用于生物基聚合物的单步脱污和酶促降解的方法和系统

相关专利申请的交叉引用

本申请要求申请日为2021年5月28日的美国临时专利申请序列号63/194,487的申请权益，该申请以引用的方式并入本文用于所有目的。

序列表

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背景技术

据估计，每年石油基聚合物的产量超过3亿吨，并且全球产量持续增加。大部分这些聚合物被用于生产一次性产品，诸如塑料饮料瓶、吸管、包装和个人护理产品。大多数这些塑料产品都被丢弃，没有进入回收流。随着全世界一次性塑料蔓延的恶化，鉴定完全可再生的塑料并开发用于可再生塑料的工业加工的方法和材料变得至关重要。

由可再生资源生产的可生物降解的聚合物(也称为“生物聚合物”)在减少全球石油基塑料在环境中的积聚方面大有前景。一类这种生物聚合物是聚羟基链烷酸酯(PHA)。关于PHA家族，已经完成了很多工作，最引人注目的是聚羟基丁酸酯(PHB)聚合物，包括聚-3-羟基丁酸酯(P3HB)、聚-4-羟基丁酸酯(P4HB)、聚羟基戊酸酯(PHV)、聚羟基己酸酯(PHH)、聚羟基辛酸酯(PHO)以及它们的共聚物。特别有利的是，PHA表现出与一些石油基聚合物非常相似的热塑性性质，因此代表了石油基聚合物(诸如聚丙烯和聚乙烯)的可行替代品。

PHA在很多可用作能量阱的细菌、真菌和古菌谱系中自然产生，这些谱系包括固氮菌属(Azotobacter)、罗尔斯通氏菌属(Ralstonia)、伯克氏菌属(Burkholderia)、原单胞菌属(Protomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)和施莱格尔氏菌属(Schlegelella)。PHA聚合物的产生涉及三步酶促机制，该机制从乙酰辅酶A开始。在形成PHB时，第一步是通过PhaA(β-酮硫解酶)进行的乙酰CoA的催化形成β-酮酰-CoA。β-酮酰-CoA继而在NADP依赖性反应中通过PhaB酶(β-酮酰-CoA还原酶)转化为R-3-羟酰-CoA。最后一步是通过PhaC(PHB合酶)的催化将R-3-羟酰-CoA聚合为PHB。

在自然界中，为了回收聚合物中储存的能量，生物降解通过PHA解聚酶(PHAD酶)来完成。不幸的是，消费后产品通常受到废弃材料(诸如食物废物和人类废物)的污染，这些废弃材料会促进多种病原性生物(包括病毒、细菌、真菌、寄生虫、原生动物等)的繁殖。因此，消费后产品的成功生物降解需要脱污(使病原体失活)和聚合物的降解二者。通常，在降解处理之前使产品的污染部分与其他未污染部分分离，或者对整个产品进行脱污和生物降解，但是在单独的操作中，这二者都会增加处理成本。

可以增加生物聚合物在消费品中的使用的系统和方法是所需要的。可以提供消费后产品(例如消费后个人护理产品)的同时脱污和生物降解的系统和方法将在本领域中产生巨大的有益效果。

发明内容

一般而言，本公开涉及用于PHA聚合物的同时降解和脱污的方法和系统。用于降解的PHA聚合物可以是消费后产品(诸如消费后个人护理产品或食品行业产品)的组分，该组分可以被一种或多种嗜中温病原体污染。目前，消费后产品包括但不限于包装、吸管、杯、瓶、购物袋、餐具、托盘和个人护理产品，诸如个人护理服装(例如，尿布、儿童训练裤、一次性泳裤、女性卫生用品、成人失禁用品)、卫生棉条售卖机、医疗用品等，这些消费后产品的很大一部分是由石油基聚合物制成的。目前的重大工作是将生物聚合物(诸如PHA)纳入此类产品中，并且改善和促进生物聚合物的回收。本公开涉及可以用于在小型或大型环境中进行生物聚合物的同时脱污和生物降解的改善的方法和系统。

在一个方面，公开了用于处理包含PHA的消费后产品的方法。例如，方法可以包括使消费后产品(例如，消费后个人护理产品、食品行业中使用的产品等)与嗜极端菌PHA解聚酶(PHAD酶)和/或表达嗜极端菌PHAD酶的微生物接触。微生物可以是在一定条件下天然存在的嗜极端菌，该条件包括极端温度、压力、盐度、酸度、碱度、辐射等中的一者或多者，并且嗜极端菌PHAD酶可以在这种条件下表现出活性。PHAD酶可以降解消费后产品的PHA。接触可以在对嗜中温病原体有害且嗜极端菌PHAD酶有活性的环境条件下进行，该环境条件例如极端温度、压力、盐度、酸度、碱度、辐射等中的一者或多者。在一个实施方案中，嗜极端菌PHAD酶可以是多嗜极端菌的，即由天然存在于一定环境中的微生物产生，该环境包括多种极端环境条件。在一个实施方案中，该方法可以包括使消费后产品与多种嗜极端菌PHAD酶接触，该嗜极端菌PHAD酶中的一者或多者可以是多嗜极端菌PHAD酶。

在一个方面，公开了一种可以用于消费后产品的同时脱污和生物降解的系统。例如，系统可以包括：反应室，含有PHA的消费后产品可以在该反应室中接触酶；环境控制系统，该系统被构造为在接触室内维持一种或多种极端环境条件一段时间；以及嗜极端菌PHAD酶和/或表达嗜极端菌PHAD酶的微生物。在多个方面，系统可以很小，例如被设计用于单个家庭或营业场所，或者较大，例如被设计用于邻里或社区回收中心，或者甚至更大，例如被设计用于工业规模。

附图说明

针对本领域普通技术人员的本主题的完整且能够实现的公开内容(包括其最佳模式)在说明书的剩余部分中参照附图更具体地阐述，在附图中：

图1示意性地展示了可以根据所公开的方法采用的生物反应器系统。

图2示意性地展示了可以根据所公开的方法采用的较小的生物反应器系统。

图3展示了来自嗜中温菌弯曲假单胞菌(Pseudomonas geniculate)的PHBD酶的酶活性和集落形成单位随时间变化的函数。

图4展示了来自嗜热菌嗜热徐丽华菌(Lihuaxuella thermophila)的PHBD酶的酶活性和集落形成单位随时间变化的函数。

图5展示了来自嗜热菌施莱格尔氏菌属物种(Schlegelella sp.ID0723)的PHBD酶的酶活性和集落形成单位随时间变化的函数。

图6展示了来自嗜盐菌海水盐单胞菌(Halomonas aquamarina)的PHBD酶的酶活性和集落形成单位随时间变化的函数。

图7展示了来自嗜盐菌东方盐海洋菌(Halomarina oriensis)的PHBD酶的酶活性和集落形成单位随时间变化的函数。

图8展示了来自嗜酸菌隐藏嗜酸菌(Acidiphilium cryptum)的PHBD酶的酶活性和集落形成单位随时间变化的函数。

图9展示了来自嗜酸菌解淀粉碱单胞菌(Alkalimonas amylolytica)的PHBD酶的酶活性和集落形成单位随时间变化的函数。

图10展示了通过四种多嗜极端菌PHB酶将PHB解聚为羟基丁酸酯。

图11展示了在有利于多嗜极端菌耐盐嗜热裂孢菌(Thermobifida halotolerans)的PHB酶的单独和组合反应条件下随时间变化的大肠杆菌(E.coli)的存活率。

图12展示了在有利于多嗜极端菌萨提亚纳拉亚纳乔治菌(Georgeniasatyanarayanai)的PHB酶的单独和组合反应条件下随时间变化的大肠杆菌(E.coli)的存活率。

图13展示了在有利于多嗜极端菌嗜盐碱球菌属物种(Natronococcus sp.LS1_42)的PHB酶的单独和组合反应条件下随时间变化的大肠杆菌(E.coli)的存活率。

图14展示了在有利于多嗜极端菌深源海杆菌(Marinobacter profundi)的PHB酶的单独和组合反应条件下随时间变化的大肠杆菌(E.coli)的存活率。

在本说明书和附图中对附图标记的反复使用旨在表示本发明的相同或类似的特征或元件。

具体实施方式

现在将详细参照所公开的主题的各种实施方案，其一个或多个实例在下文示出。每个实施方案都以解释主题而不是限制主题的方式提供。事实上，对于本领域技术人员将显而易见的是，在不背离主题的范围或精神的情况下，可对本公开做出各种修改和变化。例如，作为一个实施方案的一部分而说明或描述的特征，可以用于另一个实施方案以产生另一个实施方案。

为了减少和消除聚合物废物，不仅需要用生物聚合物来代替石油基聚合物，而且还需要改进这些聚合物的消费后加工。目前正在进行重大研究以改善生物聚合物的大规模加工。此类聚合物非常适用于生产所有不同类型的一次性产品，诸如饮料瓶、容器、包装等等。此外，本领域的技术人员已建议使用生物聚合物(诸如PHA聚合物)来替代一次性个人护理产品(诸如失禁产品)中存在的石油基聚合物。使用生物聚合物来替代石油基聚合物将在创建可持续经济方面取得重大进展。

大多数一次性塑料制品(诸如包装、吸管、杯、瓶、购物袋、餐具、托盘、个人护理产品等)在使用后都被掩埋在垃圾填埋场。即使由生物聚合物制成，但是这些材料仍然需要大量的时间来降解，并且通常与其他不易降解的材料组合，这可以进一步减缓生物聚合物的自然降解。此外，一次性产品(诸如食品包装或器具和个人护理产品)在处置时可能受到食物或人类废物(例如，粪便、尿液、血液、月经液、食物残渣等)的污染，并且此类废物可能携带致病性污染。为了进一步改善可持续性平衡，本公开涉及一种用于同时进行消费后产品脱污的和消费后产品中含有的生物聚合物的降解，并且在一个特定实施方案中，涉及消费后个人护理产品的同时脱污和降解的方法和系统。

在这方面，本公开整体涉及在嗜极端菌酶有活性但对嗜中温病原体有害的环境条件下利用嗜极端菌酶(也称为极端酶)的系统和方法。通过使用所公开的方法和系统，可以同时实现消费后产品的脱污和产品中含有的生物聚合物的降解。因此，所公开的方法和系统可以提供通向更可持续经济的途径，同时减少可能存在于消费后产品中的病原体的风险。

消除致病性污染物可以减少过程操作员的风险，也可以减少过程设备污染的风险。此外，由于所公开的方法是在对嗜中温病原体有害的环境条件下进行的，因此该系统的利用和该方法的进行可以无需处理预加工废物、生物反应器或最终后加工反应混合物所需的附加灭菌程序。这可以简化整个处理过程并且可以降低成本，例如因为后加工混合物可以安全地丢弃而无需附加加工。此外，所公开的方法提供了改善非工业环境中的消费后产品的生物降解，诸如在家庭或小型企业中由消费者进行、或者在小型邻里或社区回收中心的生物降解的途径。所公开的方法和系统也可以在不需要包括附加抗病原体剂(例如，抗细菌加工助剂)的情况下使用，并且因此可以帮助防止此类试剂的过度使用以及病原体中的抗生素抗性的相关发展。

本文公开的系统可以并入生物反应器，在该生物反应器内可以进行同时脱污和解聚操作。生物反应器系统的一个实施方案示意性地展示于图1中。生物反应器系统的另一个实例示意性地展示于图2中，例如可以用于较小的应用，诸如用于家庭或小型企业。

无论是在大型还是小型应用中，生物反应器通常可以包括反应室10、100，该反应室可以由材料形成，该材料可以容纳处于所期望的反应条件下的酶、反应物和产物。例如，生物反应器可以包括不锈钢、硼硅酸盐玻璃、

可以通过所公开的方法和系统变得不具致病性的嗜中温病原体可以包括但不限于病毒、细菌、真菌和原生动物。如本文所用，术语“嗜中温”(“mesophile”和“mesophilic”)是指自然存在于人类通常与生物体共存的环境条件下的生物体，所述环境条件包括接近人体温度(例如，约20℃至约45℃)、水中的盐含量为约千分之5至约千分之18份(也称为中盐)、约一个大气压(例如约20kPa至约110kPa)和接近中性pH(例如，约pH 5至约pH 8.5，也称为嗜中性(“neutrophile”或“neutrophilic”))。本文涵盖的典型细菌病原体可以包括人粪便中常见的那些，诸如但不限于链球菌属(Streptococcus)、双歧杆菌(Bifidobacterum)、乳杆菌属(Lactobacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、梭菌属(Clostridium)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)或拟杆菌属(Bacteroides)。

为了促进所期望的生物降解活性，嗜极端菌酶和/或表达嗜极端菌酶的微生物可以与消费后产品一起放置于反应室10、100中。例如，极端酶和/或表达极端酶的微生物可经由入口流14进料至反应室10，可以预先保留在反应室10内的床13内，或者它们的任何组合。当考虑诸如家庭使用的较小系统时，在一个实施方案中，极端酶和/或表达极端酶的微生物可以在使用前由使用者，例如从单独提供的携带酶的包或容器，进料至反应室100。

一般而言，本文涵盖能够在对嗜中温病原体有害的一种或多种环境条件下降解生物聚合物(特别是聚羟基链烷酸酯聚合物)的任何合适的极端酶。例如，嗜极端菌酶可以是由嗜极端细菌或古菌天然表达，并且在适用于嗜中温病原体的脱污的环境条件下具有活性的酶。本文涵盖的嗜极端菌可以包括但不限于嗜热菌、嗜冷菌、嗜酸菌、嗜碱菌、厌氧生物、嗜二氧化碳菌、嗜盐菌、嗜压菌和抗辐射生物体。如本文所用，关于嗜极端菌酶的术语“活性”通常是指在给定合适的底物浓度的情况下，酶以系统的最大速率(V

其中m<<

在一些实施方案中，嗜极端菌酶可以包括可以在高于最适温度(T

因此，在一些实施方案中，用于所公开的方法和系统的嗜极端菌酶可以是表现出在一些实施方案中为约40℃或更高、约50℃或更高、约60℃或更高、约70℃或更高、约80℃或更高或者约90℃或更高的T

本文涵盖的基于温度的极端酶不限于高温嗜热菌酶，然而，在一些实施方案中可以利用低温嗜冷菌酶(也称为嗜冷菌酶)。例如，很多细菌菌株将无法繁殖，但是在暴露于约10℃的温度约6小时的时间后仍能存活。因此，在一些实施方案中，可以利用能够在约10℃或更低，例如在一些实施方案中7℃或更低或者约-15℃至约10℃的温度处具有活性的嗜冷菌酶。本文涵盖的示例性嗜冷菌(以及由此产生的嗜冷菌酶)可以包括但不限于：海洋交替单胞菌(Alteromonas oceani)(WP-123325050)、白色交替单胞菌(Alteromonas alba)(WP-105936495)、交替单胞菌属物种(Alteromonas sp.)38(WP-201299304)、麦氏交替单胞菌(Alteromonas macleodii)(WP-156078157)、虾虎鱼交替单胞菌(Alteromonas ponticola)(WP-169211550)、解脂交替单胞菌(Alteromonas lipolytica)(WP-070178363)、成晶节杆菌(Arthrobacter crystallopoietes)(WP-005270754)、耐冷博斯氏菌(Boseapsychrotolerans)(WP-181011807)、解淀粉栖海冰菌(Glaciecola amylolytica)(WP-164472126)、生丝单胞菌属物种(Hyphomonas sp.)(HAO37884)、耐冷詹森菌(Janthinobacterium psychrotolerans)(WP-065307954)、嗜冷马西里亚菌(Massiliapsychrophile)(WP-099914383)、嗜冷副冰栖菌(Paraglaciecola psychrophile)(WP-007642709)、极地单胞菌属物种(Polaromonas sp.)SP1(WP-164483751)、极地单胞菌属物种(Polaromonas sp.)AER18D-145(WP-096697750)、极地单胞菌属物种(Polaromonas sp.)CF318(WP-007872516)、空泡极地单胞菌(Polaromonas vacuolate)(WP-168920719)、食萘极地单胞菌(Polaromonas naphthalenivorans)(WP-157040436)、极地单胞菌属物种(Polaromonas sp.)JS666(WP-011482994)、冰川极地单胞菌(Polaromonas glacialis)(WP-084181426)、极地单胞菌属物种(Polaromonas sp.)EUR3 1.2.1(WP-197028649)、极地单胞菌属物种(Polaromonas sp.)CG_9.2(WP-196864241)、极地单胞菌属物种(Polaromonas sp.)CG_9.11(WP-196869863)、Polaromonas eurypsychrophila(WP-188708524)、极地单胞菌属物种(Polaromonas sp.)(MBC7445758)、Polaromonasjejuensis(WP-068832216)、极地单胞菌属物种(Polaromonas sp.)AET17H-212(WP-096671180)、极地单胞菌属物种(Polaromonas sp.)YR568(WP-092127764)、极地单胞菌属物种(Polaromonas sp.)C04(WP-077562980)、耐冷假红杆菌(Pseudorhodobacterpsychrotolerans)(WP-08235149)、Psychrobacillus lasiicapitis(WP-142537823)、嗜冷芽孢杆菌属物种(Psychrobacillus sp.)OK032(WP-093265425)、嗜冷芽孢杆菌属物种(Psychrobacillus sp.)OK028(WP-093060398)、嗜冷芽孢杆菌属物种(Psychrobacillussp.)FJAT-21963(WP-056833301)、咸海鲜嗜冷杆菌(Psychrobacter jeotgali)(WP-201583776)、嗜冷杆菌属物种(Psychrobactersp.)H8-1(WP-201574875)、嗜冷杆菌属物种(Psychrobacter sp.)Cmf 22.2(WP-075103245)、嗜冷杆菌属物种(Psychrobacter sp.)ENNN9_III(WP-058368887)、嗜冷杆菌属物种(Psychrobacter sp.)P2G3(WP-068327306)、嗜冷杆菌属物种(Psychrobacter sp.)P11G5(WP-068035467)、Psychrosphaera haliotis(WP-155693683)、嗜冷希瓦氏菌(Shewanella psychrophile)(WP-077755816)、Simplicispira psychrophile(WP-051603004)、Sphingobium psychrophilum(WP-169570392)、Sphingomonas psychrolutea(WP-188445826)、同型丙酸梭菌(Clostridiumhomopropionicum)(WP-074782965)、梭菌属物种(Clostridium sp.)DL-VIII(WP-009169886)、梭状梭菌(Clostridium clostridioforme)CAG:132(CDB63357)、大西洋王祖农菌(Zunongwangia atlantica)22II14-10F7(ORL47196)。

在一些实施方案中，可以利用由嗜盐菌产生的嗜极端菌酶。例如，在一些实施方案中，可以利用在约1M或更高、约2M或更高的盐度处表现出活性的嗜盐菌酶。本文涵盖的示例性嗜盐菌(以及由此产生的嗜盐菌酶)可以包括但不限于：盐藻交替单胞菌(Alteromonashalophila)(WP-189403400)、成晶节杆菌(Arthrobacter crystallopoietes)(WP-005270754)、节杆菌属物种(Arthrobacter sp.)NEB 688(WP-173027059)、高盐固氮螺菌(Azospirillum halopraeferens)(WP-029007775)、Empedobacter haloabium(TXE30443)、Desulfovibrio sulfodismutans(NDY59052)、湖南盐芽孢杆菌(Halobacillushunanensis)(WP-139377117)、衣氏盐芽孢杆菌(Halobacillus ihumii)(WP-16352794)、Halobacteriovorax marinus(WP-157868258)、Haloechinothrix halophila(WP-051400222)、东方盐海洋菌(Halomarina oriensis)(WP-158204529)、平静盐单胞菌(Halomonas cerina)(WP-183325502)、Halomonas korlensis(WP-089794761)、盐单胞菌属物种(Halomonas sp.)PR-M31(WP-048308188)、海水盐单胞菌(Halomonas aquamarine)(WP-089674669)、湛江盐单胞菌(Halomonas zhanjiangensis)(WP-040460201)、Halomonasaestuarii(WP-071946866)、内生盐单胞菌(Halomonas endophytica)(WP-102654199)、黑龙江盐单胞菌(Halomonas heilongjiangensis)(WP-102629242)、Halomonascampaniensis(WP-088701082)、嗜碱盐单胞菌(Halomonas alkaliphile)(WP-038486873)、盐单胞菌属物种(Halomonas sp.)ALS9(WP-064233856)、盐单胞菌属物种(Halomonas sp.)GFAJ-1(WP-009098816)、盐单胞菌属物种(Halomonas sp.)KHS3(WP-041159480)、嗜碱盐单胞菌(Halomonas alkaliphile)(WP-162218603)、盐单胞菌属物种(Halomonas sp.)ZH2S(WP-160419650)、Halomonas alkaliantarctica(WP-133732469)、Halomonas zincidurans(WP-031384106)、Halomonas chromatireducens(WP-083517585)、盐单胞菌属物种(Halomonas sp.)KO116(WP-035563078)、盐单胞菌属物种(Halmonas sp.)A40-4(WP-199285424)、Halomonas ventosae(WP-035579360)、盐单胞菌属物种(Halomonas sp.)HAL1(WP-008958555)、盐单胞菌属物种(Halomonas sp.)MES3-P3E(WP-101146070)、盐单胞菌属物种(Halomonas sp.)1513(WP-083700770)、盐单胞菌属物种(Halomonas sp.)GT(WP-083007892)、盐单胞菌属物种(Halomonas sp.)PA5(QJQ97022)、Halomonas songnenensis(WP-106373458)、冰下盐单胞菌(Halomonas subglaciescola)(WP-079553041)、盐单胞菌属物种(Halomonas sp.)HL-92(WP-074398447)、新疆盐单胞菌(Halomonasxinjiangensis)(WP-197053288)、Halomonas saliphila(WP-104202516)、盐单胞菌物种(Halomonas sp.)HL-48(WP-027336292)、Halomonas qijiaojingensis(WP-189471950)、乌鲁木齐盐单胞菌(Halomonas 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boliviensis)(WP-083825729)、盐单胞菌属物种(Halomonas sp.)QHL1(WP-083571058)、Halomonas ilicicola(WP-072822829)、Halomonas saccharevitans(WP-089847692)、Halomonas muralis(WP-089729617)、Halomonas arcis(WP-089706930)、玻利维亚盐单胞菌(Halomonas boliviensis)(WP-040480056)、Halomonas andesensis(WP-126944084)、盐单胞菌属物种(Halomonas sp.)G5-11(WP-168017113)、盐单胞菌属物种(Halomonas sp.)THAF5a(QFU03326)、Halomonastaeanensis(SDG32001)、盐单胞菌属物种(Halorussus sp.)RC-68(WP-128475846)、Halorussus ruber(WP-135825713)、盐红色菌属物种(Halorussus sp.)ZS-3(WP-158056449)、盐红色菌属物种(Halorussus sp.)HD8-83(WP-135830119)、盐沼盐红色菌(Halorussus salinus)(WP-135854680)、解淀粉盐红色菌(Halorussus amylolyticus)(WP-132060623)、盐红色菌属物种(Halorussus sp.)MSC15.2(WP-163523881)、Haloterrigena limicola(WP-008010666)、西班牙盐栖菌(Haloterrigena hispanica)(WP-149782231)、盐栖菌属物种(Haloterrigena sp.)H1(WP-138782397)、Isoptericolahalotolerans(WP-171781920)、海杆菌属物种(Marinobacter sp.)X15-166B(WP-198929205)、海杆菌属物种(Marinobactersp.)LPB0319(WP-2066439888)、Marinobactersalaries(WP-126811858)、海杆菌属物种(Marinobacter sp.)PJ-16(WP-137435339)、Marinobacter nanhaiticus(WP-004579452)、Marinobacter bohaiensis(WP-111497193)、海杆菌属物种(Marinobacter sp.)ANT_B65(WP-202971753)、沉积海杆菌(Marinobactersediminum)(WP-203299860)、居泉海杆菌(Marinobacter fonticola)(WP-148861082)、海杆菌属物种(Marinobacter sp.)JB02H27(WP-150989051)、Marinobacter maritimus(WP-144775354)、硝酸盐还原海杆菌(Marinobacter nitratireducens)(WP-036130189)、Marinobacter aromaticivorans(WP-100686899)、海杆菌属物种(Marinobacter sp.)MCTG268(WP-081899301)、深源海杆菌(Marinobacter profundi)(WP-099614009)、海杆菌属物种(Marinobacter sp.)R17(WP-123633665)、海杆菌属物种(Marinobacter sp.)F3R11(WP-113816648)、Marinobacter lipolyticus(WP-012136507)、海杆菌属物种(Marinobacter sp.)LV10MA510-1(WP-098421792)、海杆菌属物种(Marinobacter sp.)LV10R520-4(WP-143751449)、南极海杆菌(Marinobacter antarcticus)(WP-072795398)、浙江海杆菌(Marinobacter zhejiangensis)(WP-092022278)、海杆菌属物种(Marinobacter sp.)LZ-8(WP-138439039)、海杆菌属物种(Marinobacter sp.)LZ-6(WP-138437074)、海杆菌属物种(Marinobacter sp.)DS40M8(WP-169052525)、胜利油田海杆菌(Marinobacter shengliensis)(WP-106694886)、栖藻海杆菌(Marinobacter algicola)(WP-007152654)、Marinobacter salicampi(WP-166253549)、海杆菌属物种(Marinobactersp.)JSM 1782161(WP-165857264)、Methyloligella halotolerans(WP-069095898)、嗜盐小单孢菌(Micromonospora halophytica)(WP-091291516)、嗜盐碱球菌属物种(Natronococcus sp.)LS1_42(WP-148858780)、Nocardiopsis halotolerans(WP-017570132)、Paracoccus halophilus(WP-036743786)、Roseivivax halodurans(WP-037257008)、嗜盐糖单孢菌(Saccharomonospora halophila)(WP-157601674)、Shewanellavesiculosa(NCO72699)、Shewanella psychrophila(WP-077755816)、Shewanellafrigidimarina(WP-123883413)、Shewanella khirikhana(WP-126168307)、Shewanellahalifaxensis(WP-108946642)、Shewanella waksmanii(WP-028774143)、Shewanellasaliphila(WP-188922486)、Shewanella ulleungensis(WP-188954542)、Shewanellalitoralis(WP-160052797)。

在一些实施方案中，可以利用由嗜酸菌产生的嗜极端菌酶。例如，可以利用在约1至约5.5的pH处表现出活性的嗜酸菌酶。本文涵盖的示例性嗜酸菌(以及由此产生的嗜酸菌酶)可以包括但不限于：Acidibrevibacterium fodinaquatile(WP-162800754)、喜酸菌属物种(Acidicaldus sp)(HGC43174)、隐藏嗜酸菌(Acidiphilium cryptum)(WP-050751056)、生红酸球形菌(Acidisphaera rubrifaciens)(WP-084623200)、酸球形菌属物种(Acidisphaera sp.)S103(WP-158926549)、酸杆菌门(Acidobacteria)细菌(MBI4850940)、酸杆菌目(Acidobacteriales)细菌(MBA3914351)、酸杆菌科(Acidimicrobiaceae)细菌(TPW09344)、解纤维热酸菌(Acidothermus cellulolyticus)(WP-011719018)、食酸菌属物种(Acidovorax sp.)(RZJ59385)、食酸菌属物种(Acidovoraxsp.)Leaf160(WP-156382378)、西瓜食酸菌(Acidovorax citrulli)(WP-116212334)、食酸菌属物种(Acidovoraxsp.)ST3(WP-110960035)、食酸菌属物种(Acidovorax sp.)SD340(WP-055393692)、食酸菌属物种(Acidovorax sp.)JHL-9(WP-026434583)、食酸菌属物种(Acidovorax sp.)JHL-3(WP-024815995)、食酸菌属物种(Acidovorax sp.)59(WP-099731663)、食酸菌属物种(Acidovorax sp.)T1(WP-087747071)、Acidovorax radices(WP-145694120)、西瓜食酸菌(Acidovorax citrulli)(MVT28077)、Acidovorax konjaci(WP-184273732)、食酸菌属物种(Acidovorax sp.)YL-MeA13-2016(WP-179683865)、食酸菌属物种(Acidovorax sp.)JMULE5(WP-176888736)、Acidovorax carolinensis(WP-086926820)、食酸菌属物种(Acidovorax sp.)Root219(WP-057264729)、食酸菌属物种(Acidovorax sp.)Root217(WP-057200451)、食酸菌属物种(Acidovorax sp.)Root70(WP-056639581)、食酸菌属物种(Acidovorax sp.)Root267(WP-057271450)、食酸菌属物种(Acidovorax sp.)Root275(WP-057228519)、食酸菌属物种(Acidovorax sp.)Root568(WP-056742554)、食酸菌属物种(Acidovorax sp.)Root402(WP-056056880)、食酸菌属物种(Acidovorax sp.)Leaf78(WP-056167938)、食酸菌属物种(Acidovorax sp.)CF316(WP-007848954)、食酸菌属物种(Acidovorax sp.)NO-1(WP-008904688)、食酸菌属物种(Acidovorax sp.)KKS102(WP-015015374)、食酸菌属物种(Acidovorax sp.)BoFeN1(WP-114656624)、食酸菌属物种(Acidovorax sp.)MR-S7(WP-020227330)、食酸菌属物种(Acidovorax sp.)GW101-3H11(WP-063462297)、食酸菌属物种(Acidovorax sp.)100(WP-121942233)、食酸菌属物种(Acidovorax sp.)94(WP-121421729)、食酸菌属物种(Acidovorax sp.)93(WP-121508058)、食酸菌属物种(Acidovorax sp.)IB03(WP-198847087)、敏捷食酸菌(Acidovorax facilis)(WP-182119389)、Acidovorax cattleya(WP-196290774)、Acidovorax soli(WP-184855240)、食酸菌属物种(Acidovorax sp.)TP4(BAA35137)、食酸菌属物种(Acidovoraxsp.)HMWF018(WP-199227795)、食酸菌属物种(Acidovorax sp.)107(WP-108624875)、食酸菌属物种(Acidovorax sp.)69(WP-100412617)、食酸菌属物种(Acidovorax sp.)RAC01(WP-069104250)、燕麦食酸菌(Acidovorax avenae)(WP-107129247)、食酸菌属物种(Acidovorax sp.)ACV01(WP-192426852)、食酸菌属物种(Acidovorax sp.)ACV02(WP-192419383)、食酸菌属物种(Acidovorax sp.)SRB_14(WP-173025722)、食酸菌属物种(Acidovorax sp.)99(WP-116748450)、Acidovorax delafieldii(WP-060985808)、食酸菌属物种(Acidovorax sp.)16-35-5(WP-175506463)、Acidovorax valerianellae(WP-092740663)、中等食酸菌(Acidovorax temperans)(WP-142084895)、水稻食酸菌(Acidovorax oryzae)(WP-026433360)、食酸菌属物种(Acidovorax sp.)SRB_24(WP-169168665)、Acidovoraxcavernicola(WP-119555154)、中等食酸菌(Acidovorax temperans)(WP-044398345)、酸体菌属物种(Acidisoma sp.)S159(WP-159014448)、酸体菌属物种(Acidisoma sp.)L85(WP-158802619)、酸球形菌属物种(Acidisphaera sp.)L21(WP-158747166)、隐藏嗜酸菌(Acidiphilium cryptum)JF-5(ABQ28771)、Actinospica acidiphila(WP-193455356)、苹果脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus pomorum)(WP-084453829)、Amycolatopsisacidiphila(WP-144638401)、Azospirillum baldaniorum(WP-014240680)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)(WP-013057692)、嗜酸细小链孢菌(Catenulispora acidiphila)(WP-015793547)、代尔夫特菌属物种(Delftia sp.)UME58(WP-183018265)、Delftiaacidovorans(WP-202760212)、Delftia lacustris(WP-016453321)、Methylocapsaacidiphila(WP-026607232)、Paraburkholderia acidophila(WP-084908171)、Paraburkholderia acidisoli(WP-158957882)、Paraburkholderia acidipaludis(WP-027796272)、Priestia megaterium(WP-016764703)、Rhizobium acidisoli(WP-054183259)、Rhodoblastus acidophilus(WP-088519736)、Stenotrophomonasacidaminiphila(WP-054666853)、酸疮痂链霉菌(Streptomyces acidiscabies)(WP-078480871)、Streptomyces acidicola(WP-152864677)。

在一些实施方案中，可以利用由嗜碱菌产生的嗜极端菌酶。例如，可以利用在约7.5至约11.5的pH处表现出活性的嗜碱菌酶。本文涵盖的示例性嗜碱菌(以及由此产生的嗜碱菌酶)可以包括但不限于：Alkalilacustris brevis(WP-114966465)、Alkalihalobacillus macyae(WP-152670966)、Alkalihalobacillus pseudofirmus(WP-012960136)、Alkalihalobacillus shacheensis(WP-082676287)、Alkalihalobacillusxiaoxiensis(WP-204463621)、碱湖生菌属物种(Alkalilimnicola sp.)S0819(WP-152144452)、解淀粉碱单胞菌(Alkalimonas amylolytica)(WP-091344878)、耐碱拟无枝酸菌(Amycolatopsis alkalitolerans)(WP-139096058)、Cupriavidus alkaliphilus(WP-111516860)、Ensifer alkalisoli(WP-151613639)、Lacimicrobium alkaliphilum(WP-062478888)、Lysobacter alkalisoli(QDH70273)、Massilia alkalitolerans(WP-036214799)、甲基细菌属物种(Methylobacter sp.)B2(WP-174627553)、Neorhizobiumalkalisoli(WP-105385441)、Nocardiopsis alkaliphile(WP-051045978)、Ramlibacteralkalitolerans(WP-201687394)、Spinactinospora alkalitolerans(WP-179641803)。

在一些实施方案中，可以利用由嗜压菌产生的嗜极端菌酶。例如，在一些实施方案中，可以利用在约110kPa或更高、或者约50MPa或更高的压力处表现出活性的嗜压菌酶。本文涵盖的示例性嗜压菌(以及由此产生的嗜压菌酶)可以包括但不限于：Oceanobacilluspiezotolerans(WP-121525044)、Oceanobacillus profunda(WP-169713018)、Colwelliamarinimaniae(WP-082606415)、Salinimonas sediminis(WP-108566897)。

本文还涵盖抗辐射嗜极端菌。例如，可以利用抗辐射生物体(诸如耐辐射奇异球菌(Deinococcus radiotolerans))，它产生抗辐射极端酶(WP_189068351)。在一些实施方案中，本文涵盖的抗辐射生物体和抗辐射极端酶通常可以在约1000Gy或更大、或者约2000Gy或更大的急性电离辐射(γ射线、高能UV射线、X射线等)水平处有活性。

所公开使用的极端酶不必限于那些天然存在于“超”极端环境中的酶。例如，不必利用由存在的最嗜盐细菌/古菌(例如，Salinibacter ruber，存在于5.0M盐水微环境中)中的一者产生的极端酶。相反，所公开的系统和方法可以包括由存在于致病性嗜中温菌不能存活或生长的环境(例如，约1.0M NaCl)中的生物体产生的极端酶。因此，本文涵盖的极端酶包括由可以在中等极端来源处存活的生物体产生的那些极端酶。

在一些实施方案中，如所公开使用的PHBD酶/细菌/古菌可以包括存在于两种或更多种极端环境条件的组合下的多嗜极端菌和/或多嗜极端菌酶。例如，嗜盐碱性嗜热菌，它理想地存在于高盐、温度和碱性条件下，或者耐冷嗜盐菌，它理想地存在于低温和高盐条件下。大多数嗜压(喜压)嗜极端菌存在于海底，因此也是嗜盐(喜盐)和嗜冷(喜冷)的，所有这些都是可以在提供嗜中温病原体脱污的反应室内同时产生和维持的条件。在这种实施方案中，可以通过多种机制结合由单一多嗜极端菌酶催化的解聚反应来解决嗜中温菌污染。

在一些实施方案中，与利用单一极端条件相比，利用多种极端条件进行脱污并结合使用一种或多种多嗜极端菌酶的酶促生物降解，可以提供病原体死亡率的增加。例如，在多种极端条件下的解聚/脱污过程期间病原体的死亡率可以大于病原体在单独的极端条件中的任一者下的死亡率，并且在一些实施方案中，病原体死亡率可以比个别极端条件下的死亡率的总和更大。此外，在一些实施方案中，与单一极端条件下的解聚速率相比，在程序期间利用多个极端条件可以增加解聚的速率，例如单体或寡聚体羟基链烷酸酯产生的速率。

在需要相对中等极端条件的实施方案中，在多种极端条件下改善的脱污效果可以是有益的。例如，通过在解聚/脱污操作中利用一种或多种多嗜极端菌酶(任选地包括一种或多种单一条件极端酶)，相对中等极端条件(例如，约1.0M NaCl的盐度与约50℃至约80℃的相对中等高温的组合)的组合与在较高盐度或温度处的单一极端条件体系下相比，可以以更低的成本提供快速脱污和解聚。

此前提及的许多嗜极端菌和极端酶都是多嗜极端菌。下表1提供了表达可以如本文所述利用的PHBD酶的多嗜极端菌属的非限制性列表。放线菌门(Actinobacteria)是在高温和碱性环境下生长的细菌门，并且该门的分类科成员(例如，链孢霉科(Streptosporangiceae)、热单孢菌科(Thermomonosporaceae)、诺卡氏菌科(Nocardiopsaceae)、柏哥里菌科(Bogoriellaceae)、链霉菌科(Streptomycetaceae)和假诺卡氏菌科(Pseudoonocardiaceae))可以在一些实施方案中利用。当然，酸性条件同样可以与温度或其他极端条件组合。属于嗜热嗜酸菌的多嗜极端细菌的实例包括但不限于：酸热菌科(Acidothermaceae)、酸杆菌科(Acidimicrobiaceae)、嗜热油菌科(Thermoleophilaceae)和红色杆菌科(Rubrobacteraceae)。

表1

*分类科

本文涵盖的示例性多嗜极端菌(以及由此产生的多嗜极端菌酶)可以包括但不限于(其中一些也包括在此前提及的那些中)：解纤维热酸菌(Acidothermuscellulolyticus)(WP_011719018)、成晶节杆菌(Arthrobacter crystallopoietes)(WP_005270754)、节杆菌属物种(Arthrobacter sp.)NEB 688(WP_173027059)、Amycolatopsisdecaplanina(WP_007028471)、Amycolatopsis azurea(WP_039919726)、Amycolatopsisorientalis(WP_044853678)、Amycolatopsis regifaucium(WP_061985795)、Amycolatopsis alba(WP_020632115)、拟无枝酸菌属物种(Amycolatopsis sp.)CB00013(WP_073845662)、拟无枝酸菌属物种(Amycolatopsis sp.)WAC 04182(WP_125683401)、拟无枝酸菌属物种(Amycolatopsis sp.)WAC 04197(WP_125733174)、拟无枝酸菌属物种(Amycolatopsis sp.)WAC 01416(WP_125797595)、Amycolatopsis lurida(WP_034314791)、澳大利亚拟无枝酸菌(Amycolatopsis australiensis)(WP_072479564)、拟无枝酸菌属物种(Amycolatopsis sp.)WAC 01375(WP_125786221)、拟无枝酸菌属物种(Amycolatopsis sp.)YIM 10(WP_194239921)、澳大利亚拟无枝酸菌(Amycolatopsisaustraliensis)(WP_072480012)、拟无枝酸菌属物种(Amycolatopsis sp.)WAC 01376(WP_125797552)、拟无枝酸菌属物种(Amycolatopsis sp.)WAC 01376(WP_125791151)、拟无枝酸菌属物种(Amycolatopsis sp.)BJA-103(WP_168214428)、拟无枝酸菌属物种(Amycolatopsis sp.)WAC 04169(WP_125694889)、拟无枝酸菌属物种(Amycolatopsissp.)YIM 10(WP_153034611)、Amycolatopsis xylanica(WP_091289432)、泰国拟无枝酸菌(Amycolatopsis thailandensis)(WP_093938547)、Amycolatopsis tolypomycina(WP_091314877)、拟无枝酸菌属(Amycolatopsis)(WP_094002797)、Amycolatopsismediterranei(WP_013227677)、Amycolatopsis tolypomycina(WP_091316988)、Amycolatopsis mediterranei(WP_013225900)、拟无枝酸菌属物种(Amycolatopsissp.)MJM2582(WP_037335097)、Amycolatopsis pretoriensis(WP_086680613)、地中海拟无枝酸菌(Amycolatopsis mediterranei)(WP_014467631)、地中海拟无枝酸菌(Amycolatopsismediterranei)(WP_013227743)、莱克星敦拟无枝酸菌(Amycolatopsis lexingtonensis)(WP_086861387)、Amycolatopsis balhimycina(WP_026468360)、Amycolatopsistolypomycina(WP_091309318)、地中海拟无枝酸菌(Amycolatopsis mediterranei)(WP_013225589)、莱克星敦拟无枝酸菌(Amycolatopsis lexingtonensis)(WP_086864508)、Amycolatopsis balhimycina(WP_020640708)、Amycolatopsis balhimycina(WP_020639925)、Amycolatopsis japonica(WP_038521005)、Amycolatopsis vancoresmycina(WP_051767789)、Amycolatopsis vancoresmycina(WP_162146255)、Amycolatopsisvancoresmycina(WP_003055279)、Amycolatopsis vancoresmycina(WP_003059137)、Amycolatopsis arida(WP_177216885)、Amycolatopsis orientalis(WP_037305638)、地中海拟无枝酸菌(Amycolatopsis mediterranei)U32(ADJ49174)、Amycolatopsisbalhimycina(WP_020640186)、Amycolatopsis balhimycina(WP_020646797)、Amycolatopsis regifaucium(WP_158070237)、Amycolatopsis umgeniensis(WP_184896802)、地中海拟无枝酸菌(Amycolatopsis mediterranei)(WP_176742238)、Amycolatopsis orientalis(WP_037318494)、Amycolatopsis taiwanensis(WP_027941815)、热黄拟无枝酸菌(Amycolatopsis thermoflava)(WP_037323546)、Amycolatopsis nigrescens(WP_157357235)、Amycolatopsis benzoatilytica(WP_020658806)、热黄拟无枝酸菌(Amycolatopsis thermoflava)(WP_123687648)、拟无枝酸菌属物种(Amycolatopsis sp.)MtRt-6(WP_206788940)、Amycolatopsis nigrescens(WP_020673950)、拟无枝酸菌属物种(Amycolatopsis sp.)MtRt-6(WP_206796628)、拟无枝酸菌属物种(Amycolatopsis sp.)MtRt-6(WP_206785025)、拟无枝酸菌属物种(Amycolatopsissp.)195334CR(WP_206808196)、拟无枝酸菌属物种(Amycolatopsis sp.)SID8362(WP_166641473)、Amycolatopsis vastitatis(WP_167441766)、拟无枝酸菌属物种(Amycolatopsis sp.)MtRt-6(WP_206794433)、拟无枝酸菌属物种(Amycolatopsis sp.)195334CR(WP_206804625)、拟无枝酸菌属物种(Amycolatopsis sp.)SID8362(WP_160695402)、拟无枝酸菌属物种(Amycolatopsis sp.)195334CR(WP_206805671)、地中海拟无枝酸菌(Amycolatopsis mediterranei)S699(AEK42609)、拟无枝酸菌属物种(Amycolatopsis sp.)SID8362(WP_160697844)、Amycolatopsis ruanii(WP_116109633)、Amycolatopsis vastitatis(WP_093953441)、Amycolatopsis antarctica(WP_094864937)、拟无枝酸菌属物种(Amycolatopsis sp.)SID8362(WP_160697847)、Amycolatopsis vastitatis(WP_093953193)、Amycolatopsis rifamycinica(WP_043779284)、Amycolatopsis rifamycinica(WP_043787922)、Amycolatopsis orientalis(WP_044854926)、Amycolatopsis albispora(WP_113697064)、Amycolatopsis vastitatis(WP_093953762)、Amycolatopsis keratiniphila(WP_043848437)、Amycolatopsisrifamycinica(WP_043776526)、拟无枝酸菌属物种(Amycolatopsissp.)ATCC 39116(WP_039791697)、拟无枝酸菌属物种(Amycolatopsis sp.)CA-126428(WP_199191631)、拟无枝酸菌属物种(Amycolatopsis 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cerina)(WP_183325502)、未分类的盐单胞菌(Halomonas)(sp.RC)(WP_126951333)、盐单胞菌属物种(Halomonas sp.)TD01(WP_009722522)、泰坦尼克盐单胞菌(Halomonas titanicae)(WP_089691351)、海水盐单胞菌(Halomonas aquamarina)(WP_089674669)、Halomonas gudaonensis(WP_089686750)、Halomonas alkaliantarctica(WP_133731111)、Halomonas saccharevitans(WP_089847692)、仙河盐单胞菌(Halomonas xianhensis)(WP_092845804)、Halomonassongnenensis(WP_106373458)、Halomonas zincidurans(WP_031384106)、黄色盐单胞菌(Halomonas lutea)(WP_019020614)、玻利维亚盐单胞菌(Halomonas boliviensis)(WP_083825729)、盐单胞菌属物种(Halomonas sp.)GFAJ-1(WP_009098816)、Halomonasmuralis(WP_089729617)、玻利维亚盐单胞菌(Halomonas boliviensis)(WP_040480056)、盐单胞菌属物种(Halomonassp.)(HAA45741)、湛江盐单胞菌(Halomonas zhanjiangensis)(WP_040460201)、Halomonas campaniensis(WP_088701082)、嗜碱盐单胞菌(Halomonasalkaliphile)(WP_162218603)、盐单胞菌属物种(Halomonassp.)ZH2S(WP_160419650)、内生盐单胞菌(Halomonas endophytica)(WP_102654199)、盐单胞菌属物种(Halomonas sp.)ALS9(WP_064233856)、盐单胞菌属物种(Halomonas sp.)KHS3(WP_041159480)、Halomonassalicampi(WP_179930793)、Halomonas 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sp.)TQ8S(WP_114486842)、泰坦尼克盐单胞菌(Halomonas titanicae)(WP_144812651)、盐单胞菌属物种(Halomonas sp.)PYC7W(WP_114478819)、盐单胞菌属物种(Halomonas sp.)PYC7W(WP_114478692)、盐单胞菌属物种(Halomonas sp.)LBP4(WP_181421925)、盐单胞菌属物种(Halomonas sp.)TQ8S(WP_114487405)、冰盐单胞菌(Halomonas glaciei)(WP_179915254)、盐单胞菌属物种(Halomonas sp.)QX-2 9(WP_180092182)、盐单胞菌属物种(Halomonas sp.)SH5A2(WP_186253301)、肇东盐单胞菌(Halomonas zhaodongensis)(WP_179927495)、泰坦尼克盐单胞菌(Halomonas titanicae)(WP_144810212)、南海盐单胞菌(Halomonas nanhaiensis)(WP_127060197)、Halomonaspantelleriensis(WP_089659512)、肇东盐单胞菌(Halomonas zhaodongensis)(WP_179926908)、Halomonas humidisoli(WP_095603093)、盐单胞菌属物种(Halomonas sp.)QHL1(WP_083571058)、盐单胞菌属物种(Halomonas sp.)PC(WP_127040515)、盐单胞菌属(Halomonas sp.)DQ26W(WP_114573011)、胜利油田盐单胞菌(Halomonas shengliensis)(WP_089679049)、盐单胞菌属物种(Halomonas sp.)QX-1(WP_176303735)、盐单胞菌属物种(Halomonas sp.)QHL1(WP_071693265)、Halomonas korlensis(WP_089794761)、Halomonasaestuarii(WP_071946866)、盐单胞菌属物种(Halomonas sp.)PR-M31(WP_048308188)、盐单胞菌属物种(Halomonas sp.)PA5(QJQ97022)、Halomonas andesensis(WP_126944084)、盐单胞菌属物种(Halomonas sp.)PA5(QJQ94877)、盐单胞菌属物种(Halomonas sp.)L5(WP_149329933)、Halomonas korlensis(SFU56513)、盐单胞菌属物种(Halomonas sp.)G5-11(WP_168017113)、Halomonas subterranean(WP_092824778)、盐单胞菌属物种(Halomonas sp.)(HDZ47214)、盐单胞菌属(Halomonas sp.)THAF5a(QFU03326)、盐单胞菌属物种(Halomonas sp)(HDZ46744)、Halomonas chromatireducens(AMD02558)、Halomonasandesensis(WP_126948398)、Halomonas korlensis(SFU93166)、Halomonas taeanensis(SDG32001)、盐沼盐红色菌(Halorussus salinus)(WP_135854385)、盐红色菌属物种(Halorussussp.)MSC15.2(WP_163523881)、盐沼盐红色菌(Halorussus salinus)(WP_135854680)、解淀粉盐红色菌(Halorussus amylolyticus)(WP_132060623)、盐红色菌属物种(Halorussus sp.)ZS-3(WP_158056449)、解淀粉盐红色菌(Halorussus amylolyticus)(WP_132060625)、盐红色菌属物种(Halorussus sp.)ZS-3(WP_158056448)、盐红色菌属物种(Halorussus sp.)RC-68(WP_128475846)、Halorussus ruber(WP_135825713)、Halorussus ruber(WP_135825712)、盐红色菌属物种(Halorussus sp.)HD8-83(WP_135830119)、海杆菌属物种(MariInobacter sp.)LV10R520-4(WP_143751449)、浙江海杆菌(Marinobacter zhejiangensis)(WP_092022278)、未分类的海杆菌(Marinobacter)(WP_150989051)、硝酸盐还原海杆菌(Marinobacter nitratireducens)(WP_036130189)、Marinobacter salarius(WP_091640839)、未分类的海杆菌(Marinobacter)(WP_098419392)、栖藻海杆菌(Marinobacter algicola)(WP_007152654)、南极海杆菌(Marinobacter antarcticus)(WP_072795398)、未分类的海杆菌(Marinobacter)(WP_152438805)、海杆菌属(Marinobacter)(WP_075197007)、深源海杆菌(Marinobacterprofundi)(WP_099614009)、海杆菌属物种(Marinobacter sp.)LPB0319(WP_206643988)、海杆菌属物种(Marinobacter sp.)DS40M8(WP_169052525)、海杆菌属物种(Marinobactersp.)X15-166B(WP_198929205)、未分类的海杆菌(Marinobacter)(WP_081899301)、海杆菌属物种(Marinobacter sp.)PJ-16(WP_137435339)、Marinobacterbohaiensis(WP_111497193)、沉积海杆菌(Marinobacter sediminum)(WP_203299860)、Marinobacter lipolyticus(WP_012136507)、海杆菌属物种(Marinobacter sp.)ANT_B65(WP_202971753)、Marinobacter nanhaiticus(WP_004579452)、Marinobacter salarius(WP_126811858)、Marinobacter maritimus(WP_144775354)、海杆菌属物种(Marinobactersp.)F3R11(WP_113816648)、海杆菌属物种(Marinobacter sp.)LZ-8(WP_138439039)、海杆菌属物种(Marinobactersp.)LZ-6(WP_138437074)、胜利油田海杆菌(Marinobactershengliensis)(WP_106694886)、居泉海杆菌(Marinobacter fonticola)(WP_148861082)、海杆菌属物种(Marinobacter sp.)JSM 1782161(WP_165857264)、海杆菌属物种(Marinobacter sp.)R17(WP_123633665)、Marinobacter salicampi(WP_166253549)、海杆菌属物种(Marinobacter sp.)LV10MA510-1(WP_098421792)、褐色喜热裂孢菌(Thermobifida fusca)(WP_016187994)、大西洋王祖农菌(Zunongwangia atlantica)22II14-10F7(ORL471960)，

当然，在所公开的方法和系统中可以利用嗜极端菌和嗜极端菌酶的任何组合，并且同样可以利用对应于极端酶的活性条件的环境条件的任何组合来提供同时进行消费后产品的脱污和消费后产品中含有的一种或多种生物聚合物的降解的多维方法。

可以选择来自特定环境的极端PHBD酶/细菌/古菌来匹配解聚过程的需要。例如，如果需要/期望在高温处运行过程，则可以从嗜热菌中选择PHBD酶/细菌/古菌。类似地，如果需要或期望在高盐存在下运行反应，则所使用的PHBD酶/细菌/古菌可以选自嗜盐菌。类似地，如果脱污和解聚过程需要不太极端的条件，例如由于已知的污染物，则可以选择在那些不太极端的条件下表现出高活性的极端PHBD酶/细菌/古菌。在这种实施方案中，脱污过程可能不需要对病原体是致命的，但是可以提供不太极端的方法来从污染物中除去致病性特征。

如下文实施例部分所示，当利用多种极端条件时，细菌死亡率通常可以由最极端的条件驱动，并且这可以用于选择过程的极端酶，以获得所期望的效率以及脱污速率、解聚速率和成本之间的平衡。当然，虽然高病原体死亡率可能是作为过程参数基础的理想因素，但这可能不是所有情况下最理想的因素。例如，当考虑工业解聚过程时，可以利用病原体的存活半衰期来选择PHA酶，而不是总体病原体死亡率，通常与酶的解聚速率结合使用，以便最有效地最大化解聚、脱污和过程成本。

所公开的方法和系统可以利用由嗜极端微生物和/或一种或多种嗜极端菌或表达极端酶的经遗传修饰的生物体表达的一种或多种天然极端酶以及经遗传修饰的极端酶。虽然从天然嗜极端菌表达的极端酶可以在一些实施方案中利用，但是在一些实施方案中，如所公开使用的极端酶可以由转基因生物体产生，例如作为在工业过程中通过使用转基因高产率生物体产生的极端酶。在这种情况下，极端酶可以与天然产生的极端酶基本上相同，或者与天然极端酶相比可以包括一个或多个修饰。因此，本文还涵盖可以表达所描述的极端酶的转化细胞或无细胞表达系统。

极端酶可以通过转化合适的宿主生物体来表达，例如通过使用原核或真核宿主细胞。宿主细胞类型的实例包括但不限于细菌细胞(例如，大肠杆菌)、酵母细胞(例如，毕赤酵母、酿酒酵母(S.cerevisiae))、培养的昆虫细胞系(例如，果蝇(Drosophila))、植物细胞系(例如，玉米、烟草、水稻、甘蔗、马铃薯块茎)、哺乳动物细胞系(例如，中国仓鼠卵巢(CHO))。在一个实施方案中，可选择重组宿主细胞系统，该系统以产生最终催化酶所需的方式对新生多肽进行加工和翻译后修饰。

编码酶的核酸序列可以放置于表达载体中用于在选定宿主中表达。此类表达载体通常可以包含与编码酶的核酸序列连接的转录起始区。表达载体还可以包括多个限制性位点，用于插入核酸，以使该核酸处于各种调控元件的转录调节下。表达载体还可以含有选择性标记基因。合适的调控元件(诸如增强子/启动子、剪接结、多腺苷酸化信号等)可以放置在紧邻编码区的位置，以允许转录的正确起始和/或初级转录物(即，酶的编码区)的正确加工。或者，表达载体中使用的编码区可以含有内源性增强子/启动子、剪接结、间插序列、多腺苷酸化信号等，或者内源性和外源性调控元件的组合。

表达载体通常在转录的5'-3'方向上包括启动子、转录和翻译起始区、编码酶的DNA序列以及在宿主细胞中发挥功能的转录和翻译终止区。在一个实施方案中，可以使用基于T7的载体，它可以包括至少以下组件：复制起点、选择性抗生素抗性基因(例如，-amp

一般而言，可以使用能够与异源性DNA可操作地连接的任何合适的启动子，以使得可以通过RNA聚合酶从启动子启动DNA的转录，该RNA聚合酶可以特异性地识别、结合至并转录开放阅读框中的DNA。一些有用的启动子包括组成型启动子、诱导型启动子、调节型启动子、细胞特异性启动子、病毒启动子和合成启动子。此外，虽然启动子可以包括RNA聚合酶结合的序列，但这不是必需的。启动子可以从多种不同的来源获得。例如，启动子可以完全来源于宿主细胞的天然基因，由来源于自然界中存在的不同启动子的不同元件组成，或者由完全合成的核酸序列组成。启动子可以来源于许多不同类型的生物体并经过定制以在给定细胞内使用。例如，除了参与控制蛋白质翻译的区域(包括编码序列)之外，启动子还可以包括其他调节蛋白质可以结合的区域。

翻译起始序列可以来源于任何来源，例如，任何表达的大肠杆菌基因。一般而言，该基因是高表达基因。翻译起始序列可以通过标准重组方法、合成技术、纯化技术或它们的组合来获得，这些都是熟知的。或者，翻译起始序列可以从许多商业供应商获得。(OperonTechnologies；Life Technologies Inc.)。

终止区可以是转录起始区天然的，可以是编码区天然的，或者可以来源于另一个来源。转化细胞识别的转录终止序列是定位于翻译终止密码子的3'的调控区，因此与启动子一起位于编码序列的侧翼。实例包括来源于具有强启动子的基因的转录终止序列，诸如大肠杆菌中的trp基因以及其他生物合成基因。

可以使用的载体包括但不限于能够在原核生物和真核生物中复制的那些载体。例如，可以使用在细菌、酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞中复制的载体。载体的实例包括质粒、噬菌粒、噬菌体、病毒(例如，杆状病毒)、粘粒和F-因子。特定的载体可用于特定的细胞类型。另外，穿梭载体可以用于在多于一种细胞类型中克隆和复制。此类穿梭载体是本领域已知的。如果需要，载体可以是可在多个宿主中发挥作用的双功能表达载体。

根据需要，编码极端酶的表达载体可以通过本领域的技术人员已知的任何方法引入宿主细胞中，并且核酸构建体可以在宿主细胞内染色体外携带或可以整合进宿主细胞染色体中。用于原核生物宿主(诸如细菌细胞)的载体包括复制系统，该复制系统能够在宿主中维持以进行表达或者克隆和扩增。载体可以以高拷贝数或低拷贝数存在于细胞中。一般而言，宿主细胞内存在约5至约200个，通常约10至约150个拷贝的高拷贝数载体。含有高拷贝数载体的宿主细胞优选地含有至少约10个、更优选至少约20个质粒载体。一般而言，宿主细胞内存在约1至10个、通常约1至4个拷贝的低拷贝数载体。

在多个实施方案中，细菌被用作宿主细胞。细菌的实例包括但不限于革兰氏阴性生物体和革兰氏阳性生物体。在一个实施方案中，可以使用适合T7蛋白表达的大肠杆菌表达系统。T7表达株的实例可以包括但不限于BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS、BLR(DE3)pLysS、Tuner(DE3)pLysS、Tuner(DE3)、Lemo21(DE3)、NiCO2(DE3)、Oragami2(DE3)、Origami B(DE3)、Shuffle T7 Express、HMS174(DE3)、HMS174(DE3)pLysS、DH5aplhaE、Rosetta2(DE3)、Rosetta2(DE3)pLysS、NovaBlue(DE3)、Rosetta-gami B、Rosetta-gami B(DE3)、Rosetta-gami B(DE3)pLysS、Rosetta Blue(DE3)、Novagen(DE3)、Novagen(DE3)pLysS。

可以通过常用的转化/感染程序来将表达载体引入细菌细胞中。含有表达盒的核酸构建体可以通过使用整合载体整合进细菌宿主细胞的基因组中。整合载体通常含有至少一个与允许载体整合的细菌染色体同源的序列。整合载体还可以含有噬菌体或转座子序列。染色体外和整合载体可以含有选择性标记，以允许选择已转化的细菌菌株。

有用的大肠杆菌表达系统载体可以含有组成型或诱导型启动子，以指导融合或非融合蛋白的表达。对于融合载体，通常将多个氨基酸添加至表达的靶基因序列中。另外，可以在靶标重组蛋白和融合序列之间的位点处引入蛋白水解切割位点。一旦融合蛋白被纯化，切割位点即允许靶标重组蛋白与融合序列分离。适用于切割蛋白水解切割位点的酶包括TEV、因子Xa和凝血酶。可用于本发明的融合表达载体可以包括表达例如但不限于麦芽糖结合蛋白(MBP)、硫氧还蛋白(THX)、几丁质结合结构域(CBD)、六组氨酸标签(His-标签)(SEQ ID NO:3)、谷胱甘肽-S-转移酶蛋白(GST)、FLAG肽、N-利用物质(NusA)或与靶标重组酶融合的小泛素修饰(SUMO)的那些。

将外源性DNA引入宿主细胞的方法是本领域可获得的，并且可以包括用CaCl

在将核酸转化或转染至细胞后，可以通过使用选择性标记来选择存在核酸的细胞。选择性标记通常编码在被引入受体细胞的核酸上。然而，选择性标记的共转染也可以在将核酸引入宿主细胞期间使用。可以在受体宿主细胞中表达的选择性标记可以包括但不限于使受体宿主细胞对药物具有抗性的基因，该药物诸如放线菌素Cl、放线菌素D、两性霉素、氨苄青霉素、博来霉素、羧苄青霉素、氯霉素、遗传霉素、庆大霉素、潮霉素B、单硫酸卡那霉素、氨甲蝶呤、丝裂霉素C、硫酸新霉素B、新生霉素钠盐、青霉素G钠盐、二盐酸嘌呤霉素、利福平、硫酸链霉素、盐酸四环素和红霉素。选择性标记还可以包括生物合成基因，诸如组氨酸、色氨酸和亮氨酸生物合成途径中的那些。在转染或转化宿主细胞后，使细胞与适当的选择剂接触。

再次参见图1，生物反应器可以包括入口流14，在一个实施方案中，入口流可以用于将一种或多种极端酶和/或嗜极端菌进料至反应室。在一些实施方案中，入口流14还可以用于连续地或周期性地向反应室提供材料。在其他实施方案中，系统可以包括多个入口，这些入口可以独立地用于向反应室10提供有用的材料。为了达到脱污目的，进料至反应室10的材料可以是促进反应室中的极端环境条件的材料。例如，在极端酶是嗜盐菌酶的那些实施方案中，入口14可以用于周期性地或连续地向反应室提供盐。例如，在一些实施方案中，反应室10的盐含量可以在反应期间维持例如约1M或更高、约1.5M或更高或者约2M或更高的浓度。在这种实施方案中可以利用任何合适的盐，包括但不限于，碱金属或碱土金属盐，诸如氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁、溴化钠、溴化钾、碘化钠、碘化钾或它们的混合物，以维持反应室10中所期望的盐含量。

当考虑嗜酸菌或嗜碱菌实施方案时，可以利用入口14向反应室提供合适的酸或碱。例如，在其中过程的极端酶是嗜酸菌酶的实施方案中，可以通过入口14向反应室10提供酸，以便可以在反应期间将反应室10内的pH维持在例如约5.5或更小的pH处，例如在一些实施方案中，约5或更小、约4或更小、约3或更小或者约2或更小。可以例如通过入口14进料至反应室10的酸可以包括强酸或弱酸以及无机酸或有机酸，优选的选择通常取决于反应程序所需的具体环境条件。

在其中过程的极端酶是嗜碱菌酶的实施方案中，可通过入口14向反应室10提供碱，以便可以在反应期间将反应室10内的pH维持在例如约7.5或更大的pH处，例如在一些实施方案中，约8或更大、约9或更大或者约10或更大。可以例如通过入口14进料至反应室10的碱可以包括强碱或弱碱以及无机碱或有机碱，优选的选择通常取决于反应程序所需的具体环境条件。

可以利用其他环境调控元件来修改/控制反应室10中的环境条件。例如，在其中过程的极端酶是嗜热菌酶或嗜冷菌酶的实施方案中，反应室10可以包括加热元件或冷却元件，例如可以具有水或蒸汽护套(图1中未示出)，以维持反应室10中的所期望的温度。例如，在嗜热菌实施方案中，反应室10中的温度可以维持在约40℃或更高、约45℃或更高、约50℃或更高或者约55℃或更高的温度处一段反应期，例如在一些嗜热菌实施方案中约40℃至约80℃，或者约45℃至约75℃。类似地，在嗜冷菌实施方案中，反应室10中的温度可以维持在约10℃或更低、约7℃或更低、约0℃或更低或者约-10℃或更低的温度处一段反应期，例如在一些嗜热菌实施方案中约-20℃至约0℃，或者约-15℃至约-5℃。

在其中过程的极端酶是嗜压菌酶的那些实施方案中，反应室10可以例如经由高压管线15与压缩机11连通。在其他实施方案中，反应室可以与合适的高压气源连通，例如当反应程序期望在高或低氧含量下进行时，或者在存在特定气态化合物(例如，二氧化碳等等)的情况下。在高压实施方案中，反应室10可以适当地与周围的大气分离，以使得反应室可以在高压处维持一段时间，在此期间反应室10的内容物可以被脱污并且反应室10内的生物聚合物物质可以被极端酶降解。例如，在一些实施方案中，反应室10内的压力可以维持在约10kPa或更大、约100kPa或更大、约500kPa或更大、约1MPa或更大、约10MPa或更大或者约50MPa或更大。

在一些实施方案中，脱污过程可以结合电离辐射的使用，例如在极端酶表现出抗辐射性的那些实施方案中。在这种实施方案中，反应室可以包括辐射源，该辐射源可以将适当的高能辐射，例如，约1000Gy或更高的高能紫外线辐射、伽马射线、X射线等，递送至反应室10的内容物。

可以将能够增强病原体对脱污过程的敏感性和/或能够增强生物聚合物的降解而不对该过程的其他组分产生负面影响的其他化合物和过程纳入到反应系统中。例如，添加气体(诸如CO

一种或多种极端酶和/或表达极端酶的嗜极端菌可以以促进极端酶与生物聚合物之间接触的任何合适的方式定位于反应室10中。例如，在一个实施方案中，反应室10可以包括床13，该床可以包括待处理的聚合物以及吸附到床13内或者包含在床内的酶和/或表达酶的细胞。酶和/或表达酶的细胞可以预先加载到床13上，可以例如通过入口14周期性地或连续地进料至反应室10，或者它们的一定组合。

第二入口16可以向反应室10提供连续的或周期性的聚合物进料，以进行同时降解和脱污。根据本公开，任何PHA聚合物都可以被降解和脱污。PHA可以是均聚物或共聚物。在一个实施方案中，可以将含PHB的材料进料至反应室10。

可掺入PHA中以进行所述加工的单体单元的实例可以包括2-羟基丁酸酯、乙醇酸、3-羟基丁酸酯、3-羟基丙酸酯、3-羟基戊酸酯、3-羟基己酸酯、3-羟基庚酸酯、3-羟基辛酸酯、3-羟基壬酸酯、3-羟基癸酸酯、3-羟基十二酸酯、4-羟基丁酸酯、4-羟基戊酸酯、5-羟基戊酸酯和6-羟基己酸酯。PHA均聚物的实例包括聚3-羟基链烷酸酯(例如，聚3-羟基丙酸酯(PHP)、聚3-羟基丁酸酯(PHB)、聚3-羟基戊酸酯(PHV)、聚3-羟基己酸酯(PHH)、聚3-羟基辛酸酯(PHO)、聚3-羟基癸酸酯(PHD)、聚3-羟基-5-苯基戊酸酯(PHPV))、聚4-羟基链烷酸酯(例如，聚4-羟基丁酸酯(以下称为PHB)、聚4-羟基戊酸酯(以下称为PHV))或聚5-羟基链烷酸酯(例如，聚5-羟基戊酸酯(以下称为PHV))。

在某些实施方案中，PHA可以是共聚物(含有两种或更多种不同的单体单元)，其中不同的单体随机分布在聚合物链中。PHA共聚物的实例包括聚3-羟基丁酸酯-共聚-3-羟基丙酸酯(下文称为PHB3HP)、聚3-羟基丁酸酯-共聚-4-羟基丁酸酯(下文称为P3HB4HB)、聚3-羟基丁酸酯-共聚-4-羟基戊酸酯(以下称为PHB4HV)、聚3-羟基丁酸酯-共聚-3-羟基戊酸酯(以下称为PHB3HV)、聚3-羟基丁酸酯-共聚-3-羟基己酸酯(以下称为PHB3HH)和聚3-羟基丁酸酯-共聚-5-羟基戊酸酯(以下称为PHB5HV)。

在一个实施方案中，通过入口16进料至反应室10的消费后产品可以被预处理，例如，切碎、研磨等，以提供用于产品的生物聚合物和反应室10内的酶之间的相互作用的大表面积。在消费后产品的脱污包括高温的实施方案中，在升高酶促过程的温度之前冷却待加工的含聚合物材料可以增强致病性微生物细胞的热失活。入口16可以进料颗粒物质，包括通过入口16进料消费后的PHA，例如螺旋型进料器，该入口可以位于反应器的侧面，通常靠近反应区12的顶部，例如，在床13上方。

入口14可以任选地提供通过床13的流动，以促进极端酶和生物聚合物之间的反应。在一些实施方案中，入口14可以提供向上通过反应室10的流动，并且入口16可以提供进入反应室10的连续的或周期性的聚合物流动。

在一个实施方案中，入口14可以靠近反应室10的底部并且可以在反应期间提供向上通过床13的连续流动。当来自入口14的流动向上移动通过反应室10时，酶任何其他组分(例如，盐、酸、碱)同样可以向上移动通过床13，并且在床的下部区域中降解PHA之后可以接触床13上端的未降解聚合物。同时，反应室10内的环境条件可以脱污聚合物以及与消费后产品中的聚合物相关的任何其他组分。因此，在一些实施方案中，通过来自入口14的向上流动向反应区10提供材料可以是有利的。在正在进行的降解过程期间，最初进料至床13的一定量的聚合物可以降解并且另外的聚合物可以在床13的顶部添加至反应器。因此，酶可以接触新进料的聚合物，并且聚合物的添加速率可以大致等于酶促水解的速率。

反应室还可以包括在床13上方的出口18，降解和脱污的聚合物以及该过程的任何其他剩余组分可以通过该出口离开反应器10。可以控制通过反应器的流动，以使得床内的保留时间提供适用于水解反应的酶和聚合物之间的接触。在一个实施方案中，床13的顶部可以装配有板，以防止剩余的聚合物颗粒和/或固体废物通过出口18离开。

在通过出口18离开后，反应产物流动可以通过分离器20，在分离器内，任何逸出的聚合物颗粒和/或酶可以与反应器流出物分离。例如，在一个实施方案中，酶可通过将诸如聚合物珠粒、凝胶等固定在载体上而保留在反应区12中，并且分离器20可以包括物理分离操作，以从流出物中除去任何此类载体材料并且通过管线22使该材料返回反应器。物理分离还可以用于使同步脱污/降解过程后剩余的任何固体废物与液体废物分离。

系统可以任选地包括分离操作15，该操作可以使来自反应器的产物流分离成各种产物，例如，PHA降解产物(可再利用的单体和/或低聚物)17、脱污的废物19、其他聚合物21等，例如通过蒸馏分离等等。有利的是，由于反应室10的全部内容物在程序期间被脱污，因此来自该程序的任何废物，无论是液体废物还是固体废物，都可以被简单且安全地丢弃。

图2展示了所公开的系统的另一个实施方案。在该实施方案中，反应室100可以是较小的系统的组件，例如可以用于家庭废物、小型企业废物、社区或邻里废物处理中心等。如图所示，系统可以包括反应室100，一种或多种消费后产品可以在使用后放置于反应室中。在较小设计的实施方案中，反应室将内部容积限定为例如约10L至约500L，例如在一些实施方案中约15L至约300L、约20L至约150L或者约25L至约100L。在一些实施方案中可以利用入口114向反应室100提供反应物或其他有用的材料。例如，在一个实施方案中，入口114可以提供与住宅水龙头的临时或永久连接，以使水流入反应室。

取决于系统中使用的极端酶和所期望的脱污方法，系统可以包括被构造为在反应室100内获得脱污环境条件的一个或多个组件。例如，在一个实施方案中，系统可以包括室110，该室可以携带反应物，例如盐、酸、碱或其他有用的材料，用于在处理操作期间控制释放。例如，室110可以容纳一定量的盐，并且在程序期间，水可以通过入口114流入室110，此时一定量的盐可以被溶解并且被水携带到反应室110。类似地，含有酸或碱反应物的室110可以被设计成将预定量的反应物可控制地释放至反应室110中，以在分批式降解/脱污操作期间使用。

或者，在通过使用所添加的材料获得反应室110内的环境条件的那些实施方案中，材料(盐、碱、酸)可以由使用者添加至反应室110中，例如根据需要与极端酶的添加或单独添加结合。

可以利用其他部件来控制反应室内的环境条件，包括一个或多个温度控制系统，例如围绕反应室110的加热或冷却盘管104、与反应室110连通的高压源115、以及/或高能辐射源，例如反应室110内的高能紫外光112。

在进行脱污/降解程序时，使用者可以简单地将用过的产品与酶、环境控制材料或如上文所述的可以促进该程序的其他材料一起加载到反应室中。然后可以例如通过盖120来密封反应室，盖可以在程序期间任选地被锁定。可以将水进料至反应室114中，并且反应室可以任选地包括搅拌装置，例如桨等等，该搅拌装置可以在同时脱污/降解程序过程中促进消费后产品和极端酶之间的接触。

在预定的反应期后，可以清空反应室的内容物，该反应期通常可以是几分钟至几小时，取决于酶、脱污条件和待处理的产品。例如，反应期可以为约5分钟或更长、约15分钟或更长、约30分钟或更长或者或约一小时或更长，诸如在一些实施方案中约5分钟至约3小时。由于反应室110的内容物通过该程序被脱污，因此处理后内容物可以被简单且安全地丢弃。例如，液体废物和固体废物可以通过排出管线121一起丢弃，或者，固体废物可以单独除去，例如通过利用可以在进行程序之前放置在反应室100中并且在程序后除去的一次性衬里125，同时液体废物可以通过排出管线121排出。

参考以下阐述的实施例可以更好地理解本公开。

实施例1

从嗜极端菌中分离出六种PHBD酶，这些酶被克隆到蛋白质表达载体中，并且纯化以供研究。这些酶包括两种从嗜热菌即嗜热徐丽华菌(Lihuaxuella thermophila)和施莱格尔氏菌属物种(Schlegelella sp.)ID0723分离的酶、两种从嗜盐菌即海水盐单胞菌(Halomonas aquamarine)和东方盐海洋菌(Halomarina oriensis)分离的酶、一种从嗜碱菌即解淀粉碱单胞菌(Alkalimonas amylolytica)分离的酶以及一种从嗜酸菌隐藏嗜酸菌(Acidiphilium cryptum)分离的酶。这两种嗜热菌酶在高温下使PHB解聚；所述高温高于肠道细菌可以存活的温度。嗜盐菌酶在盐的存在下也会进行同样的反应；海水盐单胞菌(Halomonas aquamarine)酶的最佳盐度为大约1M NaCl，并且东方盐海洋菌(Halomarinaoriensis)酶能够在高于1M的盐浓度下发挥作用；这两种浓度均高于肠道细菌可以存活的浓度。此外，从嗜中温菌弯曲假单胞菌(Pseudomonas geniculata)中分离出PHB解聚酶作为对照/比较。用于表达的特定酶序列的来源如表2所示。

表2

通过序列同源性以及纯化的蛋白质的酶活性，所有酶均被鉴定为PHBD酶。一般序列特征显示于表3中。

表3

*在除去任何信号序列并且包含N-末端甘氨酸后

PHB解聚酶表达构建体

将嗜热徐丽华菌(Lihuaxuella thermophila)、施莱格尔氏菌属物种(Schlegelella sp.)ID0723、弯曲假单胞菌(Pseudomonas geniculata)、东方盐海洋菌(Halomarina oriensis)、海水盐单胞菌(Halomonas aquamarine)、隐藏嗜酸菌(Acidiphilium cryptum)和解淀粉碱单胞菌(Alkalimonas amylolytica)PHD酶的氨基酸序列用于构建重组DNA表达系统。首先，从一些酶序列中除去已识别的信号序列(嗜热徐丽华菌同源物的前22个氨基酸、盐海洋菌(H.halomarina)同源物的前30个氨基酸、弯曲假单胞菌同源物的前27个氨基酸以及东方盐海洋菌同源物的前24个氨基酸)。对于隐藏嗜酸菌序列，由于该酶中没有信号序列，因此使用整个357个氨基酸的蛋白质。类似地，对于解淀粉碱单胞菌酶，由于该酶中没有信号序列，因此使用整个625个氨基酸的蛋白质。

将组氨酸表达序列和TEV蛋白酶切割信号序列：MHHHHHHGSENLYFQG(SEQ ID NO:1)添加至每个酶序列的氨基末端部分。在切割后，重组蛋白将具有以甘氨酸残基开始的N-末端序列。使用ATUM,Inc.的Gene Designer程序将这个新氨基酸序列反向翻译为DNA，并且针对在大肠杆菌中表达进行密码子优化。基因使用ATUM,Inc.的标准PCR技术来组装，并克隆至表达载体p454-MR(ampr，中等强度核糖体结合位点)中。在构建后通过DNA测序来验证插入片段。

酶的表达和纯化

将每个表达质粒用于转化化学感受态Oragami2-(DE3)细菌。从LB-Amp平板中选择单菌落并将单菌落用于表达筛选。使菌落在补充有100□g/mL氨苄青霉素的LB培养基中在37℃处生长12小时。该培养物用于以1:100的接种量接种新鲜的LB-AMP烧瓶。这些培养物在37℃下生长直到OD595＝0.4(通常4小时)，此时添加IPTG达到1mM的终浓度。生长持续12小时。细胞通过以10,000x g离心15分钟来收获，并冷冻于-80℃下直到使用(最短冷冻时间为24小时)。细胞在冰上解冻并重悬于缓冲液A(0.5M NaCl、20mM Tris-HCl、5mM咪唑，pH 7.9)(通常每克细胞1mL)中。使细胞通过弗氏(French)压碎器两次来破碎细胞，然后以30,000xg离心30分钟。将粗提物与等体积的带电His-Bind树脂浆液混合，并将混合物倾倒入5cm x4.9cc色谱柱中。用10倍柱体积的缓冲液(0.5M NaCl、20mM Tris-HCl、60mM咪唑，pH 7.9)以0.2mL/min的流速洗涤色谱柱。通过添加3个柱体积的0.5M NaCl、20mM Tris-HCl、1.0M咪唑，pH 7.9从色谱柱洗脱酶。收集馏分(1.0mL)。在通过SDS PAGE分析后合并含有酶的级分。将合并的级分施加于70cm x 4.9cc Sephadex G-75色谱柱(10mM Tris-HCl，pH 7.5，1mMEDTA)。合并含有均质蛋白质的级分(通过SDS PAGE检查后)，通过Centricon过滤器将该级分浓缩至5mg/mL。将酶储存于-20℃，直至使用。使用TEV蛋白酶从酶中除去组氨酸标签区域。对于嗜酸菌样品和嗜碱菌样品，使用N-末端组氨酸标签仍然存在的酶。将蛋白质以1.0mg/mL稀释至10mM Tris-HCl pH 7.5、25mM NaCl中。每毫克酶添加100U TEV蛋白酶(大约1:100(w/w)的比率)。使反应在4℃处进行16小时。使混合物通过带电镍色谱柱。收集一个柱体积的洗脱液代表纯化的无标签的酶。

PHB解聚酶测定法

直接使用Sigma-Aldrich羟基丁酸酯测定试剂盒MAK272利用测定法来测量β-羟基丁酸酯(HB)。HB通过荧光测定法测量(λex＝535nm，λem＝587nm)。在不同时间点从PHB解聚酶反应中移除等分试样(10μL)，与50μL所提供的HB测定缓冲液混合，并移入黑色平底96孔板的孔中。将板在黑暗中室温处温育30分钟。使用Molecular Dynamics SpectraMax M5来测量荧光发射强度。通过与由已知浓度的纯羟基丁酸酯构建的标准曲线进行比较，将荧光读数转换为HB浓度。所有动力学参数均根据Segel(1993)计算。

结果

图3显示了在来自弯曲假单胞菌的PHBD酶的荧光HB测定法中随时间变化的酶活性(空心圆形)，还显示了同样随时间变化的集落形成单位(实心圆形)。反应条件包括10mMTris-HCl pH 7.0、5mM KCl、5mM MgCl

假单胞菌属反应作为对照，显示在典型的PHB解聚酶反应环境中，大肠杆菌具有完整活力。这与如图4所示的徐丽华菌酶催化的PHB解聚酶反应形成鲜明对比，该图中显示了PHB解聚酶活性随时间变化的函数(空心圆形)，还显示了同样随时间变化的集落形成单位(实心圆形)。反应条件包括10mM乙酸钠pH 6.0、5mM KCl、5mM MgCl

图5显示了甚至更显著的温度依赖性，该图展示了使用来自施莱格尔氏菌属的酶获得的结果。在暴露于高温环境30秒后，反应中未检测到活细菌(实心圆形)(输入细菌＝1.26×10

还分析了两种嗜盐菌酶。海水盐单胞菌的最佳盐浓度为大约1M NaCl，而古菌东方盐海洋菌是极端嗜盐菌，最佳盐浓度为2.5M，但是它也存在于高达5MNaCl的环境中。

当将盐单胞菌属酶用于在存在4.2×10

大肠杆菌在2M NaCl中、由盐海洋菌酶催化的反应中活力显著较低，如图7所示。活力从反应开始时的6.6×10

如图8所示，隐藏嗜酸菌酶能够在pH 3.5处使PHB解聚(空心圆形)。在该pH值下添加的大肠杆菌在反应期间存活大约70分钟，在40分钟内减少大约4倍对数(实心圆形)。反应条件包括10mM柠檬酸pH 3.5、5mM KCl、5mM MgCl

如图9所示，解淀粉碱单胞菌酶能够在pH 9.5处使PHB解聚(空心圆形)。在该pH值下添加的大肠杆菌在反应期间存活大约40分钟，在20分钟内减少大约4倍对数(实心圆形)。反应条件包括10mM CHES pH 9.5、5mM KCl、5mM MgCl

实施例2

下表4中列出的来自生物体的四种PHB酶的氨基酸序列从Genbank获得，任何信号序列均被鉴定并从序列中除去，并且在开始处(最远N-末端)添加组氨酸表达序列MHHHHHHGS(SEQ ID NO:2)。使用ATUM,Inc.的Gene Designer程序将这个新氨基酸序列(表5)反向翻译为DNA，并且针对在大肠杆菌中表达进行密码子优化。基因使用ATUM,Inc.的标准PCR技术来组装，并克隆至表达载体p454-MR(ampr，中等强度核糖体结合位点)中。在构建后通过DNA测序来验证插入片段。

表4

表5

*在除去任何信号序列并且包含N-末端甘氨酸后

酶的表达和纯化

将每个表达质粒用于转化化学感受态Oragami2-(DE3)细菌。从LB-Amp平板中选择单菌落并将单菌落用于表达筛选。使菌落在补充有100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中在37℃处生长12小时。该培养物用于以1:100的接种量接种新鲜的LB-AMP烧瓶。这些培养物在30℃下生长直到OD595＝0.4(通常4小时)，此时添加IPTG达到1mM的终浓度。生长持续12小时。细胞通过以10,000x g离心15分钟来收获，并冷冻于-80℃下直到使用(最短冷冻时间为24小时)。细胞在冰上解冻并重悬于缓冲液A(0.5M NaCl、20mM Tris-HCl、5mM咪唑，pH 7.9)(通常每克细胞1mL)中。使细胞通过弗氏(French)压碎器两次来破碎细胞，然后以30,000xg离心30分钟。将粗提物与等体积的带电His-Bind树脂浆液混合，并将混合物倾倒入5cm x4.9cc色谱柱中。用10倍柱体积的洗涤缓冲液(0.5M NaCl、20mM Tris-HCl、60mM咪唑，pH7.9)以0.2mL/min的流速洗涤色谱柱。通过添加3个柱体积的0.5M NaCl、20mM Tris-HCl、1.0M咪唑，pH 7.9从色谱柱洗脱酶。收集馏分(1.0mL)。在通过SDS PAGE分析后合并含有酶的级分。将合并的级分施加于70cm x 4.9cc Sephadex G-75色谱柱(10mM Tris-HCl，pH7.5，1mM EDTA)。合并含有均质蛋白质的级分(通过SDS PAGE检查后)，通过Centricon过滤器将该级分浓缩至5mg/mL。将酶储存于-20℃，直至使用。所有蛋白质均在组氨酸标签存在的情况下进行测定。

PHB解聚酶测定法

直接使用Sigma-Aldrich羟基丁酸酯测定试剂盒MAK272利用测定法来测量β-羟基丁酸酯。HB通过荧光测定法测量(λex＝535nm，λem＝587nm)。在不同时间点从PHB解聚酶反应中移除等分试样(10μL)，与50μL所提供的HB测定缓冲液混合，并移入黑色平底96孔板的孔中。将板在黑暗中室温处温育30分钟。使用Molecular Dynamics SpectraMax M5来测量荧光发射强度。通过与由已知浓度的纯羟基丁酸酯构建的标准曲线进行比较，将荧光读数转换为HB浓度。所有动力学参数均根据Segel(1993)计算。

细菌生长

将大肠杆菌的标准实验室保藏物用于接种10.0mL Luria Broth(LB)，使培养物在37℃处以300rpm振荡培养过夜。使用该起始培养物以1:1000的比率接种250mL LB。将培养瓶在37℃、300rpm振荡处培养12小时。通过离心(5,000×g)10分钟使细菌沉淀。将沉淀重悬并在1×PBS中洗涤，再次离心并且再次洗涤。将最终沉淀重悬于1×PBS中，达到1x10

结果

本实施例中的所有酶均未在文献表征，但是根据一级序列中存在PHB酶共有结构，可以明确可靠地鉴定为PHB酶。酶的选择涵盖高温、高pH、高压和/或高盐的多极端条件，并且允许在这些不同反应条件下测试粪便细菌存活期。

所有酶都可以过表达并纯化至同质或接近同质。未进行优化表达条件或纯化程序的工作。典型产率为大约15.0mg/L，这是作者此前研究的其他PHB酶的典型产率。来自底栖生物深源海杆菌的酶在15℃处表达，以最大限度地提高蛋白质稳定性。与所有其他酶不同的是，该PHB酶不能重新冷冻，并且在使用前保存在冰上。该酶也明显不稳定，在1-2周后失去所有活性。本工作中使用的反应条件汇总于表6中。没有尝试单独优化pH值或其他缓冲液条件，因为所有酶在反应混合物的标准缓冲液组分部分中均具有活性。在所有这些条件下都可以证明PHB的解聚。在本研究中未尝试确定每种酶的动力学参数(K

表6

根据在特定反应条件下酶测定法中的羟基丁酸酯的释放所测量，所有四种酶均能够使PHB解聚(表6)。4×10

确定在四种反应条件中4×10

表7(图11)

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表8(图12)

表9(图13)

表10(图14)

下表11汇总了大肠杆菌在所研究的各种反应条件下的存活期。

表11

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虽然已经使用特定术语描述了所公开主题的某些实施方案，但是这种描述仅出于说明性目的，并且应当理解，可以在不背离本主题的精神或范围的情况下做出改变和变化。

序列表

<110> 金伯利-克拉克环球有限公司

<120> 用于生物基聚合物的单步脱污和酶促降解的方法和系统

<130> KCX-2023-PCT (65095609PCT02)

<140> 尚未分配

<141> 随附提交

<150> 63/194,487

<151> 2021-05-24

<160> 3

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

肽

<400> 1

Met His His His His His His Gly Ser Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly

1 5 1015

<210> 2

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

肽

<400> 2

Met His His His His His His Gly Ser

1 5

<210> 3

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

6xHis标签

<400> 3

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1 5