一类高度支化聚（β-氨基酯）及其制备方法和在功能性DNA递送中的应用

技术领域

本发明属于生物医用材料领域，涉及一类高度支化聚(β-氨基酯)及其制备方法和在功能性DNA递送中的应用。

背景技术

隐性营养不良性大疱性表皮松解症(RDEB)是一种严重的遗传性皮肤疾病，其致病根源在于编码胶原VII(C7)蛋白的基因发生突变，造成皮肤真皮和表皮之间无法有效锚定，导致患者的皮肤极度脆弱，易产生水泡或溃烂，最终发展为皮肤癌。基于RDEB的致病机理，在C7蛋白相关效应细胞中和组织中介导高效的C7蛋白表达是目前最希望的治疗方法。然而，由于COL7A1基因片段分子尺寸较大，这严重限制COL7A1 DNA在递送过程中的有效压缩和细胞摄取。

目前，阳离子聚合物载体作为最具潜力的基因递送载体，已表现出优异的DNA递送性能，往往只针对编码绿色荧光蛋白(GFP)DNA、荧光素酶(Gluc)DNA和尺寸较小的DNA。常用的阳离子聚合物如聚乙烯亚胺和聚酰胺由于其降解性能差导致较高的细胞毒性，其临床安全性备受质疑。

聚(β-氨基酯)由于原料广泛易得、易于合成、化学组成和结构易于调控、可生物降解的特性，在成纤维细胞、角质形成细胞、癌细胞、干细胞、星型胶质细胞及原代细胞等各种组织细胞中表现出优异的绿色荧光蛋白和荧光素酶(Gluc)表达效率，但在功能性DNA递送方面的研究较少，这明显限制了其在基因治疗临床转化方的应用。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一类高度支化聚(β-氨基酯)及其制备方法和在功能性DNA递送中的应用，实现功能性DNA的递送。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明公开了一类高度支化聚(β-氨基酯)，所述高度支化聚(β-氨基酯)的结构式如下：

式中，n＝15～100，m＝15～100。

优选地，所述高度支化聚(β-氨基酯)的分子量为8000～50000Da。

本发明还公开了上述一类高度支化聚(β-氨基酯)的制备方法，将4-氨基-1-丁醇单体、丙烯酸酯单体与支化小分子有机胺通过迈克尔加成反应，制得带双键的高度支化聚(β-氨基酯)；带双键的高度支化聚(β-氨基酯)与封端剂反应，得到高度支化聚(β-氨基酯)。

优选地，所述丙烯酸酯单体为1,4-丁二醇二丙烯酸酯；所述支化小分子有机胺为1,2-乙二胺、1,3-丙二胺、1,4-丙二胺、1,5-戊二胺、1,6-己二胺、1,4-双(3-氨基丙基)哌嗪或双(3-氨基丙基)胺。

优选地，所述封端剂为3-吗啉丙胺、1-(3-氨丙基)-4-甲基哌嗪或3,6,9-三氧杂十一烷-1,11-二胺。

优选地，4-氨基-1-丁醇单体、丙烯酸酯单体与支化小分子有机胺的摩尔比为(1～4):(0.3～1):(0.2～4)；带双键的高度支化聚(β-氨基酯)的加入量为3倍当量的封端剂。

本发明还公开了上述一类高度支化聚(β-氨基酯)在功能性DNA递送中的应用。

优选地，所述功能性DNA为编码胶原VII蛋白的DNA和编码ADAM 17蛋白的DNA。

优选地，高度支化聚(β-氨基酯)与功能性DNA的质量比为(10～200):1。

优选地，将上述高度支化聚(β-氨基酯)与功能性DNA形成的复合物纳米粒子通过微针注射后，进行功能性DNA的递送。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供的一类高度支化聚(β-氨基酯)，该高度支化聚(β-氨基酯)具有全新的化学组成、电荷密度、可生物降解、以及良好的生物相容性，与目前本领域技术中主要采用的商业化DNA转染试剂jetPEI相比，更具临床治疗RDEB的潜力。通过实验证实，在C7蛋白相关皮肤细胞和免疫缺陷鼠体内，以及采用不同方式注射高度支化聚(β-氨基酯)和COL7A1DNA的复合物纳米粒子，发现其在免疫缺陷鼠体内能够高效地介导C7蛋白表达，且分泌的C7蛋白沿着基底膜均匀分布，进而证实了制得的高度支化聚(β-氨基酯)在功能性DNA递送和基因治疗方面的应用潜力，特别是具有基因治疗RDEB的癌症临床应用潜力。此外，通过优化高度支化聚(β-氨基酯)与COL7A1 DNA的质量比，证实高度支化聚(β-氨基酯)能够高效地介导C7蛋白表达。同时，在基因缺陷鼠中，注射了高度支化聚(β-氨基酯)和ADAM 17DNA的复合物纳米粒子后，蛋白印迹和免疫组化的结果均证实高度支化聚(β-氨基酯)能够高效地介导ADAM 17蛋白过表达，进一步证实高度支化聚(β-氨基酯)与ADAM 17所形成的复合物纳米粒子具有一定的纠正基因缺陷的潜力。细胞实验和动物实验均证明，该高度支化聚(β-氨基酯)具有很好的功能性DNA递送能力。

本发明提供的一类高度支化聚(β-氨基酯)的制备方法，以4-氨基-1-丁醇单体、丙烯酸酯单体与支化小分子有机胺为原料，通过一锅法制备高度支化聚(β-氨基酯)，通过优化支化单体的种类，制备出了全新的具有可生物降解、高度支化聚(β-氨基酯)。该合成方法简单高效，所用原料便宜易得，成本低、对设备要求低，适合产业化生产。

附图说明

图1为高度支化聚(β-氨基酯)合成示意图；

图2为代表性高度支化聚(β-氨基酯)的

图3为分子量约为38000Da的高度支化聚(β-氨基酯)纯化后凝胶渗透色谱(GPC)曲线图；

图4为高度支化聚(β-氨基酯)压缩COL7A1 DNA所形成的复合物纳米粒子的微观形貌图；其中，A为分子量为38,000Da的高度支化聚(β-氨基酯)与COL7A1 DNA所形成的复合物纳米粒子在500nm下的微观形貌表征结果，B为分子量为38,000Da的高度支化聚(β-氨基酯)与COL7A1 DNA所形成的复合物纳米粒子在100nm下的微观形貌表征结果；

图5为在皮肤相关效应细胞中，高度支化聚(β-氨基酯)介导高水平的COL7A1 mRNA表达结果图；其中，A为人角质形成细胞(HaCaT)，B为正常人原代成纤维细胞(NHF)，C为原代RDEB患者原代成纤维细胞RDEBF；

图6为在皮肤相关效应细胞中，高度支化聚(β-氨基酯)介导高水平的C7蛋白表达结果图；其中，A为人角质形成细胞(HaCaT)，B为正常人原代成纤维细胞(NHF)，C为原代RDEB患者原代成纤维细胞RDEBF；

图7为通过皮下注射和微针注射两种方式，在免疫缺陷鼠体内，高度支化聚(β-氨基酯)介导高水平的COL7A1 mRNA表达结果图；

图8为蛋白印结果迹证实通过皮下注射和微针注射两种方式，在免疫缺陷鼠体内，高度支化聚(β-氨基酯)介导高水平的C7表达结果图；

图9为免疫荧光结果证实通过皮下注射和微针注射两种方式，在免疫缺陷鼠体内，高度支化聚(β-氨基酯)介导高水平的C7表达结果图；其中，A为未转染组，B为皮下注射，C为微针注射；

图10为本发明的基因缺陷鼠注射高度支化聚(β-氨基酯)与COL7A1 DNA形成的复合物纳米粒子之后的毛发生长结果图；

图11为本发明的基因缺陷鼠中，高度支化聚(β-氨基酯)在C7相关效应细胞中介导ADAM 17DNA的免疫组化结果图；

图12为本发明的基因缺陷鼠中，高度支化聚(β-氨基酯)在C7相关效应细胞中介导ADAM 17DNA的蛋白印迹结果图。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。本发明中所使用的COL7A1 DNA和ADAM 17DNA均购自于汉恒生物科技(上海)。

下面结合附图对本发明做进一步详细描述：

本发明公开的一类高度支化聚(β-氨基酯)的合成方法，合成路线参见图1，包括以下步骤：

1)将4-氨基-1-丁醇单体与小分子有机胺通过迈克尔加成反应，制得带双键的高度支化聚(β-氨基酯)；

2)通过步骤1)制备的带双键的高度支化聚(β-氨基酯)与功能化封端剂反应，制备出高度支化聚(β-氨基酯)，即HPAE。

具体地，包括以下步骤：

1)将投料摩尔比为(1～4):(0.3～1):(0.2～4)的4-氨基-1-丁醇单体、丙烯酸酯单体与支化小分子有机胺，加入装有反应溶剂二甲基亚砜或四氢呋喃的两口玻璃烧瓶中，并通过磁力搅拌使单体充分溶解，在反应过程中使用凝胶渗透色谱监测聚合物分子量，聚合物的分子量到达预设的8000Da～50000Da，终止反应，得到带双键的高度支化聚(β-氨基酯)；

其中，所使用的小分子有机胺为4-胺基-1-丁醇，其结构式如下：

所使用的丙烯酸酯单体为1,4-丁二醇二丙烯酸酯，其结构式如下：

所使用的支化小分子有机胺包括1,2-乙二胺、1,3-丙二胺、1,4-丙二胺、1,5-戊二胺、1,6-己二胺、1,4-双(3-氨基丙基)哌嗪、双(3-氨基丙基)胺，结构式如下：

2)在步骤1)得到的带双键的高度支化聚(β-氨基酯)中加入3倍当量的封端剂单体和二甲基亚砜，25℃，在单体总浓度为50～600mg/mL室温条件下反应12h～72h，再使用沉淀法对产物进行提纯，真空干燥，得到功能性高度支化聚(β-氨基酯)；

其中，所使用的封端剂单体为3-吗啉丙胺、1-(3-氨丙基)-4-甲基哌嗪或3,6,9-三氧杂十一烷-1,11-二胺，结构式如下：

实施例1

首先按照投料比1:0.2:4加入1,4-丁二醇二丙烯酸酯、1,4-双(3-氨基丙基)哌嗪和4-氨基-1-丁醇，在60℃下反应20h，得到末端为双键的高度支化聚(β-氨基酯)。然后加入3倍当量的1-(3-氨丙基)-4-甲基哌嗪，25℃下反应24h，得到功能性的高度支化聚(β-氨基酯)，核磁氢谱参见图2，分子量为38,000Da，纯化后凝胶渗透色谱(GPC)曲线参见图3，核磁氢谱呈现的特征峰和GPC曲线的积分面积均证实分子量为38,000Da的高度支化聚(β-氨基酯)被成功合成，其中，n为40，m为54。

实施例2

首先按照投料比为4:0.3:2加入4-氨基-1-丁醇、1,4-丁二醇二丙烯酸酯和1,2-乙二胺，在60℃下反应20h，得到末端为双键的高度支化聚(β-氨基酯)。然后加入3倍当量的1-(3-氨丙基)-4-甲基哌嗪，25℃下反应30h，得到功能性的高度支化聚(β-氨基酯)。

实施例3

首先按照投料比为4:0.5:3加入4-氨基-1-丁醇、1,4-丁二醇二丙烯酸酯和1,6-己二胺，在60℃下反应20h，得到末端为双键的高度支化聚(β-氨基酯)。然后加入3倍当量的3,6,9-三氧杂十一烷-1,11-二胺，25℃下反应12h，得到功能性的高度支化聚(β-氨基酯)。

实施例4

首先按照投料比为1:0.8:4加入4-氨基-1-丁醇、1,4-丁二醇二丙烯酸酯和1,3-丙二胺，在60℃下反应20h，得到末端为双键的高度支化聚(β-氨基酯)。然后加入3倍当量的3,6,9-三氧杂十一烷-1,11-二胺，25℃下反应24h，得到功能性的高度支化聚(β-氨基酯)。

实施例5

首先按照投料比为2:0.5:1加入4-氨基-1-丁醇、1,4-丁二醇二丙烯酸酯和1,4-丙二胺，在60℃下反应20h，得到末端为双键的高度支化聚(β-氨基酯)。然后加入3倍当量的3-吗啉丙胺，25℃下反应45h，得到功能性的高度支化聚(β-氨基酯)。

实施例6

首先按照投料比为4:0.6:2加入4-氨基-1-丁醇、1,4-丁二醇二丙烯酸酯和1,5-戊二胺，在60℃下反应20h，得到末端为双键的高度支化聚(β-氨基酯)。然后加入3倍当量的3-吗啉丙胺，25℃下反应72h，得到功能性的高度支化聚(β-氨基酯)。

实施例7

首先按照投料比为3:1:3加入4-氨基-1-丁醇、1,4-丁二醇二丙烯酸酯和双(3-氨基丙基)胺，在60℃下反应20h，得到末端为双键的高度支化聚(β-氨基酯)。然后加入3倍当量的1-(3-氨丙基)-4-甲基哌嗪，25℃下反应24h，得到功能性的高度支化聚(β-氨基酯)。

1.对功能性高度支化聚(β-氨基酯)压缩COL7A1 DNA所形成的复合物纳米粒子进行微观形貌测试

将功能性高度支化聚(β-氨基酯)溶液加入到COL7A1 DNA溶液中，高速涡旋20～60s，然后静置10～40min；其中，高度支化聚(β-氨基酯)与COL7A1DNA的质量比为(10～200):1，使用去离子水清洗无机盐离子，再经过冷冻干燥，最后使用透射电镜(TEM)对复合物纳米粒子的微观形貌进行观察。

具体步骤如下：

将上述实施例1合成的功能性的高度支化聚(β-氨基酯)溶液加入到2μgCOL7A1DNA溶液中，功能性的高度支化聚(β-氨基酯)与COL7A1 DNA的质量比为(30～120):1，高速涡旋15～60s，然后静置15～40min，形成复合物纳米粒子。使用去离子水洗除复合物纳米粒子溶液中的无机盐离子，同时冷冻干燥复合物纳米粒子，使用TEM对其微观形貌进行表征。表征结果参见图4，TEM结果证实，实施例1中制备的分子量为38,000Da的高度支化聚(β-氨基酯)与COL7A1 DNA形成的复合物纳米粒子粒径分布均匀，结构较为稳定，证实其优异的稳定性能。

2.在皮肤相关效应细胞中，对高度支化聚(β-氨基酯)介导COL7A1 DNA转染效率进行测试

1)细胞培养：将HaCaT细胞、原代RDEBF和原代NHF细胞以(1.0～3.0)×10

2)将功能性高度支化聚(β-氨基酯)溶液加入到COL7A1 DNA溶液中，高速涡旋20～60s，然后静置10～40min；其中，高度支化聚(β-氨基酯)与COL7A1DNA的质量比为(10～200):1。

3)转染24h～36h后，对转染的细胞进行消化，使用qPCR对高度支化聚(β-氨基酯)介导的COL7A1 mRNA转染效率进行测试。

4)转染48h～72h后，使用蛋白质印迹测试法对高度支化聚(β-氨基酯)介导的COL7A1 mRNA转染效率进行测试。

具体步骤如下：

将HaCaT细胞、原代RDEBF和原代NHF细胞以2.0×10

qPCR表征结果参见图5，从图5中可以发现，HaCaT细胞组中，COL7A1mRNA转录水平提高了60倍，NHF细胞组中，COL7A1 mRNA转录水平提高了4000多倍，RDEBF细胞组中，COL7A1mRNA转录水平提高了90000多倍，且均远高于商业化转染试剂jetPEI。这说明在HaCaT细胞、原代RDEBF和原代NHF细胞中，由于多重末端基团和三维拓扑结构，功能化的高度支化聚(β-氨基酯)能够介导高水平的COL7A1 mRNA转染，从转录水平初步证实优异的COL7A1 DNA转染效率。

在采用上述方法得到不同用量比的功能性高度支化聚(β-氨基酯)的醋酸钠缓冲溶液与COL7A1 DNA的缓冲溶液的混合液，静置45min，缓慢加入HaCaT细胞、原代RDEBF和原代NHF细胞之后，在HaCaT细胞、原代RDEBF和原代NHF细胞中继续培养72h，使用蛋白印迹对C7蛋白的表达效率进行表征。

蛋白印迹表征结果参见图6，蛋白印迹的结果表明经高度支化聚(β-氨基酯)转染的HaCaT细胞、原代RDEBF和原代NHF细胞呈现更为明显的C7蛋白条带。由于多重末端基团和三维拓扑结构，在细胞水平功能化的高度支化聚(β-氨基酯)能够介导高水平的C7蛋白转染。

3.在免疫缺陷鼠体内，对高度支化聚(β-氨基酯)介导COL7A1 DNA转染效率进行测试

在免疫缺陷鼠体内评价实施例1制备的分子量为38,000Da的高度支化聚(β-氨基酯)介导COL7A1 DNA转染性能。对免疫缺陷鼠(NOD-SCID小鼠)分别进行2次皮下注射或微针注射(每隔48h～72h进行一次注射)实施例1得到的高度支化聚(β-氨基酯)与COL7A1 DNA形成的复合物纳米粒子，其中，COL7A1 DNA的用量为20μg，以免疫缺陷鼠双侧肋缘连线为界，取上侧未处理皮肤作为阴性对照。在第二次注射48h～72h后，通过脊椎脱臼法处死免疫缺陷鼠，收获皮肤组织用于qRT-PCR、蛋白质印迹和免疫荧光测试。

图7是实施例1中制备的分子量为38,000Da的高度支化聚(β-氨基酯)在免疫缺陷鼠体内介导COL7A1 DNA转染性能评价，为mRNA转录水平。从图7中可以发现，在免疫缺陷鼠体内，采用皮下注射和微针注射高度支化聚(β-氨基酯)与COL7A1 DNA形成的复合物纳米粒子两种方式均够有效介导COL7A1mRNA转染，同时，微针注射的方式明显优于皮下注射方式，这说明功能化的高度支化聚(β-氨基酯)能够介导高水平的COL7A1 mRNA转染，从转录水平初步证实优异的COL7A1 DNA转染效率。

蛋白印迹结果参见图8，可以发现在免疫缺陷鼠体内，经皮下注射和微针注射的组织均呈现更为明显的C7蛋白条带，初步证实功能化的高度支化聚(β-氨基酯)能够克服体内递送屏障高效地介导C7蛋白表达。

免疫荧光测试结果参见图9，可以发现在免疫缺陷鼠体内，经皮下注射和微针注射的组织的基底膜中均呈现出明显的C7蛋白，且所分泌的C7蛋白沿着基底膜的方向均匀的分布，这说明功能性高度支化聚(β-氨基酯)具有潜在的锚定真皮和表皮的潜力。

4.对高度支化聚(β-氨基酯)在C7相关效应细胞中介导ADAM 17DNA转染效率进行测试

在基因缺陷鼠体内评价实施例1制备的分子量为38,000Da的高度支化聚(β-氨基酯)介导ADAM 17DNA转染性能。对基因缺陷鼠分别进行3次注射实施例1得到的高度支化聚(β-氨基酯)与ADAM 17DNA形成的复合物纳米粒子，其中，ADAM 17DNA用量为15μg，高度支化聚(β-氨基酯)与ADAM17DNA的质量比为30:1。同时，空白对照组注射等体积的PBS，在注射第3针复合物纳米粒子48h～96h后，观察基因缺陷鼠转染后的毛发生长情况，并通过脊椎脱臼法处死基因缺陷鼠，收获转染后和未转染的皮肤组织，进行免疫组化和蛋白印迹测试。

基因缺陷鼠转染后的毛发生长情况参见图10，可以发现，与空白对照组相比，注射复合物纳米粒子的实验组转染后期毛发明显增多，证实高度支化聚(β-氨基酯)与ADAM 17所形成的复合物纳米粒子具有一定的纠正基因缺陷的潜力。

免疫组化结果参见图11，由图中可以看出，在基因缺陷鼠中，高度支化聚(β-氨基酯)转染ADAM 17基因后，与空白对照组相比，HPAE与ADAM 17所形成的复合物纳米粒子转染后，基因缺陷鼠的毛囊增厚，进一步证实高度支化聚(β-氨基酯)与ADAM 17所形成的复合物纳米粒子具有一定的纠正基因缺陷的潜力。

蛋白印迹结果参见图12，由图中可以看出，在基因缺陷鼠中，高度支化聚(β-氨基酯)转染ADAM 17基因后，蛋白印迹的结果证实实验组转染后小鼠的ADAM 17蛋白过表达，说明HPAE能够高效地介导ADAM 17蛋白过表达，进一步证实高度支化聚(β-氨基酯)与ADAM 17所形成的复合物纳米粒子具有一定的纠正基因缺陷的潜力。

以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。