IGFBP1基因或CHAF1A基因在作为胃腺癌预后分子标志物中的应用

技术领域

本发明涉及基因技术和医学领域，特别是涉及IGFBP1基因或CHAF1A基因在作为胃腺癌预后分子标志物中的应用。

背景技术

胃癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一。尽管胃癌的治疗在过去几十年中取得了许多进展，但大多数胃癌的抗肿瘤都表现出强烈的治疗抗性

在胃癌中，胃腺癌是最常见的组织学类型(约95％)，临床指南阐述了不同临床病理分期的胃腺癌治疗策略和结果的差异性

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了IGFBP1基因或CHAF1A基因在作为胃腺癌预后分子标志物中的应用，为胃腺癌患者的精准治疗及病人预后预测研究提供新的思路。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明提供了IGFBP1基因或CHAF1A基因在作为胃腺癌预后分子标志物中的应用。

优选的，所述IGFBP1基因作为早期胃腺癌预后分子标志物，CHAF1A基因作为进展期胃腺癌预后的分子标志物。

本发明还提供了一种筛选胃腺癌预后分子标志物的方法，包括以下步骤：

1)数据准备和DEG识别：从TCGA数据库(癌症基因组图谱)下载407个胃腺癌总样本的mRNA表达和临床数据(http://portal.gdc.cancer.gov/)包括32个癌旁和375个肿瘤样本，早期和进展期胃腺癌的mRNA表达和临床数据被分为两个独立的数据集，早期胃腺癌样本包括21个癌旁和164个肿瘤样本，进展期胃腺癌样本包括10个癌旁样本和188个肿瘤样本，这两个数据集是从407个样本中删除24个无临床分期信息的胃腺癌样本后所获得的；

2)基于整体、早期和进展期胃腺癌样本三组胃腺癌样本，根据截止标准P adj<0.05，|log2FC|>1，使用edgeR R语言包分析基因表达谱，识别差异表达基因DEG，并生成这三个数据集DEG可视化火山图；

3)单变量COX回归分析：采用R软件的生存包对总体、早期和进展期胃腺癌组的差异表达基因DEG进行单变量COX比例风险回归评估，根据标准P<0.05，获得了与不同分期患者的总体生存相关mRNA，得到mRNAs-OS，这与胃腺癌患者的生存和预后有关；

4)PPI网络构建和候选关键mRNA识别：利用蛋白互作网络检索工具分析mRNAs-OS之间的相互作用，获得了蛋白质相互作用数据，选择最小所需相互作用得分≥0.400的蛋白质构建蛋白质-蛋白质相互作用网络，将PPI网络及其互作评分导入Cytoscape软件，并使用CytoHubba识别潜在的关键mRNA，每个分期节点度前40个候选核心mRNAs-OS被筛选出用于进一步分析；

5)建立三个COX比例风险回归模型：基于已确定的核心mRNAs-OS，利用R的“surminer”包，进行多变量COX比例风险回归分析以构建预后模型，随后分别为总体、早期和进展期胃腺癌分别构建了一个由与患者预后相关的mRNAs-OS构成的预后模型，其中，P<0.05的mRNA-PRO被认为是胃腺癌的独立预后因素，根据mRNA-PRO的表达，根据模型公式每个患者的风险评分计算如下：风险评分＝Exp(mRNA1)×β1+Exp(mRNA2)×β2+Exp(mRNA3)×β3+…+Exp(mRNAn)×βn，根据中位风险评分，将胃腺癌患者分为高风险组和低风险组，分别计算高风险和低风险患者的5年生存率，绘制风险评分曲线，以区分两组患者的风险评分差异，绘制生存状态图、风险热图、生存曲线，由此分别建立起三个分期的预后模型，绘制出通过模型曲线下面积表示的ROC曲线以评价其预测各分期患者预后的准确性和可靠性；

6)实时定量聚合酶链反应和免疫组化染色：30对cDNA组织芯片，84对组织微阵列，

采用QPCR方法检测胃腺癌样品和匹配的癌旁组织中IGFBP1和CHAF1A的表达水平；

根据标准程序，由两名独立病理医师以盲法对84例癌症和84例匹配的癌旁组织进行免疫组织化学分析，基于阳性染色细胞的比例和染色强度，半定量地分析IGFBP1和CHAF1A的表达水平。

优选的，扩增所述IGFBP1基因使用的引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

优选的，扩增所述CHAF1A基因使用的引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

本发明的有益效果为：

本发明将胃腺癌mRNA表达及临床数据分为早期和进展期组，并进行生物信息学分析，分别得到与早期(包括9个mRNA，其中包括IGFBP1)和进展期(包括14个mRNA，其中包括CHAF1A)胃腺癌相关的mRNA预后模型，两个预后模型的AUC值均较高，分别为0.87和0.92，表明这两个预后模型都可以准确预测胃腺癌患者的预后。通过QPCR和IHC确立了IGFBP1和CHAF1A可分别作为早期和进展期的代表性靶向标志物。这些基因标志物，尤其是IGFBP1和CHAF1A，在成为不同分为胃腺癌的精准治疗靶点和预后标志物方面具有很大的潜力。本发明的研究方法和结果从而有助于识别有风险的胃腺癌患者，指导有针对性的有效治疗，并可能促进新药的开发，提高胃腺癌的精准医疗水平。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为本发明的分析程序；

图2为DEG的火山图，(A)总体分期胃腺癌组的DEG，(B)早期胃腺癌组的DEG，(C)进展期胃腺癌组的DEG，横坐标表示胃腺癌样品和癌旁样品之间差异表达倍数变化的log2转换值，纵坐标表示FDR值的-log10转换值，虚线右侧的浅灰色点表示显著下调的mRNA，虚线左侧的深灰色点代表显著上调的mRNA，黑色点表示无显著差异表达的mRNA；

图3为总体分期、早期和进展期胃腺癌的交集DEG和mRNAs-OS的韦恩图，显示了交集DEG(A)或交集mRNAs-OS(B)的韦恩图，圆圈上的术语表示胃腺癌不同分期的DEG或mRNAs-OS组；

图4为三个预测模型的构建，该图(3个子图)的左上角、左下角和右下角分别表示胃腺癌总样本组(A、B和C)、早期分期组(D、E和F)中的胃腺癌样本和进展分期组(G、H和I)中的胃腺癌样本，每个子图的自上而下是低风险组和高风险组之间的风险评分曲线、生存状态图和表达热图，(A、D和G)颜色条表示mRNAs-PRO相对表达值水平，深灰色表示高表达，浅灰色表示低表达。(B、E和H)低风险和高风险人群的生存曲线，(C、E和I)预测生存的ROC曲线；

图5为通过QPCR和免疫组织化学(IHC)，分别评估CHAF1A和IGFBP1在胃腺癌和正常样本中的mRNA和蛋白表达水平。

具体实施方式

本发明提供了IGFBP1基因或CHAF1A基因在作为胃腺癌预后分子标志物中的应用。

在本发明中，所述IGFBP1基因优选作为早期胃腺癌预后分子标志物。在本发明中，扩增所述IGFBP1基因使用的引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示，具体如下：

SEQ ID No.1：5'-GCATTTCTGCTCTTCCAAAG-3'；

SEQ ID No.2：5'-GCAACATCACCACAGGTAG-3'。

在本发明中，所述CHAF1A基因优选作为进展期胃腺癌预后分子标志物。在本发明中，扩增所述CHAF1A基因使用的引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，具体如下：

SEQ ID No.3：5'-AAAGGAGCAGGACAGTTGGA-3’；

SEQ ID No.4：5'-CTGGAAGGGACTTGATTTGC-3’。

本发明还提供了一种筛选胃腺癌预后分子标志物的方法，包括以下步骤：

1)数据准备和DEG识别：从TCGA数据库(癌症基因组图谱)下载407个胃腺癌总样本的mRNA表达和临床数据(http://portal.gdc.cancer.gov/)包括32例癌旁和375例肿瘤样本，早期和进展期胃腺癌的mRNA表达和临床数据被分为两个独立的数据集，早期胃腺癌样本包括21个癌旁和164个肿瘤样本，进展期胃腺癌样本包个癌旁样本和188个肿瘤样本，这两个数据集是从407个样本中删除24个无临床分期信息的胃腺癌样本后所获得的；

2)基于整体、早期和进展期胃腺癌样本三组胃腺癌样本，根据截止标准P adj<0.05，|log2FC|>1，使用edgeR R语言包分析基因表达谱，识别差异表达基因DEG，并生成这三个数据集DEG可视化火山图；

3)单变量COX回归分析：采用R软件的生存包对总体、早期和进展期胃腺癌组的差异表达基因DEG进行单变量COX比例风险回归评估，根据标准P<0.05，获得了与不同分期患者的总体生存相关mRNA，得到mRNAs-OS，这与胃腺癌患者的生存和预后有关；

4)PPI网络构建和候选关键mRNA识别：利用蛋白互作网络检索工具分析mRNAs-OS之间的相互作用，获得了蛋白质相互作用数据，选择最小所需相互作用得分≥0.400的蛋白质构建蛋白质-蛋白质相互作用网络，将PPI网络及其互作评分导入Cytoscape软件，并使用CytoHubba识别潜在的关键mRNA，每个分期节点度前40个候选核心mRNAs-OS被筛选出用于进一步分析；

5)建立三个COX比例风险回归模型：基于已确定的核心mRNAs-OS，利用R的“surminer”包，进行多变量COX比例风险回归分析以构建预后模型，随后分别为总体、早期和进展期胃腺癌分别构建了一个由与患者预后相关的mRNAs-OS构成的预后模型，其中，P<0.05的mRNA-PRO被认为是胃腺癌的独立预后因素，根据mRNA-PRO的表达，根据模型公式每个患者的风险评分计算如下：风险评分＝Exp(mRNA1)×β1+Exp(mRNA2)×β2+Exp(mRNA3)×β3+…+Exp(mRNAn)×βn，根据中位风险评分，将胃腺癌患者分为高风险组和低风险组，分别计算高风险和低风险患者的5年生存率，绘制风险评分曲线，以区分两组患者的风险评分差异，绘制生存状态图、风险热图、生存曲线，由此分别建立起三个分期的预后模型，绘制出通过模型曲线下面积表示的ROC曲线以评价其预测各分期患者预后的准确性和可靠性；

6)实时定量聚合酶链反应和免疫组化染色：30对cDNA组织芯片，84对组织微阵列，

采用QPCR方法检测胃腺癌样品和匹配的癌旁组织中IGFBP1和CHAF1A的表达水平；

根据标准程序，由两名独立病理医师以盲法对84例癌症和84例匹配的癌旁组织进行免疫组织化学分析，基于阳性染色细胞的比例和染色强度，半定量地分析IGFBP1和CHAF1A的表达水平。

为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明:进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

早期和进展期胃腺癌预后分子标志物的确立。

1)数据准备和DEG识别：从TCGA(癌症基因组图谱)数据库下载407个胃腺癌总样本的mRNA表达和临床数据(http://portal.gdc.cancer.gov/)包括32个癌旁和375个肿瘤样本。早期(I期和II期)和进展期(III期和IV期)胃腺癌的mRNA表达和临床数据被分为两个独立的数据集。早期胃腺癌样本包括21个癌旁和164个肿瘤样本，而进展期胃腺癌样本则包括10个癌旁样本和188个肿瘤样本。这两个数据集是从407个样本中删除24个无临床分期信息的胃腺癌样本后所获得的。所有这些胃腺癌样本的数据均于2021年3月下载。基于整体、早期和进展期胃腺癌样本三组胃腺癌样本，根据截止标准Padj<0.05(校正P值考虑了错误发现率(FDR))，|log2FC|>1，使用edgeRR语言包(版本4.0.2)分析基因表达谱，识别差异表达基因(DEG)。并生成这三个数据集DEG可视化火山图。

2)单变量COX回归分析：采用R软件的生存包对总体、早期和进展期胃腺癌组的DEG进行单变量COX比例风险回归评估。根据标准P<0.05，获得了与不同分期患者的总体生存相关mRNA(mRNAs-OS)，这与胃腺癌患者的生存和预后有关。

3)PPI网络构建和候选关键mRNA识别：为了进一步识别三个胃腺癌分期中的所有关键mRNAs-OS，利用蛋白互作网络检索工具(http://string-db.org)分析mRNAs-OS之间的相互作用，获得了蛋白质相互作用数据。选择最小所需相互作用得分≥0.400的蛋白质构建蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络，并隐藏网络中断的节点。然后将PPI网络及其互作评分导入Cytoscape软件(Version3.6.1,https://cytoscape.org/)，并使用CytoHubba(Cytoscape软件中的插件)识别潜在的关键mRNA。每个分期节点度前40个候选核心mRNA-OS被筛选出用于进一步分析。

4)建立三个COX比例风险回归模型：基于已确定的核心mRNAs-OS，利用R的“surminer”包，进行多变量COX比例风险回归分析以构建预后模型。随后分别为总体、早期和进展期胃腺癌分别构建了一个由与患者预后相关的mRNAs-OS(mRNAs-PRO)构成的预后模型。其中，P<0.05的mRNA-PRO被认为是胃腺癌的独立预后因素。根据mRNA-PRO的表达，根据模型公式每个患者的风险评分计算如下：风险评分＝Exp(mRNA1)×β1+Exp(mRNA2)×β2+Exp(mRNA3)×β3+…+Exp(mRNAn)×βn。根据中位风险评分，将胃腺癌患者分为高风险组和低风险组，分别计算高风险和低风险患者的5年生存率。绘制风险评分曲线，以区分两组患者的风险评分差异。绘制生存状态图以显示每个患者的生存状态。绘制热图以显示高风险组和低风险组患者中mRNA-PRO表达水平的差异。绘制生存曲线被用于显示高风险组和低风险组患者的5年生存率。绘制出通过模型曲线下面积(AUC)表示的ROC曲线以评价其预测各分期患者预后的准确性和可靠性

5)实时定量聚合酶链反应(QPCR)和免疫组化染色(IHC)：30对cDNA组织芯片(包括13组早期配对和17组进展期配对)，84对组织微阵列(包括32组早期配对和52组进展期配对)，这些配对的胃腺癌和正常样本的相关临床病理信息由上海奥特渡生物科技有限公司(上海)提供。根据美国癌症联合委员会(AJCC)标准，所有患者均经病理诊断为胃腺癌。样本是在获得书面同意后，根据上海奥多生物科技有限公司生物库机构审查委员会批准的既定方案获得的。

采用QPCR方法检测胃腺癌样品和匹配的癌旁组织中IGFBP1和CHAF1A的表达水平(详细临床数据见表1)，GAPDH作为参考基因。通过Trizol试剂(Sigma，美国)从组织和细胞中提取总RNA。根据制造商的方案，通过使用PrimeScriptTM RT Master Mix(Perfect RealTime)(Takara，日本)逆转录RNA获得cDNA。根据制造商的方案，通过ChamQ Universal SYBRqPCR Mas ter Mix(Vazyme，南京，中国)的方案测定IGFBP1和CHAF1A的表达。本发名中使用的引物如下：IGFBP1，正向：5'-GCATTTCTGCTCTTCCAAAG-3'，反向：5'-GCAACATCACCACAGGTAG-3'；CHAF1A，正向：5'-AAAGGAGCAG GACAGTTGGA-3’，反向：5'-CTGGAAGGGACTTGATTTGC-3’。

表1胃腺癌患者QPCR检测的基线特征结果

根据标准程序，由两名独立病理医师以盲法对84例癌症和84例匹配的癌旁组织进行免疫组织化学分析(详细临床数据见表2)。基于阳性染色细胞的比例和染色强度，半定量地分析IGFBP1和CHAF1A的表达水平(Proteintech，中国)。使用半定量标准进行比例评估：0，(无染色)；1，微弱(<10％)；2，中度(10–50％)；3，弥漫性(>50％)染色细胞。染色强度也评分为0(阴性)；+1(弱)；+2(中度)；和+3(强)。总的来说，由比例和染色强度组成，每个病例的最终表达得分为0+(0)，阴性；1+(1或2)，弱阳性；2+(3或4)，中度阳性；3+(5或6)，强阳性。使用软件包(SPSS，19.0版，芝加哥，伊利诺伊州，美国)进行统计分析。使用Person卡方检验和似然比检验分析代表基因的临床病理特征和表达数据。P<0.05被认为具有统计学意义。

表2基于IHC检测的IGFBP1、CHAF1A表达水平与胃腺癌患者临床病理因素的关系统计学分析采用Pearson的χ2检验和似然比检验

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差异表达分析结果

从总体分期胃腺癌中共识别出4627个DEG，由2445个上调mRNA和2182个下调mRNA组成(图2中A和表3)。此外，在早期胃腺癌中识别出4715个DEG，其中2542个DEG显著上调，2173个DEG明显下调(图2中B和表3)。从进展期胃腺癌中检测到3465个DEG，由1493个DEG上调的mRNA和1972个下调的mRNA组成(图2中C和表3)。

表3总体分期、早期和进展期胃腺癌差异表达基因(部分内容如下)

对总体分期和早期、总体分期和进展期以及早期和进展期胃腺癌DEG取交集，分别得到4059、2850和2540个交集DEG。在胃腺癌三个分期中均有显著差异表达的交集DEG有2526个(图3中A，表4)。有趣的是，包括SCGB3A1、SRARP、MUC5B、GABRB1、CNMD和KRT27在内的6个mRNA均在早期胃腺癌中上调，在进展期胃腺癌中表达下调，而当纳入总体分期胃腺癌样本时，这些mRNA却没有显著差异(表4)。

表4三个分期的交集差异基因(部分内容如下)

DEG的Cox比例风险回归模型

单变量COX回归分析确定了总体分期、早期和进展期胃腺癌的504、430和193个mRNA-OS(表5)。交集分析显示，总体分期和早期胃腺癌、总体分期和进展期胃腺癌以及早期和进展期胃腺癌之间分别存在168、104和15个交集mRNA-OS(图3中B和表6)。此外，在所有三个分期的胃腺癌中交集mRNAs-OS后，共获得了14个交集基因(图3中B和表6)。此外，CytoHubba插件分析分别从总体分期、早期和进展期胃腺癌的中选择了40个候选的核心mRNA-OS(表7)。

表5三个分期的单因素风险比例回归分析(部分内容如下)

表6三个分期的总体生存相关基因(mRNA-OS)交集结果(部分内容如下)

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表7总体分期、早期和进展期排名前40的关键候选基因(部分内容如下)

进一步多因素COX分析分别为这三个分期组构建了由7、9和14个mRNAs-PRO的三个预后模型(图4和表8)。通过模型公式计算每个分期基于mRNAs-PRO的生存风险评分，并根据患者的中位风险评分将患者分为低风险组和高风险组。如图4中A、4中D和4中G所示，分别绘制了基于总体分期、早期和进展期胃腺癌的7、9和14mRNA的预后模型的低风险组和高风险组之间的表达热图、风险评分曲线和生存状态图。总体分期、早期和进展期胃腺癌的高风险组和低风险组的Kaplan-Meier生存曲线如图4中B、4中E和4中H所示。ROC曲线的AUC值分别为0.73、0.87和0.92，表明这些模型能够可靠地准确预测胃腺癌患者的预后(图4中C、4中F和4中I)。

表8总体分期、早期和进展期胃腺癌患者的多因素风险比例回归分析

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胃腺癌样品中IGFBP1和CHAF1A的QPCR和免疫组织化学(IHC)

通过QPCR分别评估了总体分期、早期和进展期胃腺癌和匹配的癌旁组织中IGFBP1和CHAF1A的相对mRNA水平(图5中A)。结果显示，与匹配的正常组织相比，早期胃腺癌中IGFBP 1的mRNA水平显著升高(P＝0.018，图5中A)，这与生物信息学发现相符。与匹配的正常组织相比，CHAF1A在进展期胃腺癌中的mRNA水平显著升高(P＝0.002，图5中A)，这与预期分析一致。因此，IGFBP1 mRNA可以作为早期胃腺癌的预测因子，而CHAF1A可以作为进展期胃腺癌的生物标志物。

此外，图5中B显示了IGFBP1和CHAF1A在蛋白水平的代表性IHC染色。图5中C显示，对比配对的癌旁正常组织，两个代表性靶点在胃腺癌患者癌组织中表现出细胞质免疫反应性。

IGFBP1在早期胃腺癌样本中表现出比配对的正常组织更强的染色(P＝0.022，图5中C)。对于CHAF1A，在总体分期、早期、尤其是进展期胃腺癌样本中表现出比配对的正常组织更强的染色(所有P<0.001，图5中C)。免疫组化结果显示这两个代表性靶点的蛋白水平与QPCR结果基本吻合，并与计算结果一致。因此，IGFBP1可以作为早期胃腺癌的生物标志物，而CHAF1A可以作为进展期胃腺癌的生物标志物。

在胃癌中，胃腺癌是最常见的组织学类型(约95％)，临床指南阐述了不同临床病理分期胃腺癌治疗策略和结果的差异性

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尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。