一株塔宾曲霉及其制剂和应用

技术领域：

本发明属于微生物农药技术领域，具体涉及一株塔宾曲霉及其制剂和应用。

背景技术：

根结线虫在农业上危害极其严重。植物寄生线虫病每年在全球作物上造成的产量损失约8.8%–14.6%，经济损失约1000–1570亿美元(非专利文献 1)；其在农林上的危害已成为仅次于真菌病害的第二大类病害(非专利文献 2)。在植物寄生线虫中，根结线虫（root-knot nematodes, RKNs）是最重要的类群，种类80余种，能侵染1000多种植物，危害面积最广、造成的损失最为严重(非专利文献 3）。根结线虫属（

长期以来，对作物病原线虫的防治主要依靠化学农药，但由于化学杀线虫剂高毒性，造成农产品和生态污染问题非常突出。根据保护臭氧层的“蒙特利尔议定书”国际条约，发达国家已于2005年全面禁用使用最广泛的化学杀线虫剂溴甲烷，发展中国家将于2015年全面禁用。目前，灭线磷、溴甲烷、涕灭威等化学杀线虫剂在国内几乎都被禁用或限制使用。由此导致可选用的化学杀线虫剂种类更少，加剧了线虫防治的困难。

线虫生防微生物可通过捕食、寄生、产毒等方式致死线虫，是自然界中控制线虫种群的重要微生物类群（非专利文献 4）。继利用捕食线虫真菌（

塔宾曲霉（

现有技术文献

非专利文献

非专利文献 1：Singh SK, Hodda M, Ash GJ. 2013. Plant-parasiticnematodes of potential phytosanitary importance, their main hosts andreported yield losses. EPPO Bulletin, 43, 334–374。

非专利文献 2：周沁莹, 朱曼, 黄晓玮, 等. 植物寄生线虫的化学感受系统研究进展. 中国科学:生命科学, 2019, 49(7):828-838。

非专利文献 3：Moens M, Perry RN, Starr JL. 2009.

非专利文献4：Zhang KQ, Hyde KD. 2014. Nematode-trapping fungi.Dordrecht, Neth.: Springer, pp. 1-392。

非专利文献5：刘杏忠, 张克勤, 李天飞. 2004. 植物寄生线虫生物防治. 北京:中国科学技术出版社, pp. 1-345。

非专利文献 6：Colagiero M, Rosso LC, Ciancio A. 2017. Diversity andbiocontrol potential of bacterial consortia associated to root knotnematodes. Biological Control, http://dx.doi.org/10.1016/j. biocontrol.2017.07.010。

非专利文献 7：Priyank HM, Chinnannan K, Kadirvelu K, et al., Plantgrowth promoting rhizobacteria (PGPR): A potential alternative tool fornematodes bio-control. Biocatalysis and Agricultural Biotechnology, 2019, 17:119-128。

非专利文献 8：宋玉婕，杨从军.塔宾曲霉L-27菌株代谢产物柠檬酸及其酯类的分离与抑制植物幼苗生长活性. 农药，2021，60(7): 489-492。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术之不足，而提供一种新型高效的根结线虫病生防真菌及其应用。

本发明目的是由以下技术方案实现的：

本发明人采用内生真菌的传统分离方法，贵州省花溪区的药用植物飞龙掌血（

WF01菌株在PDA培养基上长迅速，28℃培养5天，菌落直接直径可达6.7-7.8 cm，菌落表面平坦，质地丝绒状；菌丝初生时为白色，渐变为棕、黑色，成熟菌落呈黑色颗粒状，在平板上分布不均匀，无渗出液，菌落背面黄褐色； 在光学显微镜，分生孢子头呈球形，褐黑色；分生孢子梗发生于基质，孢梗茎(750-1400) µm×(7-10) µm，壁平滑，近无色。分生孢子球形，深褐色，光滑，表面不光滑，有小刺，常串生，数量众多，孢子直径 4.5-5.0 µm。顶囊褐色，近球形，50-70 µm顶囊膨大，顶囊上放射状密生着两轮小柄。利用真菌鉴定的ITS通用引物扩增扩增 WF01菌株的ITS区获得的序列在GenBank公共数据库的序列号为:ON106833，此序列是鉴定该菌株的主要分子特征依据。

本发明目的还可以由以下技术方案实现：一种塔宾曲霉菌剂的应用，该菌剂可用于防治根结线虫病。

本发明目的还可以由以下技术方案实现：

一种含有所述的塔宾曲霉的菌剂，该菌剂的制备方法包括如下步骤：

1） WF01菌株试管斜面种子培养：将 WF01菌株接种到常规的PDA培养基斜面上，28℃下培养4天后获得斜面种子；

2） WF01菌株液体种子培养：将斜面种子接种到装有PDB培养基的三角瓶中，28℃，150 rpm条件下摇床培养3天获得液体种子；

3） WF01菌株发酵罐大量培养：将液体种子按体积比为5％的比例接入发酵罐中的PDB培养基中，在500-1000升发酵罐中的培养条件控制在：温度为25-28℃，搅拌速度为150-180 rpm，发酵时间为72-96小时；

4） WF01菌株的菌剂制备：经发酵罐培养获得的菌体及其代谢物与玉米淀粉混合后干燥至水分含量小于5%，粉碎得菌剂，其中， WF01菌株的分子孢子在菌剂中的活菌数在1×10

进一步的，所述步骤4）的干燥温度为50℃-65℃。

本发明目的还可以由以下技术方案实现：

一种含有塔宾曲霉的菌剂的应用，该菌剂可用于防治根结线虫病。

进一步的，所述根结线虫病包括番茄、黄瓜、烟草的根结线虫病。

有益效果

塔宾曲霉（

1、利用WF01菌株制备的菌剂对作物根结线虫病的防效可达70%以上。

2、利用WF01菌株制备的菌剂，能高效防治作物根结线虫病，具有使用成本低、无残留、对人畜安全的特点。

具体实施方式：

下面结合实施例对本发明作进一步的详述。

实施例1

一种含有所述的塔宾曲霉的菌剂，该菌剂的制备方法包括如下步骤：

1） WF01菌株试管斜面种子培养：将 WF01菌株接种到常规的PDA培养基斜面上，28℃下培养4天后获得斜面种子；

2） WF01菌株液体种子培养：将斜面种子接种到装有PDB培养基（即PDA培养基中不添加琼脂）的三角瓶中，28℃，150 rpm条件下摇床培养3天获得液体种子；

3） WF01菌株发酵罐大量培养：将液体种子按5％（V/V）的比例接入发酵罐中的PDB培养基中，在500-1000升发酵罐中的培养条件控制在：温度为25-28℃，搅拌速度为150-180rpm，发酵时间为72小时；

4） WF01菌株的菌剂制备：经发酵罐培养获得的菌体及其代谢物与玉米淀粉混合后55℃-65℃干燥至水分含量小于5%，粉碎得菌剂。检测 WF01菌株的分子孢子在菌剂中的活菌数为：在1.0×10

实施例2

一种含有所述的塔宾曲霉的菌剂，该菌剂的制备方法包括如下步骤：

1） WF01菌株试管斜面种子培养：将 WF01菌株接种到常规的PDA培养基斜面上，28℃下培养4天后获得斜面种子；

2） WF01菌株液体种子培养：将斜面种子接种到装有PDB培养基（即PDA培养基中不添加琼脂）的三角瓶中，28℃，150 rpm条件下摇床培养3天获得液体种子；

3） WF01菌株发酵罐大量培养：将液体种子按5％（V/V）的比例接入发酵罐中的PDB培养基中，在500-1000升发酵罐中的培养条件控制在：温度为25-28℃，搅拌速度为150-180rpm，发酵时间为85小时；

4） WF01菌株的菌剂制备：经发酵罐培养获得的菌体及其代谢物与玉米淀粉混合后晾干至水分含量小于5%，粉碎得菌剂。检测 WF01菌株的分子孢子在菌剂中的活菌数为：在5.0×10

实施例3

一种含有所述的塔宾曲霉的菌剂，该菌剂的制备方法包括如下步骤：

1） WF01菌株试管斜面种子培养：将 WF01菌株接种到常规的PDA培养基斜面上，28℃下培养4天后获得斜面种子；

2） WF01菌株液体种子培养：将斜面种子接种到装有PDB培养基（即PDA培养基中不添加琼脂）的三角瓶中，28℃，150 rpm条件下摇床培养3天获得液体种子；

3） WF01菌株发酵罐大量培养：将液体种子按5％（V/V）的比例接入发酵罐中的PDB培养基中，在500-1000升发酵罐中的培养条件控制在：温度为25-28℃，搅拌速度为150-180rpm，发酵时间为96小时；

4） WF01菌株的菌剂制备：经发酵罐培养获得的菌体及其代谢物与玉米淀粉混合后50℃-55℃干燥至水分含量小于5%，粉碎得菌剂。检测 WF01菌株的分子孢子在菌剂中的活菌数为：在2.5×10

应用效果试验

1.WF01菌剂防治番茄根结线虫病的田间试验

试验地点：云南省玉溪市化念镇蔬菜大棚。

试验作物：番茄（品种：粉都-80）。

供试药剂：实施例1所得 WF01菌剂，活菌数含量为5×10

试验方法：共设如下三个处理，每处理3个重复，每重复120株番茄。

处理1： WF01菌剂1.5公斤/亩。移栽时，将菌剂溶于100公斤左右的水中，混匀后将番茄根部在药水中浸泡10分钟左右，然后移栽。

处理2：10%噻唑膦颗粒剂2公斤/亩。整地时，将颗粒剂均匀撒施于土面上，并用翻耕机将其混入土壤中。

处理3：不施用任何杀线虫药剂的空白对照。

调查和统计方法：移栽180天后调查植株根瘤病级指数（0级：无根瘤；1级：1-20%的根系有根瘤；2级：21-40%的根系有根瘤；3级：41-60%的根系有根瘤；4级：61-80%的根系有根瘤；5级：81-100%的根系有根瘤），并按以下公式计算病情指数和防效：

病情指数(%) = (n

防效（%）=100(1-x/y)，x、y分别代表处理和空白对照的病情指数。

试验结果：表1显示每亩施用1.5公斤 WF01菌剂对番茄根结线虫的防效高达70.36%，与每亩施用2公斤10%噻唑膦颗粒剂的防效相当(72.52%)。

表1.WF01菌剂对番茄根结线虫的防效

表1.WF01菌剂对番茄根结线虫的防效

2.WF01菌剂防治黄瓜根结线虫的田间试验

试验地点：云南省玉溪市化念镇蔬菜大棚。

试验作物：黄瓜（品种：中农203）。

供试药剂：实施例2所得 WF01菌剂，活菌数含量为1.0×10

试验方法：共设如下三个处理，每处理3个重复，每重复120株黄瓜。

处理1： WF01菌剂2公斤/亩。将菌剂溶于100公斤左右的水中，混匀后将番茄根部在药水中浸泡10分钟左右，然后移栽。

处理2：10%噻唑膦颗粒剂2公斤/亩。整地时，将颗粒剂均匀撒施于土面上，并用翻耕机将其混入土壤中。

处理3：不施用任何杀线虫药剂的空白对照。

调查和统计方法：移栽180天后调查植株根瘤病级指数（0级：无根瘤；1级：1-20%的根系有根瘤；2级：21-40%的根系有根瘤；3级：41-60%的根系有根瘤；4级：61-80%的根系有根瘤；5级：81-100%的根系有根瘤），并按以下公式计算病情指数和防效：

病情指数(%) = (n

防效（%）=100(1-x/y)，x、y分别代表处理和空白对照的病情指数。

试验结果：表2显示每亩施用2公斤 WF01菌剂对黄瓜根结线虫病的防效高达75.55%，与每亩施用2公斤10%噻唑膦颗粒剂的防效相当(76%)。

表2.WF01菌剂对黄瓜根结线虫的防效

3.WF01菌剂防治烟草根结线虫的田间试验

试验地点：云南省玉溪市峨山县。

试验作物：烟草（品种：K326）。

供试药剂：实施例3所得 WF01菌剂，活菌数含量为2.5×10

试验方法：共设如下三个处理，每处理3个重复，每重复60株。

处理1： WF01菌剂1.5公斤/亩。将菌剂溶于100公斤左右的水中，混匀后将番茄根部在药水中浸泡10分钟左右，然后移栽。

处理2：穴施10%噻唑膦颗粒剂，2.5克/株。

处理3：不施用任何杀线虫药剂的空白对照。

调查和统计方法：120天后调查植株根瘤病级指数（0级：无根瘤；1级：1-20%的根系有根瘤；2级：21-40%的根系有根瘤；3级：41-60%的根系有根瘤；4级：61-80%的根系有根瘤；5级：81-100%的根系有根瘤），并按以下公式计算病情指数和防效：

病情指数(%) = (n

防效（%）=100(1-x/y)，x、y分别处理和对照的病情指数。

试验结果：表3显示亩施用1.5公斤的 WF01菌剂，对烟草根结线虫的防效高达75.76%，稍低于每亩施用2公斤10%噻唑膦颗粒剂的防效相（78.1%）。

表3.WF01菌剂对烟草根结线虫的防效

实际应用表明：利用 WF01菌株制备的菌剂，在有效活菌数含量1×10