用于制备治疗类风湿性关节炎药物的间充质干细胞制剂

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，特别涉及一种用于制备治疗类风湿性关节炎药物的间充质干细胞制剂。

背景技术

类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种自身免疫系统疾病，即患者的免疫系统错误地将关节周围组织识别为“非我”进行攻击，造成关节炎症，疼痛，肿胀和僵硬等症状，严重影响患者的身体健康和生活质量，并且降低病患的预期寿命。RA的病理特征主要是滑膜衬里细胞增生，间质大量炎性细胞浸润及微血管的新生及软骨和骨组织的破坏，其发病原因复杂，跟遗传，感染，激素等。

目前治疗的手段主要是防止关节破坏，保护关节功能，主要有药物治疗如非甾体类抗炎药，慢作用抗风湿药物，免疫抑制剂等，另外有关节置换等手术治疗手段，然而药物治疗不一定能很好的控制，更不能根治，手术治疗存在风险，而且具有使用时间限制，目前没有更好的治疗手段。

间充质干细胞(Mesenchymal stromal cells，MSC)来源广泛，可以从骨髓，脐带，胎盘，脂肪等组织获得，不仅具有自我更新的能力可以大量体外培养，并且具有分化成骨，软骨，脂的三系分化能力，而且具有很低的免疫原性从而可以异体使用，近年来被广泛用于临床研究和新药研发。

目前国内已经有十几款间充质干细胞药物获得了国家食品药品监督局的临床实验许可，主要涉及移植抗宿主病，糖尿病，心肌梗死，脑卒中，下肢缺血，肺纤维化及新型冠状病毒肺炎等。

间充质干细胞具有两大特点，使得其在RA治疗上具有理论依据和独特的优势。间充质干细胞作为药效信号细胞，分泌一些细胞因子从而促进血管的再生改善微循环，比如VEGF因子；同时间充质干细胞具有很好的免疫调节能力，通过抑制T细胞增殖，上调Treg细胞比例，抑制B细胞功能和减少B细胞数量等改善炎症；此外其具有旁分泌功能，和三系分化能力，可以促进软骨及滑膜组织的再生，抑制炎症反应。因此间充质干细胞可以很好的抑制炎症，调节免疫系统，从而治疗RA。

目前，很多间充质干细胞采用是血清的培养体系，给临床实验带来了很多风险，有些无血清的培养体系中间充质干细胞很快老化，增殖速度慢。

鉴于上述描述，亟待有一种能够保证间充质干细胞可以快速的增殖，并且批次间更稳定的新的培养体系。

发明内容

本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供一种间充质干细胞的培养方法，其中，采用无血清加细胞因子的培养体系，间充质干细胞可以快速的增殖，并且批次间更稳定。

本发明还有一个目的是提供一种间充质干细胞培养基。

本发明还有一个目的是提供一种高活性的间充质干细胞制剂，其可应用于制备类风湿性关节炎的药物。

为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种间充质干细胞的培养方法，包括以下步骤：

将贴壁培养16-24小时后的间充质干细胞加入含有细胞因子的无血清完全培养基中培养36-71小时，其中，细胞因子包括IL-1β，IL-4，TNF-α,bFGF,EGF,PDGF或IGF中的至少一种。

优选的是，所述细胞因子为IL-1β，IL-4L，TNF-α,，bFGF，EGF，PDGF和IGF。

优选的是，所述细胞因子的添加量分别为IL-1β：0ng/mL-20ng/mL，IL-4：0ng/mL-20ng/mL，TNF-α：0ng/mL-20ng/mL,bFGF:0ng/mL-50ng/ml,EGF:0ng/mL-100ng/ml，PDGF:0ng/mL-100ng/ml，IGF:0ng/mL-50ng/ml。

一种间充质干细胞培养基，包括：添加有细胞因子的无血清完全培养基，其中，细胞因子包括IL-1β，IL-4，TNF-α,bFGF,EGF,PDGF或IGF中的至少一种。

优选的是，所述细胞因子为IL-1β，IL-4L，TNF-α，bFGF，EGF，PDGF和IGF。

优选的是，所述细胞因子的添加量分别为IL-1β：0ng/mL-20ng/mL，IL-4：0ng/mL-20ng/mL，TNF-α：0ng/mL-20ng/mL,bFGF:0ng/mL-50ng/ml,EGF:0ng/mL-100ng/ml，PDGF:0ng/mL-100ng/ml，IGF:0ng/mL-50ng/ml。

一种间充质干细胞制剂的制备方法，包括以下步骤：

a)收集权利要求1-3任一项所述的间充质干细胞的培养方法制备获得的间充质干细胞，并用DPBS洗两次后计数；

b)用10％-20％DMSO+人血白蛋白5％-10％+复方电解质注射液重新悬浮细胞，做成5x10

一种间充质干细胞制剂。

一种间充质干细胞制剂在制备类风湿性关节炎的药物中的应用。

本发明至少包括以下有益效果：

本发明中采用无血清加细胞因子的培养体系，间充质干细胞可以快速的增殖，并且批次间更稳定。

本发明中采用无血清加细胞因子的体系，不仅解决了细胞增殖和稳定性的问题，同时还提高了间充质干细胞的促血管再生能力和免疫调节能力，提高细胞稳定性的同时提高了细胞的活性。

本发明提供的高活性间充质干细胞制剂可应用于制备类风湿性关节炎的药物。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

实施例1

1.脐带间充质干细胞的制备

实验所用人脐带间充质干细胞具体分离方法如下：

a)获得监护人授权同意后，无菌条件下取出新生儿脐带，并将其浸泡于DPBS缓冲液中，4℃条件暂存。

b)将脐带转移至无菌容器内，并使用含有1％青/链霉素的DPBS充分冲洗2次，每次清洗2分钟。

c)把脐带剪成长约2-3cm的小段，沿脐静脉内侧剖开脐带，并使用有齿镊去除脐动脉、脐静脉和脐带包膜。

d)将脐带组织剪碎，并用含有0.1％II型胶原酶的DMEM/F12培养液在37℃水浴下持续消化30分钟。

e)将组织悬液转移至新的离心管，室温下2000rpm离心30分钟弃上清后，再次使用PBS缓冲液反复多次冲洗组织块，随后使用0.125％胰酶在37℃水浴条件下继续消化30分钟后，10％血清替代物(PALL)的DMEM/F12终止消化。

f)使用200目细胞滤器过滤消化后的组织悬液，去除未完全消化的组织杂质，随后将滤液再次收集入新的离心管中，室温2000rpm离心20分钟。

h)弃去上清，用Nuwacell

i)每隔72小时更换一次培养液，倒置显微镜下观察细胞形态与密度，待其达到80％以上融合度后进行传代扩增。

2.人脐带间充质干细胞的传代扩增

a)原代培养的细胞生长至80％融合后，吸取原先的培养基上清，并10mLDPBS轻柔冲洗2次贴壁细胞。

b)加入3mL TrpLE消化液，随后将培养瓶放入37℃培养箱消化3-5分钟。

c)显微镜下观察细胞，当细胞开始变圆变亮，细胞间隙逐渐增大后，迅速加入DPBS完全培养基终止消化。

d)反复吹打细胞，并将细胞悬液转移至新的50mL离心管中，室温条件下离心。

e)弃去上清后，加入适量Nuwacell

f)当细胞融合度再次达到80％左右时，重复上述步骤进行传代培养。

3.人脐带间充质干细胞的冻存

a)提前将细胞冻存盒放入4℃冰箱预冷30分钟以上。

b)消化细胞的步骤同上，离心、弃上清后，使用友康公司的细胞冻存液重悬细胞,并将其转移至2mL冻存管中。c)将冻存管放入细胞冻存盒，-80℃过夜保存，随后转移入液氮罐长期冻存。

4.人脐带间充质干细胞的复苏

a)迅速将冻存细胞从液氮罐中取出，并在37-42℃水浴中快速持续晃动细胞，使其能够在短时间内尽快融化。

b)将细胞冻存悬液转移至提前准备有Nuwacell

c)弃去上清后，再次使用Nuwacell

d)24小时后，弃去未贴壁的死细胞和旧培养基，更换新的完全培养基。

实施例2

人脐带间充质干细胞的处理

a)以1×10

b)提前准备含有不同细胞因子的友康无血清培养基，加入下列细胞因子中的一种或者多种组合其中各个因子的终浓度分别为：IL-1β：0ng/mL-20ng/mL，IL-4：0ng/mL-20ng/mL，TNF-α：0ng/mL-20ng/mL,bFGF:0ng/mL-50ng/ml,EGF:0ng/mL-100ng/ml,PDGF:0ng/mL-100ng/ml，IGF:0ng/mL-50ng/ml.

c)16-24小时后加入含有细胞因子的友康无血清完全培养基有细胞因子的完全培养基，培养36-71小时

d)培养48小时后，收集细胞做成制剂，并进行检测。

实施例3

1.细胞制剂的制备

a)收集细胞，并用DPBS洗两次后计数；

b)用10％-20％DMSO+人血白蛋白5％-10％+复方电解质注射液重新悬浮细胞，做成5x10

2.细胞检测

a)流式检测CD73+/CD90+/CD105+,CD14-/CD34-/CD45-/CD79α-/HLA-DR-等间充质干系特有的阳性和阴性表面标记物

b)无菌，内毒素，支原体等的检测；

c)Treg调节实验的检测；

d)细胞因子的检测，主要是跟促血管再生和免疫调节相关的细胞因子，本发明中检测VEGF、TGF-β和IL-6,方法采用ELISA试剂盒进行。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。