一种基于CUBIC透明化抗体染色生物组织样本三维成像方法

技术领域

本发明涉及生物组织样本整体染色、三维成像技术领域，具体涉及一种基于CUBIC透明化抗体染色生物组织样本三维成像方法。

背景技术

在常规生物医学研究中，组织透明技术的理想属性是安全性、操作简单、可扩展性、低环境负担和高透明度，亲水性组织透明的方法有可能满足所有这些要求。基于亲水试剂的CUBIC试剂已被开发出来，以优先考虑安全性并减少环境负担，并且这些方案只需要将样品浸入透明介质中，以最大限度地减少实验程序的数量并易于处理多个样品。

CUBIC试剂的另一个优点是氨基醇能够使小鼠全器官和全身样品中的内源性血红素脱色；自首次报道CUBIC试剂以来，该试剂和方案一直在不断更新，以提高透明度并减少处理时间。

传统的免疫染色制作过程切片、裱片、成像、数据质量无保障(手工切片、数据易损、难配准)，只能获得低轴向分辨率的成像结果。

基于三维光学成像TDI-fMOST设备，对于整体染色的组织样本，其在切片的同时即完成成像，切片上下层之间为天然配准，不存在人工误差，匹配度较高，因此重构出的三维组织结果的准确度也较高，可较好解决以上问题。

发明内容

针对现有技术中存在的不足之处，本发明提供一种基于CUBIC透明化抗体染色生物组织样本三维成像方法。

本发明公开了一种基于CUBIC透明化抗体染色生物组织样本三维成像方法，包括：

将鼠脑组织置于CUBIC-1溶液中，进行脱脂脱水；

将脱脂脱水后的鼠脑组织，进行细胞膜通透处理；

将细胞膜通透处理后的鼠脑组织，进行封闭处理；

使用稀释的一抗GFAP和二抗Alexa

将经两次抗体孵育好的鼠脑组织，进行洗涤；

将洗涤后的鼠脑组织置于CUBIC-2溶液中进行匹配，而后使用树脂将鼠脑组织包埋；

将树脂包埋样本置于缓冲液水槽中，采用TDI～fMOST相机进行图像采集。

作为本发明的进一步改进，在对鼠脑组织进行脱脂脱水之前，还包括：

将鼠脑组织置于多聚甲醛溶液中固定；其中，多聚甲醛溶液的质量分数为3～5％，固定时间为2～48h。

作为本发明的进一步改进，鼠脑组织在CUBIC-1溶液中的静置时间为1～10d。

作为本发明的进一步改进，在对鼠脑组织进行脱脂脱水与细胞膜通透处理之间，还包括：

使用PBS对鼠脑组织进行洗涤；其中，PBS洗涤时间为1～3d。

作为本发明的进一步改进，使用PBS/TritonX-100/DMSO/甘氨酸溶液对鼠脑组织进行细胞膜通透处理；其中，TritonX-100的体积分数为0.001～1％，DMSO的体积分数为2～40％，甘氨酸的摩尔量为0.001～10M，处理温度为30～50℃。

作为本发明的进一步改进，使用PBS/Triton X/DMSO/山羊血清溶液对鼠脑组织进行封闭处理；其中，TritonX-100的体积分数为0.001～1％，DMSO的体积分数为2～40％，山羊血清的体积分数为0.001～10％，处理温度为30～50℃。

作为本发明的进一步改进，使用PBS/Tween-20/DMSO/山羊血清溶液稀释一抗GFAP；其中，Tween-20的体积分数为0.001～1％，DMSO的体积分数为2～40％，山羊血清的体积分数为0.001～10％，处理温度为30～50℃，处理时间为1～10d，一抗GFAP的投入比例为1:(10～10000)。

作为本发明的进一步改进，使用PBS/Tween-20/DMSO/山羊血清溶液稀释二抗Alexa

作为本发明的进一步改进，将经两次抗体孵育好的鼠脑组织置于PBS/Tween-20溶液中，进行洗涤；其中，Tween-20的体积分数为0.001～1％，处理时间为1～10d。

作为本发明的进一步改进，将树脂包埋样本置于0.05～0.2M的PBS缓冲液水槽中。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1、本发明采用CUBIC透明化的方法，既能减少实验程序的数量同时处理多个样本，又能在脱水脱脂和匹配的过程中抑制组织背景荧光；

2、本发明借助TDI-fMOST(荧光显微光学断层成像仪)对树脂包埋的样品进行边切削，边采集的方法实现对整体CUBIC透明化抗体染色鼠脑样本进行成像；从而获取1-10μm一层整体鼠脑连续切面图。

附图说明

图1为本发明实施例1提供的小鼠3mm鼠脑半脑精细切面图；

图2为本发明实施例1提供的小鼠3mm鼠脑半脑连续切面图，1～2μm一层；

图3为本发明实施例1提供的小鼠3mm鼠脑半脑立体三维图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下面结合附图对本发明做进一步的详细描述：

本发明提供一种基于CUBIC透明化抗体染色生物组织样本三维成像方法，该方法通过CUBIC-1试剂(CUBIC-1试剂成分为尿素、乙二胺、辛基酚聚氧乙烯醚、TritonX-100)对生物组织进行脱脂脱水，然后利用一抗GFAP能与星形胶质细胞结合，二抗Alexa

具体包括：

步骤1、将鼠脑组织置于多聚甲醛溶液中固定；其中，多聚甲醛溶液的质量分数为3～5％，固定时间为2～48h；选用的鼠脑组织可为直接购买的离体鼠脑组织，或者为向小鼠心脏灌注PBS后取下的鼠脑，该PBS溶液的摩尔量为0.05～0.2M。

步骤2、将鼠脑组织置于CUBIC-1溶液中，进行脱脂脱水；其中，鼠脑组织在CUBIC-1溶液中的静置时间为1～10d。

步骤3、使用PBS对鼠脑组织进行洗涤；其中，PBS洗涤时间为1～3d。

步骤4、将脱脂脱水后的鼠脑组织置于PBS/TritonX-100/DMSO/甘氨酸溶液中，进行细胞膜通透处理；其中，TritonX-100的体积分数为0.001～1％，DMSO的体积分数为2～40％，甘氨酸的摩尔量为0.001～10M，处理温度为30～50℃。

步骤5、将细胞膜通透处理后的鼠脑组织置于PBS/Triton X/DMSO/山羊血清溶液中，进行封闭处理；其中，TritonX-100的体积分数为0.001～1％，DMSO的体积分数为2～40％，山羊血清的体积分数为0.001～10％，处理温度为30～50℃。

步骤6、使用PBS/Tween-20/DMSO/山羊血清溶液稀释的一抗GFAP对封闭处理后的鼠脑组织进行孵育；其中，Tween-20的体积分数为0.001～1％，DMSO的体积分数为2～40％，山羊血清的体积分数为0.001～10％，处理温度为30～50℃，处理时间为1～10d，一抗GFAP的投入比例为1:(10～10000)。

步骤7、使用PBS/Tween-20/DMSO/山羊血清溶液稀释的二抗Alexa

步骤8、将经两次抗体孵育好的鼠脑组织置于PBS/Tween-20溶液中，进行洗涤；其中，Tween-20的体积分数为0.001～1％，处理时间为1～10d。

步骤9、将洗涤后的鼠脑组织置于CUBIC-2溶液中进行匹配，而后使用树脂将鼠脑组织包埋；

步骤10、将树脂包埋样本置于0.05～0.2M的PBS缓冲液水槽中，采用TDI～fMOST相机进行图像采集(水镜成像)。

实施例1：

一种基于CUBIC透明化抗体染色生物组织样本三维成像方法，包括：

S11、将鼠脑组织置于3％多聚甲醛溶液中固定，固定时间为24h；

S12、将鼠脑组织CUBIC-1中静置，静置时间为1d；

S13、使用PBS对鼠脑组织进行洗涤，洗涤时间为1d；

S14、然后将鼠脑组织置于PBS/TritonX-100/DMSO/甘氨酸溶液中进行细胞膜通透处理，TritonX-100的体积分数为0.001％，DMSO的体积分数为2％，甘氨酸的摩尔量为0.001M；

S15、将鼠脑组织置于PBS/TritonX/DMSO/山羊血清溶液中进行封闭处理，TritonX-100的体积分数为0.001％，DMSO的体积分数为2％，山羊血清的体积分数为0.001％，处理温度为30℃；

S16、使用PBS/Tween-20/DMSO/山羊血清溶液稀释的一抗(GFAP)孵育鼠脑组织，Tween-20的体积分数为0.001％，DMSO的体积分数为2％，山羊血清的体积分数为0.001％，处理温度为30℃，处理时间为2d，一抗投入比例为1:100；

S17、使用PBS/Tween-20/DMSO/山羊血清溶液稀释的二抗(Alexa

S18、将抗体孵育好的鼠脑组织置于PBS/Tween-20溶液中洗涤，Tween-20的体积分数为0.001％，处理时间为2d；

S19、利用鼠脑组织置于CUBIC-2溶液进行匹配，然后使用树脂将鼠脑组织包埋；

S110、将制作好的树脂包埋样本置于在0.05M的PBS缓冲液水槽中，利用TDI～fMOST相机进行采集(水镜成像)，得到如图3所示的小鼠3mm鼠脑半脑立体三维图。

如图1～2所示：使用振动切片机对鼠脑组织进行切片处理，利用显微镜初步成像；借助TDI-fMOST(荧光显微光学断层成像仪)对树脂包埋的样品进行边切削，边用PBS漂洗，边采集的方法实现对整体CUBIC透明化抗体染色树脂样品进行成像。

实施例2：

一种基于CUBIC透明化抗体染色生物组织样本三维成像方法，包括：

S21、将鼠脑组织置于5％多聚甲醛溶液中固定，固定时间为48h；

S22、将鼠脑组织CUBIC-1中静置，静置时间为3d；

S23、使用PBS对鼠脑组织进行洗涤，洗涤时间为10d；

S24、然后将鼠脑组织置于PBS/TritonX-100/DMSO/甘氨酸溶液中进行细胞膜通透处理，TritonX-100的体积分数为2％，DMSO的体积分数为10％，甘氨酸的摩尔量为1M；

S25、将鼠脑组织置于PBS/TritonX/DMSO/山羊血清溶液中进行封闭处理，TritonX-100的体积分数为2％，DMSO的体积分数为10％，山羊血清的体积分数为1％，处理温度为40℃；

S26、使用PBS/Tween-20/DMSO/山羊血清溶液稀释的一抗(GFAP)孵育鼠脑组织，Tween-20的体积分数为2％，DMSO的体积分数为10％，山羊血清的体积分数为1％，处理温度为40℃，处理时间为5d，一抗投入比例为1:1000；

S27、使用PBS/Tween-20/DMSO/山羊血清溶液稀释的二抗(Alexa

S28、将抗体孵育好的鼠脑组织置于PBS/Tween-20溶液中洗涤，Tween-20的体积分数为2％，处理时间为3d；

S29、利用鼠脑组织置于CUBIC-2溶液进行匹配，然后使用树脂将鼠脑组织包埋；

S210、将制作好的树脂包埋样本置于在0.05M的PBS缓冲液水槽中，利用TDI～fMOST相机进行采集(水镜成像)。

以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。