一种抗氧化修复组合物及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及化妆品领域，尤其涉及一种抗氧化修复组合物及其制备方法与应用。

背景技术

目前现有技术中，植物提取物在化妆品中的应用愈发广泛。石松提取物在临床常用于治疗类风湿性关节炎、颈椎病和急慢性软组织损伤、带状疱疹等疾病，在日化领域少有应用。羊耳菊在广西侗族地区民间常用羊耳菊根浸酒用于消炎消肿止痛，治疗关节痹痛，具有较好的疗效，但其抗炎镇痛作用的物质基础及作用原理还不清楚，其在日化领域少有应用。竹荪提取物在化妆品行业虽然有相关的应用，但竹荪提取物的方法繁多，水提、醇提、生物酶提取、超声提取、超临界二氧化碳提取或其它有机溶剂提取。使用有机溶剂提取固然能可选择的得到竹荪中的一些活性物成分，但有机溶剂的参与，会让得到的竹荪提取物在化妆品行业中应用受限，而超声提取虽然能一定程度上缩减提取时间，提高提取效率，但超声提取设备成本较高，且在提取后仍需要对提取液进行处理以得到澄清的提取液，因此该方法不适合工业生产方面，超临界提取同样因工业生产成本居高不下这一问题应用受限，生物酶是一种成本相对较低，提取条件温和的方法，但生物酶的使用对pH有一定的要求，且使用生物酶后需要高温灭活，生产工艺步骤较为繁琐，因而该方法同样不适和应用到工业生产中。单一水提法虽能得到理想的竹荪提取液，但由于竹荪中含有较多的蛋白质、氨基酸等物质，其水提液颜色较深且浑浊，达不到化妆品中的应用标准。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的不足之处而提供一种抗氧化修复组合物，将竹荪提取物、石松提取物、羊耳菊提取物复配后，协同增效，可提升组合物的活性物质含量，显著提升组合物的抗氧化功效，再搭配艾片，可显著提升修复效果，可应用于化妆品领域。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

第一方面，本发明提供了一种抗氧化修复组合物，包括以下重量份的组分：竹荪提取物1-5份、石松提取物1-5份、羊耳菊提取物1-5份。

竹荪是药膳常用的一种珍稀菌菇类成分，早在公元618年，我国民间就开始食用竹荪。竹荪有降血脂、抗氧化、增强免疫力以及保护肝脏、抗辐射等作用，可以镇痛、补气、降血压，对高血压、神经衰弱、肠胃疾病等具有保健及辅助治疗作用。竹荪是优良的植物蛋白和营养源。其含有丰富的挥发油、氨基酸、多糖及萜类化合物。在日化领域，用途集中在竹荪多糖和竹荪多肽进行抗氧化抗衰，保湿用途。

石松的生物碱类含量丰富、三萜类，此外还含有少量葸醌类成分及挥发油等。现代药理研究表明其具有抗炎、镇痛、抗菌、抑制乙酰胆碱酯酶活性等作用。临床常用于治疗类风湿性关节炎、颈椎病和急慢性软组织损伤、带状疱疹等疾病。

羊耳菊主要含有倍半萜、三萜、甾醇、黄酮、芳香化合物等化学成分，而三萜和甾醇居多。在广西侗族地区民间常用羊耳菊根浸酒用于消炎消肿止痛，治疗关节痹痛，具有较好的疗效。但其抗炎镇痛作用的物质基础及作用原理还不清楚。

竹荪提取物、石松提取物和羊耳菊提取物的重量份在本发明限定的范围内，具有良好的抗氧化和修复功效，缺少其中的任一种或超出本发明的范围均会导致抗氧化和修复功效下降。

优选地，上述的抗氧化修复组合物中，所述竹荪提取物为水提醇沉或醇提提取物；所述石松提取物为醇提提取物；所述羊耳菊提取物为醇提提取物。

更优选地，所述竹荪提取物为水提醇沉提取物。

水提醇沉法既能满足化妆品中对原料澄清度的要求，又能最大限度的保留活性成分，且在工业生产方面易于实现，具有绿色环保、成本低等优点。

更优选地，上述的抗氧化修复组合物包括以下重量份组分：竹荪提取物1份、石松提取物1份、羊耳菊提取物1份。

竹荪提取物、石松提取物和羊耳菊提取物为本发明的特定重量份下，半数清除率最低，抗氧化效果最好；斑马鱼胚胎尾鳍修护促进率高达23％，相比对比例增加了8％-18％。

优选地，上述的抗氧化修复组合物还包括以下重量份组分：艾片0.1-0.5份。

艾片为菊科植物，艾纳香Blumea balsamifera(L.)DC.的新鲜叶经提取加工制成的结晶，化学结构为左旋龙脑，具有抗炎舒缓，促进渗透吸收的效果，同时具有清凉感。复配之后可以促进抗氧化修复组合物的渗透吸收，加强修复效果。

更优选地，上述的抗氧化修复组合物中，艾片为0.2重量份。

第二方面，本发明提供了上述的抗氧化修复组合物的制备方法，包括如下步骤：

(1)将竹荪与水混合，加热，浸泡得到混合液；浓缩所得混合液，加入乙醇静置8h以上，过滤取滤液得到竹荪水提醇沉提取物或将竹荪与乙醇混合浸泡，过滤取滤液得到竹荪醇提提取物；

(2)将石松与乙醇混合，回流提取得到混合液，浓缩所得混合液，澄清，过滤取滤液得到石松提取物；

(3)将羊耳菊与乙醇混合，回流提取得到混合液，浓缩所得混合液，澄清，过滤取滤液得到羊耳菊提取物；

(4)按重量份称取步骤(1)所得竹荪水提醇沉提取物或竹荪醇提提取物、步骤(2)所得石松提取物、步骤(3)所得羊耳菊提取物和艾片，混合均匀，即得到所述抗氧化修复的组合物。

优选地，竹荪提取物采用水提醇沉法和醇提法提取，去除部分高分子多糖以及其它杂质，确保最终成品的澄清度。

水提醇沉法具体步骤为：将竹荪净选除杂，以防杂质过多对提取物造成不良影响，与水混合，于恒温80～90℃下浸泡至少2h；提取完成后，将提取液过滤干净后，浓缩，加入70～95％浓度的乙醇，醇沉静置得到醇沉液；将竹荪的醇沉液过滤干净后，回收乙醇至无醇味即可得到竹荪水提醇沉提取物。

醇提法的具体步骤为：将竹荪净选除杂，与40～70％浓度的乙醇混合，进行回流提取；提取完成后，回收乙醇至无醇味即可，随后浓缩提取液、澄清；过滤、浓缩，即可得到竹荪醇提提取物。

更优选地，竹荪提取物采用水提醇沉法提取。

水提醇沉法得到的竹荪提取物作为抗氧化修复组合物组分相比竹荪醇提提取物得到的活性物质更多，抗氧化效果、修复效果均得到提升。

优选地，羊耳菊提取物的制备方法为醇提法，对羊耳菊中的黄酮类物质进行提取，具体步骤为：将羊耳菊全株或根部净选除杂，与40～70％浓度的乙醇混合，进行回流提取；提取完成后，回收乙醇至无醇味即可，随后浓缩提取液、澄清、过滤、再次浓缩，即可得到羊耳菊提取物。

优选地，石松提取物为醇提法，对石松中的生物碱及黄酮类物质进行提取。

具体步骤为：将石松净选除杂，与40～70％浓度的乙醇混合，进行回流提取；提取完成后，回收乙醇至无醇味即可，随后浓缩提取液、澄清、过滤、再次浓缩，即可得到石松提取物。

第三方面，本发明提供了一种化妆品，包括上述的抗氧化修复组合物。

优选地，上述的化妆品，还包括保湿剂、防腐剂和水；所述保湿剂为甘油、1,3-丁二醇、丙二醇中的至少一种；所述防腐剂为1,2-己二醇和辛甘醇的复配物。

优选地，上述的化妆品，包括以下重量百分比的组分：抗氧化修复组合物3％-15％、甘油5％-50％、1,3-丁二醇0％-5％、丙二醇0％-45％、1,2-己二醇0.525％、辛甘醇0.175％、水为余量。

第四方面，本发明提供了上述化妆品的制备方法，按重量百分比将抗氧化修复组合物、保湿剂、防腐剂和水混合均匀即可得到所述化妆品。

本发明的有益之处在于：

目前已报道的文献中主要是对竹荪多糖的美白、抗衰、保湿这三个方面着手，纵然竹荪多糖在这三方面有着不俗的表现，但在制备过程中需对竹荪多糖进行提纯，这不仅使得竹荪提取物的制备过程更加复杂，并且会对竹荪提取物中其它的一些活性成分造成浪费。本发明的制备工艺简单，且制备过程中未使用任何有毒有害的化学物质，安全、无有毒物质残留、对人体无害、绿色环保，且最终产品呈现黄色澄清透明状，易于在化妆品中应用，非单一活性成分提取，使得本发明中的竹荪提取物有着优异的抗炎舒缓功效。

但是竹荪提取物的修复效果和抗氧化效果，效果不佳。通过筛选，竹荪与羊耳菊及石松复配，协同增效，具有更丰富的总多糖及总黄酮活性物、更优异的抗氧化效果及修复效果。

附图说明

图1为总多糖含量测定的标准曲线图。

图2为总三萜含量测定的标准曲线图。

图3为总黄酮含量测定的标准曲线图。

图4为斑马鱼胚胎尾鳍修护促进测试流程图。

图5为斑马鱼尾鳍切除模型测试前后的变化图。

图6为实施例3与空白对照组的斑马鱼胚胎尾鳍长度变化对比图；上图为空白对照组，下图为实施例组。

图7为对比例4与空白对照组的斑马鱼胚胎尾鳍长度变化对比图；上图为空白对照组，下图为对比例组。

具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。

外观及理化指标：

外观与性状：黄色至棕色澄清液体

气味：特有气味

pH值(10％水溶液)：3.5～6.0

相对密度(20℃)：0.9900～1.2520

折光率(20℃)：1.2600～1.5200

总三萜(％)：≥1.0

总多糖(mg/mL)：≥4.0

总黄酮(mg/mL)：≥0.7

实施例1：

本发明抗氧化修复组合物的一种实施例，包括以下重量份的组分：竹荪提取物5份、石松提取物5份、羊耳菊提取物5份。

所述竹荪提取物为水提醇沉提取物；所述石松提取物为醇提提取物；所述羊耳菊提取物为醇提提取物。

上述抗氧化修复组合物的制备方法，包括如下步骤：

(1)将竹荪净选除杂，与水混合，于恒温80～90℃下浸泡至少2h；提取完成后，将提取液过滤干净后，浓缩，加入70～95％浓度的乙醇，醇沉静置得到醇沉液；将竹荪的醇沉液过滤干净后，回收乙醇至无醇味即可得到竹荪水提醇沉提取物；

(2)将石松净选除杂，与40～70％浓度的乙醇混合，进行回流提取；提取完成后，回收乙醇至无醇味即可，随后浓缩提取液、澄清、过滤、再次浓缩，即可得到石松提取物；

(3)将羊耳菊全株或根部净选除杂，与40～70％浓度的乙醇混合，进行回流提取；提取完成后，回收乙醇至无醇味即可，随后浓缩提取液、澄清、过滤、再次浓缩，即可得到羊耳菊提取物；

(4)按重量份称取步骤(1)所得竹荪水提醇沉提取物、步骤(2)所得石松提取物、步骤(3)所得羊耳菊提取物，混合均匀，即得到所述抗氧化修复的组合物。

一种化妆品，包括以下重量百分比的组分：抗氧化修复组合物15％、甘油50％、1,2-己二醇0.525％、辛甘醇0.175％、水为余量。

按重量百分比将上述组分混合均匀即可得到所述化妆品。

实施例2：

本发明抗氧化修复组合物的一种实施例，包括以下重量份的组分：竹荪提取物5份、石松提取物5份、羊耳菊提取物5份。

所述竹荪提取物为醇提提取物；所述石松提取物为醇提提取物；所述羊耳菊提取物为醇提提取物。

上述抗氧化修复组合物的制备方法，包括如下步骤：

(1)将竹荪净选除杂，与40～70％浓度的乙醇混合，进行回流提取；提取完成后，回收乙醇至无醇味即可，随后浓缩提取液、澄清；过滤、浓缩，即可得到竹荪醇提提取物；

(2)将石松净选除杂，与40～70％浓度的乙醇混合，进行回流提取；提取完成后，回收乙醇至无醇味即可，随后浓缩提取液、澄清、过滤、再次浓缩，即可得到石松提取物；

(3)将羊耳菊全株或根部净选除杂，与40～70％浓度的乙醇混合，进行回流提取；提取完成后，回收乙醇至无醇味即可，随后浓缩提取液、澄清、过滤、再次浓缩，即可得到羊耳菊提取物；

(4)按重量份称取步骤(1)所得竹荪醇提提取物、步骤(2)所得石松提取物、步骤(3)所得羊耳菊提取物，混合均匀，即得到所述抗氧化修复的组合物。

一种化妆品，包括以下重量百分比的组分：抗氧化修复组合物15％、甘油50％、1,2-己二醇0.525％、辛甘醇0.175％、水为余量。

按重量百分比将上述组分混合均匀即可得到所述化妆品。

实施例3：

本发明抗氧化修复组合物的一种实施例，包括以下重量份的组分：竹荪提取物1份、石松提取物1份、羊耳菊提取物1份。

所述竹荪提取物为水提醇沉提取物；所述石松提取物为醇提提取物；所述羊耳菊提取物为醇提提取物。

上述抗氧化修复组合物的制备方法同实施例1。

一种化妆品，包括以下重量百分比的组分：抗氧化修复组合物3％、甘油50％、1,2-己二醇0.525％、辛甘醇0.175％、水为余量。

按重量百分比将上述组分混合均匀即可得到所述化妆品。

实施例4：

本发明抗氧化修复组合物的一种实施例，包括以下重量份的组分：竹荪提取物5份、石松提取物5份、羊耳菊提取物5份、艾片0.2份。

所述竹荪提取物为醇提提取物；所述石松提取物为醇提提取物；所述羊耳菊提取物为醇提提取物。

上述抗氧化修复组合物的制备方法，包括如下步骤：

(1)将竹荪净选除杂；与40～70％浓度的乙醇混合，进行回流提取；提取完成后，回收乙醇至无醇味即可，随后浓缩提取液、澄清；过滤、浓缩，即可得到竹荪醇提提取物；

(2)将石松净选除杂，与40～70％浓度的乙醇混合，进行回流提取；提取完成后，回收乙醇至无醇味即可，随后浓缩提取液、澄清、过滤、再次浓缩，即可得到石松提取物；

(3)将羊耳菊全株或根部净选除杂，与40～70％浓度的乙醇混合，进行回流提取；提取完成后，回收乙醇至无醇味即可，随后浓缩提取液、澄清、过滤、再次浓缩，即可得到羊耳菊提取物；

(4)按重量份称取步骤(1)所得竹荪醇提提取物、步骤(2)所得石松提取物、步骤(3)所得羊耳菊提取物和艾片，混合均匀，即得到所述抗氧化修复的组合物。

一种化妆品，包括以下重量百分比的组分：抗氧化修复组合物15.2％、甘油30％、1,2-己二醇0.525％、辛甘醇0.175％、丙二醇45％、水为余量。

按重量百分比将上述组分混合均匀即可得到所述化妆品。

实施例5：

本发明抗氧化修复组合物的一种实施例，包括以下重量份的组分：竹荪提取物1份、石松提取物1份、羊耳菊提取物1份、艾片0.2份。

所述竹荪提取物为水提醇沉提取物；所述石松提取物为醇提提取物；所述羊耳菊提取物为醇提提取物。

上述抗氧化修复组合物的制备方法，包括如下步骤：

(1)将竹荪净选除杂，与水混合，于恒温80～90℃下浸泡至少2h；提取完成后，将提取液过滤干净后，浓缩，加入70～95％浓度的乙醇，醇沉静置得到醇沉液；将竹荪的醇沉液过滤干净后，回收乙醇至无醇味即可得到竹荪水提醇沉提取物；

(2)将石松净选除杂，与40～70％浓度的乙醇混合，进行回流提取；提取完成后，回收乙醇至无醇味即可，随后浓缩提取液、澄清、过滤、再次浓缩，即可得到石松提取物；

(3)将羊耳菊全株或根部净选除杂，与40～70％浓度的乙醇混合，进行回流提取；提取完成后，回收乙醇至无醇味即可，随后浓缩提取液、澄清、过滤、再次浓缩，即可得到羊耳菊提取物；

(4)按重量份称取步骤(1)所得竹荪水提醇沉提取物、步骤(2)所得石松提取物、步骤(3)所得羊耳菊提取物和艾片，混合均匀，即得到所述抗氧化修复的组合物。

一种化妆品，包括以下重量百分比的组分：抗氧化修复组合物3.2％、甘油45％、1,2-己二醇0.525％、辛甘醇0.175％、丁二醇5％、水为余量。

按重量百分比将上述组分混合均匀即可得到所述化妆品。

实施例6：

本发明抗氧化修复组合物的一种实施例，包括以下重量份的组分：竹荪提取物1份、石松提取物1.1份、羊耳菊提取物1.1份。

所述竹荪提取物为水提醇沉提取物；所述石松提取物为醇提提取物；所述羊耳菊提取物为醇提提取物。

上述抗氧化修复组合物的制备方法同实施例1。

一种化妆品，包括以下重量百分比的组分：抗氧化修复组合物3％、甘油50％、1,2-己二醇0.525％、辛甘醇0.175％、水为余量。

按重量百分比将上述组分混合均匀即可得到所述化妆品。

实施例7：

本发明抗氧化修复组合物的一种实施例，包括以下重量份的组分：竹荪提取物1份、石松提取物1份、羊耳菊提取物1份、艾片0.1份。

所述竹荪提取物为水提醇沉提取物；所述石松提取物为醇提提取物；所述羊耳菊提取物为醇提提取物。

上述抗氧化修复组合物的制备方法同实施例5。

一种化妆品，包括以下重量百分比的组分：抗氧化修复组合物3.1％、甘油45％、1,2-己二醇0.525％、辛甘醇0.175％、丁二醇5％、水为余量。

按重量百分比将上述组分混合均匀即可得到所述化妆品。

实施例8：

本发明抗氧化修复组合物的一种实施例，包括以下重量份的组分：竹荪提取物1份、石松提取物1份、羊耳菊提取物1份、艾片0.5份。

所述竹荪提取物为水提醇沉提取物；所述石松提取物为醇提提取物；所述羊耳菊提取物为醇提提取物。

上述抗氧化修复组合物的制备方法同实施例5。

一种化妆品，包括以下重量百分比的组分：抗氧化修复组合物3.5％、甘油45％、1,2-己二醇0.525％、辛甘醇0.175％、丁二醇5％、水为余量。

按重量百分比将上述组分混合均匀即可得到所述化妆品。

对比例1：

本发明抗氧化修复组合物的一种对比例，包括以下重量份的组分：石松提取物1份、羊耳菊提取物1份。

所述石松提取物为醇提提取物；所述羊耳菊提取物为醇提提取物。

上述抗氧化修复组合物的制备方法与实施例3的区别为：缺少竹荪提取物。

一种化妆品，包括以下重量百分比的组分：抗氧化修复组合物2％、甘油50％、1,2-己二醇0.525％、辛甘醇0.175％、水为余量。

按重量百分比将上述组分混合均匀即可得到所述化妆品。

对比例2：

本发明抗氧化修复组合物的一种对比例，包括以下重量份的组分：竹荪提取物1份、羊耳菊提取物1份。

所述竹荪提取物为水提醇沉提取物；所述羊耳菊提取物为醇提提取物。

上述抗氧化修复组合物的制备方法与实施例3的区别为：缺少石松提取物。

一种化妆品，包括以下重量百分比的组分：抗氧化修复组合物2％、甘油50％、1,2-己二醇0.525％、辛甘醇0.175％、水为余量。

按重量百分比将上述组分混合均匀即可得到所述化妆品。

对比例3：

本发明抗氧化修复组合物的一种对比例，包括以下重量份的组分：竹荪提取物1份、石松提取物1份。

所述竹荪提取物为水提醇沉提取物；所述石松提取物为醇提提取物。

上述抗氧化修复组合物的制备方法与实施例3的区别为：缺少羊耳菊提取物。

一种化妆品，包括以下重量百分比的组分：抗氧化修复组合物2％、甘油50％、1,2-己二醇0.525％、辛甘醇0.175％、水为余量。

按重量百分比将上述组分混合均匀即可得到所述化妆品。

对比例4：

本发明抗氧化修复组合物的一种对比例，包括以下重量份的组分：竹荪提取物1份。

所述竹荪提取物为水提醇沉提取物。

上述抗氧化修复组合物的制备方法与实施例3的区别为：缺少石松提取物和羊耳菊提取物。

一种化妆品，包括以下重量百分比的组分：抗氧化修复组合物1％、甘油50％、1,2-己二醇0.525％、辛甘醇0.175％、水为余量。

按重量百分比将上述组分混合均匀即可得到所述化妆品。

对比例5：

本发明抗氧化修复组合物的一种对比例，包括以下重量份的组分：竹荪提取物0.1份、石松提取物0.1份、羊耳菊提取物0.1份。

所述竹荪提取物为水提醇沉提取物；所述石松提取物为醇提提取物；所述羊耳菊提取物为醇提提取物。

上述抗氧化修复组合物的制备方法同实施例1。

一种化妆品，包括以下重量百分比的组分：抗氧化修复组合物0.3％、甘油50％、1,2-己二醇0.525％、辛甘醇0.175％、水为余量。

按重量百分比将上述组分混合均匀即可得到所述化妆品。

对比例6

本发明抗氧化修复组合物的一种对比例，包括以下重量份的组分：竹荪提取物0.1份、石松提取物0.1份、羊耳菊提取物0.1份。

所述竹荪提取物为醇提提取物；所述石松提取物为醇提提取物；所述羊耳菊提取物为醇提提取物。

上述抗氧化修复组合物的制备方法同实施例2。

一种化妆品，包括以下重量百分比的组分：抗氧化修复组合物0.3％、甘油50％、1,2-己二醇0.525％、辛甘醇0.175％、水为余量。

按重量百分比将上述组分混合均匀即可得到所述化妆品。

对比例7：

本发明抗氧化修复组合物的一种对比例，包括以下重量份的组分：竹荪提取物0.1份、石松提取物0.1份、羊耳菊提取物0.1份、艾片0.2份。

所述竹荪提取物为水提醇沉提取物；所述石松提取物为醇提提取物；所述羊耳菊提取物为醇提提取物。

上述抗氧化修复组合物的制备方法同实施例5。

一种化妆品，包括以下重量百分比的组分：抗氧化修复组合物0.5％、甘油30％、1,2-己二醇0.525％、辛甘醇0.175％、丙二醇20％、水为余量。

按重量百分比将上述组分混合均匀即可得到所述化妆品。

对比例8：

本发明抗氧化修复组合物的一种对比例，包括以下重量份的组分：竹荪提取物0.2份、石松提取物0.3份、羊耳菊提取物0.3份。

所述竹荪提取物为水提醇沉提取物；所述石松提取物为醇提提取物；所述羊耳菊提取物为醇提提取物。

上述抗氧化修复组合物的制备方法同实施例1。

一种化妆品，包括以下重量百分比的组分：抗氧化修复组合物0.％、甘油50％、1,2-己二醇0.525％、辛甘醇0.175％、水为余量。

按重量百分比将上述组分混合均匀即可得到所述化妆品。

测试例1——总多糖的含量测定(苯酚-硫酸法)

实验方法：

1、试剂的制备

(1)5％苯酚溶液：称取苯酚2.5g，加水定容至50mL，混匀即得。

(2)葡萄糖标准品母液：称取葡萄糖4.5mg定容50mL容量瓶(定容准确，4℃冰箱保存)

(3)样本母液：(样本稀释1000倍：10uL样本+9mL水+990uL水)精密量取稀释后样本1mL置于干燥的10mL具塞试管中。

2、标准曲线的制备

精确量取对照品溶液0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL分别置于10mL具塞试管中，各加双蒸水补足至1.0mL(先加水，再加母液)，分别配制成0、18、36、54、72、90μg/mL的溶液，进行苯酚-硫酸显色反应，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标(实际称量及稀释浓度)，绘制标准曲线，标准曲线如图1所示。

3、样品测定

精确量取一系列浓度的葡萄糖标准溶液、样品溶液和双蒸水各1.0mL，置10mL的具塞试管中(注意观察具塞试管干燥，不能有水，否则浓度变化)，精确加入5％苯酚溶液1mL(临用配制)，涡旋混匀；再精确加入硫酸5mL，封口膜封住，涡旋混匀，置沸水浴100℃中加热20分钟(时间精确，正计时方便同时计时，注意水没过反应液，注意具塞试管底部是否漏液)，取出，置冰浴中冷却5分钟，涡旋摇匀，静置无气泡后，于紫外分光度仪测定波长488nm下测定吸光度。从标准曲线上读出供试品溶液中无水葡萄糖的量，按式(1)计算，即得。结果如表1所示。

浓度(mg/mL)＝C样本*稀释倍数*10

表1

由上表可知，实施例1-8的总多糖含量均比对比例1-4高，说明缺少竹荪提取物、石松提取物和羊耳菊提取物中的任一种均会导致总多糖含量下降；实施例1-8的总多糖均比对比例5-8高，说明竹荪提取物、石松提取物和羊耳菊提取物的重量份超出本发明的范围，导致总多糖含量的下降。

实施例1的总多糖含量最多，实施例3与实施例1相比，活性物富集量相当，但原材料用量较少，因此为最佳实施例。实施例4和实施例5添加了艾叶为组分，但对总多糖含量影响不大。

实施例1和实施例2相比，相同重量份下，采用水提醇沉法获得的竹荪提取物及石松提取物，与羊耳菊提取物复配，相比醇提竹荪提取物，总多糖含量更高。总多糖的含量高，为抗氧化修复组合物实现高的抗炎、抗氧化功效提供了物质基础。

测试例2——总三萜的含量测定(香草醛-浓硫酸法)

实验方法：

1、试剂的制备

试剂与试药：准备分析纯甲醇、三氯甲烷、浓硫酸、香草醛、熊果酸标准品。

2、溶液配制：

(1)香草醛溶液：称取4.0g香草醛，加甲醇溶解，定容于50mL容量瓶中，摇匀即得。

(2)72％硫酸溶液：取122mL水，缓慢加入288mL浓硫酸，混匀即得。

(3)熊果酸标准品母液：精确称取熊果酸标准品2mg，加三氯甲烷10mL制成每1mL含0.2mg熊果酸的溶液，即得。

3、测试方法

(1)标准曲线的制备：精确量取标准品溶液0、0.07mL、0.14mL、0.21mL、0.28mL、0.35mL、0.42mL、0.49mL分别置于10mL具塞试管中，水浴80℃蒸干溶剂，放冷，精确加入新配制的香草醛溶液0.5mL、72％硫酸5mL，涡旋混匀，在60℃水浴中加热30分钟，立即置于冰浴中冷却15分钟，取出，涡旋混匀，在548nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标、浓度为横坐标绘制标准曲线，标准曲线如图2所示。

(2)提取物含量测定：按照标准曲线的制备项下的方法，取0.1mL样品溶液(预实验确定稀释倍数)置10mL具塞试管中，照标准曲线制备项下的方法，自“水浴蒸干溶剂”起，同法操作，测定吸光度，从标准曲线上读出样品溶液中熊果酸的含量，按式(2)计算，即得。结果如表(2)所示。

三萜含量＝C样品*稀释倍数*0.5/V样品式(2)

表2

由上表可知，实施例1-8的总三萜含量比对比例1高，说明缺少竹荪提取物会导致总三萜含量下降；总三萜含量与竹荪提取物的含量高低相关。实施例1-8的总三萜均比对比例5-8高，说明竹荪提取物、石松提取物和羊耳菊提取物的重量份超出本发明的范围，导致总三萜含量的下降。

实施例1的总三萜含量最多，实施例3与实施例1相比，活性物富集量相差不大，但原材料用量较少，实施例4竹荪提取物、石松提取物和羊耳菊提取物的重量份较大，容易析出沉淀，体系不稳定。

实施例1和实施例2相比，相同重量份下，采用水提醇沉法获得的竹荪提取物及石松提取物，与羊耳菊提取物复配，相比醇提竹荪提取物，总三萜含量更高。

测试例3——总黄酮的含量测定

实验方法：

1、试剂的制备

(1)5％亚硝酸钠溶液：称取5.0g亚硝酸钠，加纯化水溶解，定容于100mL容量瓶中，摇匀，避光保存。

(2)10％硝酸铝溶液：称取10.0g硝酸铝，加纯化水溶解，定容于100mL容量瓶中，摇匀，避光保存。

(3)4％氢氧化钠溶液：称取4.0g氢氧化钠，加纯化水溶解，定容于100mL容量瓶中，摇匀，保存。

(4)70％乙醇：量取70mL无水乙醇，加水定容至100mL，混匀即得。

2、对照品溶液的制备

精确称取在120℃干燥至恒重的芦丁对照品5mg，置于50mL棕色量瓶中，加70％乙醇适量(30mL)，置水浴上微热或超声处理使粉末溶解，放冷，再加70％乙醇定容至刻度，摇匀，即得(每1mL溶液中含无水芦丁0.1mg)。

3、标准由线的制备

精确吸取芦丁标准溶液0mL、1mL、2mL、3mL、4mL、5mL分别置于10mL容量瓶中，各加70％乙醇至5mL，摇匀；加5％亚硝酸钠溶液0.3mL，混匀，放置6min；加10％硝酸铝溶液0.3mL，混匀，放置6min；再加4％氢氧化钠溶液4mL，加70％乙醇定容至刻度，放置15min；以试剂空白为参比，立即照紫外-可见分光光度法，在510nm处的波长测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，标准曲线如图3所示。

4、样品测定

取样品溶液1mL，置于10mL容量瓶中，加入5％亚硝酸钠溶液0.3mL，混匀，放置6min；加入10％硝酸铝溶液0.3mL，混匀，放置6min；再加入4％氢氧化钠溶液4.0mL，加70％乙醇定容至刻度，放置15min；以试剂空白为参比，照紫外-可见分光光度法，在510nm处的波长测定吸光度，从标准曲线中读出待测溶液中芦丁的含量，按式(3)计算样品中总黄酮的含量，即得。结果如表3所示。

浓度(mg/mL)＝C样本*稀释倍数*10

表3

由上表可知，实施例1-8的总黄酮含量均比对比例1-4高，说明缺少竹荪提取物、石松提取物和羊耳菊提取物中的任一种均会导致总黄酮含量下降；实施例1-8的总黄酮均比对比例5-8高，说明竹荪提取物、石松提取物和羊耳菊提取物的重量份超出本发明的范围，导致总黄酮含量的下降。

实施例1虽总黄酮含量最多，但是容易析出沉淀。实施例3与实施例1相比，活性物富集量相差不大，原材料用量较少，性价比更高且体系更稳定因此为最佳实施例。

实施例1和实施例2相比，相同重量份下，采用水提醇沉法获得的竹荪提取物及石松提取物，与羊耳菊提取物复配，相比醇提竹荪提取物，总黄酮含量更高。对比例4的竹荪提取物未复配其他组分，总黄酮含量最低。

测试例4——抗氧化能力测试(清除DPPH自由基)

抗氧化活性可以通过评估试验样品对DPPH自由基的抑制率来表征。DPPH分析法是一种筛选自由基清除剂，评价抗氧化活性的简便方法。DPPH的乙醇溶液显紫色，最大吸收波长为517nm。当DPPH溶液加入自由基清除剂，其孤对电子被配对时，吸收消失或减弱，导致溶液颜色变浅，显黄色或淡黄色，在517nm处的吸光度变小，其变化程度与自由基清除强度呈线性关系，因而可用分光光度计法进行定量分析。达到DPPH自由基50％清除率的样品浓度越低，即半数清除率(EC50)越低，表示该物质清除自由基能力越强。

实验方法：

1、试剂的制备

溶液配制：

0.05mmol/L DPPH溶液：称取0.0020g DPPH，用无水乙醇充分溶解，定容至100mL。避光保存，3.5h内用完。

样品液：用合适的溶剂溶解样品(根据极性选择，首选无水乙醇)，为方便计算可配置成1mg/mL浓度。

2、预实验

取DPPH溶液3.5mL于试管中，往其中加少量样品液，加样时，先少后多渐加，边加边混合，并观察溶液的褪色情况，当溶液颜色基本褪色时，记录样品的加样量。此加样量即为样品的最大用量，在此最大用量的基础上，往前设置5个用量，使之成等差数列。(例如X：200、160、120、80、40uL，样品溶剂:(1000uL-x)。若总体积为9mL，则DPPH自由基工作液7mL，样品液为2mL，依此类推)

3、测量方法

1)吸光度A：取3.5mL DPPH溶液，加入不同浓度的样品液，立即混匀，室温下避光静置反应30min，于517nm波长处测定吸光值A；

2)吸光度A1：测定1mL不同浓度样品液与3.5mL无水醇溶液在517nm波长处的吸光值(若样品在517nm处无吸收，则此步可省略)；

3)吸光度A0：再测定3.5mL DPPH溶液与1mL 70％乙醇在517nm波长处的吸光值。每个浓度平行操作2-3次，取平均值。

4、清除率计算

DPPH·自由基清除率按式(4)或式(5)计算：

清除率ROS(％)＝[1-(A-A1/A0)]×100％式(4)

清除率ROS(％)＝(AO-A/A0)×100％式(5)

其中，式(4)中：A为试样与DPPH反应的吸光度，A1为无水乙醇代替DPPH的对照吸光度；AO为70％乙醇代替样品的空白吸光度。

式(5)中：A0为蒸馏水做空白的吸光度，A为加入样品后的吸光度。

结果如表4所示。

表4

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由上表可知，实施例1-8的半数清除率均比对比例1-4低，说明缺少竹荪提取物、石松提取物和羊耳菊提取物中的任一种均会导致半数清除率上升，抗氧化能力下降；实施例1-8的半数清除率均比对比例5-8低，说明竹荪提取物、石松提取物和羊耳菊提取物的重量份超出本发明的范围，导致半数清除率上升，抗氧化能力下降。

实施例1和实施例2相比，相同重量份下，采用水提醇沉法获得的竹荪提取物及石松提取物，与羊耳菊提取物复配，相比醇提竹荪提取物，半数清除率更低，抗氧化能力更强。竹荪提取物(水提)与石松提取物与羊耳菊提取物复配，可以增加抗氧化修复组合物的DPPH自由基模型的抗氧化能力。

测试例5——斑马鱼尾鳍修复效果

当受到伤害时，皮肤必须快速重生来修复皮肤屏障。在胚胎阶段，伤口愈合十分迅速且不会留下伤疤；但过了胚胎阶段，伤口愈合需经过凝血、炎症、皮肤再生、血管重生和肉芽组织的形成，最终形成伤疤等步骤。斑马鱼在伤口修复过程中，除了不会形成凝血外，其余步骤和人类相同，斑马鱼伤口皮肤愈合非常迅速，紧接着炎症细胞迁移至伤口形成由巨噬细胞、纤维细胞、血管和胶原蛋白组成的肉芽组织。因此，斑马鱼和人类伤口愈合的主要步骤和原理十分一致，可以作为人体皮肤修护功效的检测筛查模型。

修复效果：应用斑马鱼胚胎尾鳍切除模型进行测试。

实验方法：

应用斑马鱼胚胎尾鳍切除模型进行测试。将24条尾鳍切除鱼胚胎暴露于5％配方添加浓度的样品溶液中，同时设置模型对照组，暴露48h后于显微镜下对鱼胚胎进行拍照，测量尾鳍再生长度并进行统计分析。对比各组样品在5％配方添加浓度下对斑马鱼胚胎尾鳍修护促进率。

斑马鱼胚胎尾鳍切除模型测试流程图如图4所示。

测试步骤：挑选健康的受精后3天大的斑马鱼胚胎。

1、建立损伤模型

使用三卡因溶液麻醉斑马鱼胚胎，于显微镜下用实验解剖刀切除斑马鱼胚胎尾鳍(图4)。

2、测试分组

测试需设定模型对照组(鱼胚胎培养液/溶剂溶液)、阳性对照组(熟地黄提取物)和受试物组(受试物)。

2.1模型对照组设置

随机挑选24尾鱼胚胎至96-孔板中，每孔含1粒鱼胚胎和0.2mL鱼胚胎培养液。

2.2阳性对照组设置

随机挑选24尾鱼胚胎至96-孔板中，每孔含一粒鱼胚胎和0.2mL熟地黄提取物溶液。

2.3受试物处理

随机挑选24尾鱼胚胎至96-孔板中，每孔含1粒鱼胚胎和0.2mL受试物溶液。

放置于28℃±1℃恒温箱中培养48h±1h。

3、样本的显微分析

用三卡因将斑马鱼麻醉，然后放到体式显微镜下对鱼胚胎尾部进行侧面拍照。

4、数据和结果计算

(1)计算每尾鱼胚胎尾鳍长度，见图3。

(2)尾鳍修护促进率的计算如式(6)所示：

促进率＝(S-C)/C×100％式(6)

式(6)中，S为受试物处理组鱼胚胎尾鳍长度的平均值；C为模型对照组鱼胚胎尾鳍长度的平均值。

计算各实验组的平均值及标准误差，统计学处理结果用平均值±标准误差表示，使用统计学软件对数据进行方差分析，对受试物组和模型对照组间尾鳍长度进行双尾T检验，取得p值，p＜0.05表示有显著性差异。

5、测试有效性验证

(1)测试判定：各测试组暴露完成后至少90％鱼胚胎存活，否则对应测试组结果无效。

(2)测试要求：每批次测试须设置阳性对照组，要求每批次测试阳性对照组鱼胚胎尾鳍修护促进率为正数且p<0.05。

结果如表5所示。

表5

由上表可知，实施例1-8的斑马鱼胚胎尾鳍修护促进率均比对比例1-4高，说明缺少竹荪提取物、石松提取物和羊耳菊提取物中的任一种均会导致斑马鱼胚胎尾鳍修护促进率下降，修复效果下降；图6为实施例3与空白对照组的斑马鱼胚胎尾鳍长度变化对比图，图7为对比例4与空白对照组的斑马鱼胚胎尾鳍长度变化对比图，可以看出实施例3和对比例4含有竹荪提取物均具有修护效果，但实施例3的竹荪提取物、石松提取物和羊耳菊提取物协同作用，显著促进修复效果。

实施例1-8的斑马鱼胚胎尾鳍修护促进率均比对比例5-8低，说明竹荪提取物、石松提取物和羊耳菊提取物的重量份超出本发明的范围，导致斑马鱼胚胎尾鳍修护促进率下降，修复效果下降。

其余组分为同样的重量份时，实施例1、2与实施例相比，实施例3与实施例5相比，添加了艾片后，斑马鱼胚胎尾鳍修护促进率上升了5％，增强了修复效果。实施例4和实施例5添加了艾片为组分，斑马鱼胚胎尾鳍修护促进率更佳。艾片可增强渗透吸收，促进修复效果。基于产品的稳定性和研发成本性价比，优选出实施例3与实施例5。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。