和连接剂来获得所需的缩聚产物。作为连接剂，可以使用能够在两个位置与氨基发生反应的任何化合物，以便通过缩合反应形成聚合物化合物。这样形成的产物在其末端位置可能带有胺基。作为缩聚反应的附加步骤，引入封端剂以将末端官能团和最终化合物的性质导向所需的官能团。

可使用一种、两种或多种不同的胺进行缩聚，所述胺可以是有机的和/或无机的。

与现有技术部分中所述的旧结构相比，根据本发明的缩聚产品代表了向前迈出的重要一步，尤其是当它们用于杀生物剂或植物保护产品时。

当考虑胍作为连接剂和烷基二胺作为胺的缩聚产物时，可以假设以下修改：

1.分子大小、基本结构(线性或环状)、可能的交联、分子量分布。

2.使用一种或多种二胺作为析出物，后者增加了合成的可能结构的数量。

3.用于缩合反应的排出物的基本化学计量比。

4.通过以下方式终止聚合物链：

a)连接剂，如胍

b)氨基

c)使用封端剂引入的其他组

令人惊讶的是，人们发现末端氨基在哺乳动物毒性和最重要的内分泌活动方面产生了不期望的结果，后者被认为是长期毒性的驱动因素(哺乳动物和水生生物)。

另一方面，可以证明，非常短的链结构表现出不太明显的抗菌效果。

胍终止也有利于阳离子聚合物的抗菌效果，因为其阳离子电荷更明显。

试图通过在生产过程开始时添加化学计量的过量胍来获得更多的胍封端聚合物，将不可避免地导致链长度缩短，这对抗菌效果有害。此外，由于其不利的毒理学特性，必须避免过量未反应的胍。

因此，在附加合成步骤中引入附加胍(作为合适封端剂的示例)证明是最合理的解决方案，一方面获得所需的聚合物链长，另一方面获得高度非氨基端分子。

在合成的第二阶段，也可以通过使用不同于胍的封端剂来建立其他终止官能团。

在一个实施例中，以道尔顿(Da)表示的缩合产物的分子量范围在200Da和3000Da之间，分子量的附加下限和/或上限为300Da、400Da、500Da、600Da、700Da，800Da和900Da，分子量范围可以是100Da作为下限，3000Da作为上限。

在一个实施例中，大多数聚合物链(按重量计)在末端位置具有胍。

在一个实施例中，超过50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％(按重量计)的聚合物产品在聚合物产品的末端位置具有胍。

定义、一般技术和缩写

除非本文另有定义，否则结合实施例使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另有要求，单数术语应包括复数，复数术语应包括单数。例如，权利要求中的术语“a”指“一个或多个”一般而言，本文所述的与健康监测相关的术语和技术是本领域中公知且常用的术语。

短语“基本无活性”表示对脊椎动物内分泌系统的影响(a)低于或接近通过Cytotox-CALUX分析测定的体外分析的LOQ，或(b)不会对哺乳动物产生不利影响。

术语“反应”是指一种化合物与另一种化合物形成化学键的条件。

“胍”是分子式为HNC(NH

“有机”是指共价结合的碳基化合物。

“产物”是一个反应的一种以上起始材料的结果。

“末端”是聚合物链末端的最后一个化学基团。

“杀生物剂”是对(微生物)新陈代谢或病毒繁殖产生不利影响的东西。

“可降解”是指易受微生物代谢影响的物质。

“试剂”是一种具有特殊目的的化合物，即连接到聚合物链的末端。

“较低”意味着表现出较少的东西。

“形成的”是指由一个反应的不止一种原料所产生的产物。

“连接剂”是用来将一个部分、事物或化合物与另一部分、事物或化合物连接起来的东西。

术语“化合物”指一种特定的化学结构。例如，由两种或两种以上的成分(如元素)按一定的重量比例结合而成的具有一定结构排列的化学性质不同的物质。

术语“末端位置”指聚合物分子的末端。

术语“封端剂”是指能够取代化合物末端氨基的化学实体。

术语“分子量”是指分子中原子的原子量值之和。

术语“基团”是指具有特定化学性质的特定结构中共价结合的原子集合体。

术语“第一步”、“第二步”和附加步骤指的是过程的各个部分。

表1：缩略语清单

获得所需缩聚产物的方法

当使用二胺或多胺和胍作为起始材料时，从文献中知道有几种合成途径用于生产缩聚产物。

式(I)中给出了可能的二胺或多胺的式。

R和R′可以是简单的氢或烷基(C1-C6)。间隔基“X”可以表示为直链或支链亚烷基(C2-C16)，其可以包括杂原子，如O或N。还可以使用环状碳骨架作为间隔基。

胍的合适反阴离子是无机酸和有机酸的盐，例如氯化物、磷酸二氢钠、碳酸盐、山梨酸盐、硝酸盐、醋酸盐、葡萄糖酸盐、柠檬酸盐和硅酸盐。

通过每摩尔二胺或多胺分别使用0.5至2摩尔胍盐的反应获得缩合产物。

产品缩聚后，开始期望缩聚产品的附加发明步骤。为了改变缩聚产物的端基，必须添加额外量的胍作为封端剂。优选地，必须添加在反应开始时使用的量，其为盐酸胍量的8％w/w至50％w/w。应在工艺结束时添加的确切量取决于工艺参数，从而取决于所获得缩聚产物的链长。整个过程完成，当缩合反应完成时，氨的生成停止。由于盐酸胍形式的阳离子电荷的额外来源，以这种方式获得的产物可能表现出更显著的抗菌功效，但更重要的是，通过最小化最终缩聚产物中末端氨基的数量来降低内分泌干扰性质。此效果在表5(如下所示)中详细介绍。

基于针对本文所述缩聚产物的内分泌干扰性质获得的数据，现有技术化合物的ED性质的原因是缩聚产物的分子结构和端基的组合。例如，通过硅CALUX分析可以看出差异，下面的示例将对此进行详细描述。此外，如表4(如下所示)所示，细胞毒性显著降低，这是与现有技术聚合物相比的一个主要优势，用于长期暴露于例如哺乳动物。

在本发明中，实施例1中获得的缩聚产物也是可微生物降解的，这是在对污水污泥进行实验时发现的(图1)。在实验过程中，测量了污泥中的耗氧量。当一种化合物被添加到污泥中，微生物可以将其用作底物或能量来源时，耗氧量增加。事实上，我们可以对缩聚产物进行观察，发现聚合物是可生物降解的。本实验使用的剂量非常重要，因为超过活性污泥致死剂量(LD)的剂量会导致污水污泥中的微生物完全失活，从而导致本实验的负面结果。这也可以从图2中看出。

例子

在比较实施例1、实施例1和比较实施例2中，起始材料为A、B和C，其中A为三甘醇二胺(摩尔质量：148g/mol)B为己二胺(摩尔质量：116g/mol)(HMDA)，C为盐酸胍。在反应容器中添加A、B和C后加热A、B和C混合物的小时数为t1，在反应容器中向预混合的A、B和C混合物中添加C*后加热A、B、C和C*的小时数为t2，其中C*为封端剂。在实例1中，C*系盐酸胍，但可过量添加任何类似封端剂以产生本文实施例之新颖杀生物剂产物。

比较例1

使用专利WO2006047800A中所述的方法，获得了具有统计上50％末端胺基的活性物质(当忽略环状结构时)。

通过1mol盐酸胍与0.75mol己二胺和0.25mol三甘醇二胺的混合物反应获得水溶性缩聚产物。

37g(0.25mol)液体三甘醇二胺(摩尔质量：148g/mol)和87g(0.75mol)HMDA(摩尔质量：在室温下，将116g/mol)加入配有机械搅拌器和空气冷却器的100ml三颈烧瓶中。随后，96.5g(1mol)粉末状盐酸胍(摩尔质量：将96.5g/mol)添加到烧瓶中。将具有反应质量的烧瓶浸入带有温度控制器的油浴中。在一小时内，在持续搅拌下将反应物加热至140℃，随后在这些条件下保持一小时。此后，在搅拌下在一小时内将温度升高至170℃，并在所述温度下再保持一小时。

随后小心地施加真空，并在170℃下减压搅拌反应物一小时。如图所示，从加热反应混合物的第一分钟起，就会出现氨的强烈释放(pH指示纸着色)，表明反应的进展和缩聚的发生。在反应过程中，反应物变得粘稠，因此可以目视观察泡沫的形成。反应混合物逐渐转变成黄色的树脂。一旦氨的气体释放几乎完全完成，反应完成，烧瓶冷却并用水稀释至所需浓度。

添加到比较实施例1中的反应混合物中的三甘醇、HMDA和盐酸胍的摩尔数为化学计量量。

例1

通过1mol盐酸胍与0.75mol己二胺(HMDA)和0.25mol三甘醇二胺的混合物反应获得水溶性缩聚产物。作为封端剂，额外使用0.0833mol盐酸胍。

37g(0.25mol)液体三甘醇二胺(摩尔质量：148g/mol)和87g(0.75mol)HMDA(摩尔质量：在室温下，将116g/mol)加入配有机械搅拌器和空气冷却器的100ml三颈烧瓶中。随后，96.5g(1mol)粉末状盐酸胍(摩尔质量：将96.5g/mol)添加到烧瓶中。将具有反应质量的烧瓶浸入带有温度控制器的油浴中。在一小时内，在持续搅拌下将反应物加热至140℃，随后在这些条件下保持一小时。此后，在搅拌下在一小时内将温度升高至170℃，并在所述温度下再保持一小时。

随后小心地施加真空，并在170℃下减压搅拌反应物一小时。如图所示，从加热反应混合物的第一分钟起，就会出现氨的强烈释放(pH指示纸着色)，表明反应的进展和缩聚的发生。在反应过程中，反应物变得粘稠，因此可以目视观察泡沫的形成。反应混合物逐渐转变成黄色的树脂。一旦氨的气体释放几乎完全完成，反应完成，并将封端剂引入缩聚反应。再次出现氨的强烈释放(pH指示纸着色)。1至4小时后或直到氨的生成几乎完全停止，通过冷却烧瓶并用水稀释最终聚合物至所需浓度，使反应停止。

添加到实施例1中的反应混合物中的三甘醇、HMDA和盐酸胍的摩尔为非化学计量量，其中盐酸胍根据化学计量量超过约0.1mol/mol盐酸胍。

比较例2

通过2.00mol盐酸胍与0.75mol HMDA和0.25mol三甘醇二胺的混合物反应获得水溶性缩聚产物。

37g(0.25mol)液体三甘醇二胺(摩尔质量：148g/mol)和87g(0.75mol)HMDA(摩尔质量：在室温下将116g/mol)加入配备有机械搅拌器和蒸馏装置的三颈烧瓶中。随后，193g(2mol)粉末状盐酸胍(摩尔质量：将96.5g/mol)添加到烧瓶中。将具有反应质量的烧瓶浸入带有温度控制器的油浴中。在一小时内，在持续搅拌下将反应物加热至140℃，随后在这些条件下保持一小时。此后，在搅拌下在一小时内将温度升高至170℃，并在所述温度下再保持一小时。

随后小心地施加真空，并在170℃下减压搅拌反应物一小时。如图所示，从加热反应混合物的第一分钟起，就会出现氨的强烈释放(pH指示纸着色)，表明反应的进展和缩聚的发生。在反应过程中，反应物变得粘稠，因此可以目视观察泡沫的形成。反应混合物逐渐转变成黄色的树脂。一旦氨的气体释放几乎完全完成，反应完成，烧瓶冷却并用水稀释至所需浓度。

添加到比较实施例2中的反应混合物中的三甘醇、HMDA和盐酸胍的摩尔为非化学计量量，其中盐酸胍按照化学计量量超过1mol/mol二胺。

比较实施例1和2以及实施例1的缩聚产物的C/N、粘度(mm

当在比较实施例2中与实施例1相比使用双倍量的盐酸胍时，基本上不形成长链聚合物。相反，只获得了很短的片段。这些结构特征导致比较实施例2与实施例1的产品的粘度较低(见表2)、非常不利的最小抑制浓度(MIC)(见表3)以及较差的细胞毒性和ED特性(见表4和表5)。

表2：分析

表2显示，实施例1产品的粘度高于对比实施例1和对比实施例2产品的粘度。上文解释了实施例1的产物相对于比较实施例2的产物的更高粘度，因为根据比较实施例2的反应混合物中的化学计量量，盐酸胍的添加量超过1mol/mol盐酸胍。然而，完全出乎意料的是，尽管盐酸胍在实施例1的反应混合物中的化学计量量超过约0.1mol/mol盐酸胍，但实施例1的产品的粘度高于比较实施例1的产品的粘度。

表2还显示，实施例1产品的C/N值高于对比实施例1和对比实施例2的C/N值。这一结果也是完全出乎意料的，因为预计C/N值与反应混合物中盐酸胍的量之间呈线性趋势。

表3：特定微生物的MIC值(μg/ml)，单位为ppm

表4：细胞毒性

*联合研究中心自动化CALUX报告基因分析程序，第197号方案：使用高通量筛选检测核激素受体调节或细胞信号通路激活的报告基因分析方案(2017年)。

**OECD TG 455：第455号试验：稳定转染反式激活体外试验检测雌激素受体激动剂和拮抗剂的基于性能的试验指南(2016年)。

^OECD 458：第458号试验：稳定转染的人雄激素受体转录激活试验，用于检测化学物质的雄激素激动剂和拮抗剂活性(2016年)。

^^OECD 456：第456号试验：H295R类固醇生成试验(2011年)。

表5：通过CALUX分析确定的ED特性

*/**/^/^^见表4下的脚注。

CALUX测定程序和原理

哺乳动物细胞具有广泛的机制，它们可以对所面临的化合物诱发的信号或应激作出特异性反应。CALUX(化学激活荧光素酶表达)分析形成了一组哺乳动物细胞系，这些细胞系经过修饰，除了这种自然反应外，还产生了可量化的反应：如果一个细胞被触发产生反应，一个报告基因(荧光素酶)被转录并翻译成一种酶，在它催化的反应中产生光。添加基质(荧光素)后，如图3所示，使用光度计对光产生进行量化。产生的信号与诱发效应成正比。

大多数细胞反应是由调节蛋白介导的，调节蛋白是一种检测特定事件并随后激发细胞对该事件反应的传感器。该调节因子与特定的调节元件结合，该元件存在于参与反应的基因上游的RNA区域中。在CALUX细胞系中，这些调控元件也位于荧光素酶(报告基因)的前面。因此，相应荧光素酶的产生与细胞的自然反应耦合。

尽管大多数基因可能参与多种反应，但CALUX分析的分子设计确保观察到的反应对感兴趣的效应具有高度特异性。

所有引用的参考文献，包括专利、专利申请出版物和其他出版物，全部通过引用并入本文。

权利要求书(按照条约第19条的修改)

1.一种物质，其包含由包含氧亚烷基二胺、亚烷基二胺、胍或其盐的反应物反应形成的聚合产物，包含末端封端氨基化合物，该末端封端剂包含氨基化合物和至少一部分末端封端剂，该末端封端剂包含不含伯烷基胺基的胍或其盐，其中所述聚合产物显示出小于0.03ng TBT eq./g的细胞毒性，如通过Cytototox CALUX分析测得的，其中C与N的比率(C/N)聚合物产品的质量分数大于2。

2.根据权利要求1所述的物质，其中所述聚合物产物进一步表现出通过甾体生成ERαCALUX分析测得的无活性，并且其中所述封端剂不含伯烷基胺基。

3.根据权利要求2所述的物质，其中所述聚合产物进一步显示出通过AR CALUX分析测得的无活性。

4.如请求项3之物质，其中该等聚合产物进一步显示如经抗ERrαCALUX分析测得之无活性。

5.如请求项4之物质，其中该等聚合产物进一步展示如类固醇生成AR CALUX分析所测得之无活性。

6.如请求项5之物质，其中该等聚合产物进一步显示如经抗AR CALUX分析测得之无活性。

7.如请求项6之物质，其中该聚合产物进一步显示如通过TRβCALUX分析所测得之无活性。

8.如请求项7之物质，其中该等聚合产物进一步显示如经抗TRβCALUX测定所测得之无活性。

9.如请求项8之物质，其中该等聚合产物进一步显示如经TTR-TRβCALUX测定所测得之无活性。

10.根据权利要求9所述的物质，其中所述聚合产物进一步显示出通过TPO分析测得的无活性。

11.如请求项1之物质，其中该氨基化合物包含连接剂。

12.如请求项11之物质，其中该氨基化合物包含有机氨基化合物及连接剂。

13.如请求项12之物质，其中该有机胺化合物包含第一有机胺化合物及第二有机胺化合物，其中该第一有机胺化合物及第二有机胺化合物不同。

14.如请求项13之物质，其中该第一有机胺化合物包含亚烷基二胺，该第二有机胺化合物包含氧亚烷基二胺，该连接剂包含胍或其盐，且该封端剂包含盐酸胍。

15.如请求项14之物质，其中该亚烷基二胺包含己二胺，该氧亚烷基二胺包含三甘醇二胺，该封端剂包含盐酸胍。

16.一种聚合产物，由包含氧亚烷基二胺、亚烷基二胺、胍或其盐和封端剂的反应物反应形成，该反应包括第一步和第二步，其中第一步和第二步中反应物的摩尔组成不同，此外，其中所述聚合物产物具有比仅在所述反应的第一步中形成的比较聚合物产物更低的细胞毒性，如通过Cytotox CALUX分析测得的；其中，封端剂不含伯烷基胺基；其中，聚合物产品的C与N(C/N)之比大于2。

17.如请求项16之聚合产物，其中该氧亚烷基二胺包含通式化合物：

NH

其中n是介于2和5之间的整数。

18.如请求项16之聚合产物，其中该亚烷基二胺包含通式化合物：

NH

其中n是介于2和10之间的整数。

19.如请求项16之聚合产物，其中该盐包含胍之盐酸盐；其中，反应物由氧亚烷基二胺、亚烷基二胺、胍或其盐组成。

20.如请求项16之聚合产物，其中该氧亚烷基二胺包含三甘醇二胺、聚氧丙烯二胺及/或聚氧乙烯二胺。

21.如请求项16之聚合产物，其中超过50重量％之该聚合产物在该聚合产物之末端位置具有胍。

22.如请求项16之聚合产物，其中超过90重量％之聚合产物在该聚合产物之末端位置具有胍。

23.如请求项16之聚合产物，其中该聚合产物具有杀菌活性及抗菌活性。

24.如请求项16之聚合产物，其中在反应之第一步骤及第二步骤中均添加胍或其盐。

25.如请求项16之聚合产物，其中该封端剂包含胍或其盐。

26.一种方法，其包括通过使氨基化合物与至少一部分端盖剂反应来形成包含端盖氨基化合物的聚合物产品，其中所述聚合物产品显示出小于0.03ng TBT eq./g的细胞毒性，如通过Cytotox CALUX分析测得的；其中，封端剂不含伯烷基胺基。

27.根据权利要求26所述的方法，其中所述聚合物产物进一步表现出如通过类固醇生成ERαCALUX测定所测得的无活性。

28.根据权利要求27所述的方法，其中所述聚合产物进一步显示出通过AR CALUX分析测得的无活性。

29.根据权利要求28所述的方法，其中所述聚合物产物进一步显示出如通过抗ERrαCALUX测定所测量的无活性。

30.根据权利要求29所述的方法，其中所述聚合物产物进一步表现出通过类固醇生成AR CALUX分析测得的无活性。

31.根据权利要求30所述的方法，其中所述聚合物产物进一步显示出通过抗AR CALUX分析测得的无活性。

32.根据权利要求31所述的方法，其中所述聚合产物进一步显示出通过TRβCALUX分析测得的无活性。

33.根据权利要求32所述的方法，其中所述聚合物产物进一步显示出通过抗TRβCALUX测定测得的无活性。

34.根据权利要求33所述的方法，其中所述聚合物产物进一步表现出通过TTR-TRβCALUX分析测得的无活性。

35.根据权利要求34所述的方法，其中所述聚合产物进一步显示出通过TPO分析测得的无活性。

36.如请求项26之方法，其中该氨基化合物包含连接剂。

37.如请求项36之方法，其中该氨基化合物包含有机氨基化合物及连接剂。

38.如请求项37之方法，其中该有机胺化合物包含第一有机胺化合物及第二有机胺化合物，其中该第一有机胺化合物及第二有机胺化合物不同。

39.如请求项38之方法，其中该第一有机胺化合物包含亚烷基二胺，该第二有机胺化合物包含氧亚烷基二胺，该连接剂包含胍或其盐，且该封端剂包含胍或其盐。

40.如请求项39之方法，其中该亚烷基二胺包含己二胺，该氧亚烷基二胺包含三甘醇二胺，该连接剂及该封端剂包含盐酸胍。

41.一种方法，其包括通过反应物(包括含氧亚烷基二胺、亚烷基二胺、胍或其盐和封端剂)反应形成聚合产物，该反应包括第一步和第二步，其中，第一步和第二步中反应物的摩尔组成不同，进一步，其中，通过Cytotox CALUX试验测得的聚合物产物的细胞毒性低于仅在反应的第一步中形成的比较聚合物产物的细胞毒性；其中，封端剂不含伯烷基胺基；其中，聚合物产品的C与N(C/N)之比大于2。

42.根据权利要求26所述的方法，其中所述聚合产物的C与N(C/N)之比大于2。

43.如请求项41之方法，其中该聚合产物系可微生物降解。

44.如请求项41之方法，其中该氧亚烷基二胺包含通式化合物：

NH

其中n是介于2和5之间的整数。

45.如请求项41之方法，其中该亚烷基二胺包含通式化合物：

NH

其中n是介于2和10之间的整数。

46.如请求项41之方法，其中该盐包含胍之盐酸盐。

47.如请求项41之方法，其中该氧亚烷基二胺包含三甘醇二胺、聚氧丙烯二胺及/或聚氧乙烯二胺。

48.如请求项41之方法，其中超过50重量％之聚合产物在该聚合产物之末端位置具有胍。

49.如请求项41之方法，其中超过90重量％之聚合产物在该聚合产物之末端位置具有胍。

50.如请求项41之方法，其中该聚合产物具有杀菌及抗菌活性。

51.根据权利要求41所述的方法，其中在反应的第一步和第二步中添加胍或其盐。

52.如请求项41之方法，其中该封端剂包含胍或其盐。

53.如请求项41之方法，其中在第一步骤期间，氧亚烷基二胺、亚烷基二胺及胍或其盐系以化学计量比存在。

54.如请求项41之方法，其中在第一步骤期间，氧亚烷基二胺、亚烷基二胺及胍或其盐系非化学计量比，其中胍或其盐系超过化学计量比。

55.根据权利要求41所述的方法，其中在所述第二步骤中，所述氧亚烷基二胺、所述亚烷基二胺、所述胍或其盐以及所述封端剂处于非化学计量比中，其中所述胍浆、所述盐以及所述封端剂的总量超过所述化学计量比。

56.如请求项55之方法，其中该封端剂包含胍或其盐。

57.一种聚合产物，由包含氧亚烷基二胺、亚烷基二胺、胍或其盐和封端剂的反应物反应形成，该反应包括第一步和第二步，其中第一步和第二步中反应物的摩尔组成不同，此外，其中聚合物产品具有小于0.30.03ng TBT eq./g的细胞毒性，如通过Cytotox CALUX分析测得的；其中，封端剂不含伯烷基胺基；其中，聚合物产品的C与N(C/N)之比大于2。

58.(取消)。

59.如请求项57之聚合产物，其中该聚合产物系可微生物降解之。

60.如请求项57之聚合产物，其中该氧亚烷基二胺包含通式化合物：

NH

其中n是介于2和5之间的整数。

61.如请求项57之聚合产物，其中该亚烷基二胺包含通式化合物：

NH

其中n是介于2和10之间的整数。

62.如请求项57之聚合产物，其中该盐包含胍之盐酸盐。

63.如请求项57之聚合产物，其中该氧亚烷基二胺包含三甘醇二胺、聚氧丙烯二胺及/或聚氧乙烯二胺。

64.如请求项57之聚合产物，其中超过50重量％之聚合产物在该聚合产物之末端位置具有胍。

65.如请求项57之聚合产物，其中超过90重量％之聚合产物在该聚合产物之末端位置具有胍。

66.如请求项57之聚合产物，其中该聚合产物具有杀菌活性及抗菌活性。

67.如请求项57之聚合产物，其中在反应之第一步骤及第二步骤中均添加胍或其盐。

68.如请求项57之聚合产物，其中该封端剂包含胍或其盐。

69.一种方法，其包括通过反应物(包括含氧亚烷基二胺、亚烷基二胺、胍或其盐和封端剂)反应形成聚合产物，该反应包括第一步和第二步，其中，第一步和第二步中反应物的摩尔组成不同，进一步，其中聚合物产物的细胞毒性小于0.03ng TBT eq./g，如通过CytotoxCALUX分析测得的；其中，封端剂不含伯烷基胺基。

70.如请求项69之方法，其中该聚合产物之C与N(C/N)之比大于2。

71.如请求项69之方法，其中该聚合产物系可微生物降解。

72.如请求项69之方法，其中该亚烷基二胺包含通式化合物：

NH

其中n是介于2和10之间的整数。

73.如请求项69之方法，其中该盐包含胍之盐酸盐。

74.如请求项69之方法，其中该氧亚烷基二胺包含三甘醇二胺、聚氧丙烯二胺及/或聚氧乙烯二胺。

75.如请求项69之方法，其中超过50重量％之聚合产物在该聚合产物之末端位置具有胍。

76.如请求项69之方法，其中超过90重量％之聚合产物在该聚合产物之末端位置具有胍。

77.如请求项69之方法，其中该聚合产物具有杀菌及抗菌活性。

78.根据权利要求69所述的方法，其中在反应的第一步和第二步中添加胍或其盐。

79.如请求项69之方法，其中该封端剂包含胍或其盐。

80.如请求项69之方法，其中在第一步骤期间，氧亚烷基二胺、亚烷基二胺及胍或其盐系以化学计量比存在。

81.如请求项69之方法，其中在第一步骤期间，氧亚烷基二胺、亚烷基二胺及胍或其盐系非化学计量比，其中胍或其盐系超过化学计量比。

82.根据权利要求69所述的方法，其中在所述第二步骤中，所述氧亚烷基二胺、所述亚烷基二胺、所述胍或其盐以及所述封端剂处于非化学计量比中，其中所述胍浆、所述盐以及所述封端剂的总量超过所述化学计量比。

83.如请求项82之方法，其中该封端剂包含胍或其盐。