一种双(4-(十八烷氧基)苯基)甲醇的液相色谱分析方法

技术领域

本发明属于色谱分析领域，具体涉及一种双(4-(十八烷氧基)苯基)甲醇的液相色谱分析方法。

背景技术

多肽是α-氨基酸以肽键连接在一起而形成的化合物，它也是蛋白质水解的中间产物。人体很多活性物质都是以多肽的形式存在的，多肽涉及人体的激素、神经、细胞生长和生殖各领域，其重要性在于调节体内各个系统和细胞的生理功能，激活体内有关酶系，促进中间代谢膜的通透性，或通过控制DNA转录或影响特异的蛋白合成，最终产生特定的生理效应，因此，多肽对人的细胞活性和功能活动十分重要。但现代人因各种因素使人体中的多肽流失、损失，合成多肽的能力大大减弱，因此现代人体缺乏多肽，必须补充人工合成多肽。

双(4-(十八烷氧基)苯基)甲醇(TAGC)是一种液相载体材料，主要用于多肽合成，是多肽合成的关键起始物料，TAGC的质量会直接影响多肽产物的质量，因此需要对TAGC进行严格的质量检测和合成监控。但是，现有技术并未公开TAGC的检测方法。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种双(4-(十八烷氧基)苯基)甲醇的检测方法，能够对双(4-(十八烷氧基)苯基)甲醇进行准确检测。

为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种双(4-(十八烷氧基)苯基)甲醇(TAGC)的检测方法，使用液相色谱法对含TAGC的产品进行检测，其流动相组成为：四氢呋喃-乙腈混合溶液和甲酸水溶液。

优选的，所述检测过程中采用梯度洗脱。

优选的，所述梯度洗脱程序如下：

优选的，所述四氢呋喃-乙腈混合溶液中的四氢呋喃：乙腈的体积比为3～5:1。

优选的，所述甲酸水溶液中甲酸的体积浓度为0.1～0.3％。

优选的，所述检测过程中，所用色谱柱的固定相为C18、C8、C16或C30。

优选的，所述检测过程中，所用色谱柱的柱温为25～35℃。

优选的，所述检测过程中，还包括：对含TAGC的产品进行预处理。

优选的，上述预处理为采用稀释剂对含TAGC的产品进行稀释。

优选的，所述流动相的流速为0.8～1.2mL/min。

优选的，所述检测采用紫外检测器，检测波长为230～240nm。

本发明提供了一种TAGC的检测方法，以四氢呋喃-乙腈混合溶液和甲酸水溶液为流动相，使用液相色谱法对含TAGC的产品进行检测，检测结果准确。实验结果表明，本发明提供的TAGC的检测方法系统适用性良好，专属性强，精密度好及灵敏度高。

附图说明

图1为以四氢呋喃-乙腈为有机相，检测TAGC的色谱图；

图2为以四氢呋喃-乙腈为有机相，检测TAGC粗品的色谱图；

图3为以乙腈为有机相，检测TAGC的色谱图；

图4为以四氢呋喃为有机相，检测TAGC的色谱图；

图5为本发明提供的TAGC的检测方法的专属性检测图谱；

图6为本发明提供的TAGC的检测方法的灵敏度检测图谱。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供了一种双(4-(十八烷氧基)苯基)甲醇(TAGC)的检测方法，使用液相色谱法对含TAGC的产品进行检测，其流动相组成为：四氢呋喃-乙腈混合溶液和甲酸水溶液。

TAGC是一种液相载体材料，可以采用碳基标签液相合成法制备得到，通过长脂肪链的存在显著增加多肽-标签的疏水性，而这种高疏水性不受多肽链增长影响。这些碳基标签可以在诸如乙腈或甲醇的极性溶剂中沉淀，为中间体在氨基酸缩合和Fmoc去保护的分离提取提供了基础。本发明所述的含TAGC的产品可以是合成TAGC过程中的产物、中间产物或原料，本发明对含TAGC的产品的来源没有特殊限制。

称取含TAGC的产品作为待测样品，在一些可能的实现方式中，用稀释剂对待测样品进行稀释，稀释剂优选为四氢呋喃-二氯甲烷混合溶剂，加入稀释剂后进行超声处理，超声1～5min，优选为1～2min，超声完成后，用稀释剂进行定容，摇匀，得到待测样品溶液。在一些可能的实现方式中，将待测样品溶液进行过滤，优选使用有机相滤膜进行过滤，滤膜的规格为0.22～0.65μm，优选为0.45μm，过滤后得到待测样品的滤液。

过滤完成后，对待测样品的滤液进行液相色谱检测，液相色谱检测条件如下：

在上述液相色谱检测中，所用色谱柱的固定相为C18、C8、C16或C30，优选为C18，色谱柱的规格可以为4.6×250mm×5μm、2.1×250mm×5μm或10×250mm×5μm，优选为4.6×250mm×5μm，色谱柱的柱温为25～35℃，优选为30℃，本发明对色谱柱及其固定相的来源没有特殊限制，可以在市场上购买。

流动相包括有机相和水相，有机相为四氢呋喃-乙腈混合溶液，四氢呋喃：乙腈的体积比为3～5:1，优选为4:1，水相为甲酸水溶液，甲酸的体积浓度为0.1～0.3％，优选为0.1％，流动相的流速为0.8～1.2mL/min，优选为1.0mL/min。

在所述液相色谱检测中，采用梯度洗脱，梯度洗脱程序如下：

在所述液相色谱检测中，进样量为3～8μL，优选为5μL，液相色谱检测中所用的检测器为紫外检测器，检测波长为230～240nm，优选为235nm。

将上述待测样品的滤液采用上述色谱检测条件进行检测，通过面积归一化法进行计算，即可得到待测样品中TAGC的纯度。

本发明还对提供的TAGC的检测方法进行了方法学考察，包括系统适用性考察、专属性考察、精密度考察和灵敏度考察。

本发明提供了一种TAGC的检测方法，以四氢呋喃-乙腈混合溶液和甲酸水溶液为流动相，通过使用四氢呋喃-乙腈混合溶液作为有机相，增加了流动相对TAGC的洗脱能力，检测结果准确。另外，对本发明提供的TAGC检测方法进行方法学考察，实验结果表明，本发明提供的TAGC的检测方法系统适用性良好、专属性强、精密度好且灵敏度高。

实施例1：

(1)样品制备

以碳基标签液相合成法合成TAGC过程中的产物为待测样品，准确称取25mg待测样品，置于25mL容量瓶中，加入适量稀释剂(四氢呋喃-二氯甲烷混合溶剂)稀释待测样品后，超声溶解1～2min，用稀释剂定容，摇匀。取适量样品溶液，用0.45μm有机相滤膜过滤，得到待测样品滤液供检测。

(2)液相色谱检测条件

色谱柱采用Thermo hypersil GOLD(4.6×250mm×5μm)，流动相为80％的四氢呋喃-乙腈溶液和0.1％的甲酸水溶液，梯度洗脱程序为：

流动相的流速为1.0mL/min，色谱柱温度为30℃，检测波长为235nm，进样量为5.0μL。

(3)样品检测

采用步骤(2)中所述色谱检测条件对步骤(1)得到的待测样品滤液进行检测，得到如图1所示的色谱图，图1中的色谱峰及其出峰时间见表1。由图1和表1可知，采用四氢呋喃-乙腈混合溶液作为有机相，流动相能够将TAGC成功洗脱。采用面积归一化法进行计算，得到所述待测样品中所含TAGC的纯度为97.0％。

表1

实施例2

(1)样品制备

以碳基标签液相合成法合成TAGC过程中的中间产物为待测样品，准确称取25mg样品，置于25mL容量瓶中，加入适量稀释剂(四氢呋喃-二氯甲烷混合溶剂)分散待测样品后，超声溶解1～2min，用稀释剂定容，摇匀。取适量样品溶液，0.45μm有机相滤膜过滤，得到待测样品滤液供检测。

(2)仪器色谱条件

色谱柱采用Thermo hypersil GOLD(4.6×250mm×5μm)，流动相为80％的四氢呋喃-乙腈溶液和0.1％的甲酸-水体系，梯度洗脱程序为：

流动相的流速为1.0mL/min，色谱柱温度为30℃，检测波长为235nm，进样量为5.0μL。

(3)样品检测

采用步骤(2)中所述色谱检测条件对步骤(1)得到的待测样品滤液进行检测，得到如图2所示的色谱图，图2中的色谱峰及其出峰时间见表2。由图2和表2可知，采用四氢呋喃-乙腈混合溶液作为有机相，TAGC与C1(中间合成体)能够达到基线分离。通过面积归一化法进行计算，得到所述待测样品中所含TAGC的纯度为88.6％。

表2

对比例1

以实施例1的检测方法对实施例1中的待测样品进行检测，但是有机相由四氢呋喃-乙腈混合溶液改为乙腈，检测结果见图3，由图3可知，当采用乙腈为有机相，TAGC产物无法被洗脱出来。

对比例2

以实施例1的检测方法对实施例1中的待测样品进行检测，但是有机相由四氢呋喃-乙腈混合溶液改为四氢呋喃，检测结果见图4，由图4可知，当采用四氢呋喃为有机相时，TAGC与C

实施例3

对本发明提供的TAGC的液相色谱检测方法进行了方法学考察。

(1)系统适用性考察

取同一批以碳基标签液相合成法合成的TAGC的产物作为待测样品，配制1份待测溶液，以实施例1中提供的液相色谱检测方法连续进样6针，计算结果如表3所示。由表3可知，对峰面积进行检测，实验结果的相对标准偏差较小，表明本发明提供的TAGC的检测方法系统适用性好。

表3

(2)精密度考察

取同一批以碳基标签液相合成法合成的TAGC的产物作为样品，配制6份供试品溶液，以实施例1中提供的检测方法每个样品分别进样1针，计算结果如表4所示。由表4可知，对纯度进行检测，检测结果的相对标准偏差较小，表明本发明提供的TAGC的检测方法的精密度好。

表4

(3)专属性考察

配制以碳基标签液相合成法合成TAGC过程中的产物和中间产物的混合溶液，以实施例1中提供的检测方法进行分析，分离度大于2.0，色谱图如图5所示，图5中的色谱峰及其出峰时间见表5。由图5和表5可知，TAGC与C

表5

(4)灵敏度考察

采用逐级稀释的方法，以实施例1中提供的检测方法，对不同浓度的TAGC溶液进行分析，在信噪比不小于10的情况下，测得最低定量检测浓度仅为0.1mg/g，表明本发明提供的TAGC的检测方法灵敏度好。色谱图如图6所示。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。