一种植物靛蓝的生产方法

技术领域

本发明涉及天然植物染料的生产方法，具体涉及一种可全季节生产的植物靛蓝生产方法。

背景技术

靛蓝是世界上最古老、产量最大的染料之一，广泛应用于印染、食品和医药等工业。靛蓝是植物的次生代谢产物。吲哚葡萄糖苷(indoxyl-β-D-glucoside)和靛红烷B作为靛蓝的重要前体，存在于菘蓝、木蓝、马蓝等蓝草生物质中。

植物靛蓝的原料蓝草生物质在保存过程中叶片中的靛蓝前体如吲哚糖苷和靛红烷B在酶的催化作用下水解为吲哚酚，进而转化为其他物质。因此，在传统植物靛蓝生产工艺中所使用的原料通常都是新鲜的蓝草类生物质。但是，其季节性收割限制了植物靛蓝的工业化生产。为解决植物靛蓝生产的季节性行业难题，有必要开发出一种适合蓝草生物质的保存方法，在此基础上，构建新的植物靛蓝生产工艺。

发明内容

为了解决现有技术问题，本发明的目的在于克服已有技术存在的不足，提供一种植物靛蓝的生产方法，采用微波干燥快速淬灭生物质中多种酶活性，延长蓝草生物质中靛蓝前体物质的保存周期，结合外援酶水解，实现了一个可全季节生产的植物靛蓝制备工艺。

为达到上述发明创造目的，本发明采用如下技术方案：

一种植物靛蓝的生产方法，包括以下步骤：

(1)采用机械方法或人力手工方法分离制作植物靛蓝的原料植物的茎叶；

(2)将在所述步骤(1)中获得的叶片收集后，放置在微波装置内，干燥叶片至含水率不高于10％，得到干燥的叶片；

(3)将在所述步骤(2)中获得的干燥的叶片投入水中或有机溶剂中进行浸泡处理；

(4)旋蒸浓缩在所述步骤(3)中得到的液体或固体粉末；

(5)向在所述步骤(4)中获得的液体或固体粉末中添加糖苷水解酶溶液，搅拌液体至少1小时，得到固液混合物；

(6)将在所述步骤(5)中得到的固液混合物进行固液分离，收集得到沉淀物，然后干燥沉淀物，从而得到植物靛蓝。

优选地，在所述步骤(2)中，微波干燥的输出功率为500～2000W，干燥时间为1～5min。

优选地，在所述步骤(3)中，有机溶剂采用甲醇、乙醇、丙酮中至少一种易挥发有机溶剂。

优选地，在所述步骤(3)中，浸泡处理的温度为60-100℃。

优选地，在所述步骤(3)中，浸泡时间为2小时以内。

优选地，在所述步骤(4)中，控制pH为5-8。

优选地，在所述步骤(5)中，糖苷水解酶为含有β-葡萄糖苷酶活性的蛋白。

经研究发现叶片中内源性β-葡萄糖苷酶是影响采后处理过程中前体物质吲哚糖苷含量变化的重要因素。热干燥过程，由于其热传导效率无法快速钝化胞内酶活，故当细胞受到热胁迫作用时，液泡中的前体物质可与内源β-葡萄糖苷酶快速反应，导致其含量在短时间内下降。而微波干燥的加热特性可以在其短时间内快速钝化叶片中内源酶活力。本发明在系统分析蓝草生物质在保存过程中的成分变化规律基础上，采用微波干燥快速淬灭生物质中多种酶活性，延长蓝草生物质中靛蓝前体物质的保存周期，结合外援酶水解，开发了一个可全季节生产的植物靛蓝制备工艺。

本发明与现有技术相比较，具有如下显而易见的突出实质性特点和显著优点：

1.本发明生产工艺利用微波干燥的加热特性，在其短时间内快速钝化叶片中内源酶活力，达到保存叶片中靛蓝前体物质的作用，为植物靛蓝的全季节生产提供了稳定的物质基础；

2.与传统靛蓝生产工艺相比，本发明的生产工艺大幅度地缩短了反应时间，提高了靛蓝前体物质的定向转化效率；

3.本发明工艺不仅提高了靛蓝产率，大幅缩短了反应时间，同时解决了靛蓝季节性生产的行业难题。

附图说明

图1为本发明实施例1中微波干燥对叶片的影响效果图。

图2为本发明工艺处理叶片中吲哚糖苷含量变化图。

图3为本发明工艺与传统发酵的靛蓝生产效率的比较图。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述本发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。

以下结合具体的实施例子对上述方案做进一步说明，本发明的优选实施例详述如下：

实施例1

在本实施例中，一种植物靛蓝的生产方法，包括以下步骤：

(1)采用机械方法或人力手工方法分离制作植物靛蓝的马蓝的茎叶；

(2)将在所述步骤(1)中获得的叶片收集后，放置在微波装置内，干燥叶片至含水率不高于10％，得到干燥的叶片；

(3)将在所述步骤(2)中获得的干燥的叶片投入水中或有机溶剂乙醇中进行浸泡处理；浸泡处理的温度为60-100℃；浸泡时间为2小时以内；

(4)旋蒸浓缩在所述步骤(3)中得到的液体或固体粉末；控制pH为5-8；

(5)向在所述步骤(4)中获得的液体或固体粉末中添加糖苷水解酶溶液，搅拌液体至少1小时，得到固液混合物；糖苷水解酶为含有β-葡萄糖苷酶活性的蛋白；

(6)将在所述步骤(5)中得到的固液混合物进行固液分离，收集得到沉淀物，然后干燥沉淀物，从而得到植物靛蓝。

试验测试分析微波干燥对于叶片组分的影响如下：

图1为微波干燥对叶片的影响。其中，图1A为微波干燥过程中叶片水分及叶片表面温度变化；图1B为微波干燥对叶片吲哚糖苷含量及β-葡萄糖苷酶活力的影响；图1C为微波干燥对叶片的靛蓝、靛玉红含量的影响；图1D为不同干燥方式对叶片中总酚含量的影响；图1E为微波干燥叶片的红外成像图及叶片形态变化。Fresh为新鲜叶片；MD为微波干燥叶片；HD为热干燥叶片；SD为阴干叶片。

由图1A可知，微波干燥3min后，新鲜叶片的含水率可由80％可迅速下降至9％。微波干燥过程中叶片表面温度上升速率极快，新鲜叶片经微波干燥后1min后，叶片表面温度由33.5℃迅速上升至93.1℃，而在干燥至2min及3min时叶片表面温度增幅较小，分别为96.4℃及100.3℃。

微波干燥可在极短时间内钝化叶片中的β-葡萄糖苷酶，如图1B所示。新鲜叶片初始酶活力为9.01U/mg DW，经由微波干燥1min后，叶片中的β-葡萄糖苷酶的酶活力就降至0.69U/mg DW，下降率高达92％。随着微波干燥时间的延长，待干燥至2min及3min时，叶片中残留酶活力并无太大变化，分别为4％及3％。结果表明微波干燥1min即可以获得钝化叶片中酶活力的效果。由于微波干燥的瞬时高温可使叶片中大部分β-葡萄糖苷酶失活，使叶片吲哚糖苷含量在干燥过程中始终保持在相对稳定的状态(图1B)。由图1C可知，尽管叶片在微波干燥过程中吲哚糖苷含量保持基本稳定，然而在干燥过程中仍然有少量的靛蓝、靛玉红生成。这可能是由于马蓝叶片中含有少量靛蓝前体物质靛红烷B，其高度不稳定性，在较高温度下易分解从而生成少量的靛蓝及靛玉红。

同时，微波干燥过程中叶片颜色始终呈现绿色，如图1E所示。本实施例在分析叶片颜色改变基础上，系统比较各干燥叶片经乙醇回流提取后的总酚含量，结果如图1D所示。热干燥组的总酚含量最少为9.74mg/g，相较于新鲜叶片组15.55mg/g，减少了37.36％；阴干组的总酚含量略有下降，为14.27mg/g，较新鲜叶片组减少8.23％。微波干燥过程产生的热量导致叶片中水分蒸发，水分子的加热导致氧化酶(多酚氧化酶和过氧化酶)的变性，从而阻止酚类化合物的降解，因此微波干燥组的总酚含量相较于新鲜叶片略有上升，为17.24mg/g。

实施例2

在本实施例中，对实施例1制备的植物靛蓝进行实验分析测试，得到微波干燥对稳定叶片中吲哚糖苷含量的作用如下：

微波干燥与常规保存方法相比较而言，微波干燥可快速钝化酶活力使得干燥过程中吲哚糖苷含量保持稳定。蓝草类植物的生长特性限制了植物靛蓝的连续化生产。尽管微波干燥过程中叶片中吲哚糖苷含量未发生变化，然而微波干燥叶片中吲哚糖苷的稳定性仍需在长期保存中进一步验证。由图2可知，微波干燥后的叶片中吲哚糖苷含量在32周达220天的时间内基本上都保持在一个较为稳定的状态，该结果表明在保存期间影响吲哚糖苷含量的首要因素为叶片中存在的内源性β-葡萄糖苷酶，当叶片经微波高温瞬时钝化β-葡萄糖苷酶之后，其中前体吲哚糖苷的保存周期可以得到大幅延长。与其它方式相比，新鲜叶片经由微波干燥后磨碎保存可以大幅降低原料存储所需空间，进而降低使用微波干燥叶片生产植物靛蓝所需成本。

实施例3

在本实施例中，对实施例1制备的植物靛蓝进行实验分析测试，对微波干燥耦合外源酶水解的植物靛蓝生产新工艺构建分析如下：

由于微波干燥叶片中的吲哚糖苷可以长时间保存，本发明开发了一种使用微波干燥叶片生产植物靛蓝的工艺，主要流程为微波干燥处理叶片→吲哚糖苷提取→外源酶水解吲哚糖苷→靛蓝生产。为进一步验证该工艺的可行性，本发明比较该工艺与发酵生产得到靛蓝的产率及纯度。

图3发酵过程与外源酶转化过程中吲哚酚及吲哚糖苷变化。图3A为发酵；图3B为外源酶转化。

由图3A所示，新鲜叶片发酵组的吲哚酚含量随着发酵时间的延长逐渐增加，其在36h时达到最大值为0.42mg/g鲜叶；在48h时吲哚酚含量略有下降为0.37mg/g鲜叶。微波干燥叶片经水提后可得吲哚糖苷水溶液，在通氮气条件下向其中添加外源酶水解吲哚糖苷。吲哚糖苷在1h内基本上消耗完毕，最终生成吲哚酚的量为1.02mg/g鲜叶，如图3B所示，其吲哚酚生成量是发酵得到吲哚酚量的2.4倍。外源酶组吲哚酚的产率远大于发酵组的原因是发酵过程中生成的吲哚酚可能被叶片中存在的多种酶，如多酚氧化酶，转化为其它物质。然而，微波干燥组在干燥过程中的瞬时高温不仅遏制了β-葡萄糖苷酶对吲哚糖苷的分解，而且限制了其它酶对吲哚酚的影响，避免了副反应的发生。发酵组与外源酶转化组的靛蓝纯度及产率参见表1.

表1.发酵组与外源酶转化组的靛蓝纯度及产率

由表1可知，发酵组靛蓝的纯度为25.7％、靛玉红纯度为7.9％。微波干燥叶片水提吲哚糖苷后添加外源酶转化得到的靛蓝、靛玉红纯度分别为20.7％及4.9％。发酵组靛蓝及靛玉红纯度要稍高于外源酶组。但就产率而言，发酵组及外源酶组的靛蓝产率分别为0.17％及0.40％，外源酶组靛蓝的产率是发酵组靛蓝产率的2.4倍。这一比例与吲哚酚产率的比值相同，说明靛蓝产率与吲哚酚产率直接相关。本实施例试验测试结果表明使用微波干燥叶片经水提转化后生产植物靛蓝的工艺完全可行。目前前体物质酶解生成吲哚酚最为普遍的方法是短期发酵，这一过程基本需要2-3天，但采用微波干燥耦合外源酶水解工艺1h内可得到大量吲哚酚。与传统发酵相比，该工艺不仅提高了靛蓝产率，大幅缩短了反应时间，同时解决了靛蓝季节性生产的行业难题。

综上所述，本发明的生产工艺利用微波干燥的加热特性，在其短时间内快速钝化叶片中内源酶活力，达到保存叶片中靛蓝前体物质的作用，为植物靛蓝的全季节生产提供了稳定的物质基础。与传统靛蓝生产工艺相比，本发明的生产工艺大幅度地缩短了反应时间，提高了靛蓝前体物质的定向转化效率。

上面对本发明实施例结合附图进行了说明，但本发明不限于上述实施例，还可以根据本发明的发明创造的目的做出多种变化，凡依据本发明技术方案的精神实质和原理下做的改变、修饰、替代、组合或简化，均应为等效的置换方式，只要符合本发明的发明目的，只要不背离本发明的技术原理和发明构思，都属于本发明的保护范围。