几种Eif1a基因及其应用

技术领域

本发明属于基因的功能与应用领域，具体而言，本发明涉及某种Eif1a基因在出生缺陷中的功能和应用。

背景技术

真核生物翻译起始因子(eIF)是指参与真核生物翻译起始的一类蛋白质，其中eif1a这一类基因是翻译起始因子子家族的重要一员，在起始翻译过程有着不可替代的作用。eif1a在翻译起始扫描中有着非常重要的作用，通过丙型肝炎病毒建立模型，研究发现无论是在5’加帽介导的翻译起始扫描过程，还是内部核糖体进入位点序列(IRES)介导的翻译起始扫描过程，Eif1a都是不可或缺的一环。

在胚胎发育中，父源基因组和母源基因组在受精后首次转录，会存在合子基因激活(ZGA)，ZGA的发生时间在不同哺乳动物之间各不相同。长期以来，关于ZGA的主流思想一直没有改变，ZGA的主要作用是提供胚胎细胞植入前所需的RNA和蛋白质，维持胚胎细胞的基本功能，比如housekeeping基因的表达。eif1a被认为是哺乳动物植入前胚合子基因组激活的主要标志基因，它被发现是一种在小鼠胚胎双细胞阶段瞬时表达的基因，并已经被用作二细胞阶段特异性标记物。ZGA持续时间较短，表明胚胎需要在子基因激活后迅速的在抑制，有学者表明，大量的转录激活ZGA期间会导致内在的DNA损伤，必须纠正这种损伤才能正常的发育。然而eif1a这类基因在ZGA中的具体功能尚无报道，迄今为止，无文献报道有关eif1a相关基因在预防出生缺陷中应用的内容。

发明内容

本发明发现斑马鱼eif1axb，小鼠eif1ad7，人类eif1ax基因在胚胎早期心血管发育、骨骼发育的用途。

本发明所述的人类基因eif1ax序列如SEQ ID NO.1所示，小鼠基因eif1ad7序列如SEQ ID NO.2所示，斑马鱼基因eif1axb序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明第一方面提供基因eif1axb在构建斑马鱼心血管发育障碍和骨骼异常模型中的应用。

本发明第二方面提供一种心血管发育障碍和骨骼异常斑马鱼模型的构建方法，敲除或抑制斑马鱼胚胎基因eif1axb，获得的斑马鱼模型。本发明所述斑马鱼模型的制备方法可以采用本领域的常规方法将斑马鱼胚胎中的基因eif1axb进行敲除或抑制，通过调整抑制或敲除的程度，可实现模型轻重的控制。

本发明第三方面提供本发明构建的心血管发育障碍和骨骼异常斑马鱼模型在用于心血管发育障碍和骨骼异常治疗药物筛选中的应用。在一种具体的实例中，在用于基因eif1axb缺陷导致的心血管发育障碍和骨骼异常治疗药物筛选中的应用。

本发明第四方面提供基因Eif1ad7在构建小鼠先天性心血管疾病和先天性心脏病模型中的应用。

本发明第五方面提供一种先天性心血管疾病和先天性心脏病小鼠模型的构建方法，所述方法为小鼠胚胎中基因Eif1ad7抑制表达或基因Eif1ad7过表达后，胚胎在母鼠体内发育后获得。

本发明第六方面提供本发明构建的先天性心血管疾病和先天性心脏病小鼠模型在用于先天性心血管疾病和先天性心脏病治疗药物筛选中的应用。在一种实施例中，在用于基因eif1ad7缺陷导致的先天性心血管疾病和先天性心脏病治疗药物筛选中的应用。

本发明所述斑马鱼模型的制备方法为抑制斑马鱼胚胎eif1axb基因表达，使用Morpholino技术敲低对应的eif1axb基因表达，或者采用eif1axb基因的siRNA,eif1axb的抗体以及利用其他生物工程技术能够抑制eif1axb表达的方法。

本发明所述小鼠模型的构建方法为小鼠胚胎中Eif1ad7基因抑制表达或Eif1ad7基因过表达后，胚胎在母鼠体内发育后获得。进一步的所述基因抑制表达为使用Morpholino技术或反义RNA技术调节小鼠胚胎中eif1ad7基因表达。

本发明第七方面还提供检测基因eif1ax的试剂在制备先天性心脏病诊断或辅助诊断试剂中的应用。

例如所述斑马鱼eif1axb，小鼠eif1ad7,人类eif1ax基因在基因筛查试剂盒开发中的应用。在一种实施例中，可以提供一种筛查先天性心脏病的诊断试剂，所述诊断试剂是以eif1ax为靶点，含有依据eif1ax基因设计的PCR引物，RNA存储液，所述诊断试剂的使用方法包括目标DNA的提取，实时PCR的检测eif1ax的表达，通过与正常基因表达水平进行比较，判断新生儿先天性心脏病的风险。

本发明第八方面还提供基因eif1ax在用于治疗先天性心脏病药物的治疗靶点中的应用。

本发明第九方面还提供叶酸作为斑马鱼基因eif1axb或小鼠基因eif1ad7或人基因eif1ax调节剂中的应用，主要是作为斑马鱼基因eif1axb或小鼠基因eif1ad7或人基因eif1ax抑制剂中的应用。

叶酸而不是人体内源性的6S-5-甲基四氢叶酸具有心脏毒性，一定剂量下叶酸可诱导斑马鱼胚胎心脏发育障碍与畸形，而6S-5-甲基四氢叶酸则没有上述负面作用。本发明对用FA(叶酸)和MTHF-Ca(6S-5-甲基四氢叶酸钙)培养的小鼠的受精囊胚进行了体外实验。通过使用基因表达谱，我们发现gm5662是最显着差异表达的mRNA序列，该基因为未被鉴定的一个未知基因。Gm5662是小鼠基因组数据库中记录的一个mRNA序列，本发明进一步确定gm5662为小鼠的eif1ad7基因，与斑马鱼的eif1axb和人的eif1ax同源。在X和Y染色体的短臂中有一个伪常染色体区域。该基因位于这个伪常染色体区域，表明该基因很可能是一个古老的基因，且高度保守。该基因有可能在胚胎发育中起着关键的调节作用。到目前为止，关于该基因的信息非常有限，该基因调控的下游通路仍不清楚。

申请人采用斑马鱼模型和MO敲低技术来表征斑马鱼eif1axb基因的生物学功能通过斑马鱼的morpholino技术，靶向抑制斑马鱼同源基因Eif1axb基因的表达，确定了该基因表达与心脏发育，骨骼发育相关。

申请人通过研究eif1axb基因表达对斑马鱼的影响发现，斑马鱼eif1axb基因是先天性心脏病以及骨骼发育异常治疗的一个新基因靶点，有选择的条件的控制eif1axb基因表达，可以影响基因网络，因此，针对eif1axb及其同源的人的eif1ax，小鼠的eif1ad7基因的靶点的新药物，可广泛应用与出生缺陷的防治。

申请人筛选并检查了7个基因的表达，这些基因以前被证明与2-dpf和3-dpf的心脏缺陷和/或血管生成密切相关。申请人发现其中三个基因(dll4、efnb2a和s1pr1)显着减少，而其他三个基因(notch1b、ptprb和s1pr2)急剧增加，除了cd146保持不变。斑马鱼中Notch配体dll4(delta-like 4)的缺失会导致血管发芽缺陷。心脏收缩通过notch1b-efnb2a-nrg1上位性促进小梁形成。先前的研究表明，VE-PTP(斑马鱼中的ptp-rb)不仅是调节血管生成和EC粘附连接的关键参与者，而且还是血管生成依赖性疾病的潜在治疗靶点

本发明还提供一种模型，利用斑马鱼或小鼠基因敲减、或基因过表达模型，用于筛选预防、缓解、治疗先天性心脏病的药物；eif1axb基因也可以作为基因治疗中的靶基因，设计并制备预防、缓解、治疗先天性心脏病或骨骼发育障碍的药物或生物学试剂，通过基因工程技术达到预防和治疗先天性心脏病或骨骼发育障碍的药物研究所需的动物模型。例如以小鼠的eif1ad7为靶基因，设计可干扰eif1ad7表达的双链siRNA,通过化学方法合成以后，注射入动物模型，通过RNA干扰的方法使eif1ad7基因沉默，来制备小鼠胚胎的先天性心脏病模型。例如使用基因编辑技术，比如CRISPR/Cas9技术此外，使用sgRNA和/或打靶载体将序列插入eif1ad7基因座，获得基因突变小鼠模型。还可以利用eif1a相关基因过表达的体外细胞模型或动物模型，通过筛选，发现其中能够特异性调节eif1a基因表达的分子，从而为先天性心脏病出生缺陷提供新的治疗分子。

本发明通过研究斑马鱼eif1axb的基因在胚胎发育过程中的生物学功能，小鼠eif1ad7基因在胚胎发育过程中的生物学功能，通过比较基因作图方法确定人的eif1ax与上述基因同源，本发明提供斑马鱼Eif1axb、小鼠eif1ad7、人eif1ax作为靶标在筛选治疗预防出生缺陷中的应用，所述出生缺陷为先天性心脏病出生缺陷、骨骼发育障碍出生缺陷、神经发育障碍出生缺陷。

针对斑马鱼eif1axb、小鼠eif1ad7、人eif1ax的上述功能，提供对应基因的调节剂在预防出生缺陷中的应用，所述出生缺陷为先天性心脏病出生缺陷、骨骼发育障碍出生缺陷、神经发育障碍出生缺陷。所述基因调节剂包括，siRNA,基因表达蛋白对应的抗体以及利用生物工程技术能够调节斑马鱼eif1axb、小鼠eif1ad7、人eif1ax表达的中的一种。

一种斑马鱼胚胎模型，所述斑马鱼胚胎中Eif1a基因抑制表达或Eif1a基因过表达，所述模型在筛选预防出生缺陷药物中的应用。

一种小鼠胚胎模型，所述小鼠胚胎中Eif1a基因抑制表达或Eif1a基因过表达，所述模型在筛选预防出生缺陷药物中的应用。

本发明的有益效果：

本发明首次发现了eif1axb基因在斑马鱼心血管发育与骨骼发育中的功能，并发现叶酸能够抑制斑马鱼eif1axb,小鼠eif1ad7的表达。提供了斑马鱼eif1axb、小鼠eif1ad7、人eif1ax调节剂在制备治疗心血管发育障碍及骨骼缺陷的药物的新用途，并提供了预防或治疗心血管发育障碍及骨骼缺陷药物筛选的动物模型。

附图说明

图1Gm5662基因鉴别与分析，(A&B)GDE(基因差异表达)分析显示，gm5662的表达在FA和MTHF-Ca处理的囊胚之间差异最为显着；Gm5662被鉴定为小鼠(M.musculus)中的eif1ad7基因和斑马鱼(D.rerio)中的eif1axb；

图2eif1axb的进化守恒。比对来自三个物种的eif1axb直系同源物的氨基酸序列。该基因在真核生物中是保守的，在人类(EIF1A)、斑马鱼(eif1axb)和小鼠(eif1ad7)之间具有高度同源性；

图3内源斑马鱼eif1axb对照、FA处理的胚胎或MTHF-Ca处理的胚胎通过qRT-PCR在四个胚胎发育阶段(6hpf、12hpf、24hpf和48hpf)(n＝30个个体胚胎)进行评估；***P<0.001；**P<0.01；ns，不显着；hpf，受精后小时数；

图4eif1axb基因敲低效率考察；(A)斑马鱼eif1axb基因被特定的吗啉代反义物靶向，以防止外显子3(E3I3-MO)的正确剪接，引物2F和5R询问是否存在野生型(非突变)转录物或已插入内含子3的转录物；(B)受精后1天，对照-MO和E3I3-MO吗啉代注射胚胎的eif1axb转录物的RT-PCR，证明插入了内含子3，注射4ng的eif1axb MO改变了外显子3和内含子3之间的剪接，正如对照和eif1axb MO注射胚胎之间PCR条带的变化所揭示的那样；(C)通过qRT-PCR测量的eif1axb表达水平的定量测量(***P<0.0001)，MO靶向下调eif1axb(在单细胞阶段(N＝20)注射4ng MO后，在1-dpf收集样品)；(D)eif1axb-EGFP荧光报告基因的示意图，上面的包含与EGFP框内融合的eif1axb-ATG-MO目标序列(黄色框)；(E)50pgeif1axb-EGFP注射了标准对照吗啉(4ng)或eif1axb-ATG-MO(4ng)，在9-hpf和24-hpf拍摄胚胎，在CMV启动子驱动下的注射eif1axb-GFP质粒DNA的胚胎显示绿色荧光，当与eif1axb-ATG-MO共同注射时，绿色荧光显着降低，显示了MO敲低效率，dpf：受精后天数；

图5eif1axb表型缺失与心血管缺陷有关；(A-C)3-dpf斑马鱼胚胎的总体形态。与对照斑马鱼相比，eif1axb敲低导致心包水肿(B-C，红色箭头)、收缩力降低和心前区充血减少，这是明显心力衰竭的迹象；(D)对照组与eif1axb MO 3天的存活百分比的时间过程图。面板E显示了具有发育缺陷的胚胎的百分比；(F)胚胎心包面积的量化；误差线，表示±s.e.m.***P<0.001(n＝10；方差分析)；(G-O)Tg(fli1a:EGFP)y1胚胎在3-dpf的代表性荧光图像；(G&J)在3-dpf拍摄的躯干区域图像，血管结构通过eGFP荧光可视化并标记为ISV和DLAV，显示注射对照MO的胚胎有规律的发育；与对照MO相比，注射了eif1axb-MO的胚胎呈现出更薄的ISV(K-L，箭头)，在对照胚胎中，脊索旁血管(PAV)正常形成(J，红色箭头)，与对照相比，MO敲低eif1axb可防止脊索旁血管(PAV)形成，这是淋巴系统(K-L)的前体；有关的区域以更高的放大率显示，在对照胚胎中，肠下静脉血管(SIV)在3-dpf(A、E、箭头)时在蛋黄上发育为光滑的篮状结构，相反，注射了eif1axb-MO的胚胎呈现出减少的异位SIV片段(M，星号)；(P-Q)ISV平均长度和直径的量化显示eif1axb MO显着减少，列，平均值；SEM(n＝10；方差分析)***P<0.001；(R)SIV区域的量化显示eif1axb MO显着减少，列，平均值；条形图，SEM(n＝10；方差分析；***P<0.001)；DLAV，背部纵侧血管；ISV，节间血管；dpf，受精后天数；

图6eif1axb缺乏调节心血管信号通路；内源性dll4、notch1b、efnb2a、cd146、ptprb、s1pr1和s1pr2在对照和eif1axb MO中通过qRT-PCR在2-dpf和3-dpf(n＝6-10个个体胚胎)进行评估。***P<0.001；**P<0.01；*P<0.05；ns，不显着；dpf，受精后天数。

图7eif1axb敲低构成的斑马鱼模型形态图。

图8eif1axb敲低构成的斑马鱼模型肠下血管分析；(A)对照组肠下血管发育正常，为光滑的篮状结构；(B)ATG-MO 1ng斑马鱼模型；(C)ATG-MO 1.5ng斑马鱼模型；(D)E3I3-MO1ng斑马鱼模型；(E)E3I3-MO 1.5ng斑马鱼模型；(F)对照组与MO组肠下血管区域的量化统计图，SEM(n＝10；方差分析；***P<0.0001)。

图9eif1axb敲低构成的斑马鱼模型节间血管分析；(A)对照组节间血管发育正常；(B)ATG-MO 1ng斑马鱼模型；(C)ATG-MO 1.5ng斑马鱼模型；(D)E3I3-MO 1ng斑马鱼模型；(E)E3I3-MO 1.5ng斑马鱼模型；(F)ISV平均长度进行量化,SEM(n＝10；方差分析；***P<0.0001)。

图10小鼠敲低eif1ad7新生小鼠心脏解剖图与组织切片图；(A)对照组心脏解剖图；(B)si-RNA干预后小鼠心脏解剖图；(C)对照组心脏组织切片图；(D)si-RNA干预后小鼠心脏组织切片图，及缺损部位放大图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

以下实施例中所用的FA表示叶酸，MTHF-Ca表示6S-5-甲基四氢叶酸钙，分子量分别为443.40和497.52，血液循环中存在的是6S-5-甲基四氢叶酸而非叶酸。

若无特别说明，以下实施例中用到的引物如表1所示。

表1，使用引物总结如下：

实施例1 GM5662基因的发现

外源性促性腺激素治疗(PMSG/hCG)诱导的超排卵用于评估雌性小鼠(C57BL/6J)排卵卵母细胞的质量。然后进行体外受精程序。将受精卵随机分组，用单纯钾优化培养基(KSOM)培养基、KSOM-FA(60ng/L)和KSOM-MTHF(60ng/L)作为对照。培养24、48、72小时后，收集囊胚，显微镜下观察，液氮保存。

从对照组、FA和MTHF-Ca三组收集体外受精72小时后小鼠的囊胚。根据制造商的说明，使用RNeasy试剂盒(Qiagen，德国)制备总RNA。将来自所有样品的等量RNA混合用于cDNA文库构建以获得转录组数据。使用1μg总RNA构建标准化cDNA文库。使用NEBNext UltraDirectional RNA Library Prep Kit for Illumina(NEB，美国)生成测序文库，并在Illumina HiSeq 2000平台上进行配对末端读取测序。所有测序均由Genewiz Bio-pharmTechnology Corporation(中国苏州)处理和分析。

提取总RNA进行文库构建后，利用Illumina平台进行高通量测序。使用Bcl2fastq(V2.17.1.14)评估测序读数以生成FASTQ文件。FASTQ文件的初始质量控制是使用FastQC(V0.10.1)和Cutadapt(V1.9.1)进行的，以过滤低质量数据，包括适配器引入的污染和冗余序列。通过Hisat2(V2.0.1)将干净读数与小鼠基因组进行比较，并通过Htseq(V0.6.1)对基于每百万碱基片段数(FPKM)的短读数的基因表达进行定量。差异表达基因(DEGs)使用Bioconductor包中的DESeq2(V1.6.3)进行鉴定。

DEG(差异表达基因)用Bioconductor包中的DESeq2(V1.6.3)鉴定。火山图在R(V4.0.3)中使用ggplot2包完成。

通过体外受精和培养囊胚的RNA转录组分析，数据表明小鼠基因组中Gm5662在FA培养液的受精卵与MTHF-Ca相比存在差异表达(见图1A，1B)。Gm5662在人、斑马鱼和小鼠序列之间的同源性通过DNAMAN(V6.0.3)的比对获得。Gm5662是小鼠基因组数据库中记录的mRNA序列，但该基因尚未被鉴定。利用比较基因作图的优势，我们对Gm5662(M.musculus)和AAP36772.1(H.sapiens)之间的同源性分析进行了blast搜索，发现人类的EIF1AX在氨基酸序列中与Gm5662具有92％的同源性。因此，Gm5662被鉴定为小鼠(M.musculus)中的eif1ad7基因和斑马鱼(D.rerio)中的eif1axb。该基因在真核生物中是保守的，在人类(eif1ax)、小鼠(eif1ad7)和斑马鱼(eif1axb)之间具有高度同源性(图2)，在斑马鱼的早期发育过程中，该基因与人类EIF1AX基因直系同源，斑马鱼eif1axb基因与人类eif1ax基因的同源性为81.5％，在蛋白质水平上保守性为99.3％。具体的，人类基因eif1ax序列如SEQ ID NO.1所示，小鼠基因eif1ad7序列如SEQ ID NO.2所示，斑马鱼基因eif1axb序列如SEQ ID NO.3所示。

实施例2通过RT-PCR考察FA对斑马鱼胚胎的eif1axb基因表达产生的影响

在斑马鱼中，根据制造商的说明，在Trizol(Roche)中从每组30到50个胚胎中提取总RNA。使用带有gDNA Eraser(Takara)的PrimeScript RT试剂盒逆转录RNA。使用Bio-radiQ SYBR Green Supermix(Bio-rad)对eif1axb基因表达进行三次定量，并在Realplex系统(Eppendorf)上进行检测。相对基因表达定量基于比较阈值循环法(2-ΔΔCt)。实时RT-PCR实验中使用的引物如表1中所示。实时RT-PCR结果表明，在12到48hpf的斑马鱼中，eif1axb基因被FA下调，但不是MTHF-Ca(图3)。即FA而不是MTHF-Ca引起心脏毒性，从而导致斑马鱼胚胎发育缺陷。高剂量叶酸同样也会导致胎鼠的心脏缺陷发生率增加，上述结果已经在二个独立实验室中重复。

实施例3斑马鱼模型的制备

使用吗啉代反义寡核苷酸(MO)技术，我们阻止了胚胎斑马鱼中eif1axb的表达，并分析了敲低对鱼类发育的影响。

斑马鱼(Danio rerio，Hamilton，野生型)实验所用鱼是年龄小于1的成年斑马鱼，饲养水体的pH值为7±0.2，温度在28℃左右，光照和黑暗的时间比是14h:10h，每天喂食两次丰年虫卵。前一天晚上把一雌两雄三条斑马鱼放在产卵盒中，第二天早上收集鱼卵。鱼卵放于胚胎培养液(0.2g/L的海盐配置而成)中，28℃培养。

针对斑马鱼eif1axb基因的ATG位点(ATG-MO)，以及第三号外显子/第三号内含子交界处(E3I3-MO)，分别设计了MO序列，同时加入Standart Control MO。上述MO由GeneTools(Philomath,OR)设计和购买。eif1axb翻译阻断和剪接阻断吗啉的序列分别为5'-CTCCTTTTCCTTTGTTTTTCGGCAT-3'(ATG-MO)和5'-CAGCCTGAAGCTCTAAAATGCACCT-3'(E3I3-MO)。标准对照吗啉的序列是5'-CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA-3'(基因工具)。用于注射的MO量如下：Control-MO和E3I3-MO，每个胚胎2ng；ATG-MO，每个胚胎2ng。跨越eif1axb外显子2(正向引物：5'-GCGACGTGGTAAGAACGAGAA-3')和外显子5(反向引物：5'-GGCTTTCAGACTCCTAGCCT-3')的引物用于RT-PCR分析，以确认E3I3-MO的功效。用作内部对照的引物ef1α序列是5'-GGAAATTCGAGACCAGCAAATAC-3'(正向)和5'-GATACCAGCCTCAAACTCACC-3'(反向)。eif1axb cDNA 的CDS区域，包括eif1axb-ATG-MO靶序列，被克隆到pcDNA3.1-EGFP中，用于测试eif1axb吗啉代寡核苷酸(MO)的有效性。

胚胎和幼虫用尼康SMZ18荧光显微镜进行分析，随后用数码相机拍照。使用AdobePhotoshop 7.0软件(Adobe，San Jose，California)调整图像子集的级别、亮度、对比度、色调和饱和度，以优化表达模式的可视化。使用基于图像的形态分析(NIS-Elements D4.6)和ImageJ软件(NIH,http://rsbweb.nih.gov/ij/)处理的定量图像分析。倒置荧光图像用于处理。使用ImageJ通过粒子数定义阳性信号。对每种处理的10只动物进行量化，并对每只动物的总信号进行平均。

使用MO技术分析eif1axb敲低的表型。图4显示了eif1axb敲低的有效性，RT-PCR和实时定量RT-PCR证实了eif1axb的敲低效率。与对照斑马鱼(图5A)相比，eif1axb敲低导致心包水肿、收缩力降低和心前区充血减少，这是明显心力衰竭的迹象(图5B和C)。胚胎缺陷增加，而存活率下降(图5D和E)。心包区域的量化显示eif1axb mo组显着增加(图5F)。以3-dpf拍摄的躯干区域图像，血管结构通过eGFP荧光可视化并标记为ISV(节间血管)和DLAV(背部纵侧血管)，显示注射对照MO的胚胎有规律的发育。与对照MO相比，注射了eif1axb-MO的胚胎呈现出更薄的ISV(图5K和L，箭头)。在控制胚胎中，脊索旁血管(PAV)形成正常(图5J)。与对照相比，MO敲低eif1axb可防止淋巴系统的前体脊索旁血管(PAV)形成。有关的区域以更高的放大率显示(图5N&O)。ISV平均长度和直径的量化显示eif1axb mo组显着减少(图5P-Q)。因此，eif1axb基因的下调抑制了斑马鱼的早期血管发育。

Eif1a在心脏、躯干和尾部发育中的功能

大多数中度受影响的Eif1a(89.1％,n＝110)的心包腔明显扩大。同时也影响了胚胎的心率，特别是对48hpf时的胚胎心率影响最大。

中度受影响的Eif1a(68.9％，n＝103)表现出明显的身体和/或尾巴扭结。缺陷在25hpf时变得明显，并在较老的胚胎(2-7天大，数据未显示)中继续存在。

Eif1a在神经发育中的功能

通过检查活胚胎中的大脑形态和几种神经分化标记物的染色模式来评估Eif1a的中枢神经系统(CNS)发育。在25hpf时，具有不同的大脑区域(例如小脑、后脑、视顶盖)，视顶盖后壁的背侧部分和小脑背侧在Eif1a-MO中似乎更薄。

实施例4 eif1axb缺乏与信号通路

为了研究eif1axb如何介导血管生成，我们随后筛选并检查了7个基因的表达，这些基因以前被证明与2-dpf和3-dpf的心脏缺陷和/或血管生成密切相关。在斑马鱼中，根据制造商的说明，在Trizol(Roche)中从每组30到50个胚胎中提取总RNA。使用带有gDNAEraser(Takara)的PrimeScript RT试剂盒逆转录RNA。相对基因表达定量基于比较阈值循环法(2-ΔΔCt)。实时RT-PCR实验中使用的引物总结在补充表1中。

我们发现其中三个基因(dll4、efnb2a和s1pr1)显着减少，而其他三个基因(notch1b、ptprb和s1pr2)急剧增加，除了cd146保持不变(图6)。我们推测这是负反馈调节的结果，以避免血管系统过度减少。在本研究中，我们发现了斑马鱼基因eif1axb通过靶向VE-PTP来控制体内的血管生成。Eif1axb缺陷可能通过负反馈循环调节dll4、ptp-rb、notch1b和efnb2a表达。这些体内结果表明，eif1axb基因在心血管和胚胎发育中发挥重要作用。

实施例5心血管发育缺损的斑马鱼模型

斑马鱼(Danio rerio，Hamilton，野生型)实验所用鱼是年龄小于1的成年斑马鱼，饲养水体的pH值为7±0.2，温度在28℃左右，光照和黑暗的时间比是14h:10h，每天喂食两次丰年虫卵。前一天晚上把一雌两雄三条斑马鱼放在产卵盒中，第二天早上收集鱼卵。鱼卵放于胚胎培养液(0.2g/L的海盐配置而成)中，28℃培养。

Gene Tools,LLC(http://www.gene-tools.com/)设计了morpholino(MO)。根据标准方案(ref4)将反义MO(GeneTools)显微注射到受精的单细胞阶段胚胎中。eif1axb翻译阻断和剪接阻断吗啉的序列分别为5'-CTCCTTTTCCTTTGTTTTTCGGCAT-3'(ATG-MO)和5'-CAGCCTGAAGCTCTAAAATGCACCT-3'(E3I3-MO)。标准对照吗啉的序列是5'-CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA-3'(基因工具)。用于注射的MO的量如下：Control-MO和E3I3-MO，每个胚胎1、1.5ng；ATG-MO，每个胚胎1、1.5ng。

为了评估斑马鱼胚胎中的血管形成，用0.016％MS-222(三卡因甲磺酸盐，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)麻醉胚胎。然后将斑马鱼定位在侧面(前，左；后，右；背，上)，并用3％甲基纤维素安装在凹陷载玻片中，以便通过荧光显微镜观察。胚胎和幼虫用尼康SMZ18荧光显微镜进行分析，随后用数码相机拍照。使用Adobe Photoshop 7.0软件(Adobe，SanJose，California)调整图像子集的级别、亮度、对比度、色调和饱和度，以优化表达模式的可视化。使用基于图像的形态分析(NIS-Elements D4.6)和ImageJ软件(NIH,http://rsbweb.nih.gov/ij/)处理的定量图像分析。倒置荧光图像用于处理。使用ImageJ通过粒子数定义阳性信号。对每种处理的10只动物进行量化，并对每只动物的总信号进行平均。

结果显示注射1ng与1.5ng的eif1axb-MO试剂的斑马鱼胚胎发育略为迟缓，7天内观察全部存活，ATG-MO 1ng、1.5ng与E3I3-MO 1ng、1.5ng的处理会导致略微的体长缩短和心包水肿，见图7。由于eif1axb基因的生物学功能与胚胎的心血管发育相关，我们对发育三天的斑马鱼肠下静脉血管(SIV)拍摄荧光图像并统计。在对照胚胎中肠下静脉血管(SIV)在3-dpf时在蛋黄上发育为光滑的篮状结构(图8A)。用MO处理的斑马鱼胚胎出现了异位SIV片段，且血管数量减少(图8B-E)。进一步量化了SIV区域(图8F)SEM(n＝10；方差分析；***P<0.0001)。显示干扰MO干扰血管发育存在一定的剂量关系。

我们通过eGFP荧光可视化对ISV(节间血管)和DLAV(背侧纵向吻合血管)进行标记，在对照组中有关血管显示具有规律发育，ATG-MO与E3I3-MO处理的胚胎呈现更薄的ISV(箭头)或不完整的ISV和异位(星号)(见图9A-E)。对ISV平均长度进行量化(图9F),SEM(n＝10；方差分析；***P<0.0001。

我们制备出了斑马鱼血管发育障碍模型，通过MO剂量的调整，可实现斑马鱼胚胎的肠下静脉血管，节间血管等轻度缺陷，能够有组于相关药品的开发。

实施例6小鼠模型的制备

外源性促性腺激素治疗(PMSG/hCG)诱导的超排卵用于评估雌性小鼠(C57BL/6J)排卵卵母细胞的质量。然后进行体外受精程序。用单纯钾优化培养基(KSOM)培养基。培养24、48、72小时后，收集囊胚，显微镜下观察，液氮保存。

反义寡核苷酸(siRNA):5’-GCCAUAUAAGAGGGAAGCUTT-3’,5’-AGCUUCCCUCUUAUAUGGCTT-3’,阴性对照siRNA 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’,5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’用于研究。上述序列由吉玛制药技术有限公司设计设计和购买。将siRNA溶解在RNase-free缓冲液中，使用Narishige MI300显微注射器并注射20μM到一到四细胞阶段的胚胎中。注射完毕后，将存活的细胞培在KSOM培养液中，移至培养箱进行培养3天。在假孕小鼠壶腹和卵巢之间的输卵管壁上打一个小孔，移液器的尖端插入孔中，移液器开口指向壶腹，将胚胎植入假孕小鼠中。单独饲养雌鼠至产仔。

观察所有新生小鼠，并在出生当天测量体重，我们将一部分小鼠测量心电图(数据未显示)，一部分新生小鼠当它们长到6天大时，解剖小鼠的胸腔，在体场显微镜下观察心脏形态和搏动，并拍照(SMZ168,Motic,厦门,福建,中国)。小鼠心脏组织用4％多聚甲醛固定，石蜡包埋。用全景图像采集系统IX73(Olympus，东京，日本)检查H&E染色的组织切片。

结果表明对照组小鼠心脏发育正常，干扰eif1ad7表达后，新生小鼠心脏略小(见图10A-D)，新生小鼠的部分心肌缺血，心房及心室之间的部分可见心壁有缺陷46.5％(n＝43)，表明模型制备成功。

本发明实施例的结果还表明eif1ad7参与小鼠的先天性心脏病的发病过程，因此针对Eif1ad7的靶点的药物，具有良好治疗和预防出生缺陷的前景。