一种用于钴离子检测的比色-荧光双模式探针及其应用

技术领域

本发明涉及一种用于钴离子检测的比色-荧光双模式探针及其应用，属于分析检测技术领域。

背景技术

钴(Co)作为人体必需的微量元素，在铁的代谢和血红蛋白的合成中起着重要作用，但钴的过量摄入则会引发过敏、哮喘、肺水肿、甲状腺损伤和心脏疾病等危害。钴同时也是众多领域的关键元素，具有广泛的工业应用场景。然而，广泛的应用在另一方面也意味着包含钴在内的重金属离子等有害物可能通过工业废水的不当处置等方式进入土壤与水循环中，进而通过食物链被人类摄入并在人体中不断积累。面对潜在的钴中毒风险，国家标准《GB

3838-2002地表水环境质量标准》均对饮用水中钴的含量限值进行了明确地规定，需严格低于1.7μmol/L或1.0mg/L。

现有技术中对于钴离子的检测，通常使用如高效液相色谱法、原子吸收光谱法、电感耦合等离子体发射光谱(ICP-OES)、电化学法、分光光度法和荧光光谱法等。与其他方法相比，分光光度法与荧光光谱法因设备要求低且操作简便而备受研究者们的关注。

碳量子点(CQDs)作为一种粒径小于10nm的碳基纳米材料，因其成本低廉、可调的光学性能、良好的生物相容性、高稳定性和水溶性等特征，与分光光度法和荧光光谱法具有良好的适配度，并被广泛应用与食品安全分析领域；但受限于设备条件以及特征各异的应用环境，单一模式的比色或荧光传感器应用面较窄，且单一的信号输出也更易受到环境影响产生误差；选择合适的纳米材料构建比色-荧光双模式探针可在功能性上兼具分光光度法和荧光光谱法的优势，满足更多应用场景的使用要求，采用二元或多元信号输出的传感技术还能有效提高检测的准确性。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种用于Co

本发明的第一个目的是提供一种用于Co

在一种实施方式中，所述显色剂probeC溶液的制备具体包括：将4-羟基苯硼酸与对苯二胺溶解于乙醇中，然后转移至高压反应釜中进行水热反应得probeC粗产物，probeC粗产物经0.22μm微孔滤膜过滤，得显色剂溶液probeC。

在一种实施方式中，所述碳量子点溶液gCQDs的制备包括：将4-羟基苯硼酸与乙二胺溶解于乙醇中，然后转移至高压反应釜中进行水热反应得gCQDs粗产物，gCQDs粗产物经硅胶柱层析纯化，得碳量子点溶液gCQDs。

在一种实施方式中，所述gCQDs粗产物经硅胶柱层析纯化，所使用的洗脱液为甲醇/乙酸乙酯混合液，甲醇与乙酸乙酯的混合体积比为1：1。

在一种实施方式中，所述4-羟基苯硼酸与乙二胺的质量比为1：1～2。

在一种实施方式中，所述4-羟基苯硼酸与对苯二胺的质量比为1：1～2。

在一种实施方式中，所述水热反应的温度为180～200℃，时间为8～12h。

本发明的第二个目的是提供一种由上述所述的probeC/gCQDs比色-荧光双模式探针在Co

本发明的第三个目的是提供一种基于上述所述的probeC/gCQDs比色-荧光双模式探针检测Co

(1)定量关系模型建立

取显色剂probeC溶液与缓冲溶液及一系列Co

(2)待测样中钴离子含量测定

取显色剂probeC溶液与缓冲溶液及待测样混合并振荡均匀，置于室温下孵育，再加入碳量子点溶液gCQDs振荡均匀，得到检测体系；测定检测体系的紫外-可见吸收光谱及在411nm激发下的荧光光谱；根据535±5nm处吸收值以及515±5nm处荧光强度，并依据步骤(2)构建的定量关系模型，计算待测样中Co

在一种实施方式中，步骤(1)所述碳量子点溶液gCQDs在紫外-可见吸收光谱411nm处吸收值为0.50时对应的浓度被定为1个单位；所述显色剂溶液probeC在紫外-可见吸收光谱411nm处吸收值为1.60时对应的浓度被定为1个单位。

在一种实施方式中，所述检测体系中碳量子点溶液gCQDs的浓度为0.1单位，显色剂溶液probeC的浓度为0.1单位；probeC/gCQDs比色-荧光双模式探针与检测体系的体积比为9：1。

在一种实施方式中，所述缓冲溶液为Tris-盐酸缓冲溶液，pH值为8.0～9.0。

在一种实施方式中，所述缓冲溶液的pH值为8.5～8.9，浓度为0.01～0.10mol/L，体积占probeC/gCQDs比色-荧光双模式探针形成的检测体系总体积的50-90％。

在一种实施方式中，所述孵育的时间为60～180min；优选为120～150min。

本发明的第四个目的是提供一种由上述所述的基于probeC/gCQDs比色-荧光双模式探针检测Co

本发明的有益效果：

(1)本发明以4-羟基苯硼酸与对苯二胺为前驱体通过水热法制备了一种显色试剂(probeC)，同时以4-羟基苯硼酸与乙二胺作为前驱体通过水热法制备了一种氮、硼共掺杂的绿色荧光碳量子点(gCQDs)；由二者构建的probeC/gCQDs比色-荧光双模式探针体系中，probeC作为比色信号源以及Co

(2)本发明提供的探针体系能实现Co

附图说明

图1为本发明提供的probeC与gCQDs的制备流程图及Co

图2为本发明实施例1制备的probeC与gCQDs表征结果图；(A)gCQDs的HRTEM图像；(B)gCQDs的粒径分布直方图；(C)probeC与gCQDs的FT-IR光谱图；(D)probeC与gCQDs的XPS全谱图；

图3为本发明实施例1制备的probeC的HRTEM图；

图4为本发明实施例1制备的probeC与gCQDs的紫外-可见吸收光谱与荧光光谱图；(A)probeC的三维荧光光谱图；(B)probeC的紫外-可见吸收光谱、激发光谱(λ

图5为本发明实施例1制备的gCQDs的相对量子产率拟合计算图；

图6为本发明实施例2中不同Co

图7为gCQDs和probeC/gCQD不同荧光探针体系的光谱图和荧光衰减图；(A)gCQDs的归一化荧光发射光谱与添加Co

图8为本发明对比例1不同荧光探针体系的光谱图；(A)为pPD/gCQDs的紫外-可见吸收光谱；(B)为4-HPBA/gCQDs的紫外-可见吸收光谱；(C)为pPD+4-HPBA/gCQDs的紫外-可见吸收光谱；(D)为pPD/gCQDs、4-HPBA/gCQDs与pPD+4-HPBA/gCQDs的荧光猝灭率；

图9为本发明实施例3中probeC/gCQDs比色-荧光双模式探针体系的pH条件优化数据图；(A)为不同pH条件下probeC/gCQDs(A)515nm处荧光强度；(B)添加Co

图10为本发明实施例3中probeC/gCQDs比色-荧光双模式探针体系的孵育条件优化数据图；(A)孵育模式(Ⅰ)下，Co

图11为本发明实施例3中probeC/gCQDs比色-荧光双模式探针体系的孵育时间优化数据图；(A)probeC/gCQDs自身及添加Co

图12为本发明实施例4中probeC/gCQDs比色-荧光双模式探针体系在两种传感模式下的选择性及抗干扰能力数据图；(A)为比色检测模式；(B)荧光检测模式；(C)在日光和365nm紫外光下添加不同金属阳离子的probeC/gCQDs实物图，1无、2Co

图13为本发明实施例5中基于probeC/gCQDs比色-荧光双模式探针体系在实际样品中建立的检测模型图；(A)在自来水中，535nm处吸收值增强程度与加标Co

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为本发明的范围限制。

实施例1probeC与gCQDs的制备与表征

probeC与gCQDs的制备，具体方法如下：

probeC的制备：将0.1g 4-羟基苯硼酸(4-HPBA)与0.1g对苯二胺(PPD)加入10mL乙醇中，超声分散得到无色透明的前驱体溶液，随后将该前驱体溶液转移至25mL聚四氟乙烯内衬的高压釜中并在180℃下保持10h，待自然冷却至室温后，使用0.22μm微孔滤膜对probeC粗产物进行过滤处理后，然后将其稀释至紫外-可见吸收光谱411nm处吸收值为1.60的溶液作为浓度为单位1的probeC母液备用。

gCQDs的制备：将0.1g 4-羟基苯硼酸(4-HPBA)与1mL乙二胺加入10mL乙醇中，超声分散得到无色透明的前驱体溶液，随后将该前驱体溶液转移至25mL聚四氟乙烯内衬的高压釜中并在180℃下保持10h，待自然冷却至室温后，粗产物经硅胶柱层析法纯化得到所需gCQDs，其中纯化过程中洗脱剂为甲醇/乙酸乙酯混合液(1/1，v/v)；纯化后的gCQDs被稀释至其紫外-可见吸收光谱411nm处吸收值为0.50，保存于4℃下作为浓度为单位1的gCQDs母液备用。

probeC与gCQDs的表征

使用HRTEM对gCQDs与probeC的形貌进行了观察。如图2A中gCQDs的HRTEM图像所示，gCQDs呈近球状颗粒，但因分散状态不佳而聚集在一起，粒径基本均匀地分布在5-10nm范围内(图2B)，平均粒径为7.79nm。在更高倍率下可观察到其晶格条纹，表明gCQDs的结晶度高，进一步测算可得到晶面间距为0.316nm，对应着石墨碳的(0 0 2)平面。而在probeC的HRTEM图像(图3)中则无法观察到清晰的形貌，也未有衍射条纹出现，这表明probeC并不是具有规则形貌的晶体。

FT-IR光谱被用于分析probeC与gCQDs的表面官能团特征，如图2C所示。因二者前驱体均含有4-羟基苯硼酸，故它们的FT-IR光谱也存在许多相似之处。位于3329cm

图2D中的XPS光谱表明gCQDs与probeC中各元素的占比存在差异，C、N、O、B四种元素的比例分别为66.25/19.52/10.51/3.72与63.86/14.24/14.27/7.63。可见gCQDs的N元素掺杂程度更高，而B元素在probeC中的比例则要比在gCQDs中更高。光学性质方面，图4B中probeC的紫外-可见吸收光谱在239nm，300nm与400nm处各有一吸收峰，其中239nm与300nm处的吸收峰分别源于芳香sp

实施例2

一种基于probeC/gCQDs比色-荧光双模式探针体系检测钴离子的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)标准曲线构建

将100μL probeC溶液(浓度为1个单位)与700μL Tris-HCl缓冲溶液(0.05mol/L,pH＝8.5)混合，然后分别加入100μL不同浓度(0.05、0.07、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、70、100μmol/L)的Co

如图6A与6B结果所示，紫外-可见吸收光谱方式：吸收光谱中探针535nm处的吸收值随着Co

对于荧光模式：在1.00×10

由实验结果可知，probeC/gCQDs比色-荧光双模式探针主要由其中的probeC作为Co

(2)待测样品中钴离子的检测

将100μL probeC溶液(浓度为1个单位)与700μL Tris-HCl缓冲溶液(0.05mol/L,pH＝8.5)混合，然后加入100μL的待测样品，置于室温下孵育150min后，再加入100μL gCQDs溶液(浓度为1个单位)并再次振荡均匀，形成检测体系；最后测定检测体系在紫外-可见吸收光谱535nm处的吸收值及411nm激发下的荧光光谱515nm处的峰强度值，并依据步骤(1)构建的定量关系模型，计算待测样品中钴离子的含量。

对比例1

参照实施例2的样品配置和检测方法，采用PPD/gCQDs(直接采用PPD与gCQDs形成的探针体系)、4-HPBA/gCQDs(4-HPBA与gCQDs形成的探针体系)与PPD+4-HPBA/gCQDs(PPD和4-HPBA同时添加与gCQDs)形成三种探针体系，探究对Co

结果如图8所示，在三种前驱体与gCQDs的组合中，所添加的三种金属离子可使含有PPD的PPD/gCQDs与PPD+4-HPBA/gCQDs发生显色变化并在400

实施例3probeC/gCQDs比色-荧光双模式探针体系的条件优化

(1)pH条件的优化

样品配置和检测方法参照实施例2，以5.00×10

如图9结果所示，在pH 8.5条件下，位于535nm处的吸收峰将因Co

(2)样品孵育方式的优化

样品配置和检测方法参照实施例2，以1.00×10

结果如图10的表明，添加相同浓度Co

(3)孵育时间优化

样品配置和检测方法参照实施例2，以1.00×10

结果如图11所示，相较于在180min后仍表现出增强/衰减的趋势的吸收峰强度/荧光峰强度这两个直接测量值，通过分析吸收峰的增强程度(A-A

因此，光谱采集均在样品孵育150min后进行，且以(A-A

实施例4probeC/gCQDs比色-荧光双模式探针体系的选择性与抗干扰能力

选择了Ag

结果如图12所示，除Co

实施例5

基于probeC/gCQDs比色-荧光双模式探针体系检测实际样品中的钴离子的方法，具体包括如下步骤：

选择的实际样品为自来水与红茶饮料；自来水样本采集自江南大学实验室，红茶饮料样本则采购自当地超市；两种样品在使用前均仅经过0.22μm滤膜过滤。

基于probeC/gCQDs比色-荧光双模式探针检测实际样品中的Co

在两种实际样品中分别建立了比色法与荧光法的检测模型，结果如图13所示。在自来水中，probeC/gCQDs的吸收值增强程度与加标Co

在建立检测曲线后进行了实际样本中的Co

表1实际样本中Co

以上所提供的实施例并非用以限制本发明所涵盖的范围，所描述的步骤也不是用以限制其执行顺序。本领域技术人员结合现有公知常识对本发明做显而易见的改进，亦落入本发明权利要求书所界定的保护范围之内。