用于产生T细胞受体肽文库的自动化仪器

相关申请

本申请要求2018年5月14日提交的题为"MULTIPLEXED METHODS FOR PRODUCTIONAND USE OF CELL SURFACE DISPLAY LIBRARIES”的美国临时专利申请系列第62/671,266号；和2018年4月24日提交的题为"MULTIPLEXED METHODS FOR PRODUCTION AND USE OFCELL SURFACE DISPLAY LIBRARIES”的美国专利申请系列第62/662,126号的优先权，这两个美国专利申请出于所有目的通过引用以其整体并入本文。

发明领域

本公开内容涉及使用基因组编辑技术制备细胞表面展示文库的自动化多模块仪器和多重化方法(multiplexed method)。

发明背景

在以下讨论中，将出于背景和简介的目的描述某些物品和方法。本文包含的任何内容不被解释为对现有技术的“承认”。本申请人明确地保留根据情况证明根据可适用的法定条文由本文引用的物品和方法不构成现有技术的权利。

由于主要组织相容性复合体的多样性、潜在抗原的多样性以及人类和动物中T细胞的多样性，在高通量系统中难以鉴定T细胞受体(TCR)与其特异性抗原的结合和激活。常规技术，诸如HPLC，需要有关TCR靶的先验信息，并且鉴定过程可能既漫长又繁琐。

因此，本领域中存在对更好且更稳健的以高通量、多重化方式鉴定TCR的特异性抗原的方法的需求。本发明解决了此需求。

发明概述

提供本概述是为了以简化的形式介绍概念选择，所述概念在下文的详述中进一步描述。本概述既不意图确定所要求保护的主题的关键或基本特征，也不意图用于限制所要求保护的主题的范围。从以下撰写的详述，包括附图中阐明的和所附的权利要求书中限定的那些方面，所要求保护的主题的其他特征、细节、效用和优点将是明显的。

本公开内容提供了用于在细胞群体的表面上提供工程化肽的多重化展示的组合物、仪器和自动化方法。优选地，工程化肽在提供工程化肽在细胞表面上的分泌和展示二者的条件下在细胞中表达，从而提供工程化肽对潜在结合靶的访问(access)。可以使用自动化编辑系统对细胞群体工程化，该系统为每个细胞提供一个或更多个靶向编辑，允许理性设计在其各自表面上展示工程化肽的细胞文库。因此，本公开内容描述了用于在细胞上表达和展示工程化肽的多种自动化方法。

在一些实施方案中，本公开内容提供了一种产生表达工程化肽的细胞文库用于鉴定T细胞受体(TCR)-抗原结合的方法，所述方法包括提供细胞群体，使用用于多重化的核酸酶指导的基因组编辑(multiplexed nuclease-directed genome editing)的仪器使用引入的核酸和核酸指导的核酸酶(nucleic acid-directed nuclease)处理细胞群体，以产生包含编码被配置为在细胞的表面上展示的工程化肽的核酸的细胞，孵育处理的细胞以促进细胞中的核酸编辑，其中编辑在细胞中提供编码工程化肽抗原的核酸，并且允许细胞在细胞的表面上表达和展示工程化肽。

在一些方面，工程化肽是推定的TCR结合抗原。在其他方面，工程化肽包括预测的TCR结合区。在一些方面，工程化肽来源于靶基因组序列，并且包含插入的N-末端或C-末端细胞表面展示赋予标签(cell surface display conferring tag)。

在其他实施方案中，本公开内容提供了产生在细胞的表面上表达工程化的推定的T细胞受体(TCR)抗原(engineered putative T-cell receptor(TCR)antigen)的细胞文库的方法，所述方法包括提供细胞群体，使用用于多重化的核酸酶指导的基因组编辑的仪器，使用引入的核酸和核酸酶处理细胞群体，以产生包含编码被配置为在细胞的表面上展示的工程化肽抗原的核酸的细胞，孵育处理的细胞以促进细胞中的核酸编辑，其中编辑在细胞中提供编码工程化肽抗原的核酸，并且允许细胞在细胞的表面上表达和展示是推定TCR抗原的工程化肽抗原。

优选地，编辑的细胞群体中的工程化肽抗原包含理性设计的可以在细胞表面上展示的肽，所述肽在细胞表面上展示的方式使得抗原可用于与TCR靶(已知TCR和/或孤儿TCR(orphan TCR))结合。在一些方面，工程化肽抗原是一种或更多种TCR的已知抗原。

在特定实施方案中，抗原作为MHC(例如HLA)的一部分展示在细胞表面上，该抗原包括由此形成TCR配体的肽抗原。因此，在一些方面，细胞将工程化肽抗原展示为配体的一部分。在一些方面，细胞共表达推定的TCR抗原和MHC分子。

用于与本公开内容的系统和方法一起使用的肽抗原包括一种或更多种TCR的已知抗原、一种或更多种TCR的预测抗原或者使用本公开内容的自动化细胞编辑仪器中的核酸酶产生的随机肽。在实施方案中，展示的肽使用正向工程产生，以基于预测哪些抗原可能对特定TCR有用来产生肽序列。

在一些实施方案中，本公开内容提供了产生在细胞的表面上表达来源于细胞的基因组的工程化肽的细胞文库的方法，所述方法包括提供细胞群体，使用用于多重化的核酸酶指导的基因组编辑的仪器，使用引入的核酸和核酸酶处理细胞群体，以产生包含编码被配置为具有待在细胞的表面上展示的N-末端或C-末端细胞表面展示赋予标签的工程化肽的核酸的细胞，孵育处理的细胞以促进细胞中的核酸编辑，其中编辑在细胞中提供编码在工程化蛋白的N-末端或C-末端处的细胞表面展示赋予标签的核酸，并且允许细胞在细胞的表面上表达和展示工程化蛋白。

在一些实施方案中，本公开内容提供了用于鉴定与一种或更多种TCR选择性结合的肽的多重化方法，所述方法包括提供细胞群体，使用用于多重化的核酸酶指导的基因组编辑的自动化系统并将编码工程化肽抗原和核酸酶的核酸引入细胞群体来处理细胞群体，孵育细胞以促进细胞中的核酸编辑，允许编辑的细胞在编辑的细胞的表面上表达和展示工程化肽抗原，针对一种或更多种TCR筛选展示工程化肽抗原的编辑的细胞、并且鉴定表达与一种或更多种TCR选择性结合的工程化肽抗原的编辑的细胞。

在一些方面，本公开内容还提供了从细胞中分离编码与一种或更多种TCR选择性结合的工程化肽抗原的核酸。在一些方面，本公开内容还提供了从细胞中分离编码与一种或更多种推定的TCR抗原选择性结合的工程化肽的核酸。

在一些方面，编码特定肽的细胞通过检测与工程化肽缔合的条形码来鉴定。在一些方面，编码特定肽的细胞通过检测与一种或更多种TCR选择性结合的工程化肽抗原缔合的条形码来鉴定。在一些实施方案中，条形码用于分离和/或进一步鉴定或处理编码肽的细胞和核酸，用于进一步分析。在这样的实施方案中，条形码可以用作“手柄(handle)”，以选取出(pull out)感兴趣的细胞用于进一步分析。

在特定方面，本公开内容提供了一种产生在细胞的表面上表达工程化肽抗原的细胞文库的方法，所述方法通过以下进行：提供细胞群体，使用一种或更多种引入的核酸和核酸酶编辑细胞群体，所述引入的核酸包含与供体DNA(例如同源臂)共价连接的指导RNA(guide RNA)，所述供体DNA(例如同源臂)与感兴趣的基因组区域选择性结合，孵育细胞以促进细胞中的核酸编辑，其中编辑在细胞中提供编码工程化肽抗原的核酸，并且允许细胞在编辑的细胞的表面上表达和展示工程化肽抗原。

在其他特定方面，本公开内容提供了一种产生在细胞的表面上表达工程化肽抗原的细胞文库的方法，所述方法通过以下进行：提供细胞群体，使用用于多重化的核酸酶指导的基因组编辑的自动化仪器，使用包含编辑的引入的核酸和核酸酶编辑细胞群体，孵育细胞以促进细胞中的核酸编辑，其中编辑在细胞中提供编码工程化肽抗原的核酸，并且允许细胞在编辑的细胞的表面上表达和展示工程化肽抗原。

优选地，编辑的细胞群体中的工程化肽抗原包含理性设计的可以在细胞表面上展示的肽，所述肽在细胞表面上展示的方式使得抗原可用于与受体("TCR")靶结合。在本公开内容的一些方面，工程化肽来源于靶基因组序列。

多种核酸酶可以与本公开内容的编辑方法一起使用，包括锌指核酸酶、兆核酸酶(meganuclease)、TALEN和核酸指导的核酸酶(例如，RNA指导的核酸酶)。优选地，编辑方法使用核酸指导的核酸酶进行，并且更优地使用RNA指导的核酸酶进行。

在特定实施方案中，本公开内容提供了用于鉴定在其表面上表达工程化的推定的TCR抗原的细胞的多重化方法，所述多重化方法包括提供细胞群体，使用用于多重化的核酸酶指导的基因组编辑的自动化仪器以及引入的核酸和核酸酶编辑细胞群体，以产生在细胞中编码推定的TCR抗原的核酸，孵育细胞以促进细胞中的核酸编辑，允许细胞在其表面上表达和展示工程化的推定的TCR抗原，针对靶筛选展示工程化的推定的TCR抗原的细胞，并且鉴定表达与靶选择性结合的工程化的推定的TCR抗原的细胞。

在一种实施方案中，本公开内容提供了用于鉴定在其表面上表达工程化的推定的TCR抗原的细胞的多重化方法，所述多重化方法包括提供细胞群体；使用用于多重化的核酸酶指导的基因组编辑的自动化仪器以及引入的核酸和核酸指导的核酸酶编辑细胞群体，从而产生包含编码工程化的推定的TCR抗原的核酸的细胞，孵育细胞以促进细胞中的核酸编辑，允许编辑的细胞在其表面上表达和展示工程化的推定的TCR抗原，针对靶筛选展示工程化的推定的TCR抗原的细胞，选择表达与一种或更多种TCR靶选择性结合的工程化的推定的TCR抗原的细胞，并且检测或分离编码抗原的核酸。可选地，可以改变条件以确定在不同条件下的选择性。

感兴趣的细胞中的特定肽的检测可以使用本领域已知的多种方法完成，例如测序、杂交、鉴定指示抗原序列的条形码等。条形码和其他特征也可以用于进一步分析，例如，通过提供用于鉴定和/或分离编码经鉴定的肽的感兴趣的细胞的基础用于阐明TCR结合。

在一方面，本公开内容提供了用于将一种或更多种工程化肽抗原固定在细胞表面上的方法，所述方法通过提供用于在酵母细胞表面上展示一种或更多种工程化肽抗原的融合蛋白进行。在一种实施方案中，本公开内容提供了用于在细胞表面上将工程化肽抗原展示为MHC抗原(例如，HLA)的一部分的方法。在某些实施方案中，细胞展示单种工程化抗原的多个拷贝。

在特定实施方案中，本公开内容提供了用于在细胞上提供受体或其结合区的方法。

在特定实施方案中，本公开内容提供了用于鉴定在其表面上表达工程化的预测的TCR结合区(例如，预测的孤儿TCR的结合区)的细胞的多重化方法，所述多重化方法包括提供细胞群体，使用用于多重化的核酸酶指导的基因组编辑的自动化仪器以及引入的核酸和核酸酶编辑细胞群体，以产生在细胞中编码TCR结合区的核酸，孵育细胞以促进细胞中的核酸编辑，允许细胞在其表面上表达和展示工程化TCR结合区，针对靶筛选展示工程化TCR结合区的细胞，并且鉴定表达与推定的抗原选择性结合的工程化TCR结合区的细胞。

在一种实施方案中，本公开内容提供了用于鉴定在其表面上表达来自TCR(例如，孤儿TCR)的工程化预测结合区的细胞的多重化方法，所述多重化方法包括：提供细胞群体，使用用于多重化的核酸酶指导的基因组编辑的自动化仪器以及引入的核酸和核酸指导的核酸酶编辑细胞群体，从而产生包含编码工程化TCR结合区的核酸的细胞，孵育细胞以促进细胞中的核酸编辑，允许编辑的细胞在其表面上表达和展示工程化TCR结合区，针对靶筛选展示工程化TCR结合区的细胞，并且鉴定表达与一种或更多种推定的TCR结合区选择性结合的工程化TCR结合区的细胞。可选地，可以改变条件以确定在不同条件下的选择性。

下面更详细地描述本发明的这些方面和其他特征和优点。

附图简述

从以下对示例性实施方案的详细描述，结合附图，将更充分地理解本发明的前述和其他特征和优点，在附图中：

图1是示出了TCRα和TCRβ基因座的结构的示意图。

图2是示出了TCR基因区段(segment)如何在T细胞发育期间重排以形成完整的V结构域外显子的示意图。

图3是示出了TCRα基因座内编码δ链的基因区段的簇的示意图。

图4A-图4D描绘了用来产生本公开内容的细胞表面文库的自动化多模块仪器及其组件。

图5A描绘了与本文描述的细胞生长模块一起使用的旋转生长瓶的一种实施方案。图5B图示了细胞生长模块中旋转生长瓶的一种实施方案的透视图。图5C描绘了来自图5B的细胞生长模块的剖视图。图5D图示了与LED、检测器和温度调节组件耦合的图5B的细胞生长模块。

图6A是本文展示的TFF装置中使用的切向流过滤(tangential flow filtration)的模型。图6B描绘了示例性TFF装置的一种实施方案的下部构件(lower member)的顶视图。图6C描绘了示例性TFF装置的上部构件(upper member)和下部构件以及膜的顶视图。图6D描绘了示例性TFF装置的上部构件和下部构件以及膜的底视图。图6E-图6I描绘了TFF模块的实施方案的多种视图，该TFF模块包括TFF装置并且具有流体流动地耦合的用于渗余物、滤液和交换缓冲液的储库(reservoir)。

图7A和图7B分别是流通式电穿孔装置的顶透视图和底透视图(这里，存在共连接的六个这样的装置)。图7C是示例性流通式电穿孔装置的一种实施方案的顶视图。图7D描绘了图7C的电穿孔装置的截面的顶视图。图7E是图7C和图7D的电穿孔装置下部分的侧视截面图。

图8A描绘了在固体壁装置中用于使细胞单个化(singulating)、编辑细胞和在核酸指导的核酸酶基因组编辑后使细胞标准化的工作流程的简化图。图8B是固体壁装置的一种实施方案的照片。图8C-图8E是分别为低、中和高放大倍数的大肠杆菌(E.Coli)细胞被单个化(经由泊松分布)并在固体壁装置中的微孔中生长成集落的照片，所述固体壁装置具有可渗透底部。图8F是用于富集已经经由核酸指导的核酸酶编辑进行编辑的活细胞的方法的简化框图，所述方法不涉及单个化或单个化装置，而是利用细胞在液体中的生长以及编辑的诱导。图8G描绘了培养物中的细胞的典型生长曲线。图8H是用于生长、诱导、编辑、富集和筛选细胞群体中的编辑的细胞的方法的图解描绘。

图9A和图9B描绘了在自动化多模块细胞编辑仪器中使用的示例试剂筒(reagentcartridge)。

图10是用于自动化多模块细胞编辑以产生如本文描述的细胞文库的示例方法的流程图。

图11是两种示例性方法(1100a和1100b)的简化流程图，这两种方法可以通过包括单个化装置的自动化多模块细胞编辑仪器执行。

图12是包括固体壁单个化/生长/编辑/标准化模块的示例性自动化多模块细胞处理仪器的实施方案的简化框图。

图13是包括固体壁单个化/生长/编辑/标准化模块的示例性自动化多模块细胞处理仪器的替代实施方案的简化框图。

图14是示例性自动化多模块细胞处理仪器的实施方案的简化过程图。

图15是证明如本文描述的2-桨旋转生长瓶和细胞生长装置对比常规细胞振荡器(cell shaker)使EC23细胞培养物生长的有效性的图。

图16是证明如本文描述的3-桨旋转生长瓶和细胞生长装置对比常规细胞振荡器使EC23细胞培养物生长的有效性的图。

图17是证明如本文描述的4-桨旋转生长瓶和细胞生长装置对比常规轨道细胞振荡器使EC138细胞培养物生长的有效性的图。

图18是证明如本文描述的2-桨旋转生长瓶和细胞生长装置对比常规轨道细胞振荡器使EC138细胞培养物生长的有效性的图。

图19是证明采用如本文描述的细胞生长装置(其中使用了2-桨旋转生长瓶)实时监测EC138细胞培养物生长至OD

图20是证明采用如本文描述的细胞生长装置(其中使用了2-桨旋转生长瓶)实时监测s288c酵母细胞培养物生长至OD

图21A是绘制本文描述的细胞浓缩装置/模块中处理的大肠杆菌培养物的滤液电导率对过滤处理时间的曲线图。图21B是绘制本文描述的细胞浓缩装置/模块中处理的酵母培养物的滤液电导率对过滤处理时间的曲线图。

图22A是示出了使用本公开内容的装置和比较电穿孔装置(comparatorelectroporation device)对大肠杆菌进行电穿孔的结果的柱状图。图22B是示出了针对比较电穿孔装置基准化(benchmarked)的经由如本文描述的FTEP转化的大肠杆菌细胞的摄取、切割和编辑效率的柱状图。

图23是示出了使用本公开内容的FTEP装置和比较电穿孔方法对酿酒酵母(S.cerevisiae)进行电穿孔的结果的柱状图。

应当理解，附图不必按比例绘制，并且相同的附图标记是指相同的特征。

详述

除非明确声明或者特征或功能与另外的实施方案不兼容，否则结合本文描述的方法、装置或仪器的一种实施方案描述的所有功能意在适用于本文描述的方法、装置和仪器的另外的实施方案。例如，除非特征或功能与替代实施方案不兼容，否则在结合一种实施方案明确描述给定特征或功能但没有结合替代实施方案明确提及的情况下，应当理解，该特征或功能可以结合替代实施方案来部署、利用或实现。

除非另外指示，本文描述的技术的实践可以采用分子生物学(包括重组技术)、细胞生物学、生物化学和遗传工程技术的常规技术和描述，这些都在本领域从业的人员的技术内。这样的常规技术和描述可以见于标准实验室手册诸如以下：Green和Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual.第4版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,N.Y.,(2014)；Current Protocols in Molecular Biology,Ausubel，等人编著，(2017)；Neumann，等人，Electroporation and Electrofusion inCell Biology,Plenum Press,New York,1989；和Chang，等人，Guide to Electroporationand Electrofusion,Academic Press,California(1992)，所有文献出于所有目的通过引用以其整体并入本文。核酸指导的核酸酶技术可以见于以下：例如，Genome Editing andEngineering from TALENs and CRISPRs to Molecular Surgery,Appasani和Church(2018)：以及CRISPR:Methods and Protocols,Lindgren and Charpentier(2015)；两篇文献出于所有目的通过引用以其整体并入本文。

注意，除非上下文另外清楚指示，如本文和所附的权利要求书中使用的，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”包括复数指代物。因此，例如，提及“细胞”是指一个或更多个细胞，并且提及“该系统”包括提及本领域技术人员已知的等同步骤、方法和装置，等等。此外，应当理解，本文可以使用的术语诸如“左”、“右”、“顶”、“底”、“前”、“后”、“侧”、“高度”、“长度”、“宽度”、“上”、“下”、“内部(interior)”、“外部(exterior)”、“内(inner)”、“外(outer)”等仅描述参考点，并且不必然将本公开内容的实施方案限制为任何特定的方向或配置。此外，术语诸如“第一”、“第二”、“第三”等，仅标识如本文公开的许多部分、组件、步骤、操作、功能和/或参考点中的一个，并且同样不必然将本公开内容的实施方案限制为任何特定的配置或方向。

除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。本文提及的所有出版物出于描述和公开可以与本文描述的发明结合使用的装置、制剂和方法的目的通过引用并入。

在提供值的范围情况下，应理解，在该范围的上限值和下限值之间的每一个中间值和该规定的范围内的任何其他规定的值或中间值被涵盖在本发明内。这些较小的范围的上限值和下限值可以独立地被包括在较小的范围内，并且也被涵盖在本发明内，受限于规定的范围内的任何特定地排除的限值。在规定的范围包括限值中的一个或两个的情况下，将那些所包括的限值中的任一个或两个排除的范围也被包括在本发明中。

在以下的描述中，阐述了许多具体细节，以提供对本发明的更充分理解。然而，对本领域技术人员将明显的是，可以在没有一个或更多个这些具体细节的情况下，实践本发明。在其他情况下，为了避免使本发明含混不清，尚未描述本领域技术人员熟知的特征和程序。本文使用的术语意在具有如由本领域普通技术人员理解的平白且普通的含义。

如本文使用的术语“互补”是指核苷酸之间的Watson-Crick碱基配对，并且特别地是指彼此氢键合的核苷酸，其中胸腺嘧啶或尿嘧啶残基通过两个氢键与腺嘌呤残基连接,并且胞嘧啶和鸟嘌呤残基通过三个氢键连接。通常，核酸包含被描述为与指定的第二核苷酸序列具有“互补性百分比”或“同源性百分比”的核苷酸序列。例如，核苷酸序列可以与指定的第二核苷酸序列具有80％、90％或100％的互补性，指示序列的10个核苷酸中的8个、10个核苷酸中的9个或10个核苷酸中的10个与指定的第二核苷酸序列互补。例如，核苷酸序列3'-TCGA-5’与核苷酸序列5'-AGCT-3’是100％互补的；并且核苷酸序列3'-TCGA-5'与核苷酸序列5'-TTAGCTGG-3'的区域是100％互补的。

术语DNA“控制序列”统指启动子序列、多腺苷酸化信号、转录终止序列、上游调控结构域、复制起点、内部核糖体进入位点、核定位序列、增强子等，它们共同地提供编码序列在接受者细胞中的复制、转录和翻译。只要选择的编码序列能够在适当的宿主细胞中被复制、转录和(对于一些组分)翻译，则并非所有这些类型的控制序列都需要存在。

如本文使用的，术语“供体DNA”或“供体核酸”是指被设计成通过使用核酸指导的核酸酶的同源重组将DNA序列修饰(插入、缺失、取代)引入基因座的核酸。对于同源指导的修复，供体DNA必须与基因组靶序列中的“切割位点”或待编辑位点周围的区具有足够的同源性。一条或更多条同源臂的长度将取决于，例如，所做修饰的类型和大小。在许多情况下，并且优选地，供体DNA将与基因组靶基因座具有两个序列同源性区(例如，两个同源臂)。优选地，“插入物(insert)”区或“DNA序列修饰”区(期望引入细胞中的基因组靶基因座的核酸修饰)将位于两个同源区之间。DNA序列修饰可以改变一个特定位点或多于一个特定位点处的靶基因组DNA序列的一个或更多个碱基。改变可以包括改变靶序列的1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、50个、75个、100个、150个、200个、300个、400个或500个或更多个碱基对。缺失或插入可以是靶序列的1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、40个、50个、75个、100个、150个、200个、300个、400个或500个或更多个碱基对的缺失或插入。

术语“工程化肽抗原”涵盖天然存在的和合成的多肽和蛋白构建体，其包含与不同元件相关的合成多肽或天然存在的肽，例如用于肽的MHC展示的肽、固定化肽、报告物肽或分泌肽。工程化肽抗原由重组核酸编码和/或表达，所述重组核酸可以被工程化为包括序列变体、重组启动子、转录控制元件、融合肽、其他修饰或其两种或更多种的任何组合。肽展示可以包括感兴趣的蛋白的全部或一部分的展示。在一些实施方案中，工程化肽抗原包含被偶联酶修饰的结合基序，引起第二结合靶与结合基序的偶联。在一些实施方案中，第二结合靶与工程化肽抗原在细胞内偶联。

如本文使用的，“富集”是指通过单个化，任选地诱导编辑，并且使单个化的细胞生长成终末尺寸(terminal-sized)的集落(例如，集落生长的饱和或标准化)来富集编辑的细胞。

术语“指导核酸”或“指导RNA”或“gRNA”是指包含以下的多核苷酸：1)能够与基因组靶基因座杂交的指导序列和2)能够与核酸指导的核酸酶相互作用或复合的支架序列。

“同源性”或“同一性”或“相似性”是指两个肽之间的序列相似性，或者在本公开内容的上下文中，更常见是指两个核酸分子之间的序列相似性。术语“同源区”或“同源臂”是指供体DNA上与靶基因组DNA序列具有一定程度同源性的区域。同源性可以通过比较每个序列中的位置来确定，所述每个序列可以出于比较的目的而被比对。当比较的序列中的一个位置被相同的碱基或氨基酸占据时，那么分子在该位置处是同源的。序列之间的同源性程度是序列共有的匹配或同源位置数的函数。

如本文使用的，术语“前导肽”、“分泌肽”或分泌前导肽是指指导合成的融合蛋白远离翻译位点的任何信号传导序列，包括将导致融合肽穿过细胞膜并被分泌的信号传导序列。

“可操作地连接”是指其中如此描述的组分被配置为执行其通常功能的元件的布置。因此，可操作地连接至编码序列的控制序列能够影响编码序列的转录，并且在一些情况下，能够影响编码序列的翻译。只要控制序列发挥指导编码序列的表达的功能，控制序列不必与编码序列邻接。因此，例如，不翻译但转录的间插序列可以存在于启动子序列和编码序列之间，且启动子序列仍可以被认为是“可操作地连接”至编码序列。事实上，这样的序列不必驻留于同一连续DNA分子(即染色体)上，并且仍可以具有引起调控改变的相互作用。

如本文使用的，术语“蛋白”和“多肽”可互换地使用。蛋白可能完全由氨基酸组成，也可能不完全由氨基酸组成。

“启动子”或“启动子序列”是能够与RNA聚合酶结合并启动多核苷酸或多肽编码序列(诸如信使RNA、核糖体RNA、小核RNA(small nuclear RNA)或核仁小RNA(smallnucleolar RNA)、指导RNA或由任何类别的任何RNA聚合酶I、II或III转录的任何种类的RNA)的转录的DNA调控区。启动子可以是组成型或诱导型，并且在一些实施方案中，特别地在许多采用选择的实施方案中，核酸指导的核酸酶编辑系统的至少一种组分的转录处于诱导型启动子的控制下。

如本文使用的术语“可选择标记(selectable marker)”是指引入细胞中的、赋予适于人工选择的性状的基因。一般使用的可选择标记是本领域普通技术人员熟知的。可以采用可药物选择的标记，诸如氨苄青霉素/羧苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、红霉素、四环素、庆大霉素、博莱霉素、链霉素、利福平、嘌呤霉素、潮霉素、杀稻瘟素和G418。在其他实施方案中，可选择标记包括但不限于糖，糖诸如鼠李糖、人类神经生长因子受体(用MAb检测，诸如美国专利第6,365,373号中描述的)；截短的人类生长因子受体(用MAb检测)；突变体人类二氢叶酸还原酶(DHFR；可得荧光MTX底物)；分泌型碱性磷酸酶(SEAP；可得荧光底物)；人类胸苷酸合酶(TS；赋予对抗癌剂氟脱氧尿苷的抗性)；人类谷胱甘肽S-转移酶α(GSTA1；将谷胱甘肽与干细胞选择性烷化剂白消安缀合；CD34

如本文使用的术语“特异性结合”包括两种分子例如工程化肽抗原和结合靶之间具有由以下解离常数表示的结合亲和力的相互作用：约10

术语“靶基因组DNA序列”、“靶序列”或“基因组靶基因座”是指体外或体内，或者细胞或细胞群体的核酸(例如基因组)中的期望使用核酸指导的核酸酶编辑系统对至少一个核苷酸进行改变的任何基因座。靶序列可以是基因组基因座或染色体外基因座。

术语“变体”可以指与参考多肽或多核苷酸不同但保留基本特性的多肽或多核苷酸。多肽的典型变体的氨基酸序列与另一参考多肽有差异。通常，差异是有限的，使得参考多肽和变体的序列总体上非常相似，并且在许多区域是相同的。变体和参考多肽的氨基酸序列可以相差一个或更多个修饰(例如，取代、添加和/或缺失)。多肽的变体可以是保守修饰的变体。取代的或插入的氨基酸残基可以是或可以不是由遗传密码编码的氨基酸残基(例如，非天然氨基酸)。多肽的变体可以是天然存在的，诸如等位基因变体，或者它可以是未知的天然存在的变体。

“载体”是包含待递送至细胞和/或在细胞中表达的期望的一种序列或更多种序列的多种核酸中的任一种。载体通常由DNA构成，但是RNA载体也是可用的。载体包括但不限于质粒、F粘粒(fosmid)、噬菌粒、病毒基因组、合成染色体等。如本文使用的，短语“工程载体”包含用于本公开内容的核酸指导的核酸酶系统和方法中的核酸酶的编码序列。在细菌系统中，工程载体还可以包含λRed重组工程系统或其等同物。工程载体通常还包含可选择标记。如本文使用的，短语“编辑载体”包含供体核酸和gRNA编码序列，所述供体核酸任选地包括对靶序列的改变，所述改变在编辑发生后阻止核酸酶在靶序列中的PAM或间隔物(spacer)处结合。编辑载体还可以包括可选择标记和/或条形码。在一些实施方案中，可以将工程载体和编辑载体组合；即，所有编辑和选择元件都可以在单个载体上找到。此外，工程载体和编辑载体包含可操作地连接至例如核酸酶编码序列、重组工程系统编码序列(如果存在)、供体核酸、指导核酸和一种或更多种可选择标记的控制序列。

细胞文库、筛选和编辑方法

本公开内容提供了用于产生具有细胞表面展示的细胞群体的多重化方法和自动化仪器，其中所述方法采用编辑技术。使用本公开内容的多重化和自动化仪器编辑的细胞群体包含在细胞表面上展示并且可用于与结合靶结合的一种或更多种推定的受体抗原。根据本公开内容可以编辑和使用的细胞包括但不限于细菌细胞、酵母细胞和哺乳动物细胞。此外，被编辑的细胞可以包含对宿主而言异源的序列(例如，插入酵母或细菌基因组中的哺乳动物序列的编辑)。

特别地，用于产生细胞的方法和自动化仪器可用于鉴定与T细胞受体(TCR)特异性结合的抗原。快速地且容易地鉴定抗原，例如孤儿TCR的推定的抗原靶的能力，在免疫学，例如免疫疗法研究和开发中非常有用。

本公开内容还提供了用于多重化展示和筛选与TCR靶结合的抗原(例如，作为配体的组分)的方法。在一些实施方案中，使用本文描述的任何细胞展示方法将抗原展示在细胞表面上。在一些实施方案中，抗原在MHC复合体中复合，并且展示在细胞群表面上。

与T细胞受体(TCR)特异性结合的抗原可以使用多种检测方法鉴定，包括分离细胞和对引入的抗原序列测序或通过杂交鉴定，例如在阵列上杂交鉴定。在其他方面，与特定展示的抗原缔合的条形码可以被鉴定并且用于鉴定与TCR选择性结合的抗原。可以例如使用测序和/或阵列杂交来鉴定条形码。

在一些实施方案中，使用与肽缔合的条形码来鉴定和/或分离编码工程化肽抗原的细胞，所述工程化肽抗原与来自细胞的一个或更多个感兴趣的靶选择性结合。在特定实施方案中，条形码用于进一步分离和/或分析表达被鉴定为可能阐明抗原与TCR的结合的肽的细胞。在这样的实施方案中，条形码可以用作“手柄”，以选取出感兴趣的细胞用于进一步分析。

在一些实施方案中，所述方法包括经由基因组编辑产生各自在其表面展示单个工程化肽抗原的编辑的细胞群体或文库，其中使用核酸酶编辑产生不同的工程化肽抗原并随后展示在不同细胞的表面上。在其他实施方案中，编辑方法产生编辑的细胞群体或文库，其中每个编辑的细胞在其表面上展示多于一种不同的工程化肽抗原。因此，细胞可以表达被展示在群体的单个细胞的细胞表面上，任选地在一个或更多个MHC(例如，HLA)中的一种或更多种工程化肽抗原。

在一些实施方案中，本公开内容提供了一种用于在细胞表面上展示工程化肽抗原的方法，所述方法包括使用核酸指导的核酸酶编辑细胞以产生编码工程化的推定的HLA的核酸，并且在足以表达工程化HLA的条件下孵育编辑的细胞。

在一些实施方案中，文库的细胞展示至少10

在一些实施方案中，本公开内容提供了编辑的细胞群体或文库，其中细胞编码不同的工程化肽抗原及其变体，并且其中变体还包含能够偶联结合靶的结合基序。在一些实施方案中，结合基序是生物素化基序。在一些实施方案中，文库具有至少10

下文详细描述了可以用于产生细胞文库或群体的编辑方法，以及用于进行核酸酶指导的基因组编辑的细胞处理模块和仪器。

文库中编辑的细胞上展示的抗原可以是3-50个氨基酸之间的任何长度，并且优选地在5-20个氨基酸之间。在特定方面，氨基酸肽以允许在细胞表面上适当展示肽的抗原区(例如已知MHC中可用的8-11个氨基酸)的方式展示。

T细胞受体(TCR)在结构上与免疫球蛋白类似，由同源基因编码，并且通过由与免疫球蛋白基因重组类似的基因区段集的体细胞重组进行组装。TCR基因座具有大致相同的V基因区段数，但具有更多的J基因区段，并且在基因重排期间，基因区段之间的连接存在更大的多样性。此外，已知功能TCR的V基因在通过体细胞高频突变的重排后不多样化。这导致了在受体的中心部分有最高的多样性的TCR，所述受体的中心部分与配体的结合抗原接触。

TCRα链和TCRβ链各自由可变(V)氨基末端区域和恒定(C)区组成。TCRα基因座和TCRβ基因座的结构示于图1中。TCRα基因座，像免疫球蛋白轻链的那些基因座一样，包含V基因区段和J基因区段(V

TCR基因区段在T细胞发育期间重排以形成完整的V结构域外显子(图2)。TCR基因区段侧翼是与免疫球蛋白基因侧翼序列同源的七聚体和九聚体重组信号序列(RSS)。

免疫球蛋白和TCR基因重排的另外的共有特征是重排的TCRβ基因的V基因区段、D基因区段和J基因区段之间的连接中存在P-核苷酸和N-核苷酸。在T细胞中，在所有重排的TCRα基因的V基因区段和J基因区段之间也添加P-核苷酸和N-核苷酸，而免疫球蛋白轻链基因中仅约一半的V-J连接被N-核苷酸添加修饰，并且这些剩下的通常也没有任何P-核苷酸。

TCR的配体通常是与MHC分子结合的肽。因此，TCR配体的大部分可变性是在占据与受体接触的表面中心的结合抗原肽中。事实上，TCR抗原识别位点的三维结构看起来很像抗体分子的三维结构。

TCR的结构多样性主要归因于基因重排过程期间产生的组合和连接多样性。TCR链的可变性集中在由V基因区段、D基因区段和J基因区段编码并且由P-核苷酸和N-核苷酸修饰的连接区。TCRα基因座包含比任意免疫球蛋白轻链基因座多得多的J基因区段：在人类中，61个J

少数T细胞携带由γ链和δ链构成的TCR。编码δ链的基因区段的簇完全存在于TCRα基因座内，在V

携带γ:δ受体的T细胞是独特的T细胞谱系，其功能目前尚属未知。这些受体的配体很大程度上也是未知的。一些γ:δTCR似乎能够像抗体一样直接识别抗原，而不需要由MHC分子的呈递或抗原的处理。因此，MHC分子与推定的抗原的共表达是任选的。

多种展示技术可以与通过本文描述的方法和仪器产生的细胞文库和细胞群体一起使用，包括酵母表面展示技术、哺乳动物细胞表面展示技术和细菌表面展示技术。细胞表面展示技术包括但不限于以下中公开的那些：美国专利第8,883,692号；第8,685,893号；和第6,699,658号；美国专利公布第20170218382号；第20170088611号；第20150307560号；第20150203834号；第20140221621号；第20140031292号；第20140235476号；第20140221621号；第20130184177号；第20110008883号；第20100233195号；第20100210473号；第20100216659号；第20090280560号；第20090111126号；和第20040146976号。细菌细胞、酵母细胞和哺乳动物细胞都可以用于细胞表面展示。

在某些实施方案中，将工程化肽抗原固定至细胞表面可能涉及工程化肽抗原和工程化肽抗原上的结合基序之间的特异性相互作用。

本发明的工程化肽抗原可以在适于编辑和表面展示的任何细胞中表达，并且本发明涵盖任何原核细胞或真核细胞，包括细菌细胞、酵母细胞(例如，酵母属(Saccharomyces)和/或毕赤酵母属(Picchia)物种)、昆虫细胞、爪蟾(Xenopus)细胞和哺乳动物细胞。特别地适于表达本发明的融合蛋白的细胞是大肠杆菌细胞、酿酒酵母细胞、CHO细胞和293T细胞。细胞可以是“野生型”细胞，或者细胞可以针对特定特征或针对可以有助于蛋白表达的特定酶功能进行优化。优化细胞或工程化细胞包括具有摄取和维持核酸的优化能力的细胞、具有增加的蛋白合成能力的细胞和/或具有增加的蛋白分泌能力的细胞。维持编辑的核酸和合成蛋白的完整性的细胞特别地有用。

在特定方面，编辑的细胞在其表面包含结合靶，并且细胞在导致工程化肽抗原分泌的条件下孵育，其中工程化肽抗原与结合靶结合，从而在细胞表面上展示工程化肽抗原。

用于蛋白展示的常用生物体是酵母。酵母展示提供优于基于细菌的技术的优点，因为酵母可以处理需要内质网(ER)特异性翻译后加工来实现有效折叠和活性的蛋白。虽然哺乳动物细胞展示也促进翻译后加工，但酵母提供易于产生核酸文库的优点，因为载体可以更简单，并且酵母允许更容易地将编辑机器(例如，编辑载体)引入细胞。大多数酵母表达融合蛋白基于GPI(糖基-磷脂酰-肌醇)锚蛋白，所述GPI(糖基-磷脂酰-肌醇)锚蛋白在细胞表面蛋白的表面表达中起重要作用并且对酵母的存活力是必不可少的。一种这样的锚蛋白，α-凝集素，由AGA1编码的核心亚基组成，并且通过二硫桥与由AGA2编码的小结合亚基连接。由本文描述的核酸文库编码的蛋白可以被引导到AGA1的N-末端区上或AGA2的C末端区或N-末端区上。这些融合模式将导致多肽在酵母细胞表面上的展示。

在一些实施方案中，用于酵母展示的融合蛋白包括与能够锚定在真核细胞壁中的蛋白(例如，a-凝集素、AGA1、Flo1或低等真核细胞的主要细胞壁蛋白；参见美国专利第6,027,910号和第6,114,147号，所述美国专利通过引用并入本文)的N-末端部分或C-末端部分融合的工程化肽抗原，例如，与Flol的GPI片段或与Flol功能结构域融合的蛋白(Kondo等人，Appl.MicroBiol.Biotech.,64:28-40(2004))。

除了基于包含GPI锚基序的已建立融合蛋白的表面展示方法之外，本发明还涵盖基于包含修饰的GPI锚基序的新型融合蛋白的展示方法。本发明的融合蛋白可以包含待展示的蛋白(例如，一种或更多种工程化肽抗原、结合靶、分子靶、底物等，或其任何组合)、GPI锚和适当的信号传导序列，当融合蛋白在酵母中表达时，它们可以被翻译后修饰。当包含GPI锚和C-末端信号传导序列的蛋白通过ER运输时，邻近GPI锚的C-末端信号序列上的疏水区变得嵌入ER膜中，在ER膜中C-末端信号序列被ER蛋白酶裂解。当ER蛋白酶裂解这种C-末端信号序列时，ER蛋白酶同时将预形成的GPI锚连接至工程化肽抗原(例如，结合靶、分子靶、底物等，或其任何组合)的新的C-末端，最终引起蛋白(例如，结合靶、分子靶、底物等，或其任何组合)在细胞表面上展示(参见，例如，上文引述的Kondo等人)。本发明涵盖具有改进的加工特性的C-末端序列，引起包含GPI锚蛋白的融合蛋白的改进的展示。改进的展示包括展示的蛋白数的增加和/或正确表达的蛋白数的增加。在一些实施方案中，根据本领域已知的技术，通过筛选包含变体C-末端序列的文库，演化出具有改进的加工特性的C-末端序列。

在一些实施方案中，本公开内容提供了一种用于在细胞上展示工程化肽抗原的方法，所述方法包括在足以表达由第一核酸编码的工程化肽抗原的条件下孵育包含第一核酸的编辑的细胞，其中细胞展示第一结合靶，其中工程化肽抗原包含结合基序，并且当工程化肽抗原表达时，第二结合靶与结合基序偶联，并且，其中表达的工程化肽抗原由细胞分泌并且经由第二结合靶与第一结合靶的结合而展示在细胞表面上。在一些实施方案中，第一结合靶是亲和素样蛋白。在一些实施方案中，第二结合靶是生物素。在一些实施方案中，结合基序是生物素化肽。在一些实施方案中，第二结合靶的偶联通过偶联酶完成。在一些实施方案中，偶联酶是生物素连接酶。

在一些实施方案中，本公开内容提供了一种用于产生包含展示在细胞的细胞表面上的工程化(编辑的)肽抗原的编辑的细胞文库的方法，所述方法包括将多于一个编辑载体引入细胞群体中，产生允许编辑载体在细胞中编辑核酸的条件；以及产生编辑的细胞表达工程化肽抗原并将工程化肽抗原展示在细胞表面上的条件，其中载体包含核酸酶和供体核酸序列，所述供体核酸序列包含待工程化的抗原的编码区中的编辑。在特定方面，编码的工程化肽抗原包含与固定化肽连接的独特多肽，其中固定化肽包含与存在于编辑的细胞的细胞表面上的第二结合基序选择性结合的第一结合基序，并且工程化肽抗原在足以使第一结合基序与细胞表面上的第二结合基序结合的条件下表达。固定化肽也可以或可选地包含例如跨膜多肽、多肽膜锚、GPI连接的多肽或天然表面多肽。

在一些实施方案中，本公开内容提供了一种用于产生表达展示在细胞表面上的工程化肽抗原的编辑的细胞文库的方法，所述方法包括将多于一个载体引入细胞群体，其中载体包含核酸指导的核酸酶、指导RNA和供体核酸，所述供体核酸包含待工程化的蛋白的编码区中的编辑。在特定方面，待编辑的抗原是包含与固定化肽连接的独特多肽的编码的工程化肽抗原，其中固定化肽包含与存在于编辑的细胞的细胞表面上的第二结合基序选择性结合的第一结合基序，并且工程化肽抗原在足以使第一结合基序与细胞表面上的第二结合基序结合的条件下表达。

在包括使用固定化肽或包含结合基序的其他部分的方面，肽或基序可以与工程化肽抗原的C-末端或N-末端连接。

在一些实施方案中，工程化肽抗原还包含前导肽。前导肽或分泌肽可以在沿着分泌途径将蛋白输出到细胞内区室的腔(lumen of intracellular compartment)中的同时或者之后立即被蛋白水解从成熟蛋白中去除。前导肽可以是天然存在的序列或合成序列。

编辑的细胞文库可以具有包含一种或更多种工程化肽抗原的至少2个、至少5个、至少10个、至少50个、至少100个、至少1000个、至少10,000个、至少100,000个、至少1,000,000个、至少10

在一些实施方案中，工程化肽抗原在细胞中的表达是诱导型或瞬时的。在一些实施方案中，诱导步骤不是必需的，并且孵育细胞引起工程化肽抗原的表达。在一些实施方案中，包含第一结合基序的工程化肽抗原被分泌并且与存在于细胞表面上的第二结合基序结合，从而在细胞表面上展示工程化肽抗原。在一些实施方案中，第一结合基序是亲和素、链霉亲和素或中性亲和素(neutravidin)，并且第二结合基序是生物素。在一些实施方案中，亲和素与细胞表面共价缀合(例如，直接地或间接地)。又在一些实施方案中，第一结合靶由细胞表达并且展示在细胞表面。例如，结合靶之一可以由细胞表达为融合蛋白，诸如细胞壁融合蛋白或膜融合蛋白，并且展示在细胞的表面。

本公开内容的方法可以用于鉴定与TCR选择性结合的一种或更多种肽。通过提供产生具有在表达工程化肽抗原的细胞的表面上展示的该工程化肽抗原的细胞文库的系统，表达工程化肽抗原的细胞可以使用可在细胞表面上进行的任何测定来鉴定(例如，对细胞制品进行以检测展示在细胞表面上的一种或更多种分子)。本公开内容的方法可以用于筛选表达工程化肽抗原变体的文库，以鉴定与抗原选择性结合的一种或更多种TCR。

本公开内容的实施方案提供了一种用于选择展示对靶TCR(例如，已知TCR或孤儿TCR)具有期望亲和力或特异性的工程化肽抗原的细胞的方法。本发明的一些方面涉及筛选表达能够以期望的特异性与特定靶分子(例如，已知TCR或孤儿TCR)相互作用的抗原的细胞的方法。

在一些实施方案中，本公开内容提供了一种抗原筛选方法，所述方法包括在使用核酸酶编辑的细胞中表达工程化肽抗原，其中所表达的工程化肽抗原作为对TCR特异性的配体的组分被分泌并且展示在细胞表面上，并且评估配体与一种或更多种TCR的结合。在鉴定特定TCR和/或肽后，可以对序列测序，例如使用下一代测序，诸如Illumina HiSeq或MiSeq测序。在其他方面，特定TCR和/或肽可以通过检测与特定TCR和/或肽缔合的条形码来鉴定。

在一些实施方案中，本公开内容提供了抗原筛选方法，所述方法包括在使用核酸指导的核酸酶(例如，RNA指导的核酸酶，诸如CRISPR核酸酶)编辑的细胞中表达工程化肽抗原，并且评估配体与一种或更多种TCR的结合。表达的工程化肽抗原作为对TCR有特异性的配体的组分被分泌并且展示在细胞表面上。

本发明的编辑的细胞中的工程化肽抗原可以使用本领域已知的方法由编辑的核酸表达。在一些实施方案中，蛋白表达是组成型的。组成型表达包括已经整合到基因组中的核酸的表达和位于附加型载体上的核酸的表达二者。在一些实施方案中，表达由诱导型事件启动。在一些实施方案中，将编码工程化肽抗原的编辑的核酸可操作地连接至调控工程化肽抗原表达的起始序列。能够诱导表达的起始序列是本领域已知的，并且包括诱导型启动子。在一些实施方案中，诱导蛋白表达。在一些实施方案中，蛋白表达发生于当包含编码蛋白的核酸的细胞被孵育时并且不需要单独的诱导步骤。

本发明的文库包括表达独特工程化肽抗原的编辑的细胞文库。文库的细胞优选地使用核酸酶编辑，并且更优选地在如本文更详细描述的自动化多模块细胞编辑仪器中使用一种或更多种核酸酶(例如，核酸指导的核酸酶)编辑。

在一些实施方案中，文库提供了具有高密度的固定在细胞表面上的工程化肽抗原的编辑的细胞。在一些实施方案中，通过将细胞中表达的多种工程化多肽与细胞表面结合靶结合来实现高密度。在一些实施方案中，每个细胞展示的工程化肽抗原数是每个细胞大于10

在一些实施方案中，可以评估或筛选结合蛋白的文库，以鉴定和/或分离与一种或更多种TCR靶结合的变体。本发明的方法可以被设计以鉴定对特定TCR具有大于由以下解离常数表示的结合亲和力的亲和力的工程化肽抗原：约10

在实施方案中，本文描述的自动化仪器利用核酸酶指导的基因组编辑系统来引入对细胞群体的编辑，从而允许对用于细胞表面展示的蛋白工程化。存在多种不同的基于核酸酶的系统，用于将编辑提供到生物体的基因组中，并且每种系统可以用于单一编辑系统、顺序编辑系统(例如，按顺序使用不同的核酸酶指导的系统以将两种或更多种基因组编辑提供到细胞中)和/或递归编辑系统(例如，利用单一核酸酶指导的系统以将两种或更多种基因组编辑引入细胞)。本文描述了示例性的核酸酶指导的基因组编辑系统，尽管本领域技术人员在阅读本公开内容后会认识到，其他这样的编辑仪器也可用于产生用于工程化肽抗原的细胞表面展示的细胞群体。

应注意，如本文阐述的自动化编辑仪器可以使用核酸酶来裂解基因组，将编辑引入靶区域，或二者兼有。

在本发明的特定方面，核酸酶编辑系统是允许控制编辑定时的诱导型系统。调节核酸酶活性的能力可以降低脱靶裂解并且促进精确的基因组工程。许多不同的诱导型系统可以与本公开内容的仪器和系统一起使用，如本领域技术人员在阅读本公开内容后将是明显的。

在某些方面，通过核酸酶的裂解可以与本发明的仪器和系统一起使用，以选择在靶区域具有基因组编辑的细胞。例如，已经经历去除特定核酸酶识别位点(例如，经由同源重组)的基因组编辑的细胞可以使用本文描述的仪器通过在编辑后将细胞暴露于核酸酶来选择。没有基因组编辑的细胞中的DNA会被裂解，并且随后会具有有限的生长和/或死亡，而接受去除核酸酶识别位点的基因组编辑的细胞不会受到随后暴露于核酸酶的影响。

在其他方面，用于编辑的细胞可以以某种方式处理，以在将细胞引入仪器前裂解基因组，并且仪器用于将期望的基因组编辑自动引入这样的细胞中。初始裂解可以由与用于初始裂解事件的酶相同或不同的酶进行。

当包含编码核酸指导的核酸酶的DNA的细胞或细胞群体处于诱导物分子存在的情况时，核酸酶的表达可以发生。例如，CRISPR-核酸酶表达可以在阻遏分子的存在下被阻遏。当包含编码核酸指导的核酸酶的DNA的细胞或细胞群体处于阻遏CRISPR-核酸酶表达的分子不存在的情况时，CRISPR-核酸酶的表达可以发生。

例如，已经描述了用于使用RNA指导的核酸酶进行编辑的诱导型系统，其使用化学诱导来限定细胞暂时暴露于RNA指导的核酸酶。Dow，等人，Nature Biotechnology，33:390–394(2015)；还参见在Dharmacon,GE Life Sciences,Lafayette,CO可得的诱导型慢病毒表达载体。关于另外的技术，参见，例如，Campbell，Biochem J.，473(17):2573–89(2010)。

在其他实例中，病毒诱导型核酸酶可以用于诱导细胞中的基因编辑。参见，例如，Don，Antiviral Res.，130:50-57(2016)。在另一实例中，对于核酸指导的核酸酶的诱导型表达，通过将核酸酶与雌激素受体的激素结合结构域(ERT2)融合，变体可以在人类细胞中用4-羟基他莫昔芬(4-HT)打开和关闭。Liu，等人，Nature Chemical Biology，12:980–87(2016)。

锌指核酸酶(ZFN)是通过将锌指DNA结合结构域与DNA裂解结构域融合而产生的人工限制性酶。锌指结构域可以被工程化成靶向生物体的基因组中的特定靶区域。参见，例如，Urnov，等人，Nature Reviews Genetics 11，636–646(2010)。使用生物体的内源DNA修复机制，ZFN可以用于精确改变基因组的靶区域。ZFN可以用于通过在突变体等位基因的DNA中产生双链断裂(“DSB”)来使杂合子个体中的显性突变失去作用，所述双链断裂在同源模板不存在的情况下会通过非同源末端连接(NHEJ)来修复。NHEJ通过将两端连接在一起来修复DSB，并且通常不会产生突变，条件是切口干净且不复杂。Durai，等人，Nucleic AcidsRes.33(18)：5978-90(2005)。这种修复机制可以用于经由插入/缺失(indel)或染色体重排诱导基因组中的错误，通常使该位置处编码的基因产物为非功能性。

可选地，可以在外源双链DNA片段存在的情况下，使用同源依赖修复(HDR)将DNA引入基因组。可以通过在与DSB侧翼序列同源的序列中插入期望的序列来利用HDR对用以修复DSB的同源序列的依赖性，当HDR系统使用DSB侧翼序列作为模板时，将导致在感兴趣的基因组区内产生期望的改变。

多对ZFN也可以用于完全去除基因组序列的整个大区段(Lee.等人，GenomeRes..20(1)：81-89(2009)。扩展的CAG/CTG重复序列段(expanded CAG/CTG repeat tract)是十多种遗传性神经紊乱(包括亨廷顿病、强直性肌营养不良和若干种脊髓小脑性共济失调)的遗传基础。已经在人类细胞中证明，ZFN可以将DSB引导至CAG重复序列，并且将重复序列从长的病理长度缩短至短的毒性较小的长度(Mittelman等人，PNAS USA,106(24):9607-12(2009))。

兆核酸酶在20世纪90年代被鉴定，并且随后的工作表明它们是特别地有希望的基因组编辑工具，因为它们能够有效地诱导同源重组，在基因组的编码区或非编码区产生突变，并且改变基因组编码区的阅读框。参见，例如，Epinat，等人，Nucleic Acids Research,31(11):2952-62(2003)。兆核酸酶的高特异性给予其高度的精确性以及比其他天然存在的限制性酶低得多的细胞毒性。

转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)是可以被工程化以切割特定DNA序列的限制性酶。它们通过将TAL效应物DNA结合结构域与DNA裂解结构域(切割DNA链的核酸酶)融合而成。转录激活因子样效应物(TALE)可以被工程化为与实际上任何期望的DNA序列结合，因此当与核酸酶联合时，可以在特定位置处切割DNA。(参见，例如，Miller，等人，NatureBiotechnology,29(2):143–48(2011)；Boch，Nature Biotechnology,29(2):135–36(2011))。

像ZFN一样，TALEN可以通过诱导DSB来编辑基因组。在靶区域由TALEN产生的位点特异性DSB通过NHEJ或HDR进行修复，引起靶向的基因组编辑。TALEN可以用于引入插入/缺失、重排或者在外源双链DNA片段存在的情况下通过NHEJ将DNA引入基因组。

编辑活细胞的最新发现涉及核酸指导的核酸酶(例如，RNA指导的核酸酶)编辑。与适当的合成的指导核酸在细胞中复合的核酸指导的核酸酶可以在期望的位置处切割细胞的基因组。指导核酸有助于核酸指导的核酸酶识别和切割特定靶序列处的DNA。通过操纵指导核酸的核苷酸序列，核酸指导的核酸酶可以被编程为靶向任何用于裂解的DNA序列，只要适当的前间区邻近基序(protospacer adjacent motif,PAM)在附近。在某些方面，核酸指导的核酸酶编辑系统可以使用组合起来发挥指导核酸的作用的两个分开的指导核酸分子，例如CRISPR RNA(crRNA)和反式激活CRISPR RNA(tracrRNA)。在其他方面，指导核酸可以是包括crRNA序列和tracrRNA序列二者的单个指导核酸。

通常，指导核酸(例如，gRNA)可以与相容的核酸指导的核酸酶复合，并且然后可以与靶序列杂交，从而将核酸酶引导至靶序列。指导核酸可以是DNA或RNA；可选地，指导核酸可以包含DNA和RNA二者。在一些实施方案中，指导核酸可以包含修饰的或非天然存在的核苷酸。在指导核酸包含RNA的情况下，gRNA可以由多核苷酸分子诸如质粒、线性构建体上的DNA序列编码，或者编码序列可以驻留于编辑盒内，并且处于组成型启动子的控制下，或者在一些实施方案中并且优选地，在如下文描述的诱导型启动子的控制下。

指导核酸包含指导序列，其中指导序列是与靶序列具有足够互补性以与靶序列杂交并且指导复合的核酸指导的核酸酶与靶序列的序列特异性结合的多核苷酸序列。指导序列和对应的靶序列之间的互补性程度在使用合适的比对算法进行最佳比对时是约或多于约50％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、97.5％、99％或更多。最佳比对可以通过使用用于序列比对的任何合适的算法来确定。在一些实施方案中，指导序列的长度是约或多于约10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、35个、40个、45个、50个、75个或更多个核苷酸。在一些实施方案中，指导序列的长度为少于约75个、50个、45个、40个、35个、30个、25个、20个核苷酸。优选地，指导序列是10-30个或15-20个核苷酸长，或者长度是15个、16个、17个、18个、19个或20个核苷酸。

在本发明的方法和组合物中，指导核酸作为待由质粒或载体表达的序列提供，并且包含指导序列和支架序列二者作为启动子控制下的，并且在一些实施方案中，诱导型启动子控制下的单一转录物。通过改变指导序列可以将指导核酸工程化成靶向期望的靶序列，使得指导序列与期望的靶序列互补，从而允许指导序列和靶序列之间的杂交。通常，为了在靶序列中产生编辑，gRNA/核酸酶复合体与如由指导RNA确定的靶序列结合，并且核酸酶识别与靶序列邻近的前间区邻近基序(PAM)序列。靶序列可以是对原核细胞或真核细胞而言为内源或外源的任何多核苷酸，或体外的任何多核苷酸。例如，靶序列可以是驻留于真核细胞的细胞核中的多核苷酸。靶序列可以是编码基因产物(例如，蛋白)的序列或非编码序列(例如，调控多核苷酸、内含子、PAM或“垃圾”DNA(“junk”DNA))。

指导核酸可以是编码供体核酸的编辑盒的一部分。可选地，指导核酸可以不是编辑盒的一部分，而是可以被编码在工程或编辑载体骨架上。例如，可以首先将编码指导核酸的序列组装或插入载体骨架中，随后将供体核酸插入例如编辑盒中。在其他情况下，可以首先将例如编辑盒中的供体核酸插入或组装到载体骨架中，随后插入编码指导核酸的序列。在又其他情况下，编码指导核酸和供体核酸(例如，插入编辑盒中)的序列同时但分开插入或组装到载体中。在又其他实施方案中，编码指导核酸的序列和编码供体核酸的序列二者均包含在编辑盒中。

靶序列与前间区突变(PAM)相关，前间区突变(PAM)是由gRNA/核酸酶复合体识别的短核苷酸序列。用于不同的核酸指导的核酸酶的精确优选的PAM序列和长度要求不同；然而，PAM通常是与靶序列邻近或接近的2-7个碱基对序列，并且取决于核酸酶，可以是靶序列的5’或3’。核酸指导的核酸酶的PAM相互作用结构域的工程化可以允许改变PAM特异性，改进靶位点识别保真度，降低靶位点识别保真度，或增加核酸指导的核酸酶的多功能性。在某些实施方案中，靶序列的基因组编辑既将期望的DNA改变引入靶序列，例如细胞的基因组DNA，又去除靶序列中的前间区突变(PAM)区，使靶序列中的前间区突变(PAM)区突变或失活。使靶序列处的PAM失活排除了对该靶序列处细胞基因组的另外的编辑，例如，在后续的编辑轮中随后暴露于与合成的指导核酸复合的核酸指导的核酸酶时。因此，具有期望的靶序列编辑和改变的PAM的细胞可以使用与合成的指导核酸复合的核酸指导的核酸酶来选择，所述合成的指导核酸与靶序列互补。没有经历第一编辑事件的细胞会被切割，引起双链DNA断裂，并且因此会无法继续存活。包含期望的靶序列编辑和PAM改变的细胞不会被切割，因为这些编辑的细胞不再包含必需的PAM位点，并且会继续生长和繁殖。

核酸指导的核酸酶可以识别的靶序列的范围受将特定PAM定位于期望的靶序列附近的需要限制。因此，以基因组编辑必需的精度靶向编辑通常可能是困难的。已经发现，核酸酶可以非常好地识别一些PAM(例如，典型PAM(canonical PAM))，而不太好或较差地识别其他PAM(例如，非典型PAM)。因为本文公开的方法允许在未编辑的细胞的背景中鉴定编辑的细胞，所以方法允许在PAM未达最佳的情况下鉴定编辑的细胞；即，即使编辑效率非常低，本文用于鉴定编辑的细胞的方法也允许鉴定编辑的细胞。此外，因为编辑更容易被鉴定，本发明的方法扩大了可以被编辑的靶序列的范围，包括对与功能较弱的PAM相关的细胞进行基因组编辑。

至于核酸指导的核酸酶编辑系统的核酸酶组分，编码核酸指导的核酸酶的多核苷酸序列可以被密码子优化以在特定细胞类型，诸如古细菌、原核细胞或真核细胞中表达。真核细胞可以是酵母、真菌、藻类、植物、动物或人类细胞。真核细胞可以是特定生物体的细胞或来源于特定生物体的细胞，所述特定生物体诸如哺乳动物，包括但不限于人类、小鼠、大鼠、兔、犬或非人类哺乳动物，包括非人类灵长类动物。待采用的核酸指导的核酸酶的选择取决于许多因素，诸如在靶序列中待进行何种类型的编辑，以及适当的PAM是否位于期望的靶序列附近。本文描述的方法中使用的核酸酶包括但不限于Cas 9、Cas 12/CpfI、MAD2或MAD7或其他MAD酶(MADzyme)。与指导核酸一样，核酸酶可以由载体(例如，工程载体)上的DNA序列编码，并且处于组成型或诱导型启动子的控制下。在一些实施方案中，编码核酸酶的序列处于诱导型启动子的控制下，并且诱导型启动子可以与控制指导核酸转录的诱导型启动子分开但相同；即，分开的诱导型启动子驱动核酸酶和指导核酸序列的转录，但是这两个诱导型启动子可以是相同类型的诱导型启动子(例如，二者都是pL启动子)。可选地，控制核酸酶表达的诱导型启动子可以与控制指导核酸转录的诱导型启动子不同；即，例如，核酸酶可以处于pBAD诱导型启动子的控制下，并且指导核酸可以处于pL诱导型启动子的控制下。

核酸指导的核酸酶系统的另一组分是供体核酸。在一些实施方案中，供体核酸与指导核酸在同一多核苷酸(例如，编辑载体或编辑盒)上，并且可以(但不必然)处于与指导核酸相同的启动子的控制下(例如，驱动指导核酸和供体核酸二者转录的单一启动子)。供体核酸被设计成用作用于与靶序列同源重组的模板，该靶序列被作为gRNA/核酸酶复合体的一部分的核酸指导的核酸酶切口或裂解。供体核酸多核苷酸可以具有任何合适的长度，诸如约或多于约20个、25个、50个、75个、100个、150个、200个、500个或1000个核苷酸的长度。在某些优选的方面，供体核酸可以以20-300个核苷酸之间，更优选地50-250个核苷酸之间的寡核苷酸提供。供体核酸包含与靶序列的一部分互补的区域(例如同源臂)。当最佳比对时，供体核酸与靶序列重叠(互补)例如约20个、25个、30个、35个、40个、50个、60个、70个、80个、90个或更多个核苷酸。在许多实施方案中，供体核酸包含位于供体核酸和靶模板之间的突变或差异的侧翼的两个同源臂(与靶序列互补的区域)。供体核酸包含与靶序列相比的至少一个突变或改变，诸如与靶序列相比的插入、缺失、修饰或其任何组合。

通常，供体核酸以编辑盒提供，其被插入到载体骨架中，其中载体骨架可以包含驱动gRNA转录的启动子和gRNA编码序列，或者载体骨架可以包含驱动gRNA转录的启动子，但不包含gRNA本身。此外，可以存在多于一个，例如两个、三个、四个或更多个指导核酸/供体核酸盒插入到工程载体中，其中每个指导核酸处于分开的不同启动子、分开的相似启动子的控制下，或者其中所有指导核酸/供体核酸对处于单个启动子的控制下。在一些实施方案中，驱动gRNA和供体核酸(或驱动多于一个gRNA/供体核酸对)转录的启动子是诱导型启动子，并且驱动核酸酶转录的启动子也是诱导型启动子。关于编辑盒的另外的信息，参见美国专利第9,982,278号和美国系列第15/948,789号；第15/116,616号；第15/948,785号；第16/056,310号；第16,275,439号；和第16/275,465号。

诱导型编辑的优点在于，在启动编辑前，单个化的细胞可以生长几倍至许多倍的细胞倍增，这增加具有编辑的细胞将存活的可能性，因为由有效编辑(active editing)引起的双链切割对细胞有很大毒性。这种毒性既导致编辑的集落中的细胞死亡，也可能导致确实存活但必须在编辑后修复和恢复(recover)的编辑的细胞生长延滞。然而，在编辑的细胞具有恢复的机会后，编辑的细胞集落的尺寸最终会赶上未编辑的细胞集落的尺寸。此外，指导核酸可以有效指导编辑盒中多于一个供体核酸的编辑；例如，如果期望的编辑在靶序列中彼此接近。

除了供体核酸之外，编辑盒可以包含一个或更多个引物位点。引物位点可以用于通过使用寡核苷酸引物扩增编辑盒；例如，如果引物位点位于编辑盒的一个或更多个其他组分的侧翼。

此外，如以上描述的，供体核酸可以包含除了相对于靶序列的至少一个突变之外的一个或更多个PAM序列改变，所述改变使靶序列中的PAM位点突变、缺失或失活。靶序列中的PAM序列改变使PAM位点对核酸指导的核酸酶“免疫”，并且如果使用相同的核酸酶，保护靶序列在随后的编辑轮中不被进一步编辑。

此外，编辑盒可以包含条形码。条形码是对应于供体DNA序列的独特DNA序列，使得条形码可以鉴定对对应靶序列进行的编辑。条形码通常包含四个或更多个核苷酸。在一些实施方案中，编辑盒包含代表例如供体核酸的全基因或全基因组文库的供体核酸的集合。编辑盒的文库被克隆到载体骨架中，其中，例如，每个不同的供体核酸与不同的条形码缔合。

此外，在一些实施方案中，编码核酸指导的核酸酶系统的组分的表达载体或盒还编码包含一个或更多个细胞核定位序列(NLS)诸如约或多于约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个NLS的核酸指导的核酸酶。在一些实施方案中，工程化核酸酶包含氨基末端处或其附近的NLS、羧基末端处或其附近的NLS，或组合。

工程和编辑载体包含可操作地连接至待转录的组分序列的控制序列。如以上陈述的，驱动核酸指导的核酸酶编辑系统的一种或更多种组分转录的启动子可以是诱导型的。已经开发了用于在植物、微生物和动物细胞(包括哺乳动物细胞)中控制基因表达的许多基因调控控制系统，包括pL启动子(通过CI857阻遏物的热失活诱导)、pBAD启动子(通过将阿拉伯糖添加至细胞生长培养基中诱导)和鼠李糖诱导型启动子(通过将鼠李糖添加至细胞生长培养基中诱导)。其他系统包括四环素控制的转录激活系统(Tet-On/Tet-Off，Clontech,Inc.(Palo Alto,CA)；Bujard和Gossen,PNAS,89(12):5547-5551(1992))、Lac开关诱导型系统(Wyborski等人，Environ Mol Mutagen,28(4):447-58(1996)；DuCoeur等人，Strategies 5(3):70-72(1992)；美国专利第4,833,080号)、蜕皮素诱导型基因表达系统(No等人，PNAS,93(8):3346-3351(1996))、cumate基因开关系统(Mullick等人，BMCBiotechnology,6:43(2006))、以及他莫昔芬诱导型基因表达(Zhang等人，Nucleic AcidsResearch,24:543-548(1996))以及其他。在本文描述的模块和仪器中使用的本发明方法中，优选的是，至少一种核酸指导的核酸酶编辑组分(例如核酸酶和/或gRNA)处于通过温度升高而被激活的启动子的控制下，因为这样的启动子允许启动子通过温度升高而被激活，并且通过温度降低而失去活性，从而“关闭”编辑过程。因此，在启动子通过温度降低而失去活性的情况下，细胞中的编辑可以被关闭，而无需更换培养基；去除例如培养基中用于诱导编辑的诱导型生化物质(inducible biochemical)。

产生细胞表面展示文库的自动化细胞编辑仪器和模块

图4A描绘了例如进行以上描述的示例性工作流程之一的示例性自动化多模块细胞处理仪器400，以及另外的示例性模块。例如，仪器400可以并且优选地被设计为在实验室环境中使用的台式仪器。仪器400可以包括可重复使用元件和一次性元件的混合物，用于在细胞中进行自动化基因组裂解和/或编辑时进行多种分阶段过程。图示了机架(gantry)402，机架402提供了自动化机械运动系统(致动器)(未示出)，该自动化机械运动系统(致动器)向例如自动化液体操作系统458提供XYZ轴运动控制，该自动化液体操作系统458包括例如空气置换移液器以及自动化多模块细胞处理仪器400的模块。在一些自动化多模块细胞处理仪器中，空气置换移液器432由机架402移动，并且多种模块和试剂筒保持静止；然而，在其他实施方案中，液体操作系统可以在多种模块移动时保持静止。自动化多模块细胞处理仪器400中还包括试剂筒410以及洗涤筒404，该试剂筒410包括储库412和转化模块430，该洗涤筒404包括储库406。洗涤筒404可以被配置成容纳大的管，例如洗涤溶液，或者在整个迭代过程中通常使用的溶液。在一个实例中，洗涤筒404可以被配置成当依次使用和更换两个或更多个试剂筒410时保持在原位置。尽管试剂筒410和洗涤筒404在图4A中显示为分开的筒，但是洗涤筒404的内容物可以掺入到试剂筒410中。注意，在该实施方案中，转化模块430包含在试剂筒410内；然而，在替代实施方案中，转化模块430包含在其本身的模块内，或者可以是另一个模块的一部分，诸如生长模块的一部分。

在一些实施方式中，洗涤筒404和试剂筒410是被提供用于在自动化多模块细胞编辑仪器400中使用的一次性套件。例如，在启动细胞处理前，使用者可以在自动化多模块细胞编辑仪器的机箱(chassis)内打开和定位每个试剂筒410和洗涤筒404。

还图示了机器人操作系统458，包括机架402和空气置换移液器432。在一些实例中，机器人操作系统458可以包括自动化液体操作系统，诸如由Mannedorf,Switzerland的Tecan Group Ltd.、Reno,NV的Hamilton Company(参见，例如，WO2018015544A1)或FortCollins,CO.的Beckman Coulter,Inc.(参见，例如，US20160018427A1)制造的那些。移液器吸头可以设置在移液器转移吸头供应装置(未示出)中，用于与空气置换移液器432一起使用。

在一些实施方式中，筒404、410的组件标记有机器可读标记(未示出)，诸如条形码，用于由机器人操作系统458识别。例如，机器人操作系统458可以扫描每个筒404、410内的容器以确认内容物。在其他实施方式中，机器可读标记可以标记在每个筒404、410上，并且自动化多模块细胞编辑仪器400的处理系统426(图4D中示出的)可以基于机器可读标记鉴定存储材料地图。图4A的示例性自动化多模块细胞处理仪器400还包括细胞生长模块434。(注意，此处简要叙述的所有模块将在下文详细描述)。在图4A中示出的实施方案中，细胞生长模块434包括两个细胞生长瓶418、420(下文结合图5A-图5D更详细描述)以及细胞浓缩模块422(结合图6A-图6F详细描述)。在替代实施方案中，细胞浓缩模块422可以与细胞生长模块434分开，例如在分开的专用模块中。还图示了，作为图4A的自动化多模块细胞处理仪器400的一部分的任选的富集模块440，由例如机器人操作系统458和空气置换移液器432提供服务。还可见任选的核酸组装/脱盐模块414，核酸组装/脱盐模块414包括反应室或管容器(receptacle)(未示出)和磁体416，以允许使用例如磁性固相可逆固定(SPRI)珠(Applied Biological Materials Inc.,Richmond,BC)纯化核酸。细胞生长模块、细胞浓缩模块、转化模块、富集模块、试剂筒和核酸组装模块将在下文详细描述。

图4B是图4A中描绘的示例性多模块细胞处理仪器400的正面的平面图。例如，基于筒的源材料(诸如在试剂筒410中)可以被定位于仪器400的平台(deck)402上的指定区域中，以供机器人操作仪器(在该图中未示出)获取(access)。如图4B中图示的，平台402可以包括保护槽，使得从仪器400的任何模块溢出(spilling)、滴落或溢流(overflowing)的污染物容纳在保护槽的边缘(lip)内。除了试剂筒410之外，在图4B中还可见洗涤筒404、任选的富集模块440，和生长模块434的一部分。在该视图中还可见触摸屏显示器450、转化模块控制器438、电子设备架436和处理系统426。

图4C至图4D图示了多模块细胞处理仪器480，该多模块细胞处理仪器480包括用于在台式细胞编辑仪器480中使用的机箱490。例如，机箱490可以具有约24-48英寸的宽度、约24-48英寸的高度和约24-48英寸的深度。机箱490可以并且优选地被设计成容纳自动化细胞处理中使用的多个模块和一次性供应装置。此外，机箱490可以安装机器人操作系统458，用于在模块之间移动材料。

如图示的，机箱490包括具有手柄454和铰链456a-456c的盖，手柄454和铰链456a-456c用于提升盖和进入机箱490的内部。冷却格栅464允许空气通过内部风扇(未示出)流动。此外，机箱490由可调节的支脚470抬起(示出了支脚470a-c)。例如，支脚470a-470c可以在机箱490下方提供另外的气流。在一些实施方案中，控制按钮466允许机箱490内细胞处理的单按钮自动化开始和/或停止。

在一些实施方式中，在机箱490内部，机器人操作系统458沿着机架402被设置在材料筒404和410上方。在一些实施方案中，控制电路、液体操作管、气泵控制器、阀、热单元(例如，加热和冷却单元)和其他控制机构被设置在机箱490的平台下方，在控制箱区468中。在图4D中还可见包括磁体416的富集模块440和核酸组装模块414

虽然未图示，但是在一些实施方案中，显示屏可以被定位于机箱490的正面，例如覆盖了盖的一部分(例如，参见，图4B)。显示屏可以向使用者提供关于自动化多模块细胞编辑仪器的处理状态的信息。在另一实例中，显示屏可以接受来自使用者的用于进行细胞处理的输入。

图5A示出了与本文描述的细胞生长装置一起使用的旋转生长瓶500的一种实施方案。旋转生长瓶是光学透明的容器，具有用于接收液体培养基和细胞的开口端504、限定用于使细胞生长的主容器的中心瓶区506、限定至少一个光路510的锥形至收缩区(tapered-to-constricted region)518、封闭端516和驱动接合机构512。旋转生长瓶具有中心纵轴520，瓶围绕该中心纵轴520旋转，并且光路510通常垂直于瓶的纵轴。第一光路510被定位于锥形至收缩区518的下收缩部分。任选地，旋转生长瓶500的一些实施方案在锥形至收缩区518的锥形区中具有第二光路508。该实施方案中的两个光路都被定位于旋转生长瓶的区中，该区不断地填充有细胞培养物(细胞+生长培养基)并且不受生长瓶旋转速度的影响。第一光路510比第二光路508短，在瓶中细胞培养物的OD值处于高水平时(例如，在细胞生长过程的较后期)允许OD值的灵敏测量，而第二光路508在瓶中细胞培养物的OD值处于低水平时(例如，在细胞生长过程的较早期)，允许OD值的灵敏测量。还示出了边缘502，边缘502允许旋转生长瓶位于生长模块(未示出)中并且还允许使用者容易操作。

在旋转生长瓶的一些配置中，旋转生长瓶具有设置在旋转生长瓶内、从旋转生长瓶的内壁朝向中心瓶区的中心延伸的两个或更多个“桨”或内部特征。在一些方面，桨或特征的宽度随着旋转生长瓶的尺寸或体积而变化，并且范围可以为旋转生长瓶直径的1/20至刚好大于1/3、或旋转生长瓶直径的1/15至1/4、或旋转生长瓶直径的1/10到1/5。在一些方面，桨的长度随着旋转生长瓶的尺寸或体积而变化，并且范围可以为旋转生长瓶主体长度的4/5至1/4、或旋转生长瓶主体长度的3/4至1/3、或旋转生长瓶主体长度的1/2至1/3。在其他方面，可以在水平或垂直布置的旋转生长瓶的主体的内表面上设置凸起特征同心行；并且在其他方面，可以在旋转生长瓶的主体的内表面上设置凸起特征螺旋配置。在替代方面，凸起特征同心行或螺旋配置可以被设置在旋转生长瓶的柱(post)或中心结构上。尽管以上描述了具有两个桨，但是旋转生长瓶可以包括3个、4个、5个、6个或更多桨，以及多达20个桨。桨数取决于例如旋转生长瓶的尺寸或体积。桨可以对称地布置为从瓶的内壁延伸到瓶的内部的单个桨，或者桨可以对称地布置成以2个、3个、4个或更多个桨的组成组地(例如，一对桨与另一对桨相对)从瓶的内壁延伸到瓶的内部。在另一种实施方案中，桨可以从旋转生长瓶的中部向外朝向旋转生长瓶的壁延伸，例如从旋转生长瓶内部的柱或其他支撑结构延伸。

驱动接合机构512与马达(未示出)接合以使瓶旋转。在一些实施方案中，马达驱动驱动接合机构512，使得旋转生长瓶仅在一个方向上旋转，并且在其他实施方案中，旋转生长瓶在第一方向上旋转第一时间量或周期性，在第二方向(即，相对方向)上旋转第二时间量或周期性，并且该过程可以重复，使得旋转生长瓶(和细胞培养物内容物)经历振荡运动。第一时间量和第二时间量可以相同或可以不同。时间量可以是1秒、2秒、3秒、4秒、5秒或更多秒，或者可以是1分钟、2分钟、3分钟、4分钟或更多分钟。在另一种实施方案中，旋转生长瓶可以在细胞生长的早期阶段以第一周期性(例如，每60秒)振荡，并且旋转生长瓶可以然后在细胞生长的后期阶段以与第一周期性不同的第二周期性(例如，每一秒)振荡。

旋转生长瓶500可以是可重复使用的，或者优选地，旋转生长瓶是可消耗的。在一些实施方案中，旋转生长瓶是可消耗的，并且向使用者提供为预先填充有生长培养基，其中瓶在开口端504处用箔密封件密封。以这样的方式包装的填充培养基的旋转生长瓶可以是用于与独立细胞生长装置或与作为自动化多模块细胞处理仪器一部分的细胞生长模块一起使用的套件的一部分。为了将细胞引入到瓶中，使用者仅需要用移液器吸出期望体积的细胞，并且使用移液器吸头刺穿瓶的箔密封件。开口端504可以任选地包括延伸边缘502，以与细胞生长装置(未示出)重叠并接合。在自动化系统中，旋转生长瓶500可以用条形码或其他标识手段加标签，该条形码或其他标识手段可以被作为自动化系统的一部分的扫描仪或照相机(未示出)读取。

旋转生长瓶500的体积和细胞培养物(包括生长培养基)的体积可以有很大变化，但是旋转生长瓶500的体积必须足够大，以使生长瓶中的细胞培养物在瓶旋转时获得适当通气。在实践中，旋转生长瓶500的体积范围可以为1-250ml、2-100ml、5-80ml、10-50ml或12-35ml。同样，细胞培养物(细胞+生长培养基)的体积应适当，以允许旋转生长瓶中适当通气。因此，细胞培养物的体积应是生长瓶体积的约10％-85％或生长瓶体积的20％-60％。例如，对于35ml的生长瓶，细胞培养物的体积会是约4ml至约27ml或7ml至约21ml。

旋转生长瓶500优选由生物相容的光学透明材料制成，或者包括一条或更多条光路的瓶的至少一部分是透明的。此外，制造旋转生长瓶的材料应能够冷却至约4℃或更低，并且加热至约55℃或更高，以适应基于温度的细胞测定和在低温的长期储存。此外，用于制造瓶的材料必须能够承受高达55℃的温度，并且在旋转时不会变形。合适的材料包括玻璃、聚氯乙烯、聚乙烯、聚酰胺、聚乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚砜、聚氨酯，以及这些和其他聚合物的共聚物。优选的材料包括聚丙烯、聚碳酸酯或聚苯乙烯。在一些实施方案中，旋转生长瓶通过例如注射成型或挤压低成本地制造。

图5B-图5D示出了包括旋转生长瓶500的细胞生长模块550的实施方案。图5B是细胞生长装置550的一种实施方案的透视图。图5C描绘了来自图5B的细胞生长装置550的剖视图。在两幅图中，可见旋转生长瓶500被定位于主壳体526内，其中旋转生长瓶500的延伸边缘502在主壳体526上方延伸。此外，两幅图中都示出了端壳体522、下壳体532和凸缘524。凸缘524用于将细胞生长装置附接至加热/冷却装置或其他结构(未示出)。图5C描绘了另外的细节。在图5C中，上轴承542和下轴承530被示出定位于主壳体526中。上轴承542和下轴承530支持旋转生长瓶500的垂直装载。下壳体532容纳驱动马达536。图5C的细胞生长装置包括两条光路：第一光路534和第二光路530。光路534对应于定位于旋转生长瓶的锥形至收缩部分的收缩部分中的光路510，并且光路530对应于旋转生长瓶的锥形至收缩部分的锥形部分中的光路508。光路510和508未在图5C中示出，但是可见于例如图5A中。除了光路534和530之外，还存在照亮光路的发射板528，以及在光穿过旋转生长瓶中的细胞培养液后检测光的检测器板546。

在一些实施方案中，用于使旋转生长瓶500旋转的马达536是具有内置驱动控制器的无刷DC型驱动马达，所述内置驱动控制器可以被设置为保持0RPM和约3000RPM之间的恒定每分钟转数(RPM)。可选地，可以使用其他马达类型，诸如步进(stepper)、伺服(servo)、刷式DC等。任选地，马达506还可以具有允许旋转方向反转的方向控制以及感测和报告实际RPM的转速计。马达由处理器(未示出)根据例如被编程到处理器中的标准方案和/或使用者输入进行控制，并且马达可以被配置成改变RPM以引起细胞培养物的轴向进动，从而增强混合，例如以防止细胞团聚、增加通气和优化细胞呼吸。

细胞生长装置550的主壳体526、端壳体522和下壳体532可以由任何合适的稳健材料制成，包括铝、不锈钢和其他导热材料，包括塑料。这些结构或其部分可以通过多种技术产生，例如金属制造、注射成型、产生熔合的结构层，等等。尽管在一些实施方案中设想旋转生长瓶是可重复使用的，但是优选地是可消耗的，但是细胞生长装置550的其他组件优选地是可重复使用的，并且可以用作独立台式装置，或者如此处用作多模块细胞处理系统中的模块。

细胞生长系统的处理器(未示出)可以用待用作生长细胞培养物的“空白”或对照的信息编程。“空白”或对照是仅包含细胞生长培养基的容器，产生100％的透射率和0OD，而细胞样品会将光线偏转并且会具有较低的透射率百分比和较高的OD。随着细胞在培养基中生长并且变得更稠密，透射率会降低并且OD会增加。细胞生长系统的处理器可以被编程为使用与细胞培养中通常使用的生长培养基相称的空白的波长值(不论，例如，哺乳动物细胞、细菌细胞、动物细胞、酵母细胞等)。可选地，第二分光光度计和容器可以包括在细胞生长系统中，其中第二分光光度计用于以指定的间隔读取空白。

图5D图示了作为组装的一部分的细胞生长装置，包括与光源590、检测器592和热组件594耦合的图5B的细胞生长装置。将旋转生长瓶500插入细胞培养装置中。光源590和检测器592的组件(例如，诸如，具有覆盖5-log的增益控制的光电二极管)与细胞生长设备的主壳体耦合。图示了容纳使旋转生长瓶旋转的马达的下壳体532，以及将细胞生长装置固定至组装的凸缘524之一。还图示了Peltier装置或热电冷却器594。在该实施方案中，热控制通过经由下壳体532的基部上的凸缘504将细胞生长装置500附接至热装置594并与热装置594电一体化来实现。热电冷却器能够将热量“泵”至接合处(junction)的任一侧，根据电流的方向冷却表面或加热表面。在一种实施方案中，使用热敏电阻测量主壳体的温度，并且然后通过标准的电子比例积分微分(PID)控制器回路，将旋转生长瓶500控制在约+/-0.5℃。

在某些实施方案中，安装在后部的电源输入模块包含安全性保险丝和通断开关(on-off switch)，该通断开关当接通电源时，为内部AC和DC供电器(未示出)供电，启动处理器。使用600nm发光二极管(LED)(未示出)以编程的时间间隔完成光密度(OD)的测量，该发光二极管(LED)已经通过光学器件(optic)成列布置(columnated)到包含感兴趣细胞的旋转生长瓶的下收缩部分中。光继续通过收集光学器件到达检测系统，该检测系统由(数字)增益控制硅光电二极管组成。通常，光密度通常显示为光衰减器的功率传输因子(powertransmission factor)的以10为底数的对数的绝对值：OD＝-log10(断电/通电)。由于OD是光学衰减的度量，即吸收、散射和反射的总和，细胞生长装置OD测量记录了总的功率传输，因此随着细胞生长和群体变得稠密，OD(信号损失)也会增加。OD系统针对OD标准进行预校准，这些值存储在可由测量程序访问的板载存储器中。

在使用时，通过刺穿箔密封件，将细胞接种(细胞可以从例如自动化液体操作系统或由使用者移出)到旋转生长瓶的预填充生长培养基中。细胞生长装置的编程软件设置用于生长的控制温度，通常为30℃，然后缓慢启动旋转生长瓶的旋转。细胞/生长培养基混合物由于离心力缓慢垂直向上移动至壁，允许旋转生长瓶将混合物的大表面面积暴露于正常的氧气环境。生长监测系统以预设或预编程的时间间隔采取连续读取OD或OD测量。这些测量存储在内部存储器中，并且如果需要，软件将测量对比时间绘图，以展示生长曲线。如果需要增强混合，例如为了优化生长条件，可以改变瓶旋转的速度以引起液体的轴向进动，和/或可以以编程的间隔进行完全的方向改变。可以对生长监控编程，以在预先确定的OD时自动终止生长阶段，并且然后将混合物快速冷却至较低温度，以抑制进一步生长。

细胞生长装置550的一个应用是不断地测量生长细胞培养物的光密度。所描述的细胞生长装置的一个优点是光密度可以连续测量(动力学监测)或以特定时间间隔测量；例如每5秒、10秒、15秒、20秒、30秒、45秒或60秒，或者每1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟或10分钟。虽然已经在测量生长细胞培养物的光密度(OD)的背景下描述了细胞生长装置，然而鉴于本说明书的教导，本领域技术人员应理解，除了细胞培养物OD之外或者代替细胞培养物OD，可以测量其他细胞生长参数。例如，使用可见光、UV或近红外光(NIR)的光谱学允许监测细胞培养物中营养物和/或废弃物的浓度。此外，可以使用光谱测量来同时定量多种化学物质。不对称的化学物质可以通过鉴定NIR中的特征性吸收特征来定量。相比之下，对称的化学物质可以容易地使用拉曼光谱学定量。许多关键代谢物，诸如葡萄糖、谷氨酰胺、氨和乳酸，具有不同的IR中的光谱特征，使得它们可以被容易地定量。样品吸收的光的量和频率可以与样品中存在的化学物质的类型和浓度相关。这些测量类型中的每一种都提供特定的优点。FT-NIR提供最大的光穿透深度，并且可以用于较厚的样品。FT-mid-IR(MIR)提供了可更容易地辨别为对某些分析物有特异性的信息，因为这些波长更接近基本IR吸收。当由水引起的干扰被最小化时，FT-拉曼是有利的。其他光谱特性可以经由例如介电阻抗谱学、可见荧光、荧光偏振或发光来测量。此外，细胞生长装置可以包括用于测量例如溶解氧、二氧化碳、pH、电导率等的另外的传感器。

图6A-6I描绘了利用切向流过滤的细胞浓缩/缓冲液交换盒和模块的一种实施方案的变化形式。本文描述的细胞浓缩装置的一种实施方案使用切向流过滤(TFF)，切向流过滤(TFF)也称为错流过滤(crossflow filtration)，其中大部分进料切向流过过滤器表面，从而与进料流入过滤器的死端过滤(dead-end filtration)相比，降低滤饼(渗余物)的形成。还利用相对于主进料的二次流产生剪切力，以防止滤饼形成和膜结垢，从而使颗粒回收最大化，如下文描述的。

本文描述的TFF装置被设计成考虑两个主要的设计因素。首先，TFF装置的几何形状导致在大的表面积上过滤细胞培养物，以使处理时间最小化。第二，TFF装置的设计被配置成使过滤器结垢最小化。图6A是切向流过滤的一般模型150。TFF装置使用也称为错流过滤的切向流过滤进行操作。图6A示出了在膜124上流动的细胞，其中培养基或缓冲液中的细胞152的进料流平行于膜124。TFF不同于死端过滤，在死端过滤中，进料流和压降二者均垂直于膜或过滤器。

图6B描绘了提供切向流过滤的TFF装置/模块的一种实施方案的下部构件的顶视图。如在图6B的TFF装置的实施方案中可见的，TFF装置600包括通道结构616，该通道结构616包括细胞培养物流经的流动通道602b。通道结构616包括由膜(未示出)进行水平分叉的单个流动通道602b，缓冲液或培养基可以流过该膜，但是细胞不能流过该膜。该特定实施方案包括波状蛇形几何形状614(即，流动通道602中的小“摆动(wiggle)”)和蛇形“Z字形(zig-zag)”图案，其中流动通道602与装置从装置左侧的一端交叉到装置右侧的另一端。蛇形图案允许在相对于装置尺寸和总通道体积的高表面面积上的过滤，而波状作用产生二次惯性流，以实现有效的膜再生，防止膜结垢。虽然此处例示了波状几何形状和蛇形图案，但是也可以使用其他的通道形状，只要该通道可以被膜分叉，并且只要该通道配置提供在交替方向上通过TFF模块的流动。除了流动通道602b，可见作为通道结构616的一部分的端口(portal)604和606，以及凹陷608。端口604在膜(未示出)的一侧收集通过通道的细胞(“渗余物”)，并且端口606在膜(未示出)的相对侧收集通过通道的培养基(“滤液”或“渗透物”)。在该实施方案中，凹陷608容纳允许TFF装置的组件彼此固定的螺栓或其他紧固件(未示出)。

通道结构616的长度610和宽度612可以根据待生长的细胞培养物的体积和待浓缩的细胞培养物的光密度而变化。通道结构616的长度610通常是1mm至300mm，或50mm至250mm，或60mm至200mm，或70mm至150mm，或80mm至100mm。通道结构616的宽度通常是1mm至120mm，或20mm至100mm，或30mm至80mm，或40mm至70mm，或50mm到60mm。流动通道102的截面形状可以是圆形、椭圆形、卵形、方形、矩形、梯形或不规则的。如果是方形、矩形或其他具有大体上直边的形状，截面可以是约10μm至1000μm宽，或200μm至800μm宽，或300μm至700μm宽，或400μm至600μm宽；和约10μm至1000μm高，或200μm至800μm高，或300μm至700μm高，或400μm至600μm高。如果流动通道602的截面大体上是圆形、卵形或椭圆形的，则通道的半径可以是按水力半径约50μm至1000μm，或者按水力半径5μm至800μm，或者按水力半径200μm至700μm，或者按水力半径300μm至600μm宽，或者按水力半径约200μm至500μm。

当观察图6B的TFF装置/模块的顶视图时，注意到存在两个渗余物端口604和两个滤液端口606，其中在装置600的两端(例如窄边)处各存在一个类型的端口。在其他实施方案中，渗余物和滤液端口可以在同一构件(例如，上部构件或下部构件)的同一表面上，或者它们可以布置在组装的侧表面上。与其他连续操作的TFF装置不同，本文描述的TFF装置/模块使用交替的方法来浓缩细胞。用于使用TFF装置/模块的细胞浓缩的总工作流程包括使细胞培养物或细胞样品切向流过通道结构。将流动通道分叉的膜将细胞保留在膜的一侧，并且允许不需要的培养基或缓冲液流动跨过膜进入装置的滤液侧(例如，下部构件620)。在该过程中，培养基或缓冲液中的固定体积的细胞被驱动通过装置，直至细胞样品被收集到一个渗余物端口604中，并且已经通过膜的培养基/缓冲液通过一个或两个滤液端口606收集。所有类型的原核细胞和真核细胞——黏附细胞和非黏附细胞二者——均可以在TFF装置中生长。黏附细胞可以在悬浮在流过TFF装置的培养基中的珠或其他细胞支架上生长。

在细胞浓缩过程中，使细胞样品通过TFF装置并在一个渗余物端口604中收集细胞，同时在一个滤液端口606中收集培养基，这被认为是细胞样品的“一次通过”。渗余物储库之间的转移“翻转”了培养物，对于给定的通过，分别收集细胞和培养基的渗余物端口和滤液端口驻留于TFF装置/模块600的同一端，流体连接被布置成使得渗余物和滤液侧存在两个不同的流动层，但是如果渗余物端口604驻留于装置/模块600的上部构件上(即，细胞被驱动通过膜上方的通道，并且滤液(培养基)通过膜下方的通道部分)，滤液端口606会驻留于装置/模块100的下部构件上，并且反之亦然(即，如果细胞样品被驱动通过膜下方的通道，滤液(培养基)通过膜上方的通道部分)。在图6C-图6D中更清楚地可见这种配置，其中渗余物从渗余物端口604流出660，并且滤液从滤液端口606流出670。

在生长浓缩过程的“通过”结束时，细胞样品通过渗余物端口604并进入渗余物储库(未示出)而被收集。为了起始另一次“通过”，细胞样品再次通过TFF装置，这次的流动方向与第一次通过相反。细胞样品通过渗余物端口604并进入渗余物储库(未示出)收集，该储库位于装置/模块与渗余物端口604相对的一端上，渗余物端口604在第一次通过期间用于收集细胞。同样地，在第二次通过时通过膜的培养基/缓冲液通过滤液端口606或通过两个端口收集，所述滤液端口606位于装置/模块与滤液端口606相对的一端上，所述滤液端口606在第一次通过期间用于收集滤液。重复使渗余物(浓缩的细胞样品)通过装置/模块的交替过程，直至细胞已经浓缩至期望的体积，并且两个滤液端口可以在通过期间打开以降低操作时间。此外，缓冲液交换可以通过以下实现：将期望的缓冲液(或新鲜培养基)添加至渗余物储库中的细胞样品，然后起始另一次“通过”，并且重复该过程，直至旧的培养基或缓冲液被稀释并过滤掉并且细胞驻留在新鲜培养基或缓冲液中。注意，缓冲液交换和细胞浓缩可能(并且通常确实)同时发生。

图6C描绘了示例性TFF模块的上部构件(622)和下部构件(620)的顶视图。同样，可见端口604和606。如上文说明的，凹陷(诸如可见于图6B中的凹陷608)提供在操作期间经由例如螺栓或其他类似紧固件将TFF装置/膜的组件(上部构件622、下部构件620和膜624)彼此固定的手段。然而，在替代实施方案中，粘合剂诸如压敏粘合剂，或超声波焊接，或溶剂粘接(solvent bonding)，可以用于将上部构件622、下部构件620和膜624耦合在一起。事实上，鉴于本公开内容的指导，本领域普通技术人员可以找到用于耦合TFF装置的组件的其他配置，诸如，例如夹具(clamp)；设置在上部构件和下部构件上的配合配件；粘合剂、焊接、溶剂粘接和配合配件的组合；以及其他这样的紧固件和耦合件(coupling)。

注意，在TFF装置/模块的每一“端”(例如，窄边)存在一个渗余物端口和一个滤液端口。装置/模块左侧的渗余物端口和滤液端口会分别收集同一次通过的细胞(在660处的流动路径)和培养基(在670处的流动路径)。同样，装置/模块右侧的渗余物端口和滤液端口会分别收集同一次通过的细胞(在660处的流动路径)和培养基(在670处的流动路径)。在该实施方案中，渗余物从TFF装置的顶表面上的端口604收集，并且滤液从装置底表面上的端口606收集。将细胞维持在膜624上方的TFF流动通道中，而滤液(培养基)流过膜624并且然后流过端口606；因此，顶端口/渗余物端口和底端口/滤液端口的配置是实用的。然而，应认识到，可以实施渗余物端口和滤液端口的其他配置，诸如使渗余物端口和滤液端口二者均定位在TFF装置的侧面(与顶表面和底表面相对)。在图6C中，可见在TFF装置600的下部构件620上的通道结构602b。然而，在其他实施方案中，渗余物端口和滤液端口可以驻留于同一TFF装置上。

在图6C中还可见膜或过滤器624。适用于TFF装置/模块的过滤器或膜是耐溶剂的、在过滤期间无污染并且能够保留感兴趣细胞的类型和尺寸的那些。例如，为了保留小细胞类型，诸如细菌细胞，孔径可以低至0.2μm，然而对于其他细胞类型，孔径可以高至5μm。事实上，可用于TFF装置/模块中的孔径包括具有以下尺寸的过滤器：0.20μm、0.21μm、0.22μm、0.23μm、0.24μm、0.25μm、0.26μm、0.27μm、0.28μm、0.29μm、0.30μm、0.31μm、0.32μm、0.33μm、0.34μm、0.35μm、0.36μm、0.37μm、0.38μm、0.39μm、0.40μm、0.41μm、0.42μm、0.43μm、0.44μm、0.45μm、0.46μm、0.47μm、0.48μm、0.49μm、0.50μm以及更大。过滤器可以由任何合适的非反应性材料制成，包括纤维素混合酯(硝酸纤维素和乙酸纤维素)(CME)、聚碳酸酯(PC)、聚偏氟乙烯(PVDF)、聚醚砜(PES)、聚四氟乙烯(PTFE)、尼龙、玻璃纤维，或如在激光或电化学蚀刻的情况下的金属基材。图6C和图6D中示出的TFF装置没有示出过滤器624可以安置或固定的上部构件612和下部构件620中的座(seat)(例如，上部构件612和下部构件620各自中的过滤器的厚度的一半的座)；然而，在一些实施方案中考虑了这样的座。

图6D描绘了图6C中示出的示例性TFF模块的上部构件和下部构件的底视图。图6D描绘了示例性TFF模块的上部构件(622)和下部构件(620)组件的底视图。同样，可见端口604和606。同样注意，在装置/模块的每一端存在一个渗余物端口和一个滤液端口。装置/模块左侧的渗余物端口和滤液端口会分别收集同一次通过的细胞(在660处的流动路径)和培养基(在670处的流动路径)。同样，装置/模块右侧的渗余物端口和滤液端口会分别收集同一次通过的细胞(在660处的流动路径)和培养基(在670处的流动路径)。在图6D中，可见在TFF装置600的上部构件622上的通道结构602a。因此，观察图6C和图6D，注意在上部构件和下部构件二者中均存在通道结构602(602a和602b)，在通道结构的上部构件和下部构件之间存在膜624。上部构件622和下部构件620的通道结构602(分别为602a和602b)配合产生流动通道，膜624水平定位于流动通道的上部构件和下部构件之间，从而使流动通道分叉。

在TFF装置/模块上通过以下进行培养基交换(在细胞生长期间)或缓冲液交换(在细胞浓缩或赋予细胞感受态期间)：将新鲜培养基添加至生长细胞中，或将期望缓冲液添加至浓缩至期望体积的细胞中；例如，在细胞被浓缩至少20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、150倍、200倍或更多倍后。通过向渗余物储库添加或从滤液侧通过膜将期望的交换培养基或交换缓冲液添加至细胞，并且重复使细胞通过TFF装置600的过程，直至细胞在交换培养基或缓冲液中已经生长至期望的光密度或浓缩至期望的体积。该过程可以重复任何期望次数，以达到期望的缓冲液交换水平和期望的细胞体积。交换缓冲液可以包含例如甘油或山梨醇，从而除了使细胞样品的总体积减少之外，还使细胞为感受态，用于转化。

TFF装置600可以由其中通道(和通道分支)可以被磨铣的任何稳健材料制成，包括不锈钢、硅、玻璃、铝或塑料，所述塑料包括环烯烃共聚物(COC)、环烯烃聚合物(COP)、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚乙烯、聚酰胺、聚乙烯、聚丙烯、丙烯腈丁二烯、聚碳酸酯、聚醚醚酮(PEEK)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚砜和聚氨酯，以及这些和其他聚合物的共聚物。如果TFF装置/模块是一次性的，优选地它由塑料制成。在一些实施方案中，用于制造TFF装置/模块的材料是导热的，使得细胞培养物可以被加热或冷却至期望的温度。在某些实施方案中，TFF装置使用以上提及的适于这种大规模生产技术的材料通过以下形成：精密机械加工、激光加工、放电加工(用于金属装置)；湿法或干法蚀刻(用于硅装置)；干法或湿法蚀刻、粉末或喷砂、光结构化(photostructuring)(用于玻璃装置)；或热成型、注射成型、热压花、或激光加工(用于塑料装置)。

图6E描绘了组装的TFF装置的示例性配置，其中，像其他配置一样，上部构件和下部构件组合形成通道结构，其中膜设置在上部构件和下部构件之间；然而，在这种配置中，除了渗余物储库之外，在渗余物储库和较下方的滤液或渗透物储库之间还存在任选的缓冲液或培养基储库。在图6E中示出的TFF装置6000配置中，6044是TFF装置6000的顶部或盖，具有三个端口6046，其中存在设置在最右侧的端口6046中的移液器吸头6048。TFF装置6000的顶部6044邻近合二为一的储库和上部构件结构6050并且在操作中与之耦合。合二为一的储库和上部构件结构6050包括邻近TFF装置的顶部或盖6044的顶表面、包括TFF装置的上部构件6022的底表面，其中TFF装置的上部构件6022限定了设置在合二为一的储库和上部构件结构6050的上部构件6022的底表面上的流动通道(未示出)的上部分。此外，合二为一的储库和上部构件结构6050包括两个渗余物储库6080和任选的缓冲液或培养基储库6082。渗余物储库与流动通道的上部分流体地耦合，并且缓冲液或培养基储库与渗余物储库流体地耦合。在TFF装置6000的该组装视图中还可见膜6024、下部构件6020，如先前描述，下部构件6020在其顶表面上包括切向流通道的下部分(未示出)，其中上部构件6022和下部构件6020(在该视图中均未示出)的通道结构配合形成单个流动通道。在下部构件6020下方并邻近下部构件6020的是密封垫6040，密封垫6040介于下部构件6020和任选的滤液(或渗透物)储库6042之间。滤液储库6042与流动通道的下部分流体连接，作为用于从细胞培养物中去除的滤液或渗透物的容器。在操作中，顶部6044、合二为一的储库和上部构件结构6050、膜6024、下部构件6020、密封垫6040和滤液储库6042耦合并固定在一起，成为液密性和气密性的。组装的TFF装置1100通常是4cm至25cm高，或5cm至20cm高，或7cm至15cm高；5cm至30cm长，或8cm至25cm长，或10cm至20cm长；并且3cm至15cm深，或5cm至10cm深。示例性TFF装置是11cm高、12cm长，和8cm深。渗余物储库、缓冲液或培养基储库和切向流通道形成结构可以被配置成冷却至4℃，用于细胞维持。以上叙述的蛇形通道的尺寸以及过滤器和TFF装置的规格和材料适用于图6E-图6I中示出的装置的实施方案。在包括本实施方案的实施方案中，可以生长和/或过滤多达120mL的细胞培养物，或者可以生长和/或过滤多达100mL、90mL、80mL、70mL、60mL、50mL、40mL、30mL或20mL的细胞培养物。

图6F描绘了TFF装置6000的分解透视图。在该配置中，6044是TFF装置6000的顶部或盖，具有三个端口6046，其中存在设置在最左侧的端口6046中的移液器吸头6048。在操作中，TFF装置6000的顶部6044与合二为一的储库和上部构件结构6050耦合。合二为一的储库和上部构件结构6050包括在操作中邻近TFF装置的顶部或盖6044的顶表面、包括TFF装置的上部构件6022的底表面，其中TFF装置的上部构件6022限定了切向流通道(未示出)的上部分。合二为一的储库和上部构件结构6050包括两个渗余物储库6080和任选的缓冲液或培养基储库6082。渗余物储库与流动通道的上部分流体地耦合，并且任选的缓冲液或培养基储库与渗余物储库流体地耦合。在TFF装置6000的分解视图中还可见下部构件6020，如先前描述的，该下部构件6020在其顶表面上包括切向流通道6002b的下部分(在下部构件6020的顶表面上可见)，其中，上部构件6022和下部构件6020的通道结构的上部分和下部分在耦合时分别配合形成单个流动通道(在操作中介于上部构件6022和下部构件6020之间的膜未示出)。在下部构件6020下方的是密封垫6040，密封垫6040在操作中介于下部构件6020和滤液(或渗透物)储库6042之间。在操作中，顶部6044、合二为一的储库和上部构件结构6050、膜(未示出)、下部构件6020、密封垫6040和滤液储库6042耦合并固定在一起，成为液密性和气密性的。在图6F中，示出了可以用于将多种结构(顶部6044、合二为一的储库和上部构件结构6050、膜(未示出)、下部构件6020、密封垫6040和滤液储库6042)耦合在一起的紧固件。然而，作为螺栓或其他类似紧固件的替代物，TFF装置6000的多种结构可以使用粘合剂来耦合，诸如压敏粘合剂；超声波焊接；或溶剂粘接。此外，可以采用紧固件、粘合剂和/或焊接类型的组合来耦合TFF装置的多种结构。鉴于本公开内容的指导，本领域普通技术人员可以找到用于耦合TFF装置6000的组件的其他配置，诸如夹具、配合配件和这样的其他紧固件。

图6G描绘了合二为一的储库和上部构件结构6050，包括两个渗余物储库6080和任选的缓冲液或培养基储库6082，以及设置在合二为一的储库和上部构件结构6050的底部上的上部构件6020。TFF装置的上部构件6022限定切向流通道(未示出)的上部分，该切向流通道设置在合二为一的储库和上部构件结构6050的底表面上。图6H是合二为一的储库和上部构件结构6050的上表面的自上而下的视图，描绘了渗余物储库6080和缓冲液或培养基储库6082以及流体或真空端口6046的顶部。渗余物储库与流动通道的上部分流体地耦合，并且缓冲液或培养基储库与渗余物储库流体地耦合。图6I是合二为一的储库和上部构件结构6050的下表面的自下而上的视图，示出了上部构件6020，其中切向流通道6002a的上部分设置在上部构件6020的底表面上。在操作中，设置在上部构件6020的底表面上的流动通道6002a与设置在下部构件的顶表面上的切向流通道的底部分配合(在该视图中未示出，但是参见图6F)，其中流动通道结构的上部分和下部分配合形成单个流动通道。

作为以上描述的TFF模块的替代物，可以采用包括中空过滤器的细胞浓缩模块。适用于在本发明中使用的过滤器的实例包括膜过滤器、陶瓷过滤器和金属过滤器。过滤器可以以任何形状使用；过滤器例如可以是圆柱形的或者基本上是平坦的。优选地，使用的过滤器是膜过滤器，优选中空纤维过滤器。术语“中空纤维”意指管式膜。管的内径是至少0.1mm，更优选地至少0.5mm，最优选地至少0.75mm，并且管的内径优选地是至多10mm，更优选地至多6mm，最优选地至多1mm。包含中空纤维的过滤器模块从多家公司商购可得，包括G.E.LifeSciences(Marlborough,MA)和InnovaPrep(Drexel,MO)。可以用于、修改或改适用于在本方法和系统中使用的中空纤维过滤系统的具体实例包括但不限于美国专利第9,738,918号；第9,593,359号；第9,574,977号；第9,534,989号；第9,446,354号；第9,295,824号；第8,956,880号；第8,758,623号；第8,726,744号；第8,677,839号；第8,677,840号；第8,584,536号；第8,584,535号；和第8,110,112号。

本公开内容的自动化多模块细胞编辑仪器的某些实施方案任选地包括核酸组装模块。核酸组装模块被配置成接受和组装促进期望的基因组编辑事件所需的核酸。通常，术语“载体”是指能够将与其相连的期望的核酸转运到细胞中的核酸分子。载体包括但不限于为单链、双链或部分双链的核酸分子；包含一个或更多个游离末端、没有游离末端(例如环状)的核酸分子；包含DNA、RNA或两者的核酸分子；以及本领域已知的其他多种多核苷酸。一种类型的载体是“质粒”，质粒是指可以诸如通过标准分子克隆技术将另外的DNA区段插入其中的环状双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体，其中来源于病毒的DNA或RNA序列存在于载体中用于包装成病毒(例如，逆转录病毒、复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒、复制缺陷型腺病毒、和腺病毒相关病毒)。病毒载体还包含用于转染到宿主细胞中的由病毒携带的多核苷酸。某些载体能够在它们被引入的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其他载体(例如，非附加型哺乳动物载体)在引入宿主细胞中后整合到宿主细胞的基因组中，并且从而与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与它们可操作地连接的基因的表达。这样的载体在本文中被称为“表达载体”或“编辑载体”。在重组DNA技术中具有实用性的常见表达栽体通常呈质粒的形式。另外的载体包括F粘粒、噬菌粒和合成染色体。

重组表达载体可以包含呈适于在宿主细胞中转录核酸，并且对于一些核酸序列，翻译和表达核酸的形式的核酸，这意味着重组表达载体包含一个或更多个调控元件，所述调控元件可以基于待被用于表达的宿主细胞来选择，所述调控元件被可操作地连接至待被表达的核酸序列。在重组表达载体中，“可操作地连接”意在意指感兴趣的核苷酸序列以以下方式连接至一个或更多个调控元件：允许核苷酸序列的转录，并且对于一些核酸序列，允许核苷酸序列的翻译和表达(例如，在体外转录/翻译系统中，或者当载体被引入宿主细胞中时在宿主细胞中)。适当的重组和克隆方法已在美国公布第2004/0171156号中公开，其内容出于所有目的通过引用整体并入本文。

在一些实施方案中，调控元件被可操作地连接至可靶向核酸酶系统的一个或更多个元件，以驱动可靶向核酸酶系统的一个或更多个组分的转录，并且对于一些核酸序列，驱动可靶向核酸酶系统的一个或更多个组分的翻译和表达。

此外，编码核酸指导的核酸酶的多核苷酸序列可以针对特定细胞诸如原核细胞或真核细胞中的表达被密码子优化。真核细胞可以是酵母、真菌、藻类、植物、动物或人类的细胞。真核细胞可以是特定生物体的细胞或来源于特定生物体的细胞，所述特定生物体诸如哺乳动物，包括但不限于人类、小鼠、大鼠、兔、犬或非人类哺乳动物，包括非人类灵长类动物。此外或可选地，载体可以包括可操作地连接至当被转录时形成指导RNA的多核苷酸序列的调控元件。

核酸组装模块可以被配置成以自动化方式进行许多种不同的核酸组装技术。可以在所公开的自动化多模块细胞编辑仪器的核酸组装模块中进行的核酸组装技术包括但不限于使用限制性内切核酸酶的那些组装方法，包括PCR、BioBrick组装(美国专利第9,361,427号)、IIS型克隆(例如，GoldenGate组装，欧洲专利申请公布EP 2 395 087 A1)和连接酶循环反应(de Kok,ACS Synth Biol.,3(2):97-106(2014)；Engler，等人，PLoS One，3(11):e3647(2008)；和美国专利第6,143,527号)。在其他实施方案中，由所公开的自动化多模块细胞编辑仪器进行的核酸组装技术基于核酸的邻近部分之间的重叠，诸如Gibson

核酸组装模块根据自动化多模块细胞编辑仪器中使用的核酸组装类型进行温度控制。例如，当在核酸组装模块中使用PCR时，该模块包括热循环能力，允许温度在变性、退火和延伸步骤之间循环。当在核酸组装模块中使用单温度组装方法(例如等温组装方法)时，该模块提供达到并保持在优化所进行的特定组装过程的温度的能力。这些温度和维持这些温度的持续时间可以通过由脚本执行的一组预编程的参数确定，或者由使用者使用自动化多模块细胞编辑仪器的处理系统手动控制。

在一种实施方案中，核酸组装模块是使用单一等温反应进行组装的模块。某些等温组装方法可以基于序列同一性同时组合多达15个核酸片段。在一些实施方案中，组装方法提供待组装的核酸，所述核酸包括与邻近核酸片段约20-40个碱基的重叠。片段与三种酶(外切核酸酶、聚合酶和连接酶)的混合物连同缓冲液组分混合。因为过程是等温的，并且可以使用单个反应容器以1步或2步法进行，等温组装反应非常适合在自动化多模块细胞编辑仪器中使用。1步法允许使用1步等温过程组装多达五个不同的片段。将片段和酶的主混合物组合，并且在50℃孵育多达1小时。为了产生具有多达15个片段的更复杂的构建体或为了掺入100bp至多达10kb的片段，通常使用2步，其中2步反应需要两次分开添加主混合物；一次用于外切核酸酶和退火步骤，并且第二次用于聚合酶和连接步骤。

除了用于细胞生长、细胞浓缩和核酸组装的模块之外，图7A-图7E描绘了可以包括在细胞生长/浓缩/转化仪器中的细胞转化模块(在这种情况下，流通式电穿孔装置)的一种实施方案的变化。图7A和图7B分别是六个共连接的流通式电穿孔装置750的顶透视图和底透视图。图7A描绘了布置在单个基底756上的六个流通式电穿孔单元750。六个流通式电穿孔单元750各自具有限定细胞样品入口的孔752和限定细胞样品出口的孔754。图7B是图7A的六个共连接的流通式电穿孔装置的底透视图，还描绘了布置在单个基底4156上的六个流通式电穿孔单元750。可见六个入口孔4152，每个流通式电穿孔单元750一个入口孔，并且可见一个出口孔754(最左侧的流通式电穿孔单元750的出口孔)。在图7B中还可见入口702、出口704、流动通道706和两个电极708，电极708在每个流通式电穿孔单元750的流动通道706中的收缩部分的两侧。在制造了六个流通式电穿孔单元750后，它们可以彼此分开(例如，“快速分开(snapped apart)”)并且一次使用一个，或者可选地在实施方案中，两个或更多个流通式电穿孔单元750可以不分开地并行使用。

流通式电穿孔装置实现具有低毒性的高效细胞电穿孔。本公开内容的流通式电穿孔装置允许特别地容易与机器人液体操作仪器成一体，该机器人液体操作仪器通常用于自动化系统，诸如空气置换移液器。这样的自动化仪器包括但不限于来自Tecan(Mannedorf,Switzerland)、Hamilton(Reno,NV)、Beckman Coulter(Fort Collins,CO)等的现成的自动化液体操作系统。

通常来说，微流电穿孔使用小于约10ml和低至1μl的细胞悬液体积，与小型电穿孔装置相比，允许对转染或转化过程更精确的控制，并且允许灵活地与其他细胞处理工具成一体。因此，微流电穿孔为例如单细胞转化、加工和分析；多单元电穿孔装置配置；以及成一体的、自动的、多模块的细胞处理和分析提供了独特的优点。

在本公开内容的流通式电穿孔装置的特定实施方案中，转化的毒性水平产生电穿孔后大于10％的存活细胞，优选地转化后大于15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、70％、75％、80％、85％、90％或甚至95％的存活细胞，这取决于细胞类型和引入细胞的核酸。

关于图7A-图7E描述的流通式电穿孔装置包括具有电穿孔室的壳体、第一电极和第二电极，第一电极和第二电极被配置成与电脉冲发生器接合，电接触通过电脉冲发生器与电穿孔装置的电极接合。在某些实施方案中，电穿孔装置是可高压灭菌的和/或一次性的，并且可以与试剂一起包装在试剂筒中。电穿孔装置可以被配置成电穿孔1μl至2ml、10μl至1ml、25μl至750μl，或50μl至500μl之间的细胞样品体积。可以用本文公开的电穿孔装置进行电穿孔的细胞包括哺乳动物细胞(包括人类细胞)、植物细胞、酵母、其他真核细胞、细菌、古细菌和其他细胞类型。

在一种示例性实施方案中，图7C描绘了流通式电穿孔装置750的顶视图，该流通式电穿孔装置750具有用于引入细胞和待电穿孔到细胞中的外源试剂(“细胞样品”)的入口702和用于电穿孔后的细胞样品的出口704。电极708通过装置中的电极通道(未示出)引入。图7D示出了从流通式电穿孔装置750的顶部的剖视图，其中入口702、出口704和电极708相对于流动通道706中的收缩部定位。图7E中的流通式电穿孔装置750的底部分的侧面剖视图图示了该实施方案中的电极708被定位于电极通道710中并且垂直于流动通道706，使得细胞样品从入口通道712通过流动通道706流到出口通道714，并且在该过程中，细胞样品流入电极通道710中以与电极708接触。在这方面，入口通道、出口通道和电极通道都源自装置的顶部平面侧；然而，图7C-图7E中描绘的流通式电穿孔结构仅是可用于本文描述的试剂筒的一种结构。另外的电极结构在以下中描述：例如，2018年9月24日提交的美国系列第16/147,120号；2018年9月30日提交的美国系列第16/147,865号；和2018年9月30日提交的美国系列第16/147,871号。

一个任选的方面提供了用于核酸指导的核酸酶基因组编辑的自动化模块和仪器，所述自动化模块和仪器对其基因组已经被正确编辑的细胞实施富集技术。富集模块实施使用细胞单个化和标准化的方法，以降低编辑的和未编辑的细胞之间的生长竞争。单个化克服了来自未编辑的细胞或包含赋予生长优点或缺点的编辑的细胞的生长偏倚(growthbias)。方法、模块和仪器可以应用于所有细胞类型，包括古细菌、原核细胞和真核(例如酵母、真菌、植物和动物)细胞。

细胞集落的单个化、任选的诱导编辑和标准化导致在鉴定编辑的细胞方面比现有技术方法增加2-250×、10-225×、25-200×、40-175×、50-150×、60-100×或5-100×，并且提供了用于产生包含基因组文库的排列或汇集的编辑的细胞的新方法。此外，可以利用方法、模块和仪器来产生迭代编辑系统，以产生组合文库，鉴定罕见的细胞编辑，并且使高通量富集应用能够鉴定编辑活动。

本文描述的组合物和方法改进了核酸指导的核酸酶编辑系统，其中使用核酸指导的核酸酶(例如，RNA指导的核酸酶)来编辑生物体的基因组中的特定靶区域。图8A描绘了固体壁装置850和用于在固体壁装置中的微孔中使细胞单个化的工作流程，其中在该工作流程中，gRNA和核酸酶之一或二者处于诱导型启动子的控制下。在图的(i)的左上方，描绘了具有微孔852的固体壁装置850。基底850的部分854在(ii)示出，还描绘了微孔852。在(iii)，示出了固体壁装置850的侧截面，并且已经装载了微孔852，其中在该实施方案中已经发生了泊松装载(poisson loading)；即，每个微孔具有一个细胞或不具有细胞，并且任何一个微孔具有多于一个细胞的可能性低。在(iv)，图示出了工作流程840，其中具有微孔852的基底850显示出每个微孔具有一个细胞的微孔856、微孔中没有细胞的微孔857以及微孔中具有两个细胞的一个微孔260。在步骤851中，允许微孔中的细胞倍增约2-50倍以形成克隆集落(v)，然后通过加热基底(例如，用于温度诱导的编辑)或使化学物质在基底下方或上方流动(例如，用于化学诱导的编辑的糖、抗生素)或通过将固体壁装置移动至不同的培养基来诱导853编辑；如果固体壁装置放置在形成微孔852的底部的液体可渗透膜上，则特别地容易。在诱导编辑853后，已经被编辑的细胞集落中的许多细胞由于由有效编辑引起的双链切割而死亡，并且对于确实存活但必须在编辑后修复和恢复的编辑的细胞可能存在生长延滞(微孔858)，其中不经历编辑的细胞茁壮成长(微孔859)(vi)。允许所有细胞生长以继续建立集落并且标准化，其中微孔858中编辑的细胞的集落在尺寸和/或细胞数方面赶上微孔859中的细胞，当未编辑的细胞达到稳定期时，由于细胞衰老，微孔859中的细胞没有经历编辑(vii)。在细胞集落被标准化后，微孔中所有细胞的任意汇集就可以发生，在这种情况下，通过消除来自非编辑细胞和来自编辑的适应度效应的偏倚，针对编辑的细胞富集细胞；可选地，在编辑后监测微孔中的集落生长，并且鉴定和选择(例如“择优选取(cherrypicked)”)生长缓慢的集落(例如微孔858中的细胞)，产生甚至更为富集的编辑的细胞。

在使细胞生长时，所使用的培养基当然取决于被编辑的细胞类型例如细菌、酵母或哺乳动物。例如，用于细菌生长的培养基包括LB、SOC、M9基本培养基和Magic培养基；用于酵母细胞生长的培养基包括TPD、YPG、YPAD和合成基本培养基；并且用于哺乳动物细胞生长的培养基包括MEM、DMEM、IMDM、RPMI和Hanks。

图8B是包括用于使细胞单个化的微孔的固体壁装置的一种实施方案的照片。如从照片可见的，固体壁装置的直径是约2英寸(～47mm)。这张照片中所见的固体装置基本上是不锈钢的穿孔盘816，其中穿孔形成微孔的壁，并且过滤器或膜用于形成微孔的底部。使用过滤器或膜(诸如0.22μPVDF Duropore

在图8B中示出的照片中，穿孔直径是约152nM，导致微孔具有约2.5nL的体积，共计约30,000个孔。微孔之间的距离是中心至中心约279nM。虽然此处微孔具有约2.5nL的体积，但微孔的体积可以是1nL至25nL，或优选地2nL至10nL，并且甚至更优选地2nL至4nL。优选的微孔尺寸/体积取决于细胞类型(例如，细菌、酵母、哺乳动物)。此处显示的穿孔盘由316不锈钢制成；然而，可以使用其他生物相容的金属和材料。固体壁装置可以是一次性的或者其可以是可重复使用的。图8B中示出的固体壁装置是圆形的，但是可以是任何形状，例如方形、矩形、卵形等。如果使用皮氏皿经由固体培养基向固体壁装置提供营养物，圆形固体壁装置是有用的。用于形成固体壁装置的孔的底部的过滤器包括0.22μPVDF Duropore

图8C-图8E分别是大肠杆菌细胞在低、中和高放大倍数的照片，所述大肠杆菌细胞在具有膜底部的固体壁装置中的微孔中经由泊松分布单个化。图8C示出了在低放大倍数的数字生长，其中较暗的微孔是细胞生长的微孔。图8D是固体壁装置中微孔的顶视图，其中较暗的微孔是细胞生长的微孔。图8E是微孔的照片，其中膜(例如，形成微孔的底部的可渗透膜)已经被移除，其中未图案化(光滑)的微孔是细胞不生长的微孔，并且具有不规则颜色/图案化的微孔是细胞生长的微孔，并且在该照片中，细胞已经填充了它们生长的微孔。在这些照片中，0.2μm的过滤器(膜)被压在穿孔金属壁装置上，诸如图8B中描绘的圆形固体壁装置上。穿孔金属固体壁装置形成微孔的壁，并且0.2μm过滤器形成微孔的底部。为了装载固体壁装置，使用真空将大肠杆菌细胞拉入微孔中。然后将固体壁装置+过滤器面朝下放置在LB琼脂板膜上，并且使细胞在30℃生长过夜，然后在室温生长两天。移除膜，并且通过光学显微术拍摄无底微孔。注意可以容易用不同的选择性培养基选择某些细胞表型；即，仅需要将固体壁装置+过滤器转移至包含期望的选择性培养基的不同板或皮氏皿中，或者使期望的选择性培养基流入固体壁装置和耦合膜位于其上的基底中。

除了关于图8A-图8E描述的固体壁细胞单个化装置之外，其他细胞单个化装置也可以用于多模块细胞处理仪器中，诸如在2018年9月24日提交的题为“Detection ofNuclease Edited Sequences in Automated Modules and Systems”的美国系列第62/735,365号和2018年12月18日提交的题为“Improved Detection of Nuclease EditedSequences in Automated Modules and Systems”的美国系列第62/781,112号中描述的那些，包括通过在琼脂上铺板单个化、通过分离官能化岛(functionalized island)上的细胞单个化、在疏水载体液体中携带的水滴内单个化，或在聚合藻酸盐支架(polymerizedalginate scaffold)内单个化(对于单个化的该实施方案，还参见2018年11月20日提交的题为“Improved Detection of Nuclease Edited Sequences in Automated Modules andInstruments via Bulk Cell Culture”的美国系列第62/769,805号。

作为单个化的替代方法，可以采用经由在细胞生长周期的特定时间驱动gRNA和核酸酶之一或二者的诱导型启动子诱导编辑。图8F示出了用于富集编辑的细胞的示例性方法8000的简化流程图。观察图8F，方法8000开始于设计和合成编辑盒8002。如以上关于核酸指导的编辑描述的，每个编辑盒通常包含gRNA、供体DNA和PAM或间隔物突变。在合成单独编辑盒后，单独编辑盒可以被“连接”或“组装”在一起，并且被扩增和组装成编辑载体骨架8004。然后使用包含编辑盒的编辑载体来转化细胞8006，从而产生转化的细胞文库。除了包含组装的编辑盒的载体之外，可以用包含核酸酶编码序列的单独的工程载体同时转化细胞。可选地，细胞可能已经表达核酸酶(例如，细胞可能已经用工程载体转化，或者核酸酶的编码序列可以稳定地整合到细胞基因组中)，使得仅需要将编辑载体转化到细胞中；或者可以用包含进行核酸指导的核酸酶基因组编辑所需的所有组分(例如，所有的核酸酶和编辑盒)的单一载体转化细胞，这在采用处治(curing)和递归轮编辑时是有利的。

可以使用多种递送系统将核酸指导的核酸酶编辑系统组分引入(例如，转化或转染)宿主细胞8008。这些递送系统包括酵母系统、脂质体转染系统、显微注射系统、基因枪系统、病毒微体(virosome)、脂质体、免疫脂质体、聚阳离子、脂质:核酸缀合物、病毒粒子(virion)、人工病毒粒子、病毒载体、电穿孔、细胞可渗透肽、纳米粒子、纳米线、外泌体(exosome)的使用。可选地，可以使用分子特洛伊木马(trojan horse)脂质体跨越血脑屏障递送核酸指导的核酸酶组分。特别感兴趣的是电穿孔的使用，特别地流通式电穿孔(作为独立的仪器或作为自动化多模块系统中的模块)的使用，如以下中描述的：例如2018年6月30日提交的美国系列第16/024,831号；2018年6月30日提交的美国系列第16/024,816号；2018年9月28日提交的美国系列第16/147,353号；2018年9月30日提交美国系列第16/147,865号；和2018年6月30日提交的美国系列第16/147,871号。如果筛选/选择模块是自动化多模块细胞编辑系统中的一个模块，细胞可能在自动化细胞转化模块中被转化。

在转化8006后，细胞可以然后经历使用可选择标记的选择8008。采用可选择标记选择已经接收工程载体和编辑载体二者的细胞或者已经用单个合二为一的工程和编辑载体转化的细胞。常用的可选择标记包括可药物选择的标记，诸如氨苄青霉素/羧苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、红霉素、四环素、庆大霉素、博莱霉素、链霉素、鼠李糖、嘌呤霉素、潮霉素、杀稻瘟素和G418。

在已经被正确转化的细胞被选择8008后，方法8000中的下一步是使细胞在液体培养基中生长，直至细胞进入(或接近进入)生长的稳定期。在细胞处于稳定期(或接近稳定期)8010后，通过诱导核酸酶和gRNA之一或二者的转录，在细胞中诱导编辑8012。在编辑被诱导8012后，细胞可以生长、赋予电感受态，并且经历另一轮编辑8014。

图8G描绘了培养物中细胞的典型生长曲线8020(光密度对比时间)。最初存在延滞期8022，然后细胞进入对数期8024，在对数期它们快速生长，并且最后细胞到达稳定期8028，在稳定期细胞不再分裂。本发明的方法采用在时间点8026或之后当细胞处于生长稳定期或接近稳定期时，诱导核酸酶和/或gRNA酶之一或二者的转录；即，细胞在至少60％进入对数生长期，或至少65％进入对数生长期，或至少70％进入对数生长期，或至少71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、79％、98％或99％进入对数生长期的时间点被诱导，以及在生长稳定期期间的任何时间被诱导。

图8H描绘了用于进行核酸指导的核酸酶基因组编辑的示例性方案8050。图8H描绘了图8F中示出的用于编辑细胞的方案。首先，将编辑载体8052(编辑载体各自包含编辑盒)的文库或集合引入8053(例如，电穿孔到)培养的细胞8054中，所述细胞8054包含核酸酶的编码序列，所述核酸酶的编码序列在组成型或诱导型启动子(优选地，诱导型启动子)的控制下，所述核苷酸的编码序列包含1)在已经转化到细胞中的“工程质粒”上(最常与可选择标记一起)；2)整合到被转化细胞的基因组中；或者3)核酸酶的编码序列可以位于编辑载体上。编辑载体8052包含供体DNA、PAM或间隔物改变序列(最常见的是在基因组中靶位点处使PAM失去作用的序列)、在诱导型启动子控制下的gRNA编码序列，和可选择标记。

在步骤8059，细胞生长直至它们达到稳定期，或接近稳定期。在细胞达到稳定期后，编辑被诱导8067(例如，其中核酸酶、gRNA或二者的转录被诱导)，并且培养物8082中的细胞被编辑并然后允许从编辑中恢复。在恢复后，可以将细胞铺板8069、生长和汇集8084。可选地，可以将来自培养物8082的细胞铺板8081，并且选择生长缓慢的集落8086，从而择优选取编辑的集落。在又另一替代方案中，细胞可以保留在液体培养物中，生长至适当的OD，赋予电感受态，并且经历另一轮编辑8088。因为这种富集编辑的细胞的方法可以以高通量的方式进行并且不需要将细胞铺板并且是可自动的，所以这种富集编辑的细胞的方法是特别期望的。在步骤8067的诱导可以通过例如使用pL启动子系统发生，其中pL启动子通过将培养基中细胞的温度升高至42℃持续例如1小时至许多小时来诱导，以诱导核酸酶和gRNA的表达用于切割和编辑。在编辑被诱导后，培养物8082的温度返回至30℃

在一种方法8081中，将来自大量液体培养物的细胞铺板并且选择生长缓慢的集落8086。在编辑的细胞中，细胞存活力在诱导编辑后的时间段受损。图8H中示出的选择方法(例如，选择生长缓慢的集落8081)利用编辑的细胞集落的生长延滞来鉴定编辑的细胞。在一些实施方案中，编辑的细胞的集落尺寸比未编辑的细胞的集落小20％。在一些方面，编辑的细胞的集落尺寸比未编辑的细胞的集落小30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。在许多实施方案中，编辑的细胞的集落尺寸比未编辑的细胞的集落小30％-80％，并且在一些实施方案中，编辑的细胞的集落尺寸比未编辑的细胞的集落小40％-70％。

图9A描绘了包括一组18个管或瓶940的试剂筒922。在一些实施方案中，一个或更多个管或瓶940用可刺穿的箔密封，以供自动化液体操作系统(诸如吸管或移液器)访问。在其他实施方案中，一个或更多个管或小瓶可以包括可密封访问的密封垫。在一些实施方案中，每个小管或瓶的顶部标记有机器可读标记(未示出)，用于自动化鉴定内容物。机器可读标记可以包括条形码、QR码或其他机器可读编码。用于鉴定特定容器的其他自动化手段可以包括颜色编码、符号识别(例如，文本、图像、图标等)，和/或形状识别(例如，容器的相对形状)。在一些实施方案中，筒体和/或筒盖的上表面可以包含用于鉴定内容物的机器可读标记，而不是标记在容器本身上。小管或瓶可以各自具有相同的尺寸。可选地，可以在试剂筒922中提供多种体积的管或瓶。在说明性实例中，每个管或瓶可以被设计成容纳2mL和20mL之间、4mL和10mL之间，或约5mL。在仅需要小体积的一些试剂的一些实施方案中，可以使用管插入件(tube insert)来将小(例如，微量离心)管容纳在较大的容器(未示出)中。

在说明性实例中，管或瓶可以各自容纳以下材料之一：载体骨架、寡核苷酸、用于核酸组装的试剂、使用者提供的细胞样品、诱导剂、缓冲液中的磁珠、乙醇、用于细胞选择的抗生素、用于洗脱细胞和核酸的试剂、油覆盖层(oil overlay)、其他试剂，以及细胞生长和/或恢复培养基。此外，细胞转化模块，诸如以上描述的流通式电穿孔装置，任选地可以是试剂筒的一部分。

在一些实施方式中，如图9B中示的盖924将管或瓶940固定在图9A的筒体922内。转到图9B，盖924可以包括用于访问每个小管或瓶940的孔。三个大孔932用粗实线标出，以指示添加使用者提供的材料的位置。例如，使用者提供的材料可以包括载体骨架、寡核苷酸和细胞样品。此外，盖924可以包括机器可读标记930，用于鉴定筒的类型(例如，访问筒内容物地图)。可选地，每个孔可以用单独内容物分开标记。在一些实施方式中，为了确保使用者提供的材料的定位，在实验室环境中提供用于填充的瓶或管可以具有独特的形状或尺寸，使得细胞样品瓶或管仅适合细胞样品孔，寡核苷酸瓶或管仅适合寡核苷酸孔，等等。

图10是使用自动化多模块细胞编辑仪器诸如图4A-图4D中图示的系统的示例性方法1000的流程图。例如，处理系统指导方法1000的处理阶段。例如，软件脚本可以识别用于每个处理阶段的设置和用于移动机器人操作系统以进行方法1000的动作的指令。在一些实施方案中，软件指令脚本可以由提供至自动化多模块细胞编辑仪器的筒来识别。例如，筒可以包括机器可读标记，诸如条形码或QR码，包括存储在自动化多模块细胞编辑仪器的存储器中的脚本的标识。在另一实例中，筒可以包含嵌入在机器可读标记诸如射频(RF)标签中的可下载脚本。在其他实施方案中，使用者可以识别脚本，例如通过经由有线或无线连接将脚本下载至自动化多模块细胞编辑仪器的处理系统，或者通过自动化多模块细胞编辑仪器的使用者界面选择存储的脚本。在特定实例中，自动化多模块细胞编辑仪器可以包括用于提交使用者设置和启动细胞处理的触摸屏界面。

在一些实施方式中，方法1000开始于将细胞转移至细胞生长模块(1002)。生长模块可以是可适于自动化的任何生长模块，诸如，例如，关于图5B-图5D描述的细胞生长模块550。在特定实例中，处理系统可以指导机器人操作系统将细胞转移至生长模块。在另一实例中，细胞可以通过机器人操作系统从一个试剂筒转移至生长模块。在一些实施方案中，生长瓶可以包含生长培养基，并且例如作为套件的一部分来提供。在其他实施方案中，生长瓶可以填充有例如通过液体操作装置从试剂容器转移的培养基。

在一些实施方案中，在转移细胞(例如，从试剂筒或从添加至仪器的瓶)前，可以在位于为细胞指定的位置的瓶或其他容器上扫描机器可读标记，以确认瓶或容器被标记为包含细胞。此外，机器可读标记可以指示提供至仪器的细胞类型。在一些实施方案中，细胞的类型可以引起仪器选择特定处理脚本(例如，用于机器人操作系统以及多种模块的设置和启动的一系列指令)。

在一些实施方式中，细胞在生长模块中生长至期望的光密度(1004)。例如，处理系统可以管理生长模块的温度设置，用于在生长周期期间孵育细胞。处理系统还可以从生长模块接收指示光密度的传感器信号，并且分析传感器信号以监控细胞的生长。在一些实施方案中，使用者可以设置用于管理细胞生长的生长参数。例如，温度和细胞的搅动程度。此外，在一些实施方案中，可以向使用者更新关于生长过程的信息。在一些实例中，更新可以包括在自动化多模块细胞编辑仪器的使用者界面上呈现的消息、至使用者手机号码的文本消息、至电子邮件账户的电子邮件消息、或者传输至在便携式电子装置(例如，手机、平板电脑等)上执行的应用的消息。在一些实施方案中，响应于该消息，使用者可以修改参数，诸如温度，以调节细胞生长。例如，使用者可以通过自动化多模块细胞编辑仪器的使用者界面或者通过与自动化多模块细胞编辑仪器通信的便携式计算装置应用，诸如使用者界面(参见图4B的元件450)，提交更新的参数。

尽管关于光密度进行了描述，但是在其他实施方式中，生长模块内的细胞生长可以使用细胞密度和生理状态的不同测量来监测，所述不同测量诸如，在一些实例中，pH、溶解氧、释放的酶、声学特性和电学特性。

在一些实施方式中，在达到期望的光密度(1004)后，细胞从生长模块转移至过滤模块或细胞洗涤和浓缩模块(1006)。例如，机器人操作系统可以将细胞从生长模块转移至细胞浓缩模块。例如，细胞浓缩模块可以(并且通常)被设计成赋予细胞电感受态。参见以上与TFF装置有关的图6A-图6I。在过滤模块或细胞洗涤和浓缩模块中赋予细胞电感受态并洗脱(1008)。细胞可以使用洗涤溶液洗脱。例如，细胞可以使用来自试剂供应装置的试剂洗脱。

在细胞被赋予电感受态并悬浮在适当的体积中，诸如50μL至10mL，或100μL至80mL，或150μL至8mL，或250μL至7mL，或500μL至6mL，或750μL至5mL用于转化(1006)后，细胞被转移至例如FTEP模块(1018)。例如，机器人操作系统可以将细胞从过滤模块转移至FTEP。过滤模块可以与FTEP装置物理耦合，或者这些模块可以是分开的。

在一些实施方式中，将核酸在自动化多模块细胞编辑仪器之外制备。例如，使用者可以在运行方法1000中的转化过程和其他过程前将组装的载体或其他核酸组装作为试剂纳入。

然而，在其他实施方式中，将核酸通过自动化多模块细胞编辑仪器制备。在一些实施方案中，以下步骤1010至1016的一部分与步骤1002至1008的一部分并行进行。在一些实施方案中，以下步骤的至少一部分在步骤1002至1008前和/或步骤1002至1008后进行。

在一些实施方式中，核酸诸如编辑寡核苷酸和载体骨架，以及在一些实例中，酶和其他反应组分被转移至核酸组装模块(1010)。核酸组装模块可以被配置成以自动化方式进行许多种不同的核酸组装技术中的一种或更多种。可以在核酸组装模块中进行的核酸组装技术可以包括但不限于使用限制性内切核酸酶的那些组装方法，包括PCR、BioBrick组装、IIS型克隆、GoldenGate组装和连接酶循环反应。在其他实例中，核酸组装模块可以基于核酸的邻近部分之间的重叠进行组装技术，诸如Gibson

在一些实施方案中，在转移核酸样品、酶和其他反应组分中的每一种前，可以在位于为这些材料指定的位置的瓶或其他容器上扫描机器可读标记，以确认瓶或容器被标记为包含预期的材料。此外，机器可读标记可以指示提供至仪器的核酸样品、酶和其他反应组分中的一种或更多种的类型。在一些实施方案中，材料的类型可以引起仪器选择特定处理脚本(例如，用于机器人操作系统进一步识别材料的以及核酸组装模块的设置和启动的系列指令)。

在一些实施方案中，核酸组装模块根据使用的核酸组装的类型进行温度控制。例如，当在核酸组装模块中使用PCR时，该模块可以具有热循环能力，允许温度在变性、退火和延伸步骤之间循环。当在核酸组装模块中使用单温度组装方法时，该模块可以具有达到并保持在优化所进行的特定组装过程的温度的能力。

在一些实施方案中，温度控制由自动化多模块细胞编辑仪器的处理系统诸如处理系统管理。这些温度和维持这些温度的持续时间可以由一组预编程的参数确定(例如，在处理脚本中或在处理系统可访问的另一存储空间中识别的)，或者由使用者通过与处理系统对接来手动控制。

在一些实施方式中，在组装反应发生已经历时足够的时间后，可以将核酸组装转移至纯化模块(1014)。例如，处理系统可以基于反应类型、材料类型和提供至自动化多模块细胞编辑仪器的使用者设置中的一种或更多种来监测组装反应的定时。例如，机器人操作系统可以通过吸管或移液器接口(interface)将核酸组装转移至纯化模块。在另一实例中，机器人操作系统可以将包含核酸组装的瓶从核酸组装模块的室转移至脱盐/纯化模块的室。

在一些实施方式中，核酸组装在纯化模块脱盐和洗脱(1016)。例如，纯化模块可以去除核酸组装混合物中不需要的组分(例如，盐、矿物质等)。在一些实施方案中，纯化模块将组装的核酸浓缩成比核酸组装体积小的体积。用于核酸组装后交换液体的方法的实例包括磁珠(例如，由Carlsbad，CA的Invitrogen Corp.制造的SPRI或Dynal(Dynabead))、硅珠、硅旋转柱、玻璃珠、沉淀(例如，使用乙醇或异丙醇)、碱裂解、渗透纯化、用丁醇提取、基于膜的分离技术、过滤等。例如，可以使用装配有各向异性的、亲水产生的(hydrophilic-generated)有不同孔隙率的纤维素膜的一个或更多个微型浓缩器。在另一实例中，脱盐/纯化模块可以通过使混合物与包含不溶性磷酸盐的离子交换剂接触、去除液体并从离子交换剂中洗脱核酸来处理包含核酸和离子盐的液体样品。

在说明性实施方案中，核酸组装可以在纯化模块的室中与磁珠诸如SPRI珠结合。核酸组装可以在设定温度孵育足够长的时间，以使组装的核酸与磁珠结合。孵育后，磁体可以接合在室附近，使得核酸组装可以被洗涤和洗脱。在核酸组装被洗脱后，将核酸组装转移至转化模块(1018)。例如，机器人操作系统可以通过如以上描述的FTEP的吸管或吸移器接口将组装的核酸转移至转化模块。例如，在转移期间，脱盐的组装的核酸可以与来自步骤108的电感受态细胞组合。在其他实施方案中，转化模块可以分开接受电感受态细胞和核酸组装的每一种，并且能够混合(例如，打开一个或更多个通道以在共享室中组合材料)。

细胞在FTEP模块中被转化(1020)。可以将缓冲液或培养基转移至转化模块并且添加至细胞，使得细胞可以悬浮在有利于电穿孔期间细胞存活的缓冲液或培养基中。在转移缓冲液或培养基前，可以在位于为缓冲液或培养基指定的位置的瓶或其他容器或储库上扫描机器可读标记，以确认瓶、容器或储库的内容物。此外，机器可读标记可以指示提供至仪器的缓冲液或培养基的类型。在一些实施方案中，缓冲液或培养基的类型可以引起仪器选择特定处理脚本(例如，适于特定缓冲液或培养基的转化模块的设置和启动)。对于细菌细胞电穿孔，可以使用低电导介质诸如水或甘油溶液降低瞬时高电流产生的热量。对于酵母细胞，可以使用山梨醇溶液。对于哺乳动物细胞电穿孔，可以将细胞悬浮在高导电性介质或缓冲液中，诸如MEM、DMEM、IMDM、RPMI、Hanks溶液、PBS、HBSS、HeBS和林格液。在特定实例中，机器人操作系统可以将缓冲液溶液从试剂筒转移至FTEP模块。如关于图7A-图7E描述的，FTEP装置可以是一次性FTEP装置和/或FTEP装置可以作为试剂筒的一部分提供。可选地，如图4A中示出的，FTEP装置可以是分开的模块。

在转化后，细胞被转移至第二生长/恢复/编辑模块(1022)，诸如关于图5A-图5D描述的细胞生长模块。例如，机器人操作系统可以通过吸管或移液器接口将转化的细胞转移至第二生长模块。在另一实例中，机器人操作系统可以将包含转化的细胞的瓶从转化模块的室转移至第二生长模块的室。

在一些实施方案中，第二生长模块充当恢复模块，允许细胞从转化过程中恢复。在其他实施方案中，细胞可以在运输至第二生长模块前被提供至分开的恢复模块。在恢复期间，第二生长模块允许转化的细胞摄取，并且在某些方面，将引入的核酸整合到细胞的基因组中。第二生长模块可以被配置成在使用者定义的最适合细胞生长的任何温度，优选地在25℃、30℃或37℃孵育细胞。

在一些实施方案中，第二生长模块充当选择模块，基于抗生素或其他试剂选择转化的细胞。在一个实例中，RNA指导的核酸酶(RGN)蛋白系统用于选择，以裂解没有接受期望编辑的细胞的基因组。在抗生素选择剂的实例中，抗生素可以被添加至第二生长模块以进行选择。合适的抗生素抗性基因包括，但不限于，基因，诸如氨苄青霉素抗性基因、四环素抗性基因、卡那霉素抗性基因、新霉素抗性基因、刀豆氨酸抗性基因、杀稻瘟素抗性基因、潮霉素抗性基因、嘌呤霉素抗性基因或氯霉素抗性基因。例如，机器人操作系统可以通过吸管或移液器接口将抗生素转移至第二生长模块。在一些实施方案中，使用裂解增强剂诸如去污剂、通过低氧洗涤(hyponic wash)的渗透胁迫、温度、酶、蛋白酶、噬菌体、还原剂或离液剂来有助于去除死细胞背景。例如，处理系统可以改变环境变量，诸如温度，以诱导选择，而机器人操作系统可以递送另外的材料(例如，去污剂、酶、还原剂等)来有助于选择。在其他实施方案中，通过过滤去除细胞和/或交换培养基被用于降低死细胞背景。

在另外的实施方案中，除了应用选择或作为应用选择的替代方案，第二生长模块用作编辑模块，允许在转化的细胞中进行基因组编辑。可选地，在其他实施方案中，细胞在恢复和选择(如果进行的话)后被转移至分开的编辑模块。作为编辑模块，第二生长模块例如，通过促进引入的核酸的表达诱导细胞的基因组的编辑。核酸酶和/或编辑盒核酸的表达可以涉及化学、光、病毒或温度诱导方法中的一种或更多种。例如，第二生长模块可以被配置成在温度诱导过程期间加热或冷却细胞。在特定说明中，细胞可以通过在42℃-50℃加热来诱导。进一步说明，然后细胞可以在诱导后冷却至0℃-10℃。在化学或病毒诱导的实例中，可以将诱导剂转移至第二生长模块以诱导编辑。如果在编辑期间将诱导型核酸酶和/或编辑盒引入细胞，它可以通过引入诱导物分子来诱导。在一些实施方式中，诱导剂或诱导物分子通过机器人操作系统例如通过移液器或吸管接口转移至第二生长模块。

在一些实施方式中，如果不期望另外的细胞编辑(1024)，可以将细胞从细胞生长模块转移至存储单元，用于后续从自动化多模块细胞编辑仪器中取出(1026)。例如，机器人操作系统可以通过吸管或移液器接口将细胞转移至存储单元。在另一实例中，机器人操作系统可以将包含细胞的瓶从第二生长模块的室转移至存储单元内的瓶或管。

在一些实施方式中，如果期望另外的细胞编辑(1024)，则细胞可以被转移至相同或不同的过滤模块，并且被赋予电感受态(1008)。此外，在一些实施方案中，此时可以通过核酸组装模块制备新的组装的核酸样品，或者可选地，可以将第二完全组装的核酸直接引入细胞。在递归编辑前，在一些实施方案中，自动化多模块细胞编辑仪器可能需要由使用者提供另外的材料，例如，通过引入一个或更多个分开的试剂瓶或筒。

在第二轮编辑期间，步骤可能相同，也可能不同。例如，在一些实施方案中，在随后执行步骤1004时，选择性生长培养基被转移至生长模块，以使得能够从第一轮编辑中选择被编辑的细胞。机器人操作系统可以从位于为选择性生长培养基指定的位置的试剂筒中的瓶或容器转移选择性生长培养基。在转移选择性生长培养基前，可以在位于为选择性生长培养基指定的位置的瓶或其他容器或储库上扫描机器可读标记，以确认瓶、容器或储库的内容物。此外，机器可读标记可以指示提供至仪器的选择性生长培养基的类型。在一些实施方案中，选择性生长培养基的类型可以使仪器选择特定处理脚本(例如，适于特定选择性生长培养基的生长模块的设置和启动)。关于图13描述了递归编辑工作流程的特定实例。

在一些实施方式中，方法1000可以被定时以引入材料和/或与使用者的时间表相协调地完成编辑循环或生长循环。例如，自动化多模块细胞编辑仪器可以向使用者提供调度一个或更多个细胞处理循环(例如，一个或更多个递归编辑)的完成的能力，使得方法1000以在使用者的优选时间完成为目标来实施。例如，时间调度可以通过使用者界面来设置。仅作为说明，使用者可以将第一循环的完成设置为4:00PM，使得使用者可以向自动化多模块细胞编辑仪器提供另外的材料筒，以能够实现另一轮细胞编辑的过夜处理。因此，使用者可以对程序定时，使得可以在特定时间段(例如24小时时间段)内对两个或更多个循环编程。

在一些实施方式中，在整个方法1000中，自动化多模块细胞编辑仪器可以提醒使用者其当前状态。例如，使用者界面可以呈现处理的当前阶段的图形指示。在特定实例中，自动化多模块细胞处理仪器的正面可以覆盖有使用者界面(例如，触摸屏)，该使用者界面呈现描绘细胞处理的当前状态的动画图形。使用者界面还可以呈现与当前处理阶段相关的任何使用者和/或默认设置(例如，温度设置、时间设置等)。在某些实施方式中，状态可以经由无线通信控制器传递至使用者。

尽管图示为特定的一系列操作，但是在其他实施方案中，方法1000中可以包括更多或更少的步骤。例如，在一些实施方案中，在接合每一轮编辑前，可以对储库、筒和/或瓶的内容物进行筛选，以确认适当的材料可用于进行处理。例如，在一些实施方案中，一个或更多个成像传感器(例如，条形码扫描仪、照相机等)可以确认自动化多模块细胞编辑仪器壳体内不同位置的内容物。在一个实例中，多个成像传感器可以设置在自动化多模块细胞编辑仪器的壳体内，每个成像传感器被配置成检测一种或更多种材料(例如，机器可读标记诸如条形码或QR码、材料的形状/尺寸等)。在另一个实例中，至少一个成像传感器可以由机器人操作系统移动至多个位置，以检测一种或更多种材料。在另外的实施方案中，一个或更多个重量传感器可以检测一次性或可更换材料的存在或不存在。在说明性实例中，转移吸头供应装置保持器可以包括重量传感器，以检测吸头是否已经装载到区域中。在另一个说明性实例中，光学传感器可以检测液体废弃物的水平已经达到阈值水平，如果还没有达到处理的最小水平，则需要在继续细胞处理或添加液体前去除。在一些实施方式中，要求另外的材料、去除废弃物供应装置或其他使用者干预(例如，手动清理一个或更多个元件等)呈现在自动化多模块细胞编辑仪器的使用者图形界面上。在一些实施方式中，自动化多模块细胞编辑仪器通过例如软件应用、电子邮件或文本消息，联系使用者请求新材料或其他人工干预。

图11示出了用于使细胞单个化用于富集(1100a)和用于择优选取(1100b)的两种替代示例性方法1100a和1100b的简化流程图。观察图11，方法1100a开始于用进行核酸指导的核酸酶编辑所必需的组分转化细胞1110。例如，细胞可以用分开的工程载体和编辑载体同时转化；细胞可能已经表达核酸酶(例如，细胞可能已经用工程载体转化，或者核酸酶的编码序列可以稳定地整合到细胞基因组中)，使得仅需要将编辑载体转化到细胞中；或者细胞可以用包含进行核酸指导的核酸酶基因组编辑所需的所有组分的单个载体转化。

如以上描述的，可以使用多种递送系统将核酸指导的核酸酶编辑系统组分引入(例如，转化或转染)宿主细胞1110。这些递送系统包括酵母系统、脂质体转染系统、显微注射系统、基因枪系统、病毒微体、脂质体、免疫脂质体、聚阳离子、脂质:核酸缀合物、病毒粒子、人工病毒粒子、病毒载体、电穿孔、细胞可渗透肽、纳米粒子、纳米线、外泌体的使用。可选地，可以使用分子特洛伊木马脂质体跨越血脑屏障递送核酸指导的核酸酶成分。感兴趣的是，特别地在多模块细胞编辑仪器的情况下，电穿孔的使用，特别地流通式电穿孔(作为独立的仪器或作为自动化多模块系统中的模块)的使用，如以下中描述的：例如2018年9月28日提交的美国系列第16/147,120号；2018年9月28日提交的美国系列第16/147,353号；2018年9月30日提交的美国系列第16/147,865号；和2018年9月30日提交美国系列第16/147,871号。如果固体壁单个化/生长/编辑/标准化模块是自动化多模块细胞编辑仪器中的一个模块，则细胞可能在自动化细胞转化模块中被转化。

在将细胞用进行核酸指导的核酸酶编辑必需的组分转化后，使细胞在例如固体壁装置1120中的微孔中单个化；即，将细胞在液体培养培养基(在一些实施方案中，包含浓度为0.1％或更低的Tween，以实现良好的分布)中稀释(如果需要)，使得细胞在递送至固体壁装置时以泊松或基本泊松分布填充固体壁装置的微孔。当平均

在该实施方案中的细胞在1100a中被单个化后，细胞被有效编辑，因为编辑“机制”处于组成型启动子的控制下。当细胞编辑时，它们生长成终末尺寸的集落1130；即，从单个化的细胞产生的集落生长成细胞生长已经达到峰并且对于编辑和未编辑的细胞二者均是标准化的或饱和的点的集落。标准化发生在生长的细胞集落周围的培养基中的营养物耗尽和/或细胞生长充满微孔并且进一步的生长受到限制时。同样，在图11中示出的实施方案1100a中，编辑组分处于组成型启动子的控制下；因此，编辑在转化时立即(或几乎立即)开始。然而，在其他实施方案，诸如下文描述的1100b中示出的实施方案中，核酸酶和指导核酸中的一种或两种(以及例如细菌系统中的λred重组系统组分)可以处于诱导型启动子的控制下，在这种情况下，编辑可以在例如期望的细胞倍增倍数后被诱导。转回至方法1100a，通过从微孔中冲洗克隆细胞集落以混合来自标准化细胞集落的细胞，将终末尺寸的集落汇集1140。同样，因为单个化克服了来自未编辑的细胞或由于所做的编辑而表现出适应度作用的细胞的生长偏倚，所以单独的单个化/标准化就富集了具有已经被编辑的细胞的总细胞群体；即，单个化与标准化(例如，使集落生长成终末尺寸)组合允许对编辑的细胞进行高通量富集。

图11中示出的方法1100b类似于方法1100a，其中将感兴趣的细胞用进行核酸指导的核酸酶编辑必需的组分转化1110。如以上描述的，细胞可以用工程载体和编辑载体二者同时转化；细胞可能已经表达核酸酶(例如，细胞可能已经用工程载体转化，或者核酸酶的编码序列可以稳定地整合到细胞基因组中)，使得仅需要将编辑载体转化到细胞中；或者细胞可以用包含进行核酸指导的核酸酶基因组编辑所需的所有组分的单个载体转化。此外，如果单个化/生长/编辑/标准化固体壁模块是自动化多模块细胞编辑仪器中的一个模块，则细胞转化可以在如以上描述的自动化转化模块中进行。

在将细胞用进行核酸指导的核酸酶编辑必需的组分转化后，将细胞在液体培养基中稀释(如果需要)，使得细胞在递送至固体壁装置时以泊松或基本泊松分布填充固体壁装置的微孔。

在细胞在固体壁装置的微孔中被单个化1120后，允许细胞生长至例如2倍至150倍之间或5倍至120倍之间或10倍至100倍之间的倍增，建立克隆集落1150。在集落建立后，在该实施方案中，1100b编辑通过例如激活诱导型启动子来诱导1160，所述诱导型启动子控制核酸指导的核酸酶编辑所需的一种或更多种组分的转录，诸如，例如gRNA、核酸酶的转录，或者在细菌的情况下，重组工程系统的转录。在编辑被诱导1160后，克隆集落中许多编辑的细胞由于编辑过程期间发生的双链DNA断裂而死亡；然而，在一定比例的编辑的细胞中，基因组被编辑，并且双链断裂被正确修复。然后这些编辑的细胞开始生长并重新建立集落；然而，编辑的集落的生长趋于延滞落后于未发生编辑的克隆集落的生长。小的或生长缓慢的集落(编辑的细胞)被择优选取1170。

图12是包括用于富集编辑的细胞的固体壁单个化/生长/编辑/标准化模块的示例性自动化多模块细胞处理仪器的实施方案的简化框图。细胞处理仪器1200可以包括壳体1244、待转化或转染的细胞的储库1202和生长模块(细胞生长装置)1204。将待转化的细胞从储库转移至生长模块进行培养，直至细胞达到靶OD。在细胞达到靶OD后，生长模块可以冷却或冷冻细胞以供后续处理，或者细胞可以转移至过滤模块1230，在过滤模块1230细胞被赋予电感受态并浓缩至细胞转化的最佳体积。在浓缩后，然后将细胞转移至电穿孔装置1208(例如，转化/转染模块)。用于在多模块细胞处理仪器中使用的在自动化多模块细胞处理仪器中使用的示例性电穿孔装置包括流通式电穿孔装置，诸如以下中描述的那些：2018年9月28日提交的美国系列第16/147,120号；2018年9月28日提交的美国系列第16/147,353号；2018年9月30日提交的美国系列第16/147,865号；和2018年9月30日提交的美国系列第16/147,871号，所有这些通过引用以其整体并入本文。

除了用于储存细胞的储库之外，系统1200可以包括用于储存编辑寡核苷酸盒的储库1216和用于储存表达载体骨架的储库1218。将编辑寡核苷酸盒和表达载体骨架二者均从试剂筒转移至核酸组装模块1220，在核酸组装模块1220处编辑寡核苷酸盒被插入表达载体骨架中。组装的核酸可以转移到任选的纯化模块1222中，用于脱盐和/或制备用于转化的组装的核酸所需的其他纯化和/或浓缩程序。可选地，预组装的核酸，例如编辑载体，可以储存在储库1216或1218中。在由纯化模块1222进行的过程完成后，组装的核酸被转移至例如电穿孔装置1205，该电穿孔装置1205已经包含生长至靶OD并且经由过滤模块1230被赋予电感受态的细胞培养物。在电穿孔装置1208中，组装的核酸被引入细胞。电穿孔后，细胞被转移到合二为一的恢复/选择模块1210。

在恢复和任选地选择后，细胞被转移至单个化、编辑和生长模块1240，在单个化、编辑和生长模块1240处细胞被稀释和区室化(compartmentalized)，使得每个区室平均存在一个细胞。在单个化后，允许细胞生长预先确定的倍增倍数。在建立了这些初始集落后，诱导编辑，并且允许编辑的细胞建立集落，集落生长至终末尺寸(例如，集落被标准化)。在一些实施方案中，编辑由处于诱导型启动子控制下的一种或更多种编辑组分诱导。在一些实施方案中，诱导型启动子通过温度升高而被激活，并且通过温度降低而“失活”。可选地，在单个化装置是包括形成微孔的底的过滤器的固体壁装置的实施方案中，固体壁装置可以转移至包含具有激活或诱导编辑的组分的培养基的板(例如琼脂板或甚至液体培养基)，然后转移至使编辑失活的培养基。在集落生长至终末尺寸后，集落被汇集。同样，单个化克服了来自未编辑的细胞的生长偏倚和来自不同编辑的适应度作用的生长偏倚。

恢复、选择、单个化、诱导、编辑和生长模块可以全部是分开的，可以如图12中示出的排列和组合，或者可以以其他配置排列或组合。在某些实施方案中，所有的恢复、选择、单个化、生长、编辑和标准化都在固体壁装置中进行。可选地，如果需要，恢复、选择和稀释在分开容器(模块)中的液体培养基中进行，然后转移至固体壁单个化/生长/诱导/编辑/标准化模块。

在标准化的细胞集落被汇集后，细胞可以储存在例如储存模块1212中，在储存模块1212中细胞可以保持在例如4℃，直至细胞被取回用于进一步研究。可选地，细胞可以用于另一轮编辑。多模块细胞处理仪器由处理器1242控制，处理器1242被配置成基于使用者输入、如由一个或更多个脚本指导，或作为使用者输入或脚本的组合来操作仪器。处理器1242可以控制系统500的多种模块的定时、持续时间、温度和操作以及试剂的分配。例如，处理器1242可以在转化后冷却细胞，直至需要编辑，此时温度可以升高至有利于基因组编辑和细胞生长的温度。处理器可以用使用者可以从中选择的标准协议参数来编程，使用者可以手动指定一个或更多个参数，或者与试剂筒相关的一个或更多个脚本可以指定一个或更多个操作和/或反应参数。此外，处理器可以通知使用者(例如，经由智能电话或其他装置的应用)细胞已经达到靶OD，以及向使用者更新多模块系统中的多种模块中的细胞的进展。

自动化多模块细胞处理仪器1200是核酸酶指导的基因组编辑系统，并且可以用于单个编辑系统(例如，在单个编辑过程中将一个或更多个编辑引入细胞基因组)。下文描述的，图13的系统被配置成进行顺序编辑，例如，依次使用不同的核酸酶指导的系统在细胞中提供两个或更多个基因组编辑；和/或递归编辑，例如利用单个核酸酶指导的系统在细胞中依次引入两个或更多个基因组编辑。

图13图示了多模块细胞处理仪器的另一种实施方案。该实施方案描绘了对细胞群体进行递归基因编辑的示例性系统。与图12中示出的实施方案一样，细胞处理仪器1300可以包括壳体1344、用于存储待转化或转染的细胞的储库1302和细胞生长模块(包括例如旋转生长瓶)1304。将待转化的细胞从储库转移至细胞生长模块进行培养，直至细胞达到靶OD。在细胞达到靶OD后，生长模块可以冷却或冷冻细胞以供后续处理，或者将细胞转移至过滤模块1360，在过滤模块1360处细胞经历缓冲液交换并被赋予电感受态，并且细胞的体积可以显著减低。在将细胞浓缩至适当的体积后，细胞被转移至电穿孔装置1308。除了用于储存细胞的储库之外，多模块细胞处理仪器还包括用于储存预组装有编辑寡核苷酸盒的载体的储库1352。将预组装的核酸载体转移至电穿孔装置1308，该电穿孔装置1308已经包含生长至靶OD的细胞培养物。在电穿孔装置1308中，将核酸电穿孔到细胞中。电穿孔后，将细胞转移到任选的恢复模块1356中，在恢复模块1356中允许细胞在转化后短暂恢复。

在恢复后，可以将细胞转移至储存模块1312，在储存模块1312处可以将细胞储存在例如4℃以供后续处理，或者可以将细胞稀释并转移至选择/单个化/生长/诱导/编辑/标准化模块1358。在单个化/编辑/生长模块1358中，排列细胞使得每个微孔平均存在一个细胞。排列的细胞可以在选择培养基中，以选择已经用一个或更多个编辑载体转化或转染的细胞。在单个化后，细胞通过2-50倍倍增生长并建立集落。在集落建立后，通过提供诱导编辑的条件(例如温度、添加诱导或阻遏化学物质)诱导编辑。在启动编辑并允许继续进行后，允许细胞在微孔中生长至终末尺寸(例如集落的标准化)，并且然后可以从微孔中冲洗出来并汇集，然后转移至储存(或恢复)单元1314，或者可以转移至生长模块1304用于另一轮编辑。在汇集和转移至生长模块之间，可能存在一个或更多个另外的步骤，诸如细胞恢复、培养基交换、细胞浓缩等，例如通过过滤。注意，选择/单个化/生长/诱导/编辑和标准化模块可以是相同的模块，其中所有过程都在固体壁装置中进行，或者选择和/或稀释可以在分开的容器中进行，然后将细胞转移至固体壁单个化/生长/诱导/编辑/标准化模块(固体壁装置)。作为在例如固体壁装置中单个化的替代方案，如上文关于上文的图8F-图8H描述的，可以使转化的细胞在主体液体中生长并且编辑可以在主体液体中诱导。在推定编辑的细胞被汇集后，它们可以经历另一轮编辑，另一轮编辑开始于生长、细胞浓缩和处理以赋予电感受态，以及经由电穿孔模块1308通过另一编辑盒中的另一供体核酸转化。

在电穿孔装置1308中，选自第一轮编辑的细胞被第二组编辑寡核苷酸(或其他类型的寡核苷酸)转化，并且重复该循环，直至细胞已经被期望数的例如编辑盒转化和编辑。图13中例示的多模块细胞处理仪器由处理器1342控制(处理器1342被配置成基于使用者输入来操作仪器)或者由包括与试剂筒相关的至少一个脚本的一个或更多个脚本来控制。处理器1342可以控制多种过程的定时、持续时间和温度，试剂的分配以及仪器1300的多种模块的其他操作。例如，脚本或处理器可以控制细胞、试剂、载体和编辑寡核苷酸的分配；哪些编辑寡核苷酸用于细胞编辑且按什么顺序；恢复和表达模块中使用的时间、温度和其他条件，细胞生长模块中读取OD的波长，细胞生长到的靶OD，以及细胞达到靶OD的靶时间。此外，处理器可以被编程为通知使用者(例如，经由应用)自动化多模块细胞处理仪器中细胞的进展。

鉴于本公开内容，对于本领域普通技术人员来说明显的是，所描述的过程可以是递归和多重化的；即，细胞可以经历关于图13描述的工作流程，然后所得到的编辑的培养物可以经历另一轮(或若干轮或许多轮)使用不同编辑载体的另外的编辑(例如递归编辑)。例如，来自第一轮编辑的细胞可以被稀释，并且由编辑载体A编辑的编辑细胞的等分试样可以与编辑载体B组合，由编辑载体A编辑的编辑细胞的等分试样可以与编辑载体C组合，由编辑载体A编辑的编辑细胞的等分试样可以与编辑载体D组合，等等，用于第二轮编辑。在第二轮后，可以使每个双重编辑的细胞的等分试样经历第三轮编辑，其中，例如，将AB编辑的、AC编辑的、AD编辑的细胞各自的等分试样与另外的编辑载体(诸如编辑载体X、Y和Z)组合。即，双重编辑的细胞AB可以与载体X、Y和Z组合并且由载体X、Y和Z编辑，以产生三重编辑的编辑细胞ABX、ABY和ABZ；双重编辑的细胞AC可以与载体X、Y和Z组合并且由载体X、Y和Z编辑，以产生三重编辑的细胞ACX、ACY和ACZ；并且双重编辑细胞AD可以与载体X、Y和Z组合并且由载体X、Y和Z编辑，以产生三重编辑的细胞ADX、ADY和ADZ，等等。在该过程中，可以执行许多编辑的排列和组合，产生非常多样的细胞群体和细胞文库。在任何递归过程中，“处治”先前的工程载体和编辑载体(或者单个载体系统中的单个工程+编辑载体)都是有利的。“处治”是一个过程，其中将在先前一轮编辑中使用的一个或更多个载体从转化的细胞消除。处治可以通过以下完成：例如使用处治质粒裂解一个或更多个载体从而使编辑载体和/或工程载体(或单个的、合二为一的载体)无功能；经由细胞生长稀释细胞群体中的一个或更多个载体(即细胞经历的生长周期越多，保留编辑载体或工程载体的子细胞就越少)，或者通过例如利用编辑载体或工程载体(或合二为一的工程载体+编辑载体)上的热敏感复制起点。用于处治的条件取决于用于处治的机制；即，在这个实例中，处治质粒如何裂解编辑质粒和/或工程质粒。

图14是示例性自动化多模块细胞处理仪器的实施方案的简化框图，所述仪器包括如上文关于图8H-8F描述的用于诱导编辑和富集编辑的细胞的主体液体生长模块。细胞处理仪器1400可以包括壳体1444、待转化或转染的细胞的储库1402和生长模块(细胞生长装置)1404。将待转化的细胞从储库转移至生长模块进行培养，直至细胞达到靶OD。在细胞达到靶OD后，生长模块可以冷却或冷冻细胞以供后续处理，或者细胞可以转移至过滤模块1430，在过滤模块1430处细胞被赋予电感受态并浓缩至细胞转化的最佳体积。在浓缩后，然后将细胞转移至电穿孔装置1408(例如，转化/转染模块)。用于在多模块细胞处理仪器中使用的在自动化多模块细胞处理仪器中使用的示例性电穿孔装置包括流通式电穿孔装置，诸如以下中描述的那些：2018年9月28日提交的美国系列第16/147,120号；2018年9月28日提交的美国系列第16/147,353号；2018年9月30日提交的美国系列第16/147,865号；和2018年9月30日提交的美国系列第16/147,871号，所有这些通过引用以其整体并入本文。

除了用于储存细胞的储库之外，系统1400可以包括用于储存编辑盒的储库1416和用于储存表达载体骨架的储库1418。将编辑寡核苷酸盒和表达载体骨架二者均从试剂筒转移至核酸组装模块1420，在核酸组装模块1420处编辑寡核苷酸盒被插入表达载体骨架中。组装的核酸可以转移到任选的纯化模块1422中，用于脱盐和/或制备用于转化的组装的核酸所需的其他纯化和/或浓缩程序。可选地，预组装的核酸，例如编辑载体，可以储存在储库1416或1418中。在由纯化模块1422进行的过程完成后，组装的核酸被转移至例如电穿孔装置1408，该电穿孔装置1408已经包含生长至靶OD并且经由过滤模块1430被赋予电感受态的细胞培养物。在电穿孔装置1408中，组装的核酸被引入细胞。电穿孔后，细胞被转移到合二为一的恢复/选择模块1410。多模块细胞编辑仪器的实例，参见2018年6月30日提交的美国系列第16/024,816号和第16/024,831号，两篇文献都通过引用以其整体并入本文。

在恢复和任选的选择后，将细胞转移至生长、诱导和编辑模块(主体液体培养物)1440。允许细胞生长直至细胞达到稳定生长期(或接近稳定生长期)，然后通过诱导核酸酶和gRNA之一或二者的转录诱导编辑。在一些实施方案中，通过处于诱导型启动子控制下的核酸酶和gRNA之一或二者的转录诱导编辑。在一些实施方案中，诱导型启动子是pL启动子，其中启动子通过温度升高而被激活，并通过温度降低而“失活”。

恢复、选择、生长、诱导、编辑和储存模块可以全部是分开的，可以如图14中示出的排列和组合，或者可以以其他配置排列或组合。在某些实施方案中，恢复和选择在一个模块中进行，并且生长、编辑和再生长在分开的模块中进行。可选地，恢复、选择、生长、编辑和再生长在单个模块中进行。

在细胞被编辑和再生长(例如，从编辑中恢复)后，细胞可以被储存在例如储存模块1412中，在储存模块1412中细胞可以保持在例如4℃，直至细胞被取回用于进一步研究。可选地，细胞可以用于另一轮编辑。多模块细胞处理仪器由处理器1442控制，处理器1242被配置成基于使用者输入、如由一个或更多个脚本指导或作为使用者输入或脚本的组合来操作仪器。处理器1442可以控制系统1400的多种模块的定时、持续时间、温度和操作以及试剂的分配。例如，处理器1442可以在转化后冷却细胞，直至需要编辑，此时温度可以升高至有利于基因组编辑和细胞生长的温度。处理器可以用使用者可以从中选择的标准协议参数来编程，使用者可以手动指定一个或更多个参数，或者与试剂筒相关的一个或更多个脚本可以指定一个或更多个操作和/或反应参数。此外，处理器可以通知使用者(例如，经由智能电话或其他装置的应用)细胞已经达到靶OD，以及向使用者更新多模块系统中的多种模块中的细胞的进展。

实施例

提出以下实施例，以便为本领域普通技术人员提供如何制备和使用本发明的完整公开和描述，且以下实施例并不意在限制本发明人视作其发明的范围，它们也不意在代表或隐含下文的实验是进行的所有实验或仅有实验。本领域的技术人员应理解，可以对具体方面中所示的本发明作出许多变化和/或修饰而不脱离本发明所广泛描述的精神或范畴。因此，本文的方面在所有方面中被认为是说明性的而非限制性的。

针对摇动5ml管的常规细胞振荡器和摇动125ml带挡板烧瓶的轨道振荡器测试如本文描述的细胞生长装置的一种实施方案，以评估细菌和酵母细胞中的细胞生长。此外，使用本文描述的细胞生长装置的实施方案实时监测细菌细胞培养物和酵母细胞培养物的生长。

在第一实施例中，使用如本文描述的细胞生长装置，使LB中20ml的EC23细胞(大肠杆菌细胞)在35ml的具有2桨配置的旋转生长瓶中在30℃生长。使旋转生长瓶以600rpm旋转并且每1秒振荡一次(即改变旋转方向)。并行地，使LB中5ml的EC23细胞在5ml管中在30℃生长，并且以750rpm振荡。使用NanoDrop

进行了另外两个实验，这次将旋转生长瓶/细胞生长装置与带挡板的烧瓶和轨道振荡器进行比较。在一个实验中，使LB中20ml的EC138细胞(大肠杆菌细胞)在35ml的具有4桨配置的旋转生长瓶中在30℃生长。使旋转生长瓶以600rpm旋转并且每1秒振荡一次(即，改变旋转方向)。并行地，使用轨道振荡器，使LB中20ml的EC138细胞在125ml带挡板的烧瓶中在30℃生长。使用NanoDrop

在又另一个实验中，使用旋转生长瓶/细胞生长装置实时测量OD

在另一个实验中，使用旋转的生长瓶/细胞生长装置实时测量YPAD中的酵母s288c细胞的OD

如以上关于图6A-图6I描述的TFF模块已经成功地用于处理大肠杆菌培养物和酵母培养物二者和对它们进行缓冲液交换。在浓缩大肠杆菌培养物时，进行以下步骤：

首先，将LB中生长至OD 0.5-0.62的20ml大肠杆菌培养物在一个方向通过TFF装置，然后在相对方向通过TFF装置。此时，将细胞浓缩至约5ml的体积。接下来，将50ml的10％甘油添加至浓缩的细胞中，并且将细胞在一个方向、在相对方向通过TFF装置，并且在第一个方向返回，总计通过三次。同样，将细胞浓缩至约5ml的体积。同样，将50ml的10％甘油添加至5ml细胞中，并且将细胞通过TFF装置，通过三次。重复这个过程；即，同样，将50ml 10％甘油添加到浓缩至5ml的细胞中，并且使细胞通过TFF装置三次。在三次50ml 10％甘油洗涤的第三次通过结束时，将细胞再次浓缩至约5ml的10％甘油。然后将细胞在交替的方向再通过TFF装置三次，其中将细胞浓缩成约400μl的体积。

测量大肠杆菌的滤液电导率和过滤器处理时间，其中结果示于图21A中。通过测量获得靶溶液电导率所需的过滤器通过的时间和次数来定量过滤器性能。通过比较过滤前和过滤后二者的细胞培养物的光密度(OD600)来确定细胞保留。通过测量每次过滤器通过期间的跨膜流速来监测过滤器的状况(filter health)。在约30分钟内，利用三次50ml 10％甘油洗涤并且每次洗涤使细胞通过装置三次，实现靶电导率(～16μS/cm)。将细胞体积从20ml减少至400μl，并且实现了约90％的细胞回收。

用酵母细胞培养物重复相同的过程。首先，使酵母培养物以相对方向通过TFF装置两次，浓缩至约5ml。将细胞用50ml 1M山梨醇洗涤三次，每次洗涤后通过TFF装置三次。在最后一次用1M山梨醇洗涤后使细胞第三次通过之后，使细胞通过TFF装置两次，其中将酵母细胞培养物浓缩至约525μl。图21B展示了通过测量滤液电导率和过滤器处理时间确定的酵母细胞的过滤器缓冲液交换性能。在约23分钟内，利用三次50ml 1M山梨醇洗涤并且每次洗涤通过TFF装置三次，实现靶电导率(～10μS/cm)。将细胞体积从20ml减少至525μl。实现了约90％的细胞回收。

为了测试FTEP装置的转化，产生电感受态大肠杆菌细胞。为了产生起始培养物，将6ml体积的LB chlor-25(具有25μg/ml氯霉素的LB)转移至14ml培养管中。使用25μl大肠杆菌等分试样接种LB chlor-25管。接种后，将管以45°角放置在设定为250RPM和30℃的摇动培养箱中过夜生长12-16小时之间。OD600值应在2.0和4.0之间。将250ml LB chlor-25管的1:100接种体积转移至四个无菌500ml带挡板摇瓶中，即2.5ml/250ml体积摇瓶。将烧瓶放置在设定为250RPM和30℃的摇动培养箱中。通过每1至2小时测量一次OD600监测生长。当培养物的OD600在0.5-0.6之间时(约3-4小时)，将烧瓶从培养箱中取出。将细胞在4℃以4300RPM离心10min。去除上清液，并且将100ml冰冷的10％甘油转移至每个样品中。将细胞轻轻重悬，并且洗涤程序进行三次，每次将细胞重悬于10％甘油中。第四次离心后，将细胞重悬液转移至50ml锥形Falcon管中，并且添加另外的冰冷10％甘油，使体积多达30ml。同样，将细胞在4℃以4300RPM离心10min，去除上清液，并且将细胞沉淀物重悬在10ml的冰冷甘油中。将细胞以细胞悬液和冰冷甘油的1:100稀释进行等分。

使用所描述的FTEP装置进行比较电穿孔实验，以确定电感受态大肠杆菌的转化效率。流速由压力控制系统控制。将具有DNA的细胞悬液装载到FTEP入口储库中。转化的细胞直接从入口和入口通道流动，通过流动通道，通过出口通道，然后进入包含恢复培养基的出口。将细胞转移到包含另外的恢复培养基的管中，放置在30℃的培养箱振荡器中，以250rpm摇动3小时。将细胞铺板，以确定电穿孔后存活但未能摄取质粒的集落形成单位(CFU)和电穿孔后存活且摄取质粒的CFU。将板在30℃孵育；24小时后对大肠杆菌集落计数。

使用体外高压电穿孔仪(NEPAGENE

此外，对NEPAGENE

为了测试FTEP装置在酵母中的转化，使用如Bergkessel和Guthrie，MethodsEnzymol.，529:311-20(2013)中阐述的方法产生酿酒酵母细胞。简言之，用3ml接种物对YFAP培养基接种，进行过夜生长产生100ml细胞。每处理100ml培养物产生约1ml感受态细胞。将细胞在摇动培养箱中在30℃孵育，直至它们达到OD600为1.5+/-0.1。

使用100mM乙酸锂、10mM二硫苏糖醇和50mL缓冲液制备调节缓冲液(conditioningbuffer)，用于生长并保持在室温的每100mL细胞。在250ml瓶中以4300rpm收获细胞3分钟，并且去除上清液。将细胞沉淀物悬浮在100ml冷的1M山梨醇中，以4300rpm旋转3分钟，并且再次去除上清液。将细胞悬浮在调节缓冲液中，然后将悬液转移到适当的烧瓶中，并且以200RPM和在30℃摇动30分钟。将悬液转移到50ml锥形瓶中，并以4300rpm的速度旋转3分钟。去除上清液，并且将沉淀重悬在冷的1M山梨醇中。将这些步骤重复三次，总计三个洗涤-旋转-倾析步骤。将沉淀物悬浮在山梨醇中，至最终OD为150+/-20。

使用FTEP装置进行比较电穿孔实验，以确定电感受态酿酒酵母的转化效率。流速用注射泵(Harvard apparatus PHD ULTRA

使用体外高压电穿孔仪(NEPAGENE

用本公开内容的自动化多模块仪器成功地进行了使用MAD7核酸酶的单重自动化基因组编辑。参见美国专利第9,982,279号；和2018年6月30日提交的美国系列第16/024,831号；2018年6月30日提交的第16/024,816号；2018年9月28日提交的第16/147,353号；2018年9月30日提交的第16/147,865号；和2018年6月30日提交的第16/147,871号。

经由Gibson

在自动化处理和恢复后，将细胞的等分试样铺板在补充有乳糖(作为糖底物)、氯霉素和羧苄青霉素的MacConkey琼脂基上，并且生长直至出现集落。白色集落代表功能性编辑的细胞，紫色集落代表未编辑的细胞。所有液体转移都由自动化多模块细胞处理仪器的自动化液体处理装置进行。

自动化处理的结果是约1.0E

使用自动化多模块细胞处理系统成功地实现了递归编辑。经由Gibson

在细胞生长期间，在等温核酸组装模块中制备第二编辑载体。第二编辑载体包含卡那霉素抗性基因，并且编辑盒包含galK Y145*编辑。如果成功，galK Y145*编辑赋予细胞摄取和代谢半乳糖的能力。由galK Y154*盒产生的编辑在第154个氨基酸残基处引入终止密码子，将酪氨酸氨基酸改变为终止密码子。该编辑使galK基因产物为非功能性的，并且抑制细胞代谢半乳糖的能力。组装后，在等温核酸组装模块中使用AMPure珠使第二编辑载体产物脱盐，用80％乙醇洗涤，并且在缓冲液中洗脱。使用与以上详述的相同参数，将组装的第二编辑载体和电感受态大肠杆菌细胞(用第一编辑载体转化并且针对第一编辑载体选择)转移到转化模块进行电穿孔。电穿孔后，将细胞转移至恢复模块(另一生长模块)，允许在包含羧苄青霉素的SOC培养基中恢复。恢复后，将细胞保持在4℃直至取回，之后将细胞的等分试样铺板在补充有氯霉素和卡那霉素的LB琼脂上。为了定量lacZ和galK编辑二者，在两种培养基类型上产生复制斑块板(replica patch plate)：1)补充有乳糖(作为糖底物)、氯霉素和卡那霉素的MacConkey琼脂基，和2)补充有半乳糖(作为糖底物)、氯霉素和卡那霉素的MacConkey琼脂基。所有液体转移都由自动化多模块细胞处理系统的自动化液体处理装置进行。

在该递归编辑实验中，筛选的集落中的41％具有lacZ和galK编辑二者，其结果与使用“台式”或手动方法获得的双重编辑效率可比较。

由人类MHC等位基因HLA-A*02呈递的肽的结合基序已经被很好地表征(Falk，K.，等人，Nature，1991.351(6324)：p.290-296；Glanville，J.，等人，Nature，2017.547(7661)：p.94-98)并且许多限制性临床相关TCR已被鉴定(Johnson，L.A.，等人，Blood，2009.114(3)：p.535-546)。用于筛选潜在HLA-A*02:01限制性TCR的酵母展示文库如下产生。设计并且从Agilent(Santa Clara,CA)订购用于将具有不同序列的合成pMHC(Glanville，J，同上)肽引入酿酒酵母的基因组中的约10,000个寡核苷酸编辑盒的文库。

简言之，每个寡核苷酸盒的结构元件如下：启动子区、CRISPR指导RNA区、任选的间隔物区、同源臂和任选地其他序列(例如，条形码)，这些结构元件有助于基于特定编辑的选择和/或确认中使用的功能测定进行进一步分析。盒的长度范围为180nt至230nt，这取决于待引入的编辑和寡核苷酸的整体设计。同源臂的设计包括同义密码子改变(如有必要)，以产生用于插入片段盒的恒定区的限制性位点。这些恒定区包括HLA-A*02:01重链和AGA2P细胞表面展示赋予蛋白。恒定区还可以包含表位标签，以便在下游选择中使用。

简言之，每个寡核苷酸盒的结构元件如下：启动子区、CRISPR指导RNA区、任选的间隔物区、同源臂和任选地其他序列(例如，条形码)，有助于基于特定编辑的选择和/或确认中使用的功能测定进行进一步分析。盒的长度范围为180nt至230nt，这取决于待引入的编辑和寡核苷酸的整体设计。同源臂的设计包括同义密码子改变(如有必要)，以产生用于插入片段盒的恒定区的限制性位点。这些恒定区包括HLA-A*02:01重链和AGA2P细胞表面展示赋予蛋白(AGA2P cell surface display conferring protein)。恒定区还可以包含表位标签或条形码“手柄”，以便在下游选择和进一步分析中使用。此外或可选地，盒设计可以包括添加“着陆垫(landing.pad)”用于将来添加序列。也可以靶向CRISPR指导RNA区以获得高效切割和整合位点。

任选地，寡核苷酸编辑盒可以用简并PCR反应进一步处理，以产生原始TCR抗原序列的10

重要的是，组合序列多样性可以在代表HLA-A等位基因的重链构建体的任何位置以及肽区域中产生。然后，个体酵母表达与恒定HLA分子栓系的随机肽。HLA-A*02:01通常呈递8至11个氨基酸长度的肽(Hassan，C.，等人，The Journal of Biological Chemistry,2015.290(5)：p.2593-2603)，并且使用这些范围内长度的肽产生肽长度文库。文库具有由文库组成和长度决定的理论核苷酸多样性，但被设计成产生代表范围为8至11个氨基酸的数百万个独特肽的一个或更多个文库。在孵育细胞并经历编辑过程后，存在具有与AGA2P蛋白附接的展示在细胞表面上的pMHC复合体的编辑的细胞池。展示pMHC复合体的编辑的细胞的任选的初始选择可以经由展示的表位标签进行。

进行验证研究以确定实施例1的文库中细胞的表面上的HLA-A*02:01复合体是否被正确折叠以呈递肽。验证使用展示具有已知特异性的TCR靶抗原的细胞的鉴定。简言之，使用如实施例1中产生的文库来设计系统，以验证文库中抗原的正确表达。在该系统中，将展示pMHC缀合物的酵母细胞暴露于来自具有已知TCR的单个T细胞的扩增T细胞群体。使用该系统，使用者可以将TCR与已知的预测抗原靶正确地匹配。使用具有已知抗原序列的TCR进行选择。选择后，例如使用对条形码进行的测序确定选择的样品，所述条形码与文库细胞中选择的抗原缔合。尽管与实际的表位存在序列差异，使用本公开内容的系统鉴定的顶级肽抗原能够刺激TCR转导的T细胞。

为了测试自动化系统是否能够鉴定新的抗原靶，使用本公开内容的方法，使用已知的TCR和/或孤儿TCR鉴定抗原。然后这些鉴定的抗原可以通过生物信息学方法用于查询预期的或潜在的肽抗原的范围(universe)。这些生物信息学方法试图确定来源于已知蛋白序列也将结合代表性TCR的共有肽。然后，可以将这些预测的肽序列设计成实施例1的文库中的一个，或者直接用其他测定进行测试。然后，这些展示预测的肽pMHC分子的文库可以暴露于一个或更多个孤儿TCR，以寻找与孤儿TCR特异性结合的抗原。然后将这些肽鉴定为TCR的可能抗原靶。

传统上，使用基于酵母双杂交(Y2H)的方法(Rolland，T.，等人，Cell,2014.159(5)：p.1212-1226；Huttlin，E.L.，等人，2017.545(7655)：p.505-509)或基于质谱的测定(Hein，Marco Y.，等人，Cell,2015.163(3)：p.712-723，以高通量对蛋白-蛋白相互作用进行研究。流式细胞术也大量用于实现酵母表面展示应用，并且经扩展以促进蛋白-蛋白相互作用和酶特性的研究(Lim，S.，等人，Biotechnology Journal，2017.12(5)：p.10；Cherf，G.M和J.R.Cochran，Methods in molecular biology(Clifton，N.J.)，2015.1319：p.155-175。

CREATE展示可以用于促进快速筛选一对比全部(one vs.all)或全部对比全部(all vs.all)蛋白-蛋白相互作用。首先，通过从Agilent(Santa Clara,CA)订购一组约6,000个寡核苷酸编辑盒，产生全基因组的CREATE展示文库。如先前实施例中描述的，这些寡核苷酸编辑盒配置有crRNA、间隔物区和同源臂。如果这些特定寡核苷酸盒包含重复序列以有助于经由标准克隆方法添加赋予表面展示的标签，那么这些特定寡核苷酸盒也可以任选地包含最佳定位的限制性酶位点。存在许多赋予标签的表面展示。McMahon，C.，等人，同上；Cherf，G.M.和J.R.Cochran，Methods in molecular biology(Clifton,N.J.),2015.1319：p.155-175；Uchański，T.，等人，Scientific Reports，2019.9(1)：p.382。这些可能包括并扩展使用酵母AGA2P交配蛋白(mating protein)的原始方法，该交配蛋白通常与所展示的感兴趣的蛋白或肽的N-末端融合(Boder，E.T.和K.D.Wittrup，同上)。为了促进对细胞功能至关重要的必需蛋白的展示，可以任选地在赋予表面展示的标签和感兴趣的蛋白之间设计非最佳裂解位点。存在许多赋予裂解的序列，但是一个实例是烟草蚀纹病毒(TEV)裂解位点，烟草蚀纹病毒(TEV)裂解位点可以被修饰以导致次优裂解(Ioannou，M.，等人，Mammalian expression vectors for metabolic biotinylation tandem affinitytagging by co-expression in cis of a mammalian codon-optimized BirA biotinligase.BMC research notes,2018.11(1)：p.390-390)并且因此在维持天然蛋白的存活细胞内浓度的同时，导致同时表面展示期望的蛋白。在寡核苷酸盒已经被设计、订购并随后被修饰以包括赋予细胞表面展示的标准部分后，CREATE过程可以进行。简言之，如先前描述的，将细胞群体用寡核苷酸盒转化，并且使用自动机器孵育，产生编辑的细胞群体。这种细胞群体使得每个个体细胞包含一个或更多个编辑，所述编辑导致在基因组周围感兴趣的设计位置插入赋予细胞表面展示的标签。为了产生展示酵母基因组中所有蛋白的全基因组文库，制备约6,572种编辑，以在酵母基因组中所有6,572种注释的蛋白(https://www.yeastgenome.org/genomesnapshot)的N-末端插入赋予表面展示的标签。这会产生6,572种不同细胞的文库，每种细胞在其表面展示6,572种蛋白中的一种。然后该细胞文库可以分成两个群体，并且其中一个群体用表达绿色荧光蛋白(GFP)的构建体转化。然后，这两个群体可以一起孵育，并且通过流式细胞仪运行以检测指示阳性蛋白-蛋白相互作用的双联体的形成(Wersto，R.P.，等人，Cytometry,2001.46(5)：p.296-306)。然后，可以将双链体放置到标准96或384孔板的个体分区(partition)中，并且读取存在于双联体的每个细胞中的盒的DNA序列条形码，以确定蛋白-蛋白相互作用。值得注意的是，这种技术可以以全部对全部方式(all-by-all manner)进行，其中所有6,572种表达GFP的表面展示蛋白与所有6,572种不表达GFP的表面展示蛋白一起孵育。然而，这种技术也可以以一对比全部或多对比全部的配置进行，其中特定感兴趣的蛋白的分离物使用如以上描述的流式细胞术孵育和分选。这种一对比全部或多对比全部可以为确定个体蛋白二元相互作用配偶体提供另外的特异性或清晰度。还应注意的是，这种相同的程序与在噬菌体或酵母展示中传统地进行一样可以通过多轮筛选完成(Bradbury，A.R.M.，等人，Nature Biotechnology，2011.29：p.245)以选择性富集最高亲和力的结合配偶体并降低假阳性率。这种相同的程序也可以对先前编辑的基因组使用，所述先前编辑的基因组包含在引入赋予细胞表面展示的标签之前编辑进入细胞群体中的致病性或其他感兴趣变体。先前编辑的基因组也可能包含专门设计用来破坏蛋白-蛋白相互作用的变体组。值得注意的是，CREATE展示还可以用于经由在整个细胞的多个基因座处引入多个标签，在单细胞的表面上展示多于一种蛋白。

鉴定药物的靶和随后的作用机制仍然是一项具有挑战性的努力。Schenone，M.，等人，Nature Chemical Biology，2013.9：p.232；Stockwell，B.R.，Exploring biology withsmall organic molecules.Nature，2004.432(7019)：p.846-854；Xie，L.，L.Xie，和P.E.Bourne，Structure-based systems biology for analyzing off-targetbinding.Current opinion in structural biology，2011.21(2)：p.189-199。

反向遗传筛选趋于使用计算或其他理性方法来预先选择一系列可能的疾病相关靶。然后使用化学化合物文库针对一种或更多种这些疾病相关靶进行生物化学筛选。然而，生物化学测定通常是昂贵的或耗时的，并且随后通常限于少量的潜在靶。17.Wyatt，P.G.，等人，Target validation:linking target and chemical properties to desiredproduct profile.Current topics in medicinal chemistry，2011.11(10):p.1275-1283.

生物化学筛选中的少量可行靶通常转变成无法鉴定潜在的脱靶，这然后可以导致难以理解副作用和在确定作用机制时的必要“去卷积”步骤。Knight，Z.A.,H.Lin，和K.M.Shokat，Nature reviews.Cancer，2010.10(2)：p.130-137。

相比之下，正向遗传筛选通常开始于感兴趣的表型，并且然后针对模型系统筛选大量分子，以观察表型是否可以被破坏。Stockwell，B.R.，Exploring biology with smallorganic molecules.Nature，2004.432(7019)：p.846-854。

然而，这通常可以导致不知道该分子靶向的是什么蛋白或途径，并且当在进一步的研究中或在患者中施用时还可以导致不预期的副作用。Xie，L.，等人，同上。

正向遗传筛选和反向遗传筛选二者均可以极大地受益于在简单的有成本效益的测定中统一评估药物与所有细胞内蛋白结合的能力。对于正向筛选，它可以鉴定实际靶，并且对于反向筛选，它可以鉴定脱靶。使用此处描述的CREATE展示方法，可以有效地产生在细胞群体的表面上展示所有可能的细胞蛋白的文库，并且然后将该群体暴露于带有附接的荧光团或其他检测手柄的小分子，以确定所有蛋白-药物结合事件。首先，如实施例5中描述的，产生CREATE展示文库。该展示文库可以任选地展示基因组中的所有蛋白或特定于某一途径或计算确定的感兴趣集合的蛋白子集。该展示文库也可以在已经含有一种或更多种致病变体的细胞群体中产生，所述致病变体经由先前轮的CREATE鉴定为先验结果并编程到细胞群中。然后，可以将该文库暴露于具有附接的有机荧光团的单个感兴趣的分子。CREATE展示文库与感兴趣的小分子一起孵育，在小分子能够与该蛋白结合的情况下导致与展示该蛋白的细胞结合的小分子的复合体。使用流式细胞术，可以对展示具有结合配体的蛋白的细胞进行分选，并且使用CREATE盒上的条形码来确定哪些蛋白被给定小分子结合。这引起小分子二元映射至蛋白，并且可以独特地鉴定给定小分子的所有可能的结合配偶体。任选地，使用DNA编码的化学文库或其他组合筛选方法(Zimmermann，G.和D.Neri,Drug discoverytoday，2016.21(11)：p.1828-1834；Szymański，P.、M.Markowicz和E.Mikiciuk-Olasik，International journal of molecular sciences，2011.13(1)：p.427-452)，可以针对表面展示的蛋白的CREATE展示文库对化学化合物的文库进行全部对全部筛选。

传统的抗体药物开发集中在细胞表面或其他容易被抗体访问的细胞外靶。然而，在批准用于药物的约700种蛋白分子靶中，多于一半是细胞内蛋白。参见，例如，Carter，P.J.和G.A.Lazar，Nature Reviews Drug Discovery，2017.17：p.197；Santos，R.，等人，Drug discovery，2017.16(1)：p.19-34；Wang，X.，等人，Genome biology and evolution，2013.5(7)：p.1291-1297。

正在非常努力地开发用于抗体或小肽治疗性分子的递送系统。Stewart，M.P.，等人，Nature，2016.538：p.183。如果细胞内抗体或肽递送的前景实现，那么系统地使与一种或更多种细胞内蛋白结合的抗体亲和力成熟的方法会具有巨大的价值。使用CREATE展示，细胞内蛋白的大文库可以展示在细胞群体的表面上，并且系统地暴露于酵母或噬菌体展示文库，以选择一组靶的单、双或多特异性结合物。首先，酵母展示文库经由本文描述或如别处描述的方法(McMahon，C.，等人，同上；Lim S.等人，同上；Cherf，G.M.和J.R.Cochran，同上)产生，其中许多组合编码的蛋白被编码到用于在表面上展示的酵母细胞群体中。此时，工作流程以与实施例5中列出的相同方式进行。特别地，具有表面上展示的组合编码肽的细胞文库也用赋予绿色荧光蛋白表达的DNA序列转化。然后，将具有多达10^10种不同展示抗体、纳米抗体(nanobody)或肽片段的细胞文库与所有细胞内蛋白的CREATE展示文库一起孵育。然后，使用流式细胞术并选择双联体使得能够确定一种或更多种工程化肽和一种或更多种表面展示的细胞蛋白之间的任何成对结合相互作用。该程序也可以与经由酵母展示(Cherf，G.M和J.R.Cochran，同上)进行的传统抗体亲和力成熟相同的方式迭代进行。对代表给定途径或基因组的蛋白子集的表面展示的细胞蛋白文库迭代进行，导致鉴定出与整个蛋白途径的高亲和力结合物。以这种方式，可以确定多特异性结合物抑制或识别整个途径的作用机制。重要的是，经由溶液中所有其他细胞内蛋白的存在，在全基因组CREATE展示文库中存在脱靶影响的内置阴性对照。因此，当选择仅与途径中的蛋白子集结合的结合物时，可以找到强结合一种或更多种期望的细胞内蛋白之间的帕累托最优(pareto optimum)，同时使与非期望的细胞内蛋白的结合最小化。因此，在连续几轮的CREATE展示中，可以使抗体亲和力成熟以与特异性靶结合，同时还选择使与其他细胞内蛋白的脱靶结合最小化。

虽然本发明通过许多不同形式的实施方案来满足，但是如结合本发明的实施方案详细描述的，应理解本公开内容应被认为是对本发明的原理的示例而不意在将本发明局限于本文说明和描述的具体实施方案。本领域技术人员可以作出不脱离本发明的精神的许多变化。本发明的范围将由所附权利要求书及其等同物判断。摘要和标题不应被解释为限制本发明的范围，因为它们的目的是使适当的机构以及一般公众能够迅速确定本发明的一般性质。在以下的权利要求书中，除非使用术语“手段(means)”，否则其中列举的特征或要素都不应被解释为根据35U.S.C.§112,