生物酵素发酵的酶解法提取肝素钠粗品的无盐生产技术

技术领域

本发明涉及生物酵素发酵的酶解法提取肝素钠粗品的无盐生产技术，属于从猪小肠黏膜提取肝素钠粗品的生产技术领域。

背景技术

肝素钠(Heparin Sodium)是一种在医学领域广泛应用于抗凝血抗血栓的生物药剂。肝素抗凝剂广泛应用于(a)治疗各种疾病并发的播散性血管内凝血早期；(b)预防动、静脉血栓和肺栓塞；(c)治疗动、静脉血栓和肺栓塞，缺血性脑卒中，不稳定型心绞痛(减轻症状、预防心肌梗塞)，急性心肌梗塞(防止早期再梗塞和梗塞区延展，降低病死率)；(d)作为溶血栓疗法的维持治疗；(e)用于输血时预防血液凝固及血库保存鲜血等体外抗凝剂。

肝素钠分子结构极其复杂，还没有人工合成肝素钠成功的例子，只能从动物组织中提取。目前，官方药政认可的肝素钠来源，是从猪小肠黏膜液提取。肝素钠为酸性黏多糖，是由葡萄糖胺，L-艾杜糖醛苷、N-乙酰葡萄糖胺和D-葡萄糖醛酸交替组成的黏多糖硫酸脂，平均分子量为15KD，主要由肥大细胞和嗜碱性粒细胞产生。

粗品肝素钠生产原料为猪小肠，猪小肠经刮肠机加工，将肠衣与肠黏膜分离。目前，行业内现有肝素钠粗品的生产技术方案，主要有高盐盐解法、中等盐度和稀浆黏膜液的酶解法、盐解酶解复合法，和中等盐度和稀浆黏膜液的复合酶双酶酶解法等。尤其高盐盐解法和盐解酶解复合法中，在提取过程中添加肠衣盐水和肠衣盐，致使盐浓度高达质量分数3.5％(中等盐度和稀浆黏膜液)，造成废水处理难度大、成本高。

提取肝素钠粗品后的废水中，含有大量小肠黏膜蛋白质和小分子肽营养成分，含量高达9～12％，可作为动物饲料的优质营养添加剂，或者有机复合肥的优质有机质。但是，所述营养添加剂和有机质对氯离子含量有严格的要求(≤0.1％即1000ppm以下)，相应地，提取肝素钠粗品后的废水中氯离子浓度需要控制在0.3％(3000ppm)以下，才能实现废水的变废为宝。为降低提取肝素钠废水中的氯化钠含量，现有技术中出现了无盐提取肝素钠粗品的方法，但是现有的无盐提取方法或依赖于特定设备达到特定效果，或无法实现预期的效果。专利CN 115448995A涉及一种肝素钠粗品的无盐提取方法。每2000根动物小肠最终可获得的肝素钠含量达到1075g，但是得率低，并且提取中需要用到超声，对设备的要求高。专利CN 103724456A提供了一种肝素钠的常温无盐提取工艺，采用由蛋白酶、脂肪酶和核酸酶组成的复合酶制剂在常温无盐条件进行酶解，再用离子交换树脂吸附离心液中的肝素钠，洗脱、醇沉、烘干得到肝素钠粗品，但是，并没有公开所述无盐工艺的提取效果，仅仅停留在实验室试验阶段，离规模化生产尚远。

另外，通过在提取过程中将猪小肠黏膜液调制成浓浆的方式，减少用水量，可以显著减少废水量，降低处理难度。现有技术对猪小肠黏膜液体积没有严格要求，每根猪小肠黏膜液体积达到10升，致使肝素钠粗品收率和废水排放量都不理想。无盐生产技术，要求猪小肠黏膜液体积在每根2～4L的极端粘稠的浓浆，才有实际意义，方可达到提高肝素钠粗品收率，利于废水回收，减少废水排放量的目的。

但是，浓浆和无盐条件都是不利于黏膜组织破裂和裂解的条件。一方面，猪小肠黏膜液过于粘稠不利于组织与酶充分接触，使得小肠组织裂解不完全，“肝素钠-蛋白复合体”底物量少，影响肝素钠粗品的产量；另一方面，氯化钠盐起到防腐和提供离子强度稳定性等多种功能，而无盐条件下，生产的稳定性无法保证。在浓浆和无盐双重不利于黏膜组织破裂和裂解的条件下，游离出肝素钠分子的效率低。目前，国外的现有浓浆无盐技术方案的肝素钠粗品收率，平均为4.5万美标单位/根(2222根/亿)，无法满足工业生产的需要。

综上，现有的无盐酶解技术方案，存在三大致命缺陷。其一，每根猪小肠黏膜液体积达到10升，导致废水排放量大；其二，没有离子强度稳定剂，也没有合适的可替代的防腐剂对肠黏膜起到保鲜作用，导致生产结果不可控；其三，没有合适有效的肠黏膜组织破裂技术，致使肠黏膜组织破裂不完全，致使可酶解的“肝素钠-蛋白复合体”底物量少，显著影响肝素钠粗品的产量。现有的浓浆无盐提取肝素钠粗品的技术无法满足工业需求。

发明内容

本发明针对猪小肠黏膜提取肝素钠粗品的技术中废水排放量大、生产结果不可控以及提取率低等缺陷，提供了一种采用生物活性酵素，使用益生菌等生物活性菌的生物发酵技术，在无盐，极端粘稠的浓浆肠黏膜液条件下，协同通过胰酶的选择性酶解作用，使肠黏膜组织产生游离的肥大细胞，并且将游离的肥大细胞尽可能地裂解，最大量地产生游离的肝素钠前体—“肝素-蛋白复合体”。从而达到提高肝素钠粗品收率的目的。

本发明的技术方案包含四个生物学、酶学和纯化与分离科学的系列技术过程，分六步进行。

第一步：对于极端粘稠的浓浆肠黏膜组织液，不能添加任何来源的氯化钠盐，而是添加合理量的硫酸钠作为必须的离子强度的电解质稳定剂；

第二步：对于极端粘稠的浓浆肠黏膜组织液，添加焦亚硫酸钠作为防腐剂；

第三步：使用益生菌等生物活性菌的生物发酵技术，达到对极端粘稠的浓浆肠黏膜组织进行有效破裂的生物活性发酵技术过程，破裂肠黏膜组织，游离出来肥大细胞；

第四步：肥大细胞裂解的生物活性发酵技术过程，对游离的肥大细胞，采用生物活性酵素可控生物发酵技术，将游离的肥大细胞尽可能地裂解，最大量地产生游离的肝素钠前体—“肝素-蛋白复合体”；

第五步：使用胰酶酶解，对游离的肝素钠前体—“肝素-蛋白复合体”，实施胰酶定点切割酶解技术，使“肝素-蛋白复合体”的链结化学键发生“精准切割蛋白点位”的定点高效选择性酶解切割，释放出具有抗凝血生物活性的肝素钠生物大分子，和蛋白分子的混合溶液；

第六步：纯化与分离技术过程，将释放的肝素钠和蛋白混合溶液，使用大孔径阴离子树脂(杜邦罗门哈斯-美国FPA98Cl大孔径强阴离子肝素钠专用树脂)，优先选择性的吸附/脱附过程，达到肝素钠的分离。进一步用酒精沉淀与分级技术，最终得到肝素钠粗品(生物活性大分子的纯化与分离技术)。

在一种实施方式中，所述大孔径阴离子树脂包括杜邦罗门哈斯-美国FPA98Cl大孔径强阴离子肝素钠专用树脂。

本发明提供一种从猪小肠黏膜提取肝素钠粗品的方法，包括以下步骤：

(1)制备猪小肠黏膜液：步骤(1)将猪小肠用软化水刮制黏膜液，并用软化水调节，使得每根猪小肠黏膜液体积达到2.7L，或者每根猪小肠黏膜液体积达到2.0～4.0L，比较现有方法的废水量，减少60～80％，向所得粘稠猪小肠黏膜液中依次添加硫酸钠电解质和焦亚硫酸钠防腐剂，并用30％氢氧化钠碱液调节pH至6.0～8.0。

(2)生物发酵：向步骤(1)所得猪小肠黏膜溶液中添加生物活性酵素和辅助剂，升温至25～50℃，保温90～300分钟，得到发酵后的小肠黏膜液；所述生物活性酵素的添加量为猪小肠黏膜溶液质量的0.05～0.50％，所述辅助剂的添加量为猪小肠黏膜溶液质量的0.15～1.50％；

(3)酶解：调节步骤(2)所得发酵后的小肠黏膜液pH为7～9，以猪小肠的黏膜液质量的0.05～0.30％加入胰酶，升温至50～60℃，保温120～300分钟，得到酶解液；

(4)树脂吸附：将步骤(3)所得酶解液升温至70～85℃，保温10～60分钟，然后过滤并降温至56～60℃，进行树脂吸附与洗脱，得到肝素钠粗品溶液；所述树脂的质量占猪小肠的黏膜液质量的1.0～3.0％；

(5)树脂脱附：将步骤(4)树脂吸附后，过滤收集树脂。收集的树脂使用5％稀盐水洗涤后，用饱和浓盐水进行树脂洗脱。所述饱和食盐水的质量占树脂质量的100～200％，即得到肝素钠粗品溶液；

(6)酒精沉淀：将步骤(5)得到肝素钠粗品溶液，使用60～90％酒精进行沉淀，酒精沉淀的终止浓度为25～55％，析出肝素钠粗品，静置12～24个小时；

(7)收集肝素钠粗品：将步骤(6)得到的肝素钠粗品过滤，脱水，干燥后，得到肝素钠粗品产品。

(8)入库：将步骤(7)得到的肝素钠粗品产品，登记入库存放。

在一种实施方式中，步骤(1)所述的粘稠的浓浆猪小肠黏膜液中(比较现有方法的水量减少70％以上)，加入硫酸钠电解质，添加量为猪小肠黏膜溶液质量的0.10～0.60％。

在一种实施方式中，步骤(1)所述的粘稠的浓浆猪小肠黏膜液中，加入焦亚硫酸钠防腐剂，添加量为猪小肠黏膜溶液质量的0.15～1.5％。

在一种实施方式中，步骤(1)所述的1粘稠的浓浆猪小肠黏膜液中，用30％氢氧化钠碱液调节酸碱度pH值6.0～8.0。

在一种实施方式中，步骤(2)所述生物活性酵素包括益生菌与生物酶。所述益生菌为乳双歧杆菌，乳双歧杆菌菌落单位≥10亿CFU/g；所述生物酶为碱性蛋白酶，酶活性含量为30000U/g；所述生物活性酵素的添加量为所述猪小肠的黏膜溶液质量的0.05～0.50％。

在一种实施方式中，步骤(2)所述辅助剂包括10～50％碳酸氢钠、10～50％葡萄糖、10～50％柠檬酸和10～30％苯甲酸钠；所述辅助剂的添加量为猪小肠黏膜溶液质量的0.10～1.00％。

在一种实施方式中，步骤(3)所述胰酶包括≥3000U/g的胰蛋白酶、≥40000U/g的胰脂肪酶、≥60000U/g的胰淀粉酶，所述胰酶的用量为猪小肠的黏膜液质量的0.05～0.30％。

在一种实施方式中，步骤(4)所述树脂的质量是猪小肠的黏膜液质量的1.0～3.0％。

在一种实施方式中，步骤(5)用的洗脱液是质量分数为18～25％的氯化钠溶液。

在一种实施方式中，步骤(6)所述醇沉是指使用60～90％浓度的酒精，终止浓度25～55％。

在一种实施方式中，步骤(7)所述干燥为真空干燥。

在一种实施方式中，步骤(8)所述肝素钠粗品产品存放条件为室温避光条件。

本发明还提供所述方法制备得到的肝素钠。

本发明还提供所述方法在制备肝素钠和含肝素钠的产品中的应用。

有益效果：

本发明为从猪小肠黏膜液提取肝素钠粗品的无盐生产技术，对比现有肝素钠粗品生产技术方案，本技术发明方案，具有三个优势：

(1)无盐：本发明在提取肝素钠粗品中不添加氯化钠盐，比较现有技术方案，氯化钠的使用量减少99％以上，使得废水中氯化钠离子含量小于0.03％，即300ppm以下，满足生态环保和变废为宝的需求。

(2)浓浆：本技术发明方案采用极端粘稠猪小肠浓浆黏膜液，体积2.7升/根，与现有技术平均每根猪小肠加水后的黏膜液体积10升的现状相比，猪小肠浓浆黏膜液中含水量减少70％以上。使得提取肝素钠粗品后的废水中，小肠黏膜蛋白质和小分子肽营养成分含量高达9～12％，以保障最终产品的小肠黏膜蛋白质和小分子肽营养成分达标，尤其是灰份指标不超标，使废水变废为宝成为可能。目前，已经与国内的养饲料添加剂公司联合开发出“肠膜蛋白粉”动物蛋白营养饲料添加剂产品。

(3)生物活性酵素生物发酵：本发明首次应用生物活性酵素可控生物发酵技术针对无盐和极端粘稠猪小肠浓浆黏膜液的组织破裂和裂解。在这种双重不利于黏膜组织破裂和裂解的浓浆和无盐条件下，本发明新技术方案的实例证明，生物活性酵素可控生物发酵技术与生物酶酶解的协同作用下，得到干燥的固体肝素钠粗品收率8.2万美标单位/根(1220根/亿)，对比没有实施生物活性酵素酶解技术的肝素钠粗品收率6.4万美标单位/根(1563根/亿)，提升28.1％；对比使用碱性蛋白酶2709酶解技术的肝素钠粗品收率6.2万美标单位/根(1613根/亿)，收率提升32.3％，肝素钠粗品收率获得显著提高。

附图说明

图1为现有技术方案，肝素钠粗品酶解生产工艺的生物学流程图；

图2为肝素钠粗品的无盐生物发酵酶解生产新技术的生物学流程图；

图3为不同胰酶用量对应的肝素钠粗品收率。

具体实施方式

本发明所用的实验材料如下：

生物活性酵素：为自制的活性益生菌生物活性酵素与生物酶的混合物，生物活性酵素益生菌原料，采购自陕西云奇生物科技有限公司的食品级乳双歧杆菌，含100亿活菌/克，货号YQ202001101。生物酶原料采购自河南新仰韶生物酶制剂有限公司，食品级碱性蛋白酶，货号DBJ20200901，20万单位/克。使用前将1份乳双歧杆菌：1.5份碱性蛋白酶：7.5份软化水，搅拌均匀，现用现制，即得到自制的生物活性酵素与生物酶的混合物。其中乳双歧杆菌每克含10亿菌落单位，碱性蛋白酶活性含量每克30000单位。生物活性酵素的添加量为所述猪小肠的黏膜溶液质量的0.20％。

辅助剂为自制的含质量分数30％碳酸氢钠、30％葡萄糖、20％柠檬酸和20％苯甲酸钠的混合物，添加量为所述猪小肠的黏膜溶液质量的0.20％。

胰酶：为提取自猪胰脏的复合酶，其中含胰蛋白酶活力大于4000单位/克，含胰脂肪酶活力大于30000单位/克，含胰淀粉酶活力大于60000单位/克。所述胰酶采购自重庆祥盛生物制药公司，货品批号C01200930。胰酶用量为所述猪小肠的黏膜溶液质量的0.15％。

胰酶酶解的条件为：PH值8～8.5，52℃±2保温150分钟，保温过程中维护PH值为8左右。

吸附树脂：杜邦罗门哈斯(美国)FPA98Cl大孔径强阴离子肝素钠专用树脂。所述树脂质量占猪小肠的黏膜液质量的1.30％。

本发明所用的实验方法如下：

肝素钠的抗凝血活性效价的定义：

肝素是一种天然活性物质，其活性不能用化学或物理的方法进行确切测定，只能采用生物检定法测定。Reinert等介绍用椽酸抗凝的牛血浆为底物进行测定，其抗凝活性单位定义为：在37℃恰能抑制再钙化牛血浆1mL于4h内发生凝结所需肝素的量。(目前有美国标准和欧洲欧盟标准，两个标准差异0.927倍)

肝素钠的抗凝血活性效价定义：每毫克肝素钠的抗凝血活性单位数。

肝素钠的抗凝血活性效价的检测方法：

目前国标的肝素钠的抗凝血活性效价的检测方法为羊血浆法，本发明的实例采用羊血浆法测定酶解液和肝素钠粗品产品的效价，使用的肝素钠标准为美国药典标准(美标，USPU)。

肝素钠收率的定义：

本发明实例所述的肝素钠粗品收率，定义是每根猪小肠生产的肝素钠的抗凝血活性单位数，亦表述为：万单位/根，单位为抗凝血活性单位，美标(USPU)，数值越高收率越高。

本发明实例所述的肝素钠粗品收率，亦可定义为生产1个亿抗凝血活性单位所需要的猪小肠数量(根)，亦表述为：根/亿单位，单位为抗凝血活性单位，美标(USPU)，数值越高收率越低。

下面将结合本发明实施例中的附图，说明本发明实施例中的技术方案细节。本发明“生物酵素发酵的酶解法提取肝素钠粗品的无盐生产技术”的技术方法，不仅仅限于以下所描述的实施实例。凡在本发明的生物学科学原理和基本的逻辑思路范围之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

实施例1：生物酵素发酵的酶解法提取肝素钠粗品的无盐生产技术

本实施实例涉及“生物酵素发酵的酶解法提取肝素钠粗品的无盐生产技术”的技术方法，包括无盐(氯化钠盐)的条件下，利用生物活性酵素生物发酵技术联合胰酶酶解技术，使肠黏膜组织破裂，肥大细胞裂解，产生肝素钠前体—“肝素-蛋白复合体”。并对游离的肝素钠前体—“肝素-蛋白复合体”底物，实施“精准切割蛋白点位”的定点高效选择性酶解，从而高效地释放出具有抗凝血生物活性的肝素钠生物大分子。然后，升高温灭活；过滤除渣滓；树脂吸附和脱附过程，得到含粗品肝素钠洗脱液。采用酒精沉淀/脱水，收集的肝素钠湿固体。最后，采用真空干燥，得到肝素钠粗品固体。总共十二个关键步骤。

步骤一，无盐条件下，生物活性酵素生物发酵：将3500根新鲜猪小肠，新鲜刮制，并且严格控制水量，达到每根猪小肠黏膜液体积不超过2.5升。猪黏膜液转入到10000升的酶解罐中，加入软化水，到9500L(按每根猪小肠黏膜液体积稀释至2.7L黏膜溶液的比例，所述软化水为离子交换树脂软化法，去除了钙镁离子的纯水)。

步骤二，向步骤(1)所述的极端粘稠的猪小肠黏膜液中，在充分搅拌下，加入20千克硫酸钠，20千克焦亚硫酸钠。

步骤三，向步骤(2)所述的黏膜液中，在充分搅拌下，用30％质量分数的氢氧化钠碱液精细地调节至PH值到7.0，充分搅匀。

步骤四，向步骤(3)所述的黏膜液中，在充分搅拌下,加入20千克辅助剂(含碳酸氢钠，葡萄糖，柠檬酸，和苯甲酸钠的混合物)。充分搅匀后，加入20千克生物活性酵素。缓慢升温至39℃±2，继续搅拌下，保温120±10分钟。

本方法使用的可控生物发酵过程，一方面，微生物发酵能够有效地消化分解小肠黏膜组织，达到彻底地破裂游离出肥大细胞，并能有效地促进肥大细胞的高效裂解；另一方面，过度地微生物发酵，将引起小肠黏膜液的发酵酸败腐烂，进而造成肝素钠生物大分子的降解。为此，生物活性酵素发酵过程的可控性就非常重要。通过使用辅助剂的调配，达到既含有提高微生物活性的成分，也含有控制发酵酸败腐烂的防腐剂。通过各个成分合理地调配，既达到高效的微生物活性，又控制黏膜液酸败腐烂的作用。

步骤五，实施胰酶酶解：用少量稀碱液调节PH值为8.5，升温至52℃±2,加入14千克胰酶(猪小肠的黏膜液质量的0.15％)，继续搅拌，保温，保温过程中调节维护PH值8.0左右，保温150±10分钟。保温结束后，立刻取酶解样品检测，效价为35.3USPU/ML(相当于收率9.6万USPU/根)。然后，升高温，达到75℃±5，停止升温，保温30分钟，得酶解液。

步骤六，步骤(5)得到的酶解液，用60目过滤网过滤去除渣滓，过滤液降温到58℃±3，转入吸附罐中。加入准备好的120千克罗门哈斯(美国)大孔径强阴离子树脂，搅拌吸附～8个小时。

步骤七，步骤(6)得到的吸附树脂，100目过滤网过滤，收集树脂。收集的树脂用大量软化水漂洗。

步骤八，步骤(7)得到的漂洗后的树脂，室温下，用质量分数5％的稀盐水洗涤2遍。然后，用饱和盐水溶液，脱附3遍，饱和盐水的质量占树脂质量的100～200％，脱附时间2个小时，温度55℃，收集得到肝素钠脱附液。

步骤九，向步骤(8)得到的脱附液中，加入85°左右的食品级酒精，达到乙醇含量45％后，静止放置12小时。200目过滤网过滤，得到湿肝素钠固体。

步骤十，步骤(9)得到的湿肝素钠固体，再用质量分数90％以上酒精脱水2～3小时。然后，再200目过滤网过滤，得到高浓度酒精脱水后的湿肝素钠固体。

步骤十一，步骤(10)得到的脱水后的湿肝素钠固体，采用真空干燥，调整温度～60℃，时间12小时，得到干燥的粗品肝素钠浅黄色固体3120克。

步骤十二，步骤(11)得到的干燥的粗品肝素钠浅黄色固体，化验检测效价，效价92.0USPU/MG(收率8.2万USPU/根)。登记入库，肝素钠粗品产品用食品级PE塑料袋密封。室温下，存放在干燥避光保管柜里。

经检测，上述工艺所产生的废水中氯化钠离子含量小于0.03％。

对比例1：不同胰酶用量提取肝素钠粗品

具体实施方式参考实施例1，区别在于，改变步骤五的胰酶用量至7kg和20kg，检测肝素钠粗品的收率，结果表明，当胰酶用量为7KG时，步骤五中酶解液的效价为28.7USPU/ML(相当于收率7.8万USPU/根)，步骤十一和十二得到干燥的粗品肝素钠浅黄色固体2776克，效价87.0USPU/MG，肝素钠粗品收率6.9万美标单位/根，产生的肝素钠粗品量降低了18.8％；当胰酶用量为20KG时，步骤五中酶解液的效价为30.6USPU/ML(相当于收率8.3万USPU/根)，步骤十一和十二得到干燥的粗品肝素钠浅黄色固体2807克，效价91.0USPU/MG，肝素钠粗品收率7.3万美标单位/根，产生的肝素钠粗品量降低了12.3％，表明胰酶的使用量对酶解液中游离出来的肝素钠含量，有直接的影响，如图3所示。

对比例2：省略生物活性酵素发酵生产肝素钠粗品

具体实施方式参考实施例1，区别在于，省略步骤四的生物活性酵素的生物发酵技术，单独使用胰酶酶解技术。酶解保温结束后，测得酶解液溶液的抗凝血效价为27.7USPU/ML(相当于收率7.5万USPU/根)。最终，得到的湿肝素钠固体，采用真空干燥，调整温度～65℃，时间12小时，得到干燥的粗品肝素钠浅黄色固体2856克，效价78.0USPU/MG，肝素钠粗品收率6.4万美标单位/根。实施例1中固体肝素钠粗品收率比对比例2中收率提高28.1％。

对比例3：使用碱性蛋白酶2709酶解提取肝素钠粗品

具体实施方式参考实施例1，区别在于，步骤五中用碱性蛋白酶2709替换胰酶进行酶解，所用碱性蛋白酶2709的活性为20万单位/克，用量为17.5千克。保温结束后，测得酶解液中效价为21.4USPU/ML(相当于收率5.8万USPU/根)。最终得到干燥的粗品肝素钠浅黄色固体2614克，效价83.0USPU/MG，肝素钠粗品收率6.2万美标单位/根。实施例1中固体肝素钠粗品收率比对比例3的收率提高32.3％。

对比例4：用碱性蛋白酶2709单独酶解提取肝素钠粗品

具体实施方式参考实施例1，区别在于，省略步骤四的生物活性酵素的生物发酵技术，并在步骤五采用碱性蛋白酶2709实施酶解工艺，所用碱性蛋白酶2709的活性为20万单位/克，用量为17.5千克。测得酶解液中效价为18.8USPU/ML(相当于收率5.1万USPU/根)。最终得到干燥的粗品肝素钠浅黄色固体1909克，效价88.0USPU/MG，固体肝素钠粗品收率4.8万美标单位/根。实施例1中固体肝素钠粗品收率比对比例4的收率提高70.8％。

对比例5：调整生物活性酵素的比例生产肝素钠粗品

具体实施方式参考实施例1，区别在于，步骤四的生物酵素发酵中，降低生物活性酵素中的乳双歧杆菌含量50％，即将“0.5份乳双歧杆菌：1.5份碱性蛋白酶：8.0份软化水”，搅拌均匀。即制得的活性益生菌与生物酶的混合物中，乳双歧杆菌每克含5亿菌落单位，碱性蛋白酶活性含量每克30000单位。生物活性酵素的添加量仍然为所述的20千克。结果表明，酶解液中肝素钠的活性效价为28.6USPU/ML(相当于收率7.8万USPU/根)，与实施例1的9.6万USPU/根比较，下降率23.1％。进一步，得到干燥的粗品肝素钠浅黄色固体2815克，效价86.0USPU/MG，肝素钠粗品收率6.9万USPU/根。实施例1的肝素钠粗品收率比对比例5提高18.8％。

结果表明，降低生物活性酵素中的生物发酵过程，会导致肝素钠粗品收率显著下降。

对比例6：调整生物活性酵素的比例生产肝素钠粗品

具体实施方式参考实施例1，区别在于，步骤四的生物酵素发酵中，增加生物活性酵素中的乳双歧杆菌含量达到2倍量，即将“2份乳双歧杆菌：1.5份碱性蛋白酶：6.5份软化水”，搅拌均匀。即制得的活性益生菌与生物酶的混合物中，乳双歧杆菌每克含20亿菌落单位，碱性蛋白酶活性含量每克30000单位。生物活性酵素的添加量仍然为所述的20千克。结果表明，酶解液中肝素钠的活性效价为26.8USPU/ML(相当于收率7.3万USPU/根)，与实施例1的9.6万USPU/根比较，下降率31.5％。进一步，得到干燥的粗品肝素钠浅黄色固体2733克，效价81.0USPU/MG，肝素钠粗品收率6.3万USPU/根。实施例1的肝素钠粗品收率比对比例6的收率提高30.2％。

结果表明，过高的生物活性酵素的生物发酵过程，肝素钠粗品收率不升反降。

对比例7：调整生物活性酵素的发酵时间生产肝素钠粗品

具体实施方式参考实施例1，区别在于，步骤四的生物酵素发酵中，生物活性酵素生物发酵的时间缩短60分钟，保温时间更改为60分钟。结果表明，酶解液中肝素钠的活性效价为31.4USPU/ML(相当于收率8.5万USPU/根)，与实施例1的9.6万USPU/根比较，低12.9％。进一步，得到干燥的粗品肝素钠浅黄色固体2785克，效价93.0USPU/MG，肝素钠粗品收率7.4万USPU/根。实施例1的肝素钠粗品收率比对比例7提高10.8％。

结果表明，缩短生物活性酵素的生物发酵过程时间，造成生物发酵过程不够完全，肝素钠粗品收率下降。

对比例8：调整生物活性酵素的发酵时间生产肝素钠粗品

具体实施方式参考实施例1，区别在于，步骤四的生物酵素发酵中，生物活性酵素生物发酵的时间延长60分钟，保温时间更改为180分钟。结果表明，酶解液中肝素钠的活性效价为26.9USPU/ML(相当于收率7.3万USPU/根)，与实施例1的9.6万USPU/根比较，低31.5％。进一步，得到干燥的粗品肝素钠浅黄色固体2613克，效价81.7USPU/MG，肝素钠粗品收率6.1万USPU/根。实施例1的肝素钠粗品收率比对比例8提高34.4％。

结果表明，延长生物活性酵素的生物发酵过程时间，造成生物发酵过程过量，肝素钠粗品收率大幅度下降。

对比例9：调整辅助剂的种类和比例生产肝素钠粗品

具体实施方式参考实施例1，区别在于，步骤四的生物酵素发酵中，调整辅助剂的比例为10％葡萄糖，40％碳酸氢钠，30％柠檬酸，20％苯甲酸钠的混合物。结果表明，酶解液中肝素钠的活性效价为29.1USPU/ML(相当于收率7.9万USPU/根)，与实施例1的9.6万USPU/根比较，低21.5％。进一步，得到干燥的粗品肝素钠浅黄色固体2526克，效价95.6USPU/MG，肝素钠粗品收率6.9万USPU/根。实施例1的肝素钠粗品收率比对比例9提高18.8％。

结果表明，当生物活性酵素的活化成分葡萄糖含量减少三分之二，造成生物发酵过程不足，肝素钠粗品收率显著下降。

对比例10：调整辅助剂的种类和比例生产肝素钠粗品

具体实施方式参考实施例1，区别在于，步骤四的生物酵素发酵中，调整辅助剂的比例为50％葡萄糖，30％碳酸氢钠，10％柠檬酸，10％苯甲酸钠的混合物。结果表明，酶解液中肝素钠的活性效价为26.7USPU/ML(相当于收率7.2万USPU/根)，与实施例1的9.6万USPU/根比较，低33.3％。进一步，得到干燥的粗品肝素钠浅黄色固体2665克，效价78.8USPU/MG，肝素钠粗品收率6.0万USPU/根。实施例1的肝素钠粗品收率比对比例10提高36.7％。

结果表明，当辅助剂成分葡萄糖含量增加三分之二，造成生物发酵过程过量，肝素钠粗品收率大幅度下降。

对比例11：省略硫酸钠电解质稳定剂生产肝素钠粗品

具体实施方式参考实施例1，区别在于，省略步骤二的硫酸钠电解质稳定剂。酶解保温结束后，测得酶解液溶液的抗凝血效价为28.7USPU/ML(相当于收率7.8万USPU/根)。最终，得到的湿肝素钠固体，采用真空干燥，调整温度～65℃，时间12小时，得到干燥的粗品肝素钠浅黄色固体2718克，效价86.5USPU/MG，肝素钠粗品收率6.7万美标单位/根。实施例1中固体肝素钠粗品收率比对比例11中收率提高22.4％。

对比例12：调整硫酸钠电解质稳定剂的用量生产肝素钠粗品

具体实施方式参考实施例1，区别在于，调整硫酸钠电解质稳定剂的用量，添加量由20Kg提高到30Kg。酶解保温结束后，测得酶解液溶液的抗凝血效价为31.5USPU/ML(相当于收率8.6万USPU/根)。最终，得到的湿肝素钠固体，采用真空干燥，调整温度～65℃，时间12小时，得到干燥的粗品肝素钠浅黄色固体2846克，效价91.0USPU/MG，肝素钠粗品收率7.4万美标单位/根。实施例1中固体肝素钠粗品收率比对比例12中收率提高10.8％。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。